CN109134652B

CN109134652B - Pan-ELR+ CXC趋化因子抗体

Info

Publication number: CN109134652B
Application number: CN201811074266.5A
Authority: CN
Inventors: C.B.贝德勒; K.K.基克利; B.A.斯特里夫勒; D.R.维彻尔; J.S.博伊尔斯
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: MX2015013053A; PH12015502090B1; CN105143259B; IL269387B; AU2014237898A8; PE20191480A1; IL241167A0; CA2901468A1; CY1120459T1; JP2016512026A; UA116008C2; EA201591514A1; MY171213A; EP3608336A1; EP3348569B1; JP6105146B2; MX364831B; SI2970447T1; CA2901468C; SG11201507686TA

Abstract

提供了特异性结合7种人ELR+CXC趋化因子的Pan‑ELR⁺CXC趋化因子抗体。本发明的抗体可用于治疗多种炎症性/自身免疫性疾病，诸如炎性肠病（IBD）、牛皮癣和掌跖脓疱病；和癌症，诸如肾癌或卵巢癌。

Description

Pan-ELR+ CXC趋化因子抗体

本申请是申请日为2014年3月5日的中国专利申请201480013248.X“Pan-ELR⁺ CXC趋化因子抗体”的分案申请。

技术领域

本发明涉及针对ELR+ CXC趋化因子的抗体，以及它们在治疗由ELR+ CXC趋化因子介导发病的疾病中的用途。

背景技术

ELR+ CXC趋化因子（这样称谓是因为该趋化因子家族成员都具有紧邻它们的CXC基序的E-L-R氨基酸基序）在各种发病机制中发挥重要作用，包括嗜中性粒细胞向炎症和血管生成位点的迁移。嗜中性粒细胞促进几种急性和慢性炎症/自身免疫性疾病的发病，诸如炎性肠病（IBD）、牛皮癣和掌跖脓疱病。ELR+ CXC趋化因子还在肿瘤生成和肿瘤转移中发挥关键作用。这些趋化因子在肿瘤中高表达。在肿瘤环境中，ELR+ CXC趋化因子涉及多个通路，例如血管生成、内皮细胞和白细胞在肿瘤部位的移动和侵袭，以及肿瘤细胞的增殖和存活。

趋化因子分为4个亚家族：CXC、CC、（X）C和CX3C。在CXC趋化因子中，一个氨基酸隔开前两个半胱氨酸（“CXC基序”）。ELR+ CXC趋化因子是CXCR1和/或CXCR2趋化因子受体的配体，其是特异性结合ELR+ CXC趋化因子的G-蛋白偶联的7种跨膜结构域型受体。所述7种人ELR+ CXC趋化因子是人Gro-α（也称为CXCL1）、人Gro-β（也称为CXCL2）、人Gro-γ（也称为CXCL3）、人ENA-78（也称为CXCL5）、人GCP-2（也称为CXCL6）、人NAP-2（也称为CXCL7）和人IL-8（也称为CXCL8）。所有的ELR+ CXC趋化因子都结合CXCR2受体；此外，一些ELR+ CXC趋化因子结合CXCR1和CXCR2受体两者（即，CXCL6和CXCL8），它们都促进活化途径中的冗余。

先前已经描述了结合个别ELR⁺ CXC趋化因子的抗体。在早期的临床实验中已经评价了针对CXCL8（IL-8）的两种单克隆抗体在炎症疾病中具有效力（J Leuk Biol 66:401-410; J Immunol 181:669-679）。此外WO 2008/130969公开了结合人IL-8 (CXCL8)、人Gro-α (CXCL1)、人Gro-β (CXCL2)、人Gro-γ(CXCL3)和人ENA-78 (CXCL5)的抗体。但是，该公开没有证实该抗体紧密结合GCP-2（CXCL6），并且没有提及对NAP-2（CXCL7）的结合。

但是，尚未公开能够结合并中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子的抗体。靶向一种或一些人ELR+ CXC趋化因子使得其它ELR+ CXC趋化因子有机会引发多种生物学功能。中和所有7种ELR+ CXC趋化因子可以影响CXCR1+或CXCR2+细胞迁移到炎症部位的能力，并且可以抑制血管生成。鉴于在CXCR1和CXCR2受体活化通路中显著的冗余，对于结合所有7种人ELR+CXC趋化因子的具有特异性和高亲和力的抗体仍然存在需要。对中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子的抗体存在需要。对于物理性能稳定的抗体也存在需要。因此，希望提供能够结合并中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子并且物理性能稳定的septa-特异性抗体。

发明内容

本发明提供了中和人Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体。本发明还提供了中和Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体，其中所述抗体在下列氨基酸处结合IL-8（SEQ ID NO: 27）:Arg 6、Ile 10、Ala 35、Ile 40。本发明还提供了中和人Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体，其中所述抗体在下列氨基酸处结合IL-8（SEQ ID NO: 27）:Arg 6、Ile 10、Ala 35、Ile 40和Leu 49。

本发明提供了抗体，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区（LCVR）并且所述重链包含重链可变区（HCVR），其中所述LCVR包括LCDR1、LCDR2、LCDR3并且所述HCVR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1是RASQSISNNLH（SEQ ID NO：7），LCDR2是YTSRSVS（SEQID NO：8），LCDR3是GQNNEWPEV（SEQ ID NO：9），HCDR1是GYEFTSYWIH（序列ID NO：10），HCDR2是NISPNSGSANYNEKFKS（SEQ ID NO：11），并且HCDR3是EGPYSYYPSRXaaYYGSDL（SEQ ID NO：20），其中Xaa是E或Q。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，其中HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14。本发明还提供了一种抗体，其中LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 4或SEQID NO: 16。

