CN106236616A - 化妆品新原料土贝母总皂苷 - Google Patents

Abstract

土贝母水提取、大孔吸附树脂分离土贝母总皂苷，主要成分是土贝母苷甲、苷乙和苷丙，溶于水和乙醇溶液；对皮肤无刺激性；不引起皮肤过敏反应；抑制花生四稀酸和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)诱发的鼠耳水肿；局部应用完全抑制，加入饮水中部分抑制二甲基苯并蒽激发、TPA促进的小鼠皮肤乳头状瘤的发生；缓解，甚至完全抑制对苯二胺诱发豚鼠皮肤接触过敏，不影响其着色效果；缓解，甚至完全抑制染发剂对皮肤的刺激、过敏和炎症反应；无菌水溶液室温可保存1.5年，75％乙醇溶液、干品室温可保存2年。总皂苷可作为染发、洗发、护发、护肤补充剂。苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合有类似作用和用途。

Description

化妆品新原料土贝母总皂苷

发明背景

土贝母[Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet(Cucurbitaceae)]是一种传统中药，载于清代赵学敏氏所编《本草纲目拾遗》，药用部分为其鳞茎。在古代用它来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生和瘰疬等各种疾患，临床上显示出明显的散结毒、消痈肿效果。中医用它来治疗食道癌、胃癌等，其消除梗阻、减小肿块、延长生命效果显著。

土贝母总皂苷(简称总皂苷)，主要由土贝母苷甲、苷乙和苷丙(简称苷甲、苷乙、苷丙))组成，其标志性成分是苷甲。苷甲、苷乙和苷丙是从土贝母块茎中分离纯化出的三种单体皂苷，其化学结构已经确定(图1)，其相对分子量分别为1318，1334和1364。三种土贝母皂苷中以苷甲的含量最高，苷乙和苷丙次之。上述土贝母皂苷均为具有独特结构的五环三萜类皂苷，酸水解后释放出贝咢苷元(bayogenin)和四种糖：葡萄糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖。苷甲与苷乙化学结构的唯一区别是：苷甲16位碳上连-H，而苷乙16位碳上连-OH。苷丙的的化学结构与苷甲的区别是：苷丙A位碳上连-OH，苷甲A位碳上连-H；苷丙B位碳上连-OH，苷甲B位碳上连-O；苷丙C位碳上连-CH₂O，苷甲C位碳上连-H。苷甲、苷乙水溶性和稳定性都好。总皂苷易溶于水和85％(及以下)乙醇。

染发已成为一种时尚，不用说追求多彩发色的时髦青少年，绝大多数中老年人为了留住青春也染发。尽管由于现代技术水平的提高，染发剂中的一些有害物质，例如铅、汞的含量可以想办法降低，但目前市面上销售的染发剂，无论哪一种品牌，里面都含有“偶氮染料”，一种有致敏、致癌作用的化学成分。任何染发剂，不加这种化学物质就很难在毛发上着色，即使能够着色，颜色也不牢固，很快就会脱落，所以目前世界上尚不存在一种完全无害的染发剂。黑色染发剂上色难、偶氮染料用量更多、毒性相 对大。而且，头皮毛囊又是毒素进入人体的最佳通道。染发剂的危害不一定即时显现但确实存在，染发剂的毒副作用是不容忽视的。

染发剂有三大危害：致敏、致癌和损伤肝肾。最常见的危害是引起接触性皮炎。在接触性皮炎患者中，大概有20％是由染发引起的。目前大多数染发剂中都含有强过敏原-对苯二胺(p-phenylenediamine，PPD)。对苯二胺是最简单的芳香二胺之一(图2)，也是一种应用广泛的中间体，可用于制备偶氮染料，高分子聚合物，也可用于生产毛皮染色剂，橡胶防老剂和照片显影剂。部分人群会对这种化学成分产生过敏反应，染发后出现眼睑浮肿、皮肤发红、奇痒难忍的小疹，甚至会出现全身性过敏反应。除了过敏，染发剂中的化学成分还与几种可怕的癌症有着不可忽视的联系。染发可能引发膀胱癌、乳腺癌和淋巴癌。医学界早在几十年前就已证实，染发可以引起膀胱癌。染发剂中的二胺化合物和芳香胺类化合物，同样具有致癌作用。美国研究人员曾对市售的169种永久性染发剂做过试验，发现其中150种(89％)有致癌作用。原先患有良性乳腺病者，使用染发剂后得乳腺癌的可能性比不用染发剂者高4.5倍。国外有调查显示，染过头发的女性患淋巴癌的几率要比没染过头发的女性高50％。染料经皮肤、毛囊进入人体，然后进入血液。染发剂浓度过高或染发频率太高可能会破坏血细胞，从而成为淋巴瘤和白血病的致病元凶。染发剂中的有毒化学物质进入人体后需要通过肝和肾进行代谢、排泄，所以长期反复的染发必然会对肝肾功能造成损害。此外，染发还有可能诱发骨质疏松，对生殖器官也有危害。染发剂对人体的危害不少，但除了过敏，多数恶果都不会即时或在短时间内出现。然而，这并不代表人们可以对染发剂的危害掉以轻心。

