CN108175769A

CN108175769A - 土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用

Info

Publication number: CN108175769A
Application number: CN201711399633.4A
Authority: CN
Inventors: 刘梅; 刘振州; 孙胜楠
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-06-19

Abstract

本发明公开了土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，相对于现有技术，本发明提供了土贝母苷甲治疗类风湿性关节炎的新用途，土贝母苷甲能够抑制RA滑膜细胞的过度激活，并且在体内可以对滑膜炎症和骨破坏施加治疗保护，表明土贝母苷甲治疗类风湿性关节炎效果显著。

Description

土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及土贝母苷甲的新应用，特别涉及土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以关节慢性炎症、滑膜组织增生和软骨、骨的侵蚀性破坏为主要表现的全身性疾病，具有较高的发病率和致残率。位于关节中的滑膜成纤维细胞(FLS)通过局部产生细胞因子来降解细胞外基质，其中软骨的蛋白水解酶起关键作用。与来自健康个体的FLS不同，来源于RA滑膜的FLS获得了在转化细胞中常观察到的表型特征，例如非依赖性锚定生长，对细胞凋亡不敏感以及增加的增殖和侵袭。已经证明FLS的过度激活与RA及其动物模型中的影像学和组织学损伤密切相关。此外，活化的RA-FLS即使在炎症减轻的情况下也能够破坏软骨和骨骼(Lange等人，2005)。众所周知，这种对骨和软骨的侵蚀性破坏与疾病的严重程度以及残疾、畸形和预期寿命缩短的风险增加有关。因此，抑制RA滑膜细胞的过度激活可有效控制RA的病情发展。

目前临床上常用的治疗药物包括非甾体类抗炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、糖皮质激素、缓解病情的抗风湿药物(disease-modifyinganti-rheumatic drugs，DMARDs)和生物制剂。现已证明，NSAIDs和糖皮质激素虽然能减少炎症，但不能阻止骨破坏的进展；DMARDs和生物制剂虽然能延缓骨破坏的程度，但长期摄入这些药物会引起严重的感染甚至会患恶性肿瘤，而且生物制剂价格昂贵，给病人带来沉重的经济负担。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题，本发明目的在于提供了土贝母苷甲(TBMS I)在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

技术方案：本发明提供了土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

所述类风湿性关节炎为包含滑膜炎症的类风湿性关节炎。

所述类风湿性关节炎为包含骨破坏的类风湿性关节炎。

所述药物是以所述土贝母苷甲作为单一成分所制成的药物。

或者，所述药物是以所述土贝母苷甲作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

所述药物选自注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液，但不限于上述剂型。

本发明所述土贝母苷甲在治疗类风湿性关节炎时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗类风湿性关节炎的目的。

本发明在制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料(即药学上可接受的辅料)，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的制剂，例如可以是注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂等。

本发明通过设计体内外实验检测土贝母苷甲对RA的治疗作用。体外实验：检测土贝母苷甲对RA滑膜细胞过度激活的抑制影响(包括抑制RA滑膜细胞的增殖、迁移和炎性因子的表达等)；体内实验：检测土贝母苷甲对胶原诱导的RA大鼠的治疗作用。结果表明，土贝母苷甲对于治疗类风湿性关节炎，效果显著。

技术效果：相对于现有技术，本发明提供了土贝母苷甲治疗类风湿性关节炎的新用途，土贝母苷甲能够抑制RA滑膜细胞的过度激活，并且在体内可以对滑膜炎症和骨破坏施加治疗保护，表明土贝母苷甲治疗类风湿性关节炎效果显著。

附图说明

图1：(A)TBMSI的化学结构式(B)CIA造模和药物处理过流程图：雌性Wistar大鼠分别在第0天和第7天免疫。建立关节炎模型(临床评分≥2)后，将CIA大鼠随机分组，腹腔注射不同浓度的TBMS I(低剂量，1mg·kg^-1·day^-1；中剂量，5mg·kg^-1·day^-1；高剂量，10mg·kg^-1·day^-1)或PBS，持续14天。实验结束时，杀死大鼠并收集组织用于进一步检测。