本发明提供了一种抗体，其中重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:13。本发明还提供了一种抗体，其中轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 15。

本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子包含编码具有SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 13的氨基酸序列多肽的第一多核苷酸序列；和包含编码具有SEQ ID NO: 3或SEQ IDNO: 15的氨基酸序列多肽的第二多核苷酸序列。

本发明提供了包含上述DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链。已知能够表达功能性免疫球蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、COS细胞和NS0细胞。用于本发明的优选的宿主细胞是NS0细胞。

本发明进一步提供了用于生产包含氨基酸序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 15的轻链和氨基酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 13的重链的抗体的方法，所述方法包括在使得抗体表达的条件下培养上述哺乳动物细胞并回收表达的抗体。

本发明提供一种治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的方法，包括对有需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗体。

本发明进一步提供了用于治疗的本发明的抗体。此外，本发明提供了用于治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的本发明的抗体。此外，本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的药物中的用途。

本发明提供了包含本发明的抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

具体实施方式

如本文所用，术语“人ELR+ CXC趋化因子”意在指具有E-L-R基序并结合CXCR1和/或CXCR2受体的7种已知的CXC趋化因子。人ELR+ CXC趋化因子是人Gro-α（也称为CXCL1）（SEQ ID NO：21）、人Gro-β（也称为CXCL2）（SEQ ID NO：22）、人Gro-γ（也称为CXCL3）（SEQID NO：23）、人ENA-78（也称为CXCL5）（SEQ ID NO：24）、人GCP-2（也称为CXCL6）（SEQ ID NO：25）、人NAP-2（也称为CXCL7）（SEQ ID NO：26）和人IL-8（也称为CXCL8）（SEQ ID NO：27）。本文中所有7种人ELR+ CXC趋化因子统称为“人pan-ELR+ CXC趋化因子”。

如本文所用术语“抗体”意在指包含四条多肽链（通过二硫键互相连接的两条重（H）链和两条轻（L）链）的单克隆免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区（HCVR）和重链恒定区。所述重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区（LCVL）和轻链恒定区，CL。HCVR和LCVR区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区（CDR），其间散布更保守的称为框架区（FR）的区域。每个HCVR和LCVR由三个CDR和4个FR构成，按照下列顺序从氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。HCVR中的CDR区称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。LCVR中的CDR区称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR包含与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。对于抗体目前有三种用于序列划分的CDR排列系统。Kabat CDR定义（Kabat 等, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）基于抗体序列可变性。Chothia CDR定义(Chothia 等, “Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani 等, “Standard conformations for the canonical structures ofimmunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构。除了HCDR1和HCDR2之外，Chothia CDR定义与Kabat CDR定义相同。对于本发明的目的，使用杂合的Kabat和Chothia定义来定义CDR。在HCVR和LCVR区中的氨基酸排列与Kabat编号规则一致。还理解术语“抗体”涵盖对抗体的任何细胞内翻译后修饰包括但不限于酰化和糖基化。

如本文所用，术语“中和抗体”意在指结合ELR+ CXC趋化因子导致该趋化因子诱导的生物学活性被抑制的抗体。ELR+趋化因子诱导的生物学活性的抑制可以通过一种或多种本领域已知的几种标准体外测定来进行评价（参见实施例）。进一步理解，如本文所用关于本发明抗体活性的术语“抑制”或“中和”意指拮抗、降低或破坏由一种或多种ELR+ CXC趋化因子诱导的生物学活性的进展、强度或严重程度的能力。

如本文所用，术语“septa-特异性抗体”意在涵盖以高亲和力（例如具有从约5 x10^-11 M至约1 x 10^-9 M范围的结合亲和力（K_D））结合所有7种人ELR+ CXC趋化因子的抗体。

如本文所用，“患者”指哺乳动物，优选具有疾病、病症或状况的人，所述疾病、病症或状况将受益于人ELR+ CXC趋化因子水平的降低或由人ELR+ CXC趋化因子诱导的生物活性的降低。

如本文所用，“治疗”或“治疗”意在指其中可以减慢、控制或终止本文所公开的病症进展，但不必指示所有病症症状的完全消除的所有方法。治疗包括施用本发明的抗体用于治疗患者特别是人中的疾病或状况。

本发明的抗体以高亲和力结合人pan-ELR+ CXC趋化因子。例如，当作为全长IgG4抗体表达时，本发明抗体以下列范围中的结合亲和力（K_D）结合所有7种人ELR+ CXC趋化因子：从约5 x 10^-11 M至约1 x 10^-9 M，例如从约1.0 x 10^-10 M至约8.6 x 10^-10 M，如通过表面等离子共振所测量。本发明的抗体进一步表征为，当它们特异性结合人pan-ELR+ CXC趋化因子时，它们不特异性结合其它CXC趋化因子，例如基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α，也称为CXCL12）。

在一个实施方案中，本发明的抗体可以具有重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：HCDR1 (SEQ ID NO: 10)、HCDR2 (SEQ IDNO: 11)和HCDR3 (SEQ ID NO: 12)；并且其中所述轻链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：LCDR1 (SEQ ID NO: 7)、LCDR2 (SEQ ID NO: 8)和LCDR3 (SEQ ID NO: 9)。

在另一个实施方案中，本发明的抗体可以具有重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：HCDR1 (SEQ ID NO: 10)、HCDR2 (SEQ IDNO: 11)和HCDR3 (SEQ ID NO: 19)；并且其中所述轻链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：LCDR1 (SEQ ID NO: 7)、LCDR2 (SEQ ID NO: 8)和LCDR3 (SEQ ID NO: 9)。

在进一步的实施方案中，本发明的抗体可以包含具有SEQ ID NO: 2或14的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 4或16的氨基酸序列的轻链可变区。