世界各地城市雾霾，空气、水等环境污染，包括PM2.5微粒、汽车排放的尾气、飞扬的灰尘，空气和水中的无机成分(包括重金属元素)和有机成分等在内的约224种污染物及其污染微粒等，都会影响人的头发和皮肤的健康。空气和水中的化学有毒物质和头皮油脂混合氧化，会堵塞毛孔， 造成头发脆弱、脱落；也可通过皮肤、毛囊进入体内，进入血液；空气和水中的低分子物质还可直接进入表皮，与皮下淋巴组织相互作用，激活、增殖抗原特异T淋巴细胞，引起变态反应。这些污染物及其污染微粒还能够穿透皮肤，破坏皮肤细胞。人受到重金属和其他污染物伤害的情况下，体内形成的自由基会损害保护皮肤、减少水分流失的角蛋白，使皮肤变薄。污染还会引起炎症，破坏皮肤的壁层，损害保护皮肤弹性的胶原蛋白，加速皱纹形成和皮肤老化。过去认为，紫外线照射是造成皮肤老化的主要原因，现在科学家认为，多达50％的皮肤损害是由城市污染引起的。北京200多名30岁到45岁的农村和城市女性的调查结果表明，尽管在农村女性中，阳光照射造成的老化速度比城市女性快，但城市女性的皮肤受到的总体损伤更严重，老化速度比农村女性快10％；德国400多名的农村和城市女性的调查结果显示，城市女性出现皮肤色素沉着过度的速度比农村女性高20％。紫外线照射与空气和水中污染物及其污染微粒的共同(协同)作用更是造成皮肤癌的主要原因。

发明概要

本发明涉及土贝母总皂苷(Bolbostemma total saponins)的工业化生产工艺及其作为染发、洗发、护发、护肤补充剂的用途。本发明还涉及苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物作为染发、洗发、护发、护肤补充剂的用途。

一、本发明涉及的总皂苷的工业化生产工艺

1、原料

1.1产地：陕西省大荔县。选择饱满、体大、红棕色、质坚实、有亮光、半透明的土贝母块茎，去除不饱满、质地轻、黑或暗黄色的块茎及其他杂物。

1.2原料中苷甲含量的测定：按照我国药典2010年版一部(P16)土贝母项下《含量测定》操作，水分测定依照药典2010年版一部附录(P52)IXH水分测定法第一法(烘干法)操作。

2、工业化生产工艺

2.1水提取

粉碎土贝母块茎，过8mm圆孔工业筛，得土贝母粗粉。以6～12倍体积(倍数为水体积与土贝母质量之比)的饮用水，保持一定压力(0.02～0.10MPa)、温度(100～120℃)，不回流或回流(回流提取效果更好)提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并提取液，过300目工业筛，回收滤液。减压浓缩，回收浓缩液。

2.2大孔吸附树脂分离

2.2.1大孔吸附树脂NKA-9(苯乙烯骨架型)对于总皂苷有较好的吸附和解吸性能。树脂柱的径高比为1∶7。

2.2.2上样液：浓缩到相当土贝母生药量150～1300mg/ml的水提取浓缩液。

2.2.3上样量：NKA-9树脂(干重)∶土贝母生药(干重)＝1∶0.5～1.0。

2.2.4上样流速：1.5BV/h。

2.2.5洗脱：先用6～10BV的蒸馏水洗脱，然后用4～8BV 15～30％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。再以3～4BV的70～90％乙醇洗脱，洗脱流速为1～2BV/h。薄层层析法(按《中国药典》2010年版第一部土贝母项下的[鉴别]进行操作，定性检测洗脱液是否含苷甲。洗脱液开始为褐色，洗至终点时，洗出液澄清透明，微黄。