图2：TBMS I治疗显著阻断CIA的进展：给药处理第14天CIA大鼠后爪的代表照片；健康对照组n＝6，和不同剂量的TBMS I处理组，n＝8。

图3：TBMS I治疗显著阻断CIA的进展：给药处理第14天CIA大鼠关节炎评分；健康对照组n＝6，和不同剂量的TBMS I处理组，n＝8。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与CIA单纯造模组相比较。

图4：TBMS I治疗显著阻断CIA的进展：给药处理第14天CIA大鼠足爪肿胀情况；健康对照组n＝6，和不同剂量的TBMS I处理组，n＝8。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与CIA单纯造模组相比较。

图5：TBMS I治疗显著阻断CIA的进展：给药处理第14天CIA大鼠后爪的影像学代表性图片及影像学评分；健康对照组n＝6，和不同剂量的TBMS I处理组，n＝8。*P<0.05，**P<0.01，与CIA单纯造模组相比较。

图6：TBMS I对CIA大鼠病理变化的影响：来自不同组的大鼠踝关节HE染色代表性图片；B，骨；C，软骨；J，关节腔；P，血管翳；S，滑膜。

图7：TBMS I对CIA大鼠病理变化的影响：来自不同组的大鼠踝关节HE切片进行病理学评分；*P<0.05，**P<0.01，与CIA对照组相比较，每组n＝6-8。

图8：TBMS I治疗显著抑制CIA大鼠中细胞因子的产生：(A)关节匀浆和(B)血清中的细胞因子。^###P<0.001，与健康大鼠比较；与对照组处理的CIA大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每组n＝6-8。

图9：TBMS I抑制TNFα诱导的关节炎滑膜细胞的增殖和迁移：(A)使用免疫荧光，通过VCAM-1表达(DAPI染色核)鉴定CIA大鼠关节FLS。(B)MTT检测TBMS I孵育48小时后的大鼠滑膜细胞存活曲线。

图10：TBMS I抑制TNFα诱导的关节炎滑膜细胞的增殖和迁移：(A，B)通过EdU掺入法测定TBMS I(1μm)对TNFα诱导的大鼠滑膜细胞增殖的抑制作用。^##P<0.01，与TNFα未处理的，TBMS I未处理的对照组比较；*P<0.05，与TNFα处理的，TBMS I未处理的细胞比较。

图11：TBMS I抑制TNFα诱导的关节炎滑膜细胞的增殖和迁移：(A，B)TBMS I抑制TNFα诱导的FLS迁移。血清饥饿细胞用TBMS I预处理1小时，然后用TNFα刺激24小时。通过划痕实验来测量细胞迁移。*P<0.05，***P<0.001，与TNFα处理的，TBMS I未处理的细胞比较。

图12：TBMS I抑制TNFα诱导的关节炎滑膜细胞的凋亡：(A，B)通过流式细胞术检测大鼠FLS细胞凋亡。不同TBMS I浓度处理细胞24小时，膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)染色确定每个群体中凋亡细胞的百分比。*P<0.05，与TBMS I未处理的细胞相比较。数据表示为三个独立制备的样品的平均值±SD。

图13：TBMS I治疗显著抑制TNFα诱导的关节炎大鼠FLS中细胞因子的产生：用不同浓度的TBMS I处理关节炎大鼠FLS细胞1h，然后与TNFα(50ng·mL^-1)孵育24h。实时荧光定量PCR检测细胞因子的表达，包括IL-1β，IL-6，IL-8，TNFα和MMP-9。β-肌动蛋白编码基因的表达为内参。^###P<0.001，与TNFα未处理的，TBMS I未处理的对照相比较；的相对表达并表示为相对于未经的倍数变化。*P<0.05，***P<0.001，与TNFα处理的，TBMS I未处理的细胞相比较。n＝3。

图14：TBMS I抑制TNFα诱导的MAPK(p38和JNK)和NF-κB的激活：(A，C)用TBMS I(1μM)预处理FLS细胞1小时，TNFα(50ng·mL^-1)刺激不同时间。使用针对p-ERK 1/2，总ERK 1/2，p-p38，总p38，p-JNK，总JNK，p-IκBα，IκBα和GAPDH的特异性抗体对细胞进行蛋白质印迹。(B，D)通过光密度分析确定相对表达。使用ImageJ确定p-IκBα和IκBα条带相对于GAPDH条带的密度和每个磷酸化的MAPK条带相对于其总蛋白对应物的比率。n＝3，*P<0.05，相对于TNFα处理，TBMS I未处理组。