在又进一步的实施方案中，本发明的抗体可以包含具有SEQ ID NO: 1或13的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 3或15的氨基酸序列的轻链。

优选地，所述抗体包含两条相同的轻链和两条相同的重链。优选地，所述具有如SEQ ID NO: 3中所示氨基酸序列的轻链由包含SEQ ID NO: 6所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述具有如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的重链由包含SEQ ID NO: 5所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述如SEQ ID NO: 15中所示轻链氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 18所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述如SEQ ID NO: 13中所示重链氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 17所示多核苷酸序列的核酸编码。

本发明最优选的实施方案是包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的两条相同重链和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的两条相同轻链的抗体。

本发明的抗体可以掺入适合用于施用给患者的药物组合物。典型地，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学可接受的载体。如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体可以进一步包括微量的增强所述抗体货架期或有效性的辅助物质。

本发明的组合物可以以各种形式。优选形式取决于施用和治疗应用的意向方式。典型的优选组合物以可注射或可输注溶液的形式，诸如类似于那些用于人的被动免疫的组合物。施用的优选方式是胃肠外（例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内）。在一个实施方案中，所述抗体通过腹膜内或皮下注射施用。但是，如本领域技术人员会理解的，施用的途径和/或方式会取决于所希望的结果而变化。

补充的活性化合物也可以掺入药物组合物。在某些实施方案中，本发明的抗体与一种或多种可用于治疗其中ELR+ CXC趋化因子活性有害的病症的额外的治疗剂共配制和/或共施用。例如，本发明的抗体可以与一种或多种化疗剂（例如，舒尼替尼或顺铂）共配制和/或共施用。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”的本发明的抗体。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间阶段，有效获得需要的治疗结果的量。本发明抗体的治疗有效量可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述抗体在个体中引发所需应答的能力而改变。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益作用超出所述抗体的任何毒性或有害作用。

可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答（例如，治疗应答）。例如，可以施用单次推注，可以经过一段时间施用几个分份剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。

剂量值可以随所要缓解的状况的类型和严重程度变化。进一步理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定剂量方案。

本发明的抗体对人ELR+ CXC趋化因子的特异性结合和中和允许所述抗体用作用于受益于人ELR+ CXC趋化因子生物活性抑制的疾病和病症的治疗剂。鉴于它们结合和中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子的能力，本发明的抗体相对于靶向单个人ELR+ CXC趋化因子的单一疗法和靶向多种人ELR+ CXC趋化因子的组合疗法提供优势。

在一个实施方案，本发明提供用于治疗溃疡性结肠炎或癌症，如肾癌或卵巢癌的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗溃疡性结肠炎或癌症，如肾癌或卵巢癌的抗体。

本发明通过下列非限制性实例进一步阐明。

实施例

抗体的表达和生产

用于本发明的抗体可以如下表达和纯化。使用包含SEQ ID NO: 5（编码SEQ IDNO: 1的重链多肽）和SEQ ID NO: 6（编码SEQ ID NO: 3的轻链多肽）的DNA序列的表达载体转染NS0细胞。此表达载体获得的抗体是“抗体1”。

另外，使用包含SEQ ID NO: 17（编码SEQ ID NO: 13的重链多肽）和SEQ ID NO:18（编码SEQ ID NO: 15的轻链多肽）的DNA序列的表达载体转染NS0细胞。此表达载体获得的抗体是“抗体2”。

对于抗体1或抗体2，转染库以低密度铺板以允许长出接近单克隆的稳定表达细胞。筛选主孔的抗体表达，并且然后在无血清悬浮培养基中放大用于生产。将抗体分泌到其中的澄清的培养基施加到蛋白A或G柱，所述柱已用相容的缓冲液，诸如磷酸缓冲盐水（pH7.4）进行平衡。清洗柱以去除非特异性结合组分。通过pH梯度（诸如0.1M磷酸钠缓冲液，pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH2.5）洗脱结合的抗体。通过SDS-PAGE检测抗体级分并然后合并。进一步的纯化是任选的，取决于意向的用途。可以使用常规技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可以通过常规技术有效去除可溶性聚集物和多聚体，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。这些色谱步骤后抗体的纯度可以超过99%。产物可以立即冷冻在-70℃，或可以冻干。

对人ELR+ CXC趋化因子的结合亲和力

使用Biacore 2000设备和Biacore 2000评价软件版本4.1用于表面等离子共振分析。使用制造商的EDC/NHS氨基偶联方法准备CM5芯片。简而言之，通过以10 μL/min注射EDC/NHS的1：1混合物7分钟活化所有4个流通池的表面。蛋白A在10mM醋酸盐，pH4.5缓冲液中稀释到100 μg/mL，并且通过以10 μL/min的流速注射7分钟固定化到所有4个流通池上以获得约10,000 RU。未反应的位点用乙醇胺以10 μL/min的流速注射7分钟进行封闭。使用以10 μL/min进行30秒的甘氨酸的两次注射（pH1.5）来去除任何非共价结合的蛋白。运行缓冲液是HBS-EP+。

抗体1或抗体2在运行缓冲液中稀释到2μg/mL，并且在流通池（Fc）中捕获大约400-600 RU。配体在运行缓冲液中稀释到从100μg/mL到50nM，并然后在运行缓冲液中两倍系列稀释到3.125nM。每种配体浓度的两次重复注射以100 μL/min进行150秒，随后是解离期。对于所有配体，解离期是1800秒。对于所有流通池通过以50μL/min注射10mM甘氨酸（pH1.5）进行60秒进行再生。参考消减的数据收集为Fc2-Fc1、Fc3-Fc1和Fc4-Fc1。在25℃获得测量。对于每种配体的结合-速率（k _on）和解离-速率（k _off）使用“1：1（质量转移）结合”结合模型进行评价。根据关系K_D = k _off/ k _on根据结合动力学计算亲和力（K_D）。