2.2.6收集、合并70～90％乙醇洗脱液中苷甲检测阳性部分。回收乙醇，减压浓缩并喷雾干燥，得干燥细粉。

2.2.7检测：总皂苷含量采用5％香草醛冰醋酸溶液-脱水硫酸为显色剂，90℃加热显色，分光光度法在540nm波长处测定吸光度；苷甲含量按照我国药典2010年版一部(P16)土贝母项下《含量测定》操作；大孔吸附 树脂残留物或裂解物采用顶空进样，气相色谱法测定苯、二甲苯、苯乙烯、二苯乙烯、烷烃类等。有机溶剂残留量按照我国药典2010年版二部(附录VE，附录31-32)所载气相色谱法检测。

2.2.8检测结果：产品中总皂苷含量＞75％；苷甲含量＞30％；未检出大孔吸附树脂残留物；未检出残留有机溶剂(乙醇)。

3、总皂苷的稳定性

总皂苷的无菌水溶液室温保存1.5年、75％乙醇溶液室温保存2年，粉剂干品在干燥器内保存2年，其组成无明显改变、活性无明显降低。

二、本发明涉及的总皂苷作为染发、洗发、护发、护肤补充剂的用途

以下列举实验和使用案例，以资总皂苷作为染发、洗发、护发、护肤补充剂，具有既不影响对苯二胺着色效果，又能预防染发剂和各种环境污染物诱发皮肤刺激症状、炎症反应、过敏反应，以及肿瘤发生，还相当安全的证据。

1、总皂苷对对苯二胺着色效果的影响

本实验的目的是考察总皂苷是否影响对苯二胺的着色效果。

1.1材料

1.1.1试剂：对苯二胺，纯度98％，AMRESCD产品。苷甲标准品，购自中国食品药品检定研究院。硅胶G薄层板，青岛海洋化工厂分厂产品。三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、醋酐、硫酸、乙醇等：均为分析纯，分别为广州化学试剂厂、广州市海珠化学试剂有限公司、天津市大茂化学试剂厂、衡阳市凯信珠化工试剂有限公司产品。

1.1.2药品：总皂苷喷雾干燥细粉，其中总皂苷含量＞75％，苷甲含量＞30％。

1.1.3白羊毛：苏尼特右旗宏达绒毛有限责任公司产品。

1.2方法

1.2.1溶液配制

①苷甲标准品甲醇溶液的配制：准确称取五氧化二磷减压干燥(50℃)至恒重的苷甲标准品适量，置容量瓶，加甲醇溶解，配制成1mg/ml的苷甲标准品甲醇溶液。

②对苯二胺水溶液的配制：准确称取对苯二胺适量，置容量瓶，加去离子水，40℃水浴加热溶解，配制成浓度为10mg/ml、20mg/ml的对苯二胺水溶液。

③对苯二胺乙醇溶液的配制：准确称取对苯二胺适量，置容量瓶，加75％乙醇溶解，配制成浓度为10mg/ml、20mg/ml的对苯二胺75％乙醇溶液。

④总皂苷水溶液的配制：准确称取总皂苷喷雾干燥细粉适量，置容量瓶，加去离子水溶解，配制成浓度为10mg/ml、20mg/ml的总皂苷水溶液。

⑤总皂苷乙醇溶液的配制：准确称取总皂苷喷雾干燥细粉适量，置容量瓶，加75％乙醇溶解，配制成浓度为10mg/ml、20mg/ml的总皂苷75％乙醇溶液。

⑥展开剂：三氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，甲酸，水以12∶3∶8∶2∶2的比例混合均匀。

⑦显色剂：醋酐，硫酸，乙醇以1∶1∶10的比例均匀混合。

1.2.2分组

①对苯二胺组：取10mg/ml对苯二胺水溶液3ml，置10ml具塞玻璃试管，一式六份，其中三份放白羊毛0.1g。取10mg/ml对苯二胺75％乙醇溶液3ml，置具塞玻璃试管，一式六份。其中三份放白羊毛0.1g。

②总皂苷组：取10mg/ml的总皂苷水溶液3ml，置10ml具塞玻璃试管，一式六份，其中三份放白羊毛0.1g。取10mg/ml的总皂苷75％乙醇溶液3ml，置入10ml具塞玻璃试管，一式六份，其中三份放白羊毛0.1g。

③对苯二胺+总皂苷混合溶液组：取20mg/ml的对苯二胺水溶液1.5ml置10ml具塞玻璃试管，加20mg/ml的总皂苷水溶液1.5ml，混匀，一式六份，其中三份放白羊毛0.1g。取20mg/ml对苯二胺75％乙醇溶液1.5ml， 置具塞玻璃试管，加20mg/ml总皂苷75％乙醇溶液1.5ml，混匀，一式六份，其中三份放白羊毛0.1g。