具体实施方式

下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

一、实验耗材

土贝母苷甲I(TBMS I，纯度≥98％)从成都曼斯特生物科技有限公司(成都，四川)购入(图1A)。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Gibco(Gibco BRL，Grand Island，NY)。重组肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Peprotech(PeproTech，Inc.，RockyHill，NJ)。MTS试剂获自Sigma(Sigma-Aldrich)。靶向磷酸化的(p)ERK，p-p38，p-JNK，ERK，p38，JNK，IκBα和GAPDH的抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas，CA，USA)。抗-p-IκBα抗体购自CST(Cell Signaling Technology，Inc.，USA)。TNFα和IL-1βELISA试剂盒购自CUSABIO BIOTECH CO.，Ltd(中国武汉)。鸡II型胶原蛋白(CII)购自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO，USA)。

二、实验方法

1、CIA大鼠模型的建立和TBMS I药物处理

从上海斯莱克实验动物有限公司(中国上海)购买38只雌性Wistar大鼠(160-180g)。将大鼠置于SPF条件下(22℃，12小时光照/12小时黑暗，50-55％湿度)饲养，大鼠自由饮水和取食。1周适应期后，将大鼠用10％水合氯醛(3.0mL·kg^-1体重)麻醉，每只大鼠皮内注射1mg鸡II型胶原(溶解于完全弗氏佐剂)。七天后，给大鼠皮下加强注射0.5mg鸡II型胶原(溶解于不完全弗氏佐剂)。对照大鼠以相同的方式注射生理盐水(n＝6)。将CIA大鼠(关节炎指数评分≥2)随机分为模型组和三个TBMS I治疗组(每组8只)。TBMS I治疗组腹腔注射不同剂量的TBMS I(低剂量1mg·kg^-1·day^-1；中剂量5mg·kg^-1·day^-1；高剂量10mg·kg^-1·day^-1)，模型组每天注射0.9％生理盐水，治疗时间为14天。自第一次免疫接种后的第9天开始，每天用0～4分的评分系统进行临床关节炎指数学评分，评分标准为：0分：足爪无肿胀和红斑；1分：有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节部位中度肿胀；3分：严重肿胀；4分：严重肿胀且不能负重。每只动物的得分介于0和最大值16之间。另外，用足爪测量仪(YLS-7A，山东省医学科学院设施站)测量爪肿胀。评分和爪体积测量由两位独立的观察员进行。治疗14天后，收集血清用于细胞因子分析，收集关节组织用于影像学、组织学和促炎因子检测的评估。所有动物实验均经南京师范大学实验委员会批准。

2、影像学评估

使用FX小动物活体成像系统在X射线下成像大鼠后爪。使用影像学评分进行分析。总分由每只大鼠的两只后爪的总和计算，最大值为6。影像学评分者对大鼠分组情况不清楚。

3、组织病理学评估

影像学评估后，将左踝关节固定在4％PFA(Sigma-Aldrich)中，在12％二钠EDTA中脱钙并包埋在石蜡中。切片(4μm)并用苏木精和伊红(H&E)染色，并记录炎症、滑膜增殖、血管翳形成、软骨损伤和骨侵蚀的变化，如前所述。组织病理学分析由独立的观察者以盲法进行评估。

4、CIA大鼠的细胞因子水平

收集血液，离心并将上清液保存在-80度直到开始分析。将大鼠右爪进行组织匀浆。根据说明书步骤，通过特异性ELISA试剂盒测量关节中的TNFα和IL-1β含量。使用市售的特异性放射免疫测定试剂盒(Sino-UK Institute of Biological Technology,Beijing,China).测定血清中TNFα和IL-1β含量。