人ELR+ CXC趋化因子与抗体1和抗体2产生浓度依赖性结合应答。表1和表2总结了抗体1和抗体2的k _on 、k _off和K_D值。这些结果证实抗体1和抗体2以高亲和力结合所有7种人ELR+ CXC趋化因子。

表1 抗体1对人ELR+ CXC趋化因子的体外结合亲和力

表2 抗体2对人ELR+ CXC趋化因子的体外结合亲和力

物理稳定性评价

在抗体中蛋白聚集和自缔合是不希望的性质，因为其可以潜在地加剧不需要的效果，诸如触发免疫应答。因此，维持抗体在单体状态是高度希望的。百分比高分子量（%HMW）聚集物是蛋白聚集和自缔合的指示物。更高的%HMW聚集物指示增加的蛋白聚集/自缔合和增加的物理稳定性。抗体1和抗体2的物理稳定性如下确定。

抗体在4˚C对10 mM柠檬酸盐，pH 6 +/- 150 mM NaCl透析过夜。第二天早晨，将样品浓缩到50mg/mL，过滤通过0.2微米过滤器，并然后添加吐温-80至0.02%的终浓度。每个样品在 25℃孵育特定时间。通过分析型SEC使用直径30cmx0.78cm的TSK3000SWXL, 5微米柱追踪可溶性聚集物形成。流动相是50mM磷酸钠，pH7，175mM NaCl，以0.5mL/min的流速。样品以1µL注射施加，并且在280nm监测以确定增加的%HMW聚集物（表3）。

50 mg/mL制剂在25℃孵育1和4周以评价在压力条件下的长期稳定性。通过在1周或4周的时间点的%HMW，减去在时间0（在表3中称为“初始”）的%HMW聚集物来确定Δ%HMW聚集物。在1和4周后，抗体1和抗体2均展示Δ%HMW聚集物低于1%，从而展示良好的物理稳定性。

表3 %高分子量聚集物

对于抗体1的抗体表位作图

采取了多种方法来表征抗体1的表位，包括Western印迹分析、抗体与几种ELR+CXC趋化因子的共结晶以及对于结合和中和的突变分析。

Western印迹分析:

为了确定抗体1是否能够结合线性或构象表位，使用还原和非还原条件进行Western印迹分析。使用预制NuPAGE® 4-12% Bis-Tris凝胶进行蛋白电泳。将NuPAGE®MES SDS运行缓冲液添加到mini-cells的内（200mL）和外（至少600mL）室中。在具有或不具有NuPAGE® 10X样品还原剂的NuPAGE® LDS 4X样品缓冲液中制备人CXCL8的系列稀释（每条泳道400 ng、100 ng或25 ng）。样品在95℃加热2分钟。样品的上样体积是每个泳道10 µL，并且对于SeeBlue Plus2预染标准标记物是每个泳道5 µL。凝胶在室温下在200V运行35分钟。

使用具有iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose, Mini的iBlot® 干燥印迹系统将蛋白转移到PVDF上。膜在封闭缓冲液（在磷酸缓冲盐水中的3%脱脂奶）中在室温下封闭1小时。将抗体1添加到封闭溶液中达到1 µg/mL的终浓度，并且然后在室温下孵育2小时。初步孵育后，去除抗体/封闭溶液，并将膜在清洗缓冲液（磷酸缓冲盐水+0.05%吐温20）中15分钟清洗3次。然后将膜与HRP缀合的驴抗人Fc特异性IgG二抗（0.1 µg/mL在封闭液中）在室温下一起孵育1小时。去除二抗后，将膜用清洗缓冲液清洗4次，进行10分钟。然后将膜与稳定过氧化物溶液和鲁米诺/增强溶液（Super Signal West Pico ChemiluminescentSubstrate）的工作溶液一起孵育5分钟。将膜置于塑料膜保护器中在X射线胶片暗盒中与CL-X Posure™胶片一起30秒。使用Konica SRX-101系统使胶片显色。

在非还原条件下，在400ng的CXCL8浓度下，在约17kDa和约10kDa出现两条条带。在100ng的CXCL8浓度，在约10kDa出现一条条带。在25ng的CXCL8浓度，没有出现条带。在还原条件下，在任何测试浓度都没有出现条带。

结果证明抗体1能够结合非还原的变性的人CXCL8，但是不能结合还原变性的人CXCL8。因此，需要CXCL8中两个二硫键来维持抗体表位。这些结果证明了抗体1的构象表位。

晶体结构分析

获得了人CXCL8和食蟹猴CXCL2、CXCL3和CXCL7的Fab/抗原复合物的晶体结构，以确定抗体1的完整的结合表面。野生型截短的人CXCL8 1-66、人CXCL8点突变体和食蟹猴CXCL7均在大肠杆菌中表达具有N端His-SUMO标签。这些蛋白是重折叠的；标签被切除；并且所述蛋白通过标准纯化技术进行纯化。食蟹猴CXCL2和CXCL3在HEK293EBNA细胞中表达并且通过标准纯化技术纯化。通过胰蛋白酶消化和质量指纹图谱分析来证实二硫键形成，并且通过中性粒细胞的趋化性试验证实活性。抗体1的Fab在HEK293EBNA细胞中表达并且通过标准纯化技术纯化。通过向Fab添加略微摩尔过量的抗原来形成Fab/抗原复合物，然后进行大小排阻色谱纯化以去除过量的游离抗原。使复合物结晶，并使用Buster 2.9.5 (GlobalPhasing Ltd.)通过分子置换解析晶体结构。