1.2.3实验步骤：以上三组试管室温放置，敞口2h，之后封口。放置第2h、第4h、第8h、第24h，上述各管取1.0ml作等倍系列稀释，并观察、对比相同稀释度下各管溶液的颜色变化；观察、对比各管溶液对白色羊毛的染色效果；薄层层析法检测总皂苷组和对苯二胺+总皂苷混合溶液组各管溶液中苷甲RF值：常规展开，晾干后喷显色剂，110℃加热至斑点清晰，分析薄层层析图谱。

1.2.4结果 对苯二胺组与对苯二胺+总皂苷混合溶液组各管溶液颜色深浅在同一稀释度时接近，对白色羊毛的染色效果类似；总皂苷组与对苯二胺+总皂苷混合溶液组各管溶液在放置时间、稀释度和层析条件相同时薄层板上出现RF值相当、大小接近的斑点。总皂苷本身对白色羊毛无染色效果。本实验经重复，结果可重现。

1.2.5结论 土贝母总皂苷对对苯二胺的着色效果无明显影响。

2、总皂苷对对苯二胺皮肤接触致敏的影响

对苯二胺分子中有苯环、氨基，所以它有这两种官能团具有的性质。对苯二胺是偶氮系分散染料、酸性染料、直接染料和硫化染料的中间体。加入3％的双氧水颜色变黑，加入5％三氯化铁可变成棕色。它对毛发中的角蛋白有极强的亲和力，其氧化过程就是染发时颜色的固着过程。它既是染发剂中最有效的着色成分，也是对人体健康最具有潜在危害的物质。不易因吸入而中毒，口服毒性剧烈，与苯胺同。对苯二胺作为目前最重要的着色剂成分，1939年首次被定义为强过敏原，并被选入北美、欧洲和T.R.U.E斑贴试验的标准抗原组，是一个众所周知的染发剂引起皮炎的最常见抗原，同时也被认为是测试染发剂皮炎的最佳抗原。局部封闭涂皮实验表明，随着PPD浓度的升高，皮肤反应程度也随之增强。1mg/ml PPD时，皮肤反应性较低，2.5mg/ml时明显升高，5～20mg/ml PPD时的反应强度基本一致。

近年来染发人群暴增，每年用于染发消耗的对苯二胺近80吨，引起的皮炎病例显著增加。普通人群样本中有5.3％个体在染发后出现不同程度的红斑、脱屑、瘙痒或水肿。虽然对苯二胺引起皮炎，但目前还没有可以完全替代对苯二胺的相对安全又有效的着色成分，因此，寻找、筛选、研究既不影响对苯二胺的染发效果，又能预防对苯二胺引起皮肤接触致敏的物质十分必要。

2.1、实验一

按照标准作业程序(Standard Operating Procedures，SOPs)规定进行。

2.1.1动物 Hartley豚鼠，普通级，体重250～350g，雌雄各半，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部。实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0012，实验动物质量合格证号：HNACSDC20100504。SPF级标准动物实验室喂养及实验。广东省动物实验环境设施监测合格证：粤监证字2008C039号；实验动物使用许可证：SYXK(粤)2009-0053号。实验前观察2周。

2.1.2试剂 对苯二胺(PPD)，AMRESCD产品，纯度＞98％，配制成10mg/ml对苯二胺水溶液。

2.1.3药物 总皂苷细粉，其中总皂苷含量＞75％，苷甲含量＞30％，配制成1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的总皂苷水溶液。

2.1.4动物分组 取检疫合格的豚鼠，雌雄各半。按照性别体重采用区段随机方法分为溶剂对照组、总皂苷对照组、PPD组、总皂苷(4个不同浓度)+PPD组共7组，每组8只豚鼠。实验前一天按SOPs规定用宠物理发剪对豚鼠背部脊柱中间两侧进行脱毛处理。脱毛区不少于3cm×3cm。

2.1.5局部涂布封闭实验 溶剂对照组：涂抹纯水100μl；总皂苷对照组：涂抹10mg/ml的总皂苷水溶液100μl；PPD组：涂抹10mg/ml PPD水溶液100μl；总皂苷+PPD组：将不同浓度总皂苷(1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)的水溶液各100μl，分别涂抹在各组豚鼠背部脱毛区的皮肤上， 30min后再涂布10mg/ml PPD的水溶液100μl。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天，各组分别按上述方式涂布皮肤一次，每次涂布之后以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布封包固定。24h后用温水清洗皮肤，之后2h、24h、48h、72h观察并记录豚鼠局部皮肤反应(红斑、水肿、焦痂、水泡或破溃)，同时密切观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。