5、CIA大鼠FLS的培养和鉴定

通过酶消化法从CIA大鼠膝关节滑膜组织中分离出FLS细胞。简而言之，将滑膜切成小块，并在37℃下用0.4％胶原酶(Sigma-Aldrich)在DMEM培养基中温育2小时。然后，更换培养基并用0.25％胰蛋白酶连续孵育细胞30分钟。随后将细胞重复洗涤并在含有10％FBS、100单位·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素的DMEM中在5％CO₂培养箱中培养过夜。洗去非贴壁细胞，并在相同培养基中培养贴壁细胞。利用免疫荧光技术，通过形态学和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达来鉴定这些细胞是否为FLS。大部分培养的细胞在传代2次后包含同质的FLS群体。用于实验的细胞处于第三至第九代。

6、细胞活力测定

用MTS测定法检测TBMS I对大鼠FLS活力的影响。将大鼠FLS细胞用梯度稀释的TBMS I(0～80μM)处理48小时，然后根据说明书步骤加入MTS/PMS混合物再孵育4小时。在分光光度计(Model 680，BioRAD)和GraphPad Prism(version 5.0c；San Diego,CA,USA)中测量490nm处吸光度的变化以计算半数最大致死浓度(IC₅₀)。

7、TNF-α诱导的FLS增殖

通过使用EdU掺入法测量DNA合成来分析细胞增殖。用TBMS I(1μM)预处理类大鼠FLS细胞6小时，然后在培养基中选择性加入TNFα(50ng·mL^-1)再培养16小时。在实验结束前6小时，向每个孔中加入10μM EdU(Sigma-Aldrich)，根据说明书步骤测量EdU在新合成的DNA中的掺入量。将细胞核用Hoechst 33342复染。细胞增殖率计算为每孔5个高倍视野中掺入EdU的有核细胞的比例。

8、细胞迁移能力测试

划痕实验用于分析TBMS I对FLS迁移率的影响。将FLS铺于24孔板中，待70-80％汇合度时，血清饥饿(0.1％FBS/DMEM)过夜。使用无菌200mL移液管尖端(设定为0h)划出线性划痕，然后用PBS洗涤三次以除去未附着的细胞。加药组和对照组一起温育1小时，然后将TNF-α(50ng·mL^-1)加入孔中进行刺激。通过显微镜观察，在0h将划痕的每个区域底部创建一个参考点，刺激24h后立即在同一参考点处对无细胞区域进行拍摄和测量，分析计算细胞迁移率。

9、流式细胞术检测细胞凋亡

使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(e-Bioscience，San Diego，CA)按照说明书的步骤进行细胞凋亡测定。将大鼠FLS细胞置于不同浓度(0、1、2.5、5和10μM)的TBMS I中处理24小时。然后将细胞悬浮于缓冲液中并用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)溶液染色。流式细胞分析用FACScan(Becton Dickinson)和CellQuest程序进行，并表示为每个群体中凋亡细胞的百分比。

10、实时荧光定量PCR检测

使用实时荧光定量PCR来检测TNF-α诱导的大鼠FLS中细胞因子的表达水平。将细胞置于12孔板中培养过夜，然后在指定浓度的TBMS I(0、0.5、1、2.5μm)作用下预处理1小时，再用TNF-α(50ng·mL^-1)温育24小时，使用TRIzol试剂(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)提取总RNA，并按照说明书进行cDNA合成。

实时荧光定量PCR主要引物序列：

IL-1β，5′-GCTGTGGCAGCTACCTATGTCTTG-3′(forward),(SEQ ID No：1)

5′-AGGTCGTCATCATCCCACGAG-3′(reverse)；(SEQ ID No：2)

IL-6,5'-CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3'(forward),(SEQ ID No：3)

5'-GTGCATCATCGCTGTTCATACAATC-3'(reverse)；(SEQ ID No：4)

IL-8,5'-CATTAATATTTAACGATGTGGATGCG TTTCA-3'(forward),(SEQ ID No：5)

5'-GCCTACCATCTTTAAACTGCACAAT-3'(reverse)；(SEQ ID No：6)

TNFα,5′-ATACACTGGCCCGAGGCAAC-3′(forward),(SEQ ID No：7)

5′-CCACATCTCGGATCATGCTTTC-3′(reverse)；(SEQ ID No：8)

MMP-9,5'-GGACGATGCCTGCAACGT-3'(forward),(SEQ ID No：9)

5'-CAAATACAGCTGGTTCCCAATCT-3'(reverse)；(SEQ ID No：10)