这些晶体结构证实抗体1的表位包括ELR+ CXC趋化因子的N端，但它们也显示Fab与ELR+ CXC趋化因子的ß1- ß2环和ß2和ß3束之间的接触。晶体结构还展示抗体特异性识别ELR+ CXC趋化因子的折叠，因为晶体结构是重叠的。也观察到很多的氢键和范德华力相互作用。最值得注意的是，ELR基序的保守R6侧链位于由Fab重链在残基W33，Y102，和Y110，以及Fab轻链在残基W94形成的深结合口袋中。野生型截短的人CXCL8趋化因子还与Fab重链在残基E99和Fab轻链在N91主链羰基形成氢键。在野生型截短的人CXCL8趋化因子的L5主链羰基和Fab轻链W94主链酰胺之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的I10主链羰基和Fab重链S52侧链之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的K11侧链和Fab重链T30和S31侧链之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的H33侧链和Fab轻链W94主链羰基之间；A35主链酰胺和Fab重链N59侧链之间；以及野生型截短的人CXCL8趋化因子的C50主链酰胺和Fab重链Y104主链羰基之间，观察到其它氢键。此外，野生型截短的人CXCL8趋化因子的N-端残基5至13造成与Fab的很多接触，因为N端位于Fab重链CDR2和CDR3之间的沟里。此外，Fab重链CDR3环从此沟延伸并与野生型截短的人CXCL8趋化因子的ß2束上的非N端残基I40和ß3束上的残基Glu48、Leu49和Cys50相互作用。最后，野生型截短的人CXCL8趋化因子中的ß1-ß2环的残基33-36相对Fab重链CDR2包裹。

突变分析

在晶体结构中观察到抗体1Fab和野生型人CXCL8之间的几个关键接触，并且进一步通过结合动力学研究和人CXCL8点突变的U937-huCXCR2荧光成像板读板器（FLIPR）中和来进行测试。为了研究这些关键接触，基于人CXCL8序列（SEQ ID NO: 27）制造了几个点突变（R6A、I10A、A35P、I40A和L49A）。根据标准技术表达、重折叠和纯化野生型、R6A、I10A、A35P、I40A和L49A人CXCL8点突变体。通过胰蛋白酶消化和质量指纹图谱分析来证实二硫键形成，并且通过中性粒细胞的趋化性试验证实活性。

如上述，在Biacore 2000设备上用Biacore 2000评价软件版本4.1测试结合动力学。使用U937-huCXCR2测定来测试野生型和突变体人CXCL8的生物学活性和被抗体1的中和。U937-huCXCR2是用逆转录病毒转导的单核细胞细胞系用于表达人CXCR2。

CXCL8突变体在含有0.2%BSA的测定缓冲液中系列稀释在V形底96孔聚丙烯板的孔中。配体浓度是最终测定浓度（最终测定浓度范围从300至0.0051nM）的3倍。将细胞板和配体板加载到荧光成像板读板器（FLIPR-3, Molecular Devices）中，设定程序以转移50µL配体到细胞板的孔中。以1秒间隔记录荧光进行90秒。从图像10到90计算荧光变化（Δ相对荧光单位（DRFU），MaxRFU-MinRFU）。使用Graph Pad Prism，DRFU相对log（配体浓度）绘图，并且通过非线性回归确定EC₅₀值。在三个测定板上一式三份进行测定。

将抗体1系列稀释到包含0.2%BSA的测定缓冲液中。抗体浓度是最终测定浓度（最终测定浓度范围从10至0.0195 µg/ml）的3倍。在测定缓冲液+0.2%BSA中制备240nM（8nM的最终测定浓度的30X）的野生型人CXCL8和CXCL8突变体的贮存溶液。将20µL配体与180µL抗体1在V形底96孔聚丙烯板的孔中混合。配体和抗体在室温下孵育30分钟。将细胞板和配体-抗体板加载到荧光成像板读板器（FLIPR-3, Molecular Devices）中，设定程序以转移50µL配体-抗体到细胞板的孔中。以1秒间隔记录荧光进行90秒。根据图像10至90计算荧光（DRFU）变化。使用Graph Pad Prism，DRFU相对log（抗体浓度）绘图，并且通过非线性回归确定IC₅₀值。在三个测定板上一式三份进行测定。

结合动力学、生物学活性和中和结果总结在表4中。在25℃获得测量。对于每种配体的结合-速率（kon）和解离-速率（koff）使用“1：1（质量转移）结合”结合模型进行评价。根据关系KD = k_off/k_on根据结合动力学计算亲和力（KD）。

几个突变敲除了对受体的活性（EC₅₀）并且，因此，不能测试中和。值得注意的是，A35P突变完全消除了中和活性，尽管对于受体具有完全活性。这些结果突出了CXCL8抗原结合界面内的对抗体结合重要的关键接触（R6、I10、A35、I40和L49）。

表4 人CXCR8野生型和突变体的结合动力学、U937 FLIPR活性(EC₅₀)以及U937 FLIPR 中和 (IC₅₀)。

总体上，对于抗体1的表位作图分析证明了抗原的结合界面包括ELR+ CXC趋化因子（氨基酸5-13）、ß1-ß2环（氨基酸33-36）以及ß2和ß3束（氨基酸40，48-50）。在此界面内的对于抗体结合重要的关键接触包括CXCL8中的氨基酸R6、I10、A35、I40和L49(SEQ ID NO:27)。

中和测定

使用人CXCR2-转染的HMEC细胞的人ELR+ CXC趋化因子的体外中和

因为所有的ELR+ CXC趋化因子可以结合CXCR2受体，所以选择表达CXCR2的细胞用于体外研究。HMEC-huCXCR2是用逆转录病毒转导的永生化的人内皮细胞系用于表达人CXCR2受体。表达人CXCR2的HMEC细胞能够诱导对人、食蟹猴、大鼠和小鼠ELR+ CXC趋化因子应答的细胞内Ca²⁺内流。可以通过荧光成像板读板器（FLIPR）检测细胞内Ca²⁺内流。因此趋化因子中和还应该中和由这些趋化因子诱导的细胞内Ca²⁺内流。