2.1.6皮肤反应评判及标准 红斑：0＝无红斑；1＝轻微红斑(勉强可见)；2＝明显红斑；3＝中重度红斑；4＝严重红斑至轻微焦痂形成。水肿：0＝无水肿；1＝极微弱水肿；2＝轻度水肿(皮肤隆起轮廓清楚)；3＝中度水肿(皮肤隆起超过1mm)；4＝重度水肿(皮肤隆起超过1mm或边界超出暴露部位)。总分0至8分，≥2分为反应阳性。

2.1.7统计处理 按照SOPs规定进行统计学分析，所用软件为SPSS16.0。

2.1.8结果 溶剂和总皂苷对照组在整个实验期间未发现豚鼠有皮肤或全身性过敏反应，平均得分为0。PPD组从第三周起部分动物(2/8)涂抹部位皮肤开始出现阳性反应，如红斑、水肿，第四、五周大部分动物(7/8)皮肤出现阳性反应，严重者出现红斑、肿胀，乃至溃烂，皮毛稀疏甚至不长。第五周平均得2.5分。总皂苷(1mg/ml)+PPD组部分动物在第三周(2/8)、第四周(4/8)、第五周(4/8)皮肤出现阳性反应，平均得1.5分，发生阳性反应的动物数较PPD组少，反应程度也较轻。总皂苷(5mg/ml)+PPD组部分动物在第四周(2/8)、第五周(2/8)皮肤出现阳性反应，平均得1.0分，发生反应的动物数较总皂苷(1mg/ml)+PPD组少，反应程度也较轻。总皂苷(10mg/ml)+PPD组在第五周仅少数动物(1/8)出现轻微的红斑或极微弱水肿(得2分)，平均得0.38分。总皂苷(20mg/ml)+PPD组在整个实验期间未发现任何豚鼠的皮肤出现阳性反应，平均得分为0(表1)。

苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物具有与总皂苷类似的效果。

2.1.9结论 总皂苷的提前应用可剂量依赖性地缓解、改善，甚至完全抑制对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎。总皂苷本身不仅对皮肤无不良影响，而且在一定程度上有使皮肤光滑润泽，促进皮毛生长的作用(表1，图3)。

表1 土贝母总皂苷抑制对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎

*P＜0.05，**P＜0.01vs PPD对照。

2.2实验二

2.2.1动物 同实验一。

2.2.2试剂 对苯二胺(PPD)，同实验一，配制成10mg/ml、20mg/ml对苯二胺水溶液。

2.2.3药物 总皂苷细粉，同实验一，配制成2mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的总皂苷水溶液。

2.2.4动物分组：取检疫合格的豚鼠，雌雄各半。按照性别体重采用区段随机方法分为溶剂对照组、总皂苷对照组、PPD组、PPD+总皂苷(3个不同浓度)混合组共6组，每组8只豚鼠。其余实验操作同实验一。

2.2.5局部涂布封闭实验 溶剂对照组：豚鼠背部脊柱中线两侧脱毛区涂抹纯水100μl；总皂苷对照组：豚鼠背部脊柱中线左侧脱毛区涂抹纯水100μl，右侧涂抹总皂苷水溶液(10mg/ml)100μl；PPD组：左侧涂抹纯水100μl，右侧涂抹PPD水溶液(10mg/ml)100μl；PPD+总皂苷(1mg/ml)混合组：左侧涂抹PPD水溶液(10mg/ml)100μl；右侧涂抹PPD(20mg/ml)50μl+总皂苷(2mg/ml)50μl混合液；PPD+总皂苷(5mg/ml)混合组：左侧涂抹PPD水溶液(10mg/ml)100μl；右侧涂抹PPD(20mg/ml)50μl+总皂苷(10mg/ml)50μl混合液；PPD+总皂苷(10mg/ml)混合组：左侧涂抹PPD水溶液(10mg/ml)100μl；右侧涂抹PPD(20mg/ml)50μl+总皂苷(20mg/ml)50μl混合液。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天，各组分别按上述方式涂布皮肤一次，每次涂布之后以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布封包固定。24h后用温水清洗皮肤，之后2h、24h、48h、72h观察并记录豚鼠局部皮肤反应(红斑、水肿、焦痂、水泡或破渍)，同时密切观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。