β-actin,5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'(forward),(SEQ ID No：11)

5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'(reverse).(SEQ ID No：12)

RT-PCR实验严格按照2×Pfu PCR MasterMix说明书进行。按照体系将所需模板、引物、酶和无RNA酶水加入200μl的PCR管中，在PCR仪中进行扩增。每个实验用三个平行并重复三次。β-actin的表达为内参。

11、蛋白免疫印迹分析

将FLS以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，再分别用土贝母苷甲和TNFα(50ng·mL^-1)处理不同的时间。将细胞置于放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液(50mM TriseHCl，150mMNaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100,1mM氟化钠，1mM钒酸钠，1％脱氧胆酸盐和蛋白酶抑制剂)中，在12000×g下离心10分钟，收集上清液中的蛋白质。然后进行SDS-PAGE电泳，再将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用5％牛血清蛋白封闭。用针对p-p38、p-ERK、p-JNK、p-IκB、p38、ERK1/2、-JNK，IκB和GAPDH的抗体探测印迹。然后用增强化学发光(ECL)试剂(Amersham)显影。最后用Image J软件分析每条带的强度。

三、统计分析

所有数据用三个或更多个实验获得的均数±标准差。统计分析使用非配对双尾t检验进行，P<0.05被认为有统计学意义。

四、实验结果

1、土贝母苷甲抑制CIA大鼠滑膜炎症和骨质破坏

为研究TBMS I对CIA动物模型的影响，选择明显发生关节炎(临床评分≥2)的大鼠，腹腔注射不同浓度的TBMS I(低剂量：1mg·kg^-1·d^-1；中剂量：5mg·kg^-1·d^-1；高剂量：10mg·kg^-1·d^-1)或0.9％生理盐水，每天一次，持续14天。如图2和图3所示，足爪外观形态(红斑或肿胀)证实TBMS I以剂量依赖性显著阻断CIA大鼠的发生和进展。与临床关节炎评分一致，CIA大鼠足爪肿胀的测量也显示TBMS I治疗是有效的(图4)。与无明显治疗作用的1mg·kg^-1的TBMS I剂量相比，5mg·kg^-1剂量显著降低CIA大鼠的关节炎症状，明显减轻关节炎的严重程度。高剂量10mg·kg^-1的TBMS I治疗几乎完全抑制CIA的进展和发展，在CIA动物治疗中显示出巨大的治疗潜力(图2-4)。

随后，用影像学方法研究了TBMS I对CIA大鼠关节破坏的影响。在X射线成像条件下，无关节炎大鼠呈现正常的关节结构和关节间隙。没有药物治疗的CIA大鼠表现出RA的典型变化，观察到明显的骨侵蚀、关节破坏、关节移位和关节间隙变窄(图5)。然而，影像学检测评分显示TBMS I处理后的大鼠中关节的破坏程度被剂量依赖性减轻(图5)，表明其除了在临床评分和足爪肿胀评分中所呈现的抗炎症效果外，TBMS I还可以发挥抗骨破坏作用。

为了进一步评估TBMS I对发展中的关节炎的影响，通过半定量分级量表进行组织病理学评估。结果显示，未加药物治疗的CIA大鼠的踝关节中，RA的病理学特征明显，包括炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀。TBMS I处理后可剂量依赖性地抑制上述结构变化(图6和图7)，进一步证明了TBMS I对RA的治疗作用。

2、TBMS I处理可显著抑制CIA大鼠中炎性细胞因子的产生

众所周知，促炎性因子在RA的发病过程中起关键作用。因此，收集了CIA大鼠关节组织和血清以测量TNFα和IL-1β的含量。与未加药物处理的CIA大鼠相比，TBMS I处理的大鼠关节组织中TNFα和IL-1β的含量显著降低(图8A)。与组织ELISA数据一致，用TBMS I处理对血清中TNFα和IL-1β的水平存在显著的抑制作用(图8B)，表明TBMS I可通过下调炎性因子的合成来抑制关节炎的进程。