HMEC-huCXCR2在37℃在5% CO₂中维持在补充有10%胎牛血清、2xGlutamax、1x非必需氨基酸、1 µg/mL氢化可的松、10 ng/mL人类表皮生长因子，和0.4 µg/mL嘌呤霉素的MCDB31培养基中。培养物维持在亚汇合密度（50-80%汇合）。细胞用TrypLE Express收获，在完全培养基中将细胞密度调整到3x10⁵ 细胞/mL，并且将100µL细胞悬浮物接种到黑色透明底测定板的孔中。细胞板在室温下孵育30分钟以允许细胞沉降到孔的底部，然后将板在37℃在5% CO₂中孵育过夜。对于每个测定板，一小瓶Fluo-4NW试剂的内容物悬浮在10mL测定缓冲液和100 µL丙磺舒中以制备1xFluo-4NW试剂。孵育后，吸干培养基并将100 µL1xFluo-4NW溶液加入到测定板的每个孔中。板在 37℃孵育30分钟，随后在室温孵育额外30分钟并避光。将抗体1系列稀释到包含0.2%BSA的测定缓冲液中。抗体浓度是最终测定浓度（最终测定浓度范围从10至0.0195 µg/mL）的3倍。在测定缓冲液+0.2%BSA中制备300nM（10nM的最终测定浓度的30X）的配体的贮存溶液。将20µL配体与180µL抗体在V形底96孔聚丙烯板的孔中混合。配体和抗体在室温下孵育30分钟。将细胞板和配体-抗体板加载到荧光成像板读板器（FLIPR-3, Molecular Devices）中，设定程序以转移50µL配体-抗体到细胞板的孔中。每秒记录荧光进行90秒。根据图像10至90计算荧光（DRFU）变化。使用Graph Pad Prism，DRFU相对log（抗体浓度）绘图，并且通过非线性回归确定IC₅₀值。在三个测定板上一式三份进行测定。数据表示为重复的平均值。

结果总结在表5中。这些结果证实抗体1能够中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子。IC₅₀ 值表示为µg/mL 抗体（标准偏差在括号中）。CXCL8的72氨基酸和77氨基酸形式均被使用。数据是2-5次重复的平均值。

表5：使用表达人CXCR2的HMEC细胞的体外FLIPR研究

使用原代人嗜中性粒细胞的人CXCL8的体外中和作用或CXCL1诱导的趋化性

选择使用人嗜中性粒细胞的趋化性测定来确定抗体在天然表达CXCR1和CXCR2两者的细胞中的中和活性。来自健康志愿者的外周血吸取到两个10mL肝素钠管中。为了分离嗜中性粒细胞，在4个15mL管中将5mL血液对5mLPolymorphprep分层。管以470xg在18℃离心30分钟。移除并丢弃血浆和顶部细胞带（单核细胞）。合并来自4管的第二条带（嗜中性粒细胞）并添加等体积的PBS。管以400xg在18℃离心10分钟。如先前用12mLPBS洗涤沉淀，并将沉淀用11mLHBSS/BSA（7.5 mg/mL BSA, HBSS）重悬。将60x10⁶个细胞悬浮在12mLHBSS/BSA 和5 µM CMFDA中并在37℃孵育30分钟。孵育后，离心管以沉淀细胞，用12mLHBSS/BSA洗涤一次，并然后将细胞重悬在12mLHBSS/BSA（5x10⁶ 细胞/mL）中。

使用HBSS/BSA将抗体1和同种型对照（人IgG4抗体）稀释到1495nM（稀释1）并然后用HBSS/BSA 1：5系列稀释。用HBSS/BSA将CXCL8稀释到20nM。用HBSS/BSA将CXCL1稀释到10.1nM。

70 µL抗体1或HBSS/BSA与70 µLCXCL8或CXCL1溶液混合并在室温孵育约30分钟。一式三份将30 µL混合物分散入 ChemoTx板的下层室的孔中。仅包含HBSS/BSA的孔（无趋化因子或抗体）将显示背景信号。ChemoTx滤器置于下层室上，并将50 µL（250000细胞）分散到每个孔上。将ChemoTx板在37℃，5% CO₂孵育3小时。孵育后，用PBS将细胞从顶表面润洗，并去除ChemoTx滤器。仅使用底部检测器读取485/535荧光（Wallac Victor³ 1420 计数器）。背景孔（仅HBSS/BSA）的平均荧光从测试孔荧光减去，并且在Excel中计算平均和标准偏差。

在5nM的CXCL8浓度，对于抗体1（MW 150,000 kDa）的IC₅₀是26.4 (±0.236) nM。在10nM的CXCL8浓度，对于抗体1的IC₅₀是43.7 (±0.086) nM。在5nM的CXCL1浓度，对于抗体1的IC₅₀是18.5 (±0.158) nM。在20nM的CXCL1浓度，对于抗体1的IC₅₀是40.3 (±0.112)nM。在CXCL1和CXCL8的所有测试浓度，同种型对照抗体没有影响趋化性。数据显示抗体1可以以剂量依赖性方式阻断人CXCL8或CXCL1的趋化活性，而趋化活性不受同种型对照抗体的影响。