2.2.6皮肤反应判定及标准 同实验一。

2.2.7统计处理 同实验一。

2.2.8结果 溶剂和总皂苷对照组各豚鼠脊柱左右两侧涂抹部位在整个实验期间未发现皮肤阳性反应，平均得分0。其余各组第五周动物皮肤反应如下。PPD组：左侧(涂水)部分动物(4/8)皮肤反应阳性，平均得分＝1.25，右侧(涂PPD)大部分动物(7/8)皮肤反应阳性，平均得分＝2.5；可见，PPD不仅引起直接接触皮肤的反应，还引起邻近皮肤(未直接接触)的反应。PPD+总皂苷(1mg/ml)混合组：左右两侧均为部分动物(4/8)皮肤反应阳性，平均得分：左为1.88，右为1.5；PPD+总皂苷(5mg/ml)混合组：部分动物(左4/8，右3/8)皮肤反应阳性，平均得分：左为1.57，右为1.0；PPD+总皂苷(10mg/ml)混合组：仅少部分动物(左 1/8，右1/8)皮肤反应阳性(P＜0.01，与PPD组比)，平均得分：左为0.86，右为0.57。结果表明，总皂苷与对苯二胺混合后应用可剂量依赖性地缓解、改善，甚至抑制对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎。值得注意的是，总皂苷还能抑制相邻部位同时应用的对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎。

苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物具有与总皂苷类似的效果。

2.2.9结论 总皂苷与对苯二胺混合后应用，可剂量依赖性地缓解、改善，甚至完全抑制对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎。

3、总皂苷对花生四烯酸和佛波脂诱导的鼠耳炎性水肿的影响

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是二十碳不饱和脂肪酸，经环加氧酶和脂质加氧酶途径代谢，生成各种产物。花生四烯酸代谢并释放其代谢产物，导致发热、疼痛、血管扩张、通透性升高及白细胞渗出等炎症反应。抗炎药物如阿司匹林、消炎痛和炎固醇激素则能抑制花生四烯酸代谢，减轻炎症反应。

12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)系十四烷酸和佛波醇形成的酯，它因能激活导致细胞增殖或分化的信号通路而具有促进细胞癌变的作用，是一种活性很高的皮肤粘膜促癌剂。按照标准作业程序(Standard Operating Procedures，SOPs)规定进行。

3.1材料和方法

3.1.1动物 昆明种小鼠，SPF级，体重22～25g，雌雄各半，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部。实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0012，实验动物质量合格证号：HNACSDC20120424。SPF级标准动物实验室喂养及实验。广东省动物实验环境设施监测合格证：粤监证字2008C039号；实验动物使用许可证：SYXK(粤)2009-0053号。实验前观察2周。

3.1.2试剂 AA、TPA，Sigma公司产品，丙酮溶解，分别配制成100mg/ml的AA和100μg/ml的TPA丙酮溶液。

3.1.3药物 总皂苷细粉，其中总皂苷含量＞75％，苷甲含量＞30％，以去离子水溶解配制成0.5mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml的总皂苷水溶液。

3.2动物分组 随机将小鼠分为试剂对照组；总皂苷对照组；模型组(AA或TPA)；AA(或TPA)+总皂苷组；总皂苷+AA(或TPA)组。每组6只小鼠，雌雄各半。

3.3实验步骤

溶剂对照组：20μl丙酮涂抹小鼠左耳两侧皮肤；总皂苷对照组：20μl总皂苷溶液(100μg/耳)涂抹小鼠左耳两侧皮肤；AA模型组：20μl AA(2mg/耳)涂抹小鼠左耳两侧皮肤；TPA模型组：20μl TPA(2μg/耳)涂抹小鼠左耳两侧皮肤；AA(或TPA)+总皂苷组：20μl AA(2mg/耳)或TPA(2μg/耳)涂抹小鼠左耳两侧皮肤，30min后20μl不同浓度总皂苷(10μg/耳、50μg/耳、100μg/耳)分别涂抹小鼠左耳两侧皮肤；总皂苷+AA(或TPA)组：20μl不同浓度总皂苷(10μg/耳、50μg/耳、100μg/耳)分别涂抹小鼠左耳两侧皮肤，1h后20μl AA(2mg/耳)或TPA(2μg/耳)分别涂抹小鼠左耳两侧皮肤。分别在AA用后1h或TPA用后5h用游标卡尺测量鼠耳厚度。用Student′s t检验法，P＜0.05，P＜0.01示差异有统计学意义。

3.4结果

溶剂对照和总皂苷对照组鼠耳都无红肿现象，平均厚度也无明显差异。AA和TPA模型组鼠耳都明显红肿，平均厚度显著增加。无论是在AA和TPA之前还是之后应用，总皂苷都能显著抑制AA和TPA诱发的鼠耳炎性水肿，其效果还表现出明显的量效依赖关系(表2、3、4、5；图4、5、6、7)。苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物具有与总皂苷类似的效果。

表2土贝母总皂苷对花生四烯酸诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用AA，30min后用总皂苷)

P值：与AA组比。

表3土贝母总皂苷对花生四烯酸诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用总皂苷，1h后用AA)