3、TBMS I可抑制TNFα诱导的关节炎大鼠FLS的增殖和迁移

为进一步研究TBMS I对类风湿性关节炎的治疗作用，首先从CIA大鼠膝关节中分离、培养和鉴定滑膜成纤维细胞。如图9A所示，培养的细胞呈梭形，与成纤维细胞形态学特征一致。此外，由免疫荧光实验(图9A)证实，VCAM-1呈阳性表达，培养的细胞与FLS的内膜亚群相一致。

接下来用MTS检测了TBMS I对大鼠FLS的潜在细胞毒性作用。如图9B所示，用不同浓度的TBMS I处理FLS48小时以上，结果显示IC50为14.83μM。因此，在接下来的实验中TBMSI的浓度不超过10μM。为了进一步研究TBMS I对FLS增殖的影响，申请人进行了EdU实验。如图10A和图10B所示，单独用TNFα处理24小时显著增加细胞增殖潜力，1μmTBMS I显著抑制TNFα诱导的FLS增殖。

为了研究TBMS I对FLS细胞迁移的影响，用不同剂量的TBMS I处理FLS细胞，经TNFα刺激后进行划痕实验。如图11A和11B所示，当剂量大于1μM时，TBMS I显著降低细胞迁移面积。在用5μMTBMS I处理后，划痕区域中仅发现约40％的FLS数量，表明TBMS I对FLS迁移潜力具有剂量依赖性抑制作用。

已有研究证实TBMS I可在几种癌细胞中诱导细胞凋亡，因此本发明研究了TBMS I在FLS中的细胞凋亡诱导作用。如图12A和12B所示，在较高剂量(10μM)下，膜联蛋白V阳性细胞的数量增加。然而，与对照细胞相比，用量少于5μM(其显著抑制增殖和迁移)的处理不增加膜联蛋白V阳性FLS的数目，这表明TBMS I在较低浓度下不诱导细胞凋亡。

4、TBMS I在培养的FLS中抑制TNFα诱导的促炎因子产生

本发明已经证明TBMS I可以减少CIA大鼠中TNFα和IL-1β的产生。为了进一步研究TBMS I在RA中的抗炎效果，将FLS细胞与不同浓度的TBMS I一起温育，然后用TNFα刺激24小时以模拟RA患者中的滑液流体环境。如图13所示，TNFα刺激显著增加包括IL-1β，IL-6，IL-8，TNFα和MMP-9等细胞因子的mRNA转录水平。然而，用TBMS I处理则显著抑制上述炎性细胞因子的表达，并下调MMP-9的产生，该基因被认为是与软骨退化和骨侵蚀有关的关键基因。

5、TBMS I抑制TNFα诱导的MAPK和NF-κB的激活

为了探索TBMS I抑制细胞因子产生并进一步减弱RA进展的潜在机制，通过免疫印迹分析了TNFα诱导的MAPK信号传导途径。和预期的一样，经过5分钟TNFα刺激，使包括细胞外信号调节激酶(ERK)，C-Jun N-末端激酶(JNK)和p38激酶在内的三个MAPK家族成员磷酸化水平升高。相比之下，用TNFα和TBMS I共同处理FLS显著减弱了TNFα诱导的JNK和p38的磷酸化(图14A，B)，而TBMS I对TNFα诱导的ERK激活具有增加的作用(图14A，B)。此外，检测到了NF-κB的激活，这证明NF-κB在RA的发展和进展中起关键作用。如图14C和14D所示，对照组TNF-α刺激的NF-κB抑制亚基IκBα磷酸化，而TBMS I处理抑制了磷酸化并降解了IκBα。

五、结论

近几十年来，TBMS I的主要药理学发现是证明其有效的抗癌活性。本发明发现TBMS I具有新的药理作用，即通过抗炎和抑制骨破坏有效抑制RA的发生发展。

众所周知，炎性因子通过促进自身免疫，慢性炎症和组织损伤而参与RA发病的各个阶段(Mcinnes等，2007)。因此，减少炎症反应和维持关节活动性是RA治疗的主要目的。在本发明中，TBMS I可以通过抑制炎症反应来有效减轻RA的严重程度。首先，TBMS I抑制CIA大鼠的局部和全身水平的促炎性因子；其次TBMS I在培养的FLS细胞中抑制了IL-1β，IL-6，IL-8和TNFα等细胞因子的产生；最后，TBMS I在临床和组织病理学水平降低了CIA大鼠的炎症反应。RA中TBMS I的这种抗炎作用可归因于其抑制一系列炎性细胞因子合成的能力。