小鼠中的体内急性DSS结肠炎模型

葡聚糖硫酸钠（DSS）是最常用的溃疡性结肠炎（UC）的模型。在该模型中，DSS是添加到饮用水中诱导模拟UC的急性疾病的化学刺激物。DSS结肠炎的急性期表征为嗜中性粒细胞招募到粘膜和粘膜下并增加ELR+ CXC趋化因子的表达。但是，对DSS的慢性暴露导致严重的肠道损伤和显著的体重丧失，其在结肠炎模型中是不合适的。为了适应此模型的急性性质，以预防性的方式使用抗体1来测试其抑制嗜中性粒细胞招募和发展结肠炎的能力。在此模型中值得注意的是，小鼠CXCL5（LIX）蛋白在结肠组织中显著增加（Kwon 2005）；但是抗体1不中和此小鼠细胞因子。

获得了C57BL/6小鼠，8–10周龄，重18–22 g。通过心脏穿刺收集血液并分析以建立基线。为了诱导结肠炎，小鼠在饮用水中接受2.5%DSS（MW=36,000-50,000）进行5天（第1-5天），随后是6天的无DSS水（反映急性炎症）。对照健康小鼠仅接受水（“无DSS”组）。在第0、2、4和8天，接受DSS的小鼠用人IgG4对照抗体（25 mg/kg）或抗体1（25 mg/kg）通过皮下注射给药。每天记录体重。对于每种治疗使用的小鼠的数目是9（除了在健康的“无DSS”组中使用5只健康小鼠之外）。一式四份进行该研究。

如表6所示，接受人IgG4对照抗体的DSS小鼠在第5天和第8天之间显著丧失体重。在诱导结肠炎之前和疾病的急性期期间接受抗体1的DSS小鼠显示在第5天和第8天之间相比那些用人IgG4对照抗体治疗的DSS小鼠更少的体重丧失（在第8天，对于抗体1为94.0%的初始体重相比对于IgG4对照为85.3%的初始体重）。这些结果证明，抗体1的全身施用有效缓解DSS诱导的结肠炎中的体重丧失，支持如下结论，即抗体1中和某些小鼠ELR+ CXC趋化因子的活性并降低结肠的嗜中性粒细胞的招募。

表6

在786-O透明细胞肾细胞异种移植物模型中的体内中和作用

786-O肾细胞癌(RCC)细胞与matrigel1：1混合并皮下植入到无胸腺的雌性裸鼠右后侧，以每次注射3.0 × 10⁶细胞。具有达到100 mm³肿瘤体积的786-O异种移植物负荷小鼠在连续给药方案下喂饲10 mg/kg舒尼替尼，每天两次，直至即使在舒尼替尼治疗下的小鼠也像对照治疗小鼠（IgG4和10%媒介物）一样开始发展肿瘤生长。舒尼替尼治疗下发展肿瘤生长的小鼠随机分入2组。一组接受10 mg/kg舒尼替尼，每天两次加20 mg/kg的对照IgG4抗体，每周一次。另一组接受10 mg/kg舒尼替尼，每天两次加20 mg/kg的抗体1，每周一次。平均肿瘤体积（标准偏差在括号中）显示在表7中。将抗体1添加到舒尼替尼随时间显著减少肿瘤生长（p<0.0001），指示抗体1使透明细胞RCC肿瘤对舒尼替尼治疗重新敏感。

表7

在SKOV3-Luc卵巢癌异种移植物模型中的体内中和作用

SKOV3-Luc是表达萤火虫荧光素酶基因的人卵巢癌细胞系。SKOV3-Luc细胞经常用于体内以建立人卵巢腺癌肿瘤生长。

SKOV3-Luc卵巢癌细胞与matrigel1：1混合并皮下植入到无胸腺的雌性裸鼠右后侧，以每次注射3.0 × 10⁶细胞。当异种移植物生长到200 mm³平均肿瘤体积后，在基线时根据肿瘤体积将小鼠随机分到4组中。通过腹膜内注射，使小鼠接受对照IgG4抗体（2.5 mg/kg，每周一次）、顺铂（2.5 mg/kg，每周一次）、抗体1（20 mg/kg，每周一次）或顺铂（2.5 mg/kg，每周一次）和抗体1（20 mg/kg，每周一次）的组合。肿瘤生长显示在表8中。相比同种型对照，顺铂单一治疗没有显示统计学显著性的肿瘤生长抑制。但是，相比同种型对照和顺铂单一治疗，顺铂和抗体1的组合显示统计学显著性的肿瘤生长抑制（p≤0.001），指示在SKOV3-Luc卵巢癌异种移植物模型中，抗体1协同增强化疗。

表8

序列

抗体1 重链氨基酸序列：SEQ ID NO: 1

抗体1 重链可变区：SEQ ID NO: 2

抗体1 轻链氨基酸序列：SEQ ID NO: 3

抗体1 轻链可变区：SEQ ID NO: 4

抗体1 重链DNA序列：SEQ ID NO: 5

抗体1 轻链DNA序列：SEQ ID NO: 6

抗体1/抗体2 LCDR1：SEQ ID NO: 7

抗体1/抗体2 LCDR2：SEQ ID NO: 8

抗体1/抗体2 LCDR3：SEQ ID NO: 9

抗体1/抗体2 HCDR1：SEQ ID NO: 10

抗体1/抗体2 HCDR2：SEQ ID NO: 11

抗体1 HCDR3：SEQ ID NO: 12

抗体2 重链氨基酸序列：SEQ ID NO: 13

抗体2 重链可变区：SEQ ID NO: 14

抗体2 轻链氨基酸序列：SEQ ID NO: 15

抗体2 轻链可变区：SEQ ID NO: 16

抗体2 重链DNA序列：SEQ ID NO: 17

抗体2 轻链DNA序列：SEQ ID NO: 18

抗体2 HCDR3：SEQ ID NO: 19

HCDR3共有序列：SEQ ID NO: 20

其中Xaa是E或Q

人Gro-α（CXCL1）：SEQ ID NO：21

人Gro-β（CXCL2）：SEQ ID NO：22

人Gro-γ（CXCL3）：SEQ ID NO：23

人ENA-78 (CXCL5): SEQ ID NO: 24

人GCP-2 (CXCL6): SEQ ID NO: 25

人NAP-2 (CXCL7): SEQ ID NO: 26

人IL-8 (CXCL8): SEQ ID NO: 27

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> pan-ELR+ CXC 趋化因子抗体

<130> X19897

<150> 61/792800

<151> 2013-03-15

<150> PCT/US2014/020605

<151> 2014-03-05

<160> 27

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Gly

100 105 110

Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly

450

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Gly

100 105 110

Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Ser Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn Asn Glu Trp Pro Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Ser Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn Asn Glu Trp Pro Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