P值：与AA组比。

表4土贝母总皂苷对12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用TPA，30min后用总皂苷)

P值：与TPA组比。

表5土贝母总皂苷对12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用总皂苷，1h后用TPA)

P值：与TPA组比。

4、总皂苷局部涂布或自由饮用对小鼠皮肤肿瘤发生的影响

癌症的发生和发展是一个多病因、多基因、多阶段相互作用的过程，一般要经历3个阶段，即始发阶段、促癌阶段和演进阶段。癌症的始发阶段是一个不可逆的突变过程，涉及致癌物的代谢活化、DNA加成物的形成和DNA的损伤修复等环节，历时甚短；促癌阶段是始发突变细胞克隆后连续过度增殖的漫长过程，涉及细胞增殖的很多环节，与多胺、蛋白激酶C、磷酸肌醇、蛋白酶、花生四烯酸代谢、自由基及癌基因表达等有关。一般认为促癌过程是可逆的，如果化学预防药物能阻断或抑制其中的某些环节，则可达到阻止癌症发生的目的，因此促癌阶段是癌症化学预防的理想靶点。

化学致癌剂加促癌剂可诱导小鼠皮肤鳞状细胞乳头状瘤和鳞状细胞癌变。二甲基苯并蒽(DMBA)和TPA是经典的激癌剂和促癌剂，可诱发广泛的激癌、促癌过程的生物学效应。TPA对鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase)的诱导是早期最重要的细胞内反应之一。

4.1材料

4.1.1动物 7周龄SPF级雌性ICR小鼠。

4.1.2试剂 丙酮，分析纯，DMBA、TPA，Sigma公司产品，用丙酮配制成100μg/ml DMBA和100μg/ml TPA的丙酮溶液。

4.1.3药物 总皂苷细粉，其中总皂苷含量＞75％，苷甲含量＞30％，以去离子水溶解配制成10mg/ml的总皂苷水溶液。

4.2方法

采用经典的二阶段小鼠皮肤肿瘤发生模型，7周龄雌性ICR小鼠，分为DMBA+TPA组、DMBA+TPA+总皂苷(皮肤涂布)组、DMBA+TPA+总皂苷(饮用)组，每组15只小鼠。剃去小鼠背部毛。各组通过一次性涂布100μl DMBA丙酮溶液液(10μg/鼠)於小鼠背部剃毛区来实现激癌。激癌1周后，各组以不同方式促癌：DMBA+TPA组涂布100μl TPA液(10μg/鼠)，每周两次；DMBA+TPA+总皂苷(皮肤涂布)组同时涂布100μl TPA液(10μg/鼠)和100μl总皂苷溶液(1.0mg/鼠)，每周两次；DMBA+TPA+总皂苷(饮用)组皮肤涂布100μl TPA液(10μg/鼠)～，每周两次，总皂苷则加入饮用水中(0.2mg/ml)供小鼠自由饮用。每周检测一次发生肿瘤的小鼠数，并计数肿瘤个数，每四周称小鼠体重一次。

4.3结果

DMBA+TPA组小鼠的第一个皮肤肿瘤在激癌后6周出现，激癌后18周小鼠的荷瘤率为87.0％，平均肿瘤数为13.6/鼠。而DMBA+TPA+总皂苷(皮肤涂布)组则无肿瘤发生，总皂苷完全抑制了DMBA激发的、TPA促进的小鼠皮肤肿瘤的发生。局部皮肤检查结果表明，DMBA+TPA+总皂苷组小鼠的皮肤光滑润泽，而DMBA+TPA组小鼠的皮肤粗糙，有点状、散在的炎性病灶。体重测定结果表明，总皂苷的局部应用不仅不妨碍体重的增长，而且还能改善促癌剂对体重增长的抑制。DMBA+TPA+总皂苷(饮用)组第一个皮肤肿瘤在激癌后8周出现，激癌后18周小鼠的荷瘤率为73.0％，平均肿瘤数为7.2/鼠(P＜0.05，t-test)。总皂苷饮用部分抑制小鼠皮肤肿瘤的发生。小鼠体重测定结果提示，饮用总皂苷对小鼠体重增长无明显影响，未表现出明显的全身性毒副作用。苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物具有与总皂苷类似的效果。

5、安全性评价

5.1土贝母总皂苷的急性毒性试验

采用成年ICR健康小鼠，雌雄各半，常规方法做急性毒性实验。结果显示，土贝母总皂苷肌肉注射的半数致死量(LD₅₀)为35.3mg/kg，腹腔注射的LD₅₀为20.7mg/kg，灌胃的LD₅₀为308.8mg/kg。