除了抗炎症之外，TBMS I还被证明可以抑制CIA大鼠的关节破坏。影像学和组织病理学评估显示TBMS I剂量依赖性地减弱CIA诱导的关节损伤。

成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)通过产生炎性细胞因子和促进软骨破坏的蛋白酶，在RA发病机制中起关键作用。RA FLS的过度增殖和迁移是滑膜增生和侵袭性血管翳形成的主要原因，这进一步加剧了关节损伤。本发明应用中TBMSI能够通过抑制增殖和迁移来减弱关节炎FLS的破坏性表型。EdU掺入法显示，在1μM的剂量下，TBMS I显著降低了EdU阳性细胞的比例。TBMS I的这种抗增殖作用由体内数据进一步证实。发现TBMS I显著减弱了CIA大鼠的滑膜增生。此外，本发明证明了TBMS I能够降低FLS的迁移率，这通过在TBMS I处理的CIA大鼠体内抑制的血管翳形成来进一步证实。众所周知，MMPs特别是MMP-9已被证明在细胞迁移中发挥重要作用，尽管有些基质金属蛋白酶组分在无活性的FLS中组成型表达，但不受炎性细胞因子的影响，但MMP-9可被炎性细胞因子如TNFα和IL-1β诱导。本发明中证明了TBMSI下调TNFα诱导的MMP-9的表达，这与TNFα刺激的FLS迁移的结果一致，进一步证明了TBMS I在RA治疗中的抗迁移性质。

明确了TBMS I在CIA模型和FLS细胞培养中发挥治疗作用后，进一步研究了可能涉及的信号传导机制。因为MAPK在调节一系列细胞应答中发挥关键作用，特别是涉及细胞增殖，迁移和炎症应答，所以这些激酶的调节可以为包括RA在内的炎性相关疾病的治疗提供依据。而且在活化的类风湿关节炎中，MAPKs已被证明是普遍上调的。本发明发现TBMS I可抑制TNFα诱导的JNK和p38的磷酸化。这些抑制活性有助于抑制促炎症细胞因子的分泌，并且细胞因子水平的降低导致了FLS的抗增殖活性。

NF-κB是一种多效转录因子，在调节炎症细胞因子和MMPs的表达中起重要作用，所有这些都与RA的发病密切相关。这些基因的产物协同增强炎症反应，进一步激活NF-κB。鉴于RA中这种正调控环的重要性，抑制NF-κB途径可被认为是延缓RA发展的新策略。本发明TBMS I可显著抑制IκBα磷酸化和降解。总之，上述数据表明，TBMS I可能通过多个靶点发挥对RA的治疗作用。

综上所述，本发明证实了从土贝母(葫芦科)分离的天然产物TBMS I通过抗炎和抑制关节破坏对CIA大鼠起治疗作用。此外，TBMS I能够改变关节炎FLS的生物学功能，包括抑制其增殖和迁移。进一步分析表明，TBMS I抑制TNFα诱导的NF-κB和MAPK(p38和JNK)的活化，导致促炎因子的下调。因此，TBMS I有望发展成人类RA的新型替代性天然药物。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgtggcag ctacctatgt cttg 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtcgtcat catcccacga g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacttcaca agtcggaggc tta 23

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtgcatcatc gctgttcata caatc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cattaatatt taacgatgtg gatgcgtttc a 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcctaccatc tttaaactgc acaat 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atacactggc ccgaggcaac 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggacgatgcc tgcaacgt 18

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cccatctatg agggttacgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttaatgtca cgcacgattt c 21

Claims

1.土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述类风湿性关节炎为包含滑膜炎症的类风湿性关节炎。

3.根据权利要求1所述的土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述类风湿性关节炎为包含骨破坏的类风湿性关节炎。

4.根据权利要求1所述的土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述药物是以所述土贝母苷甲作为单一成分所制成的药物。

5.根据权利要求1所述的土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述药物是以所述土贝母苷甲作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

6.根据权利要求4所述的土贝母苷甲在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述药物选自注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。