caggtgcagc tggtgcagtc tggtgctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg catctggcta cgagttcacc agctactgga ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat atttctccta atagtggtag tgctaactac 180

aatgagaagt tcaagagcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagggc 300

ccttacagtt attatccgag tagggagtac tatggctctg acctctgggg gcaagggacc 360

ctagtcacag tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttcccgct agcgccctgc 420

tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc ccatgcccac cctgcccagc acctgagttc 720

ctggggggac catcagtctt cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 840

ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag 1260

agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacac agaagagcct ctccctgtct ctgggt 1356

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca aagtatcagc aataacctac actggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctattat acttcccggt ccgtctctgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtggacag aataacgagt ggcctgaggt gttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

Tyr Thr Ser Arg Ser Val Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Gly Gln Asn Asn Glu Trp Pro Glu Val

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

Gly Tyr Glu Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 11

Asn Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 12

Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Gly Ser Asp

1 5 10 15

Leu

<210> 13

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Gln Tyr Tyr Gly

100 105 110

Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly

450

<210> 14

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Gln Tyr Tyr Gly

100 105 110

Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Ser Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn Asn Glu Trp Pro Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Ser Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn Asn Glu Trp Pro Glu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 17

caggtgcagc tggtgcagtc tggtgctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg catctggcta cgagttcacc agctactgga ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat atttctccta atagtggtag tgctaactac 180

aatgagaagt tcaagagcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagggc 300

ccttacagtt attatccgag taggcagtac tatggctctg acctctgggg gcaagggacc 360

ctagtcacag tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttcccgct agcgccctgc 420

tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc ccatgcccac cctgcccagc acctgagttc 720

ctggggggac catcagtctt cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 840

ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag 1260

agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacac agaagagcct ctccctgtct ctgggt 1356

<210> 18

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 18

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca aagtatcagc aataacctac actggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctattat acttcccggt ccgtctctgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtggacag aataacgagt ggcctgaggt gttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 19

Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Asp

1 5 10 15

Leu

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa 位置 11 是 Glu 或 Gln

<400> 20

Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Arg Xaa Tyr Tyr Gly Ser Asp

1 5 10 15

Leu

<210> 21

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

65 70

<210> 22

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn

65 70

<210> 23

<211> 73

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn

65 70

<210> 24

<211> 74

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Cys Val Cys Leu Gln Thr Thr Gln

1 5 10 15

Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser Asn Leu Gln Val Phe Ala Ile Gly

20 25 30

Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys

35 40 45

Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys Val Ile Gln

50 55 60

Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys Glu Asn

65 70

<210> 25

<211> 75

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg Val Thr

1 5 10 15

Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe Pro Ala

20 25 30

Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly

35 40 45

Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys Val Ile

50 55 60

Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn

65 70 75

<210> 26

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro

1 5 10 15

Lys Asn Ile Gln Ser Leu Glu Val Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn

20 25 30

Gln Val Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu

35 40 45

Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala

50 55 60

Gly Asp Glu Ser Ala Asp

65 70

<210> 27

<211> 72

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro

1 5 10 15

Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro

20 25 30

His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys

50 55 60

Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser

65 70

Claims

1.结合人生长调节的癌基因-α Gro-α、人Gro-β、人Gro-γ、人表皮中性粒细胞活化肽-78、人粒细胞趋化蛋白-2、人中性粒细胞活化蛋白-2和人白介素-8的抗体在制备用于治疗斑块状牛皮癣的药物中的用途，其中所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2、LCDR3且所述HCVR包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1是RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7)，LCDR2是YTSRSVS (SEQ ID NO: 8)，LCDR3是GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9)，HCDR1是GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10)，HCDR2是NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11)，且HCDR3是EGPYSYYPSREYYGSDL (SEQ ID NO: 12)。

2.权利要求1的用途，其中所述HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2，且所述LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 4。

3.权利要求1的用途，其中所述重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1，且所述轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 3。

4.权利要求1的用途，其中所述抗体包含两条具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的轻链。

5.抗体在制备用于治疗掌跖脓疱病的药物中的用途，其中所述抗体结合人生长调节的癌基因-α Gro-α、人Gro-β、人Gro-γ、人表皮中性粒细胞活化肽-78、人粒细胞趋化蛋白-2、人中性粒细胞活化蛋白-2和人白介素-8，其中所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含轻链互补决定区(LCDR) LCDR1、LCDR2、LCDR3且所述HCVR包含重链互补决定区(HCDR) HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1是RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7)，LCDR2是YTSRSVS (SEQ ID NO: 8)，LCDR3是GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9)，HCDR1是GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10)，HCDR2是NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11)，且HCDR3是EGPYSYYPSREYYGSDL (SEQ ID NO: 12)。

6.权利要求5的用途，其中所述HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2，且所述LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 4。

7.权利要求5的用途，其中所述重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1，且所述轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 3。

8.权利要求5的用途，其中所述抗体包含两条具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的轻链。