5.2土贝母总皂苷对实验兔的皮肤刺激性试验

委托湖南省实验动物中心、湖南省药物安全评价研究中心，实施土贝母总皂苷实验兔的皮肤刺激性试验。按照国家GLP规范要求，取检疫合格背部脱毛处理的实验兔8只，雌雄各半，按性别体重采用区段随机方法分为完整皮肤组和破损皮肤组。每组4只，完整皮肤组在每只实验兔背部左侧已去毛的完整皮肤上涂布土贝母总皂苷(20mg/ml)0.5ml，在每只实验兔背部右侧已去毛的完整皮肤涂布溶剂75％乙醇0.5ml；破损皮肤组在每只实验兔背部左侧已去毛的破损皮肤上均涂布土贝母总皂苷(20mg/ml)0.5ml，在每只实验兔背部右侧已去毛的破损皮肤均涂溶剂75％乙醇0.5ml。用玻璃纸、两层纱布和无刺激胶布固定，药物接触皮肤时间为4h，然后除去包裹物，并用温水清洁给药部位，每天按上法给药一次，连续5天在同一部位给药。给药期在去除药物后1h以及再次涂布前分别观察及记录每只实验兔给药部位红斑、水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生和消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次涂布后，在去除药物后30～60min，24h、48h和72h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。

肉眼观察显示，完整皮肤和破损皮肤土贝母总皂苷给药侧，完整皮肤、破损皮肤75％乙醇对照侧，涂布局部皮肤表面均未见红斑、水肿、糜烂、坏死，皮下组织未见水肿、坏死等变化。

结论：土贝母总皂苷((20mg/ml)，每天给药1次(0.5ml/只)，同一部位连续给药5天，对实验兔皮肤无明显刺激性反应。

5.3土贝母总皂苷给予豚鼠的主动皮肤过敏试验

委托湖南省实验动物中心、湖南省药物安全评价研究中心，实施土贝母总皂苷对豚鼠的主动皮肤过敏试验。按照国家GLP规范要求，选取检疫合格、体重300～400g的白色豚鼠18只，雌雄各半，分为3组，分别为阴性对照组、阳性对照组和土贝母总皂苷组。实验前一天进行脱毛处理。在第0天、第7天和第14天，将75％乙醇、1％2，4-二硝基氯苯和土贝母总皂苷(20mg/ml)，分别涂在相应的动物左侧背部脱毛区，0.5ml/只，玻璃纸和二层纱布覆盖，再用无刺激性胶布和绷带固定。动物分笼饲养，1只/笼，6h后用温水洗去药物。末次给受试物致敏后14天，实施激发接触，将75％乙醇、0.1％2，4-二硝基氯苯和土贝母总皂苷分别涂于相应的动物右侧脱毛区，0.5ml/只，玻璃纸和二层纱布覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。6h后用温水去掉药物，即可比较观察皮肤过敏反应情况，然后于24h、48h、72h再次观察。观察土贝母总皂苷对豚鼠主动皮肤过敏反应。结果显示，涂布1％2，4-二硝基氯苯的阳性对照组，过敏反应致敏反应率为100％(6h)、100％(24h)、50％(48h)和16.7％(72h)，皮肤致敏性评价分别为极度致敏性(6h)、极度致敏性(24h)、中度致敏性(48h)和轻度致敏性(72h)；涂布75％乙醇的阴性对照组，过敏反应6h、24h、48h和72h致敏反应率均为0，皮肤致敏性评价均为无致敏性；涂布土贝母总皂苷组，过敏反应6h、24h、48h和72h致敏反应率均为0，皮肤致敏性评价均为无致敏性。

结论：土贝母总皂苷(20mg/ml)对豚鼠未见明显主动皮肤过敏反应。

6、观察案例

观察对象：20例，男、女兼有，年龄50～70岁，头发灰白或全白，均为使用市售染发剂染发后发生过敏反应者。轻度过敏反应为头皮不适、瘙痒、轻度刺痛、潮红、头屑多等，占50％(10/20)；中度为红斑、头面 部皮肤肿胀、流泪、流涕等，占40％(8/20)；重度为丘疹、小水疱、皮肤溃烂、继发感染等，占10％(2/20)。

总皂苷细粉用量：轻度(75mg/次)，中度(100mg/次)，重度(150～200mg/次)。染发前取75～150mg总皂苷粉剂，加适量饮用水溶解后与染发剂充分混匀，按染发剂说明书使用。

按上述方式添加总皂苷于多种染发剂中混匀染发，20例观察对象中的轻度反应者(10/20)、中度反应者(6/20)未再发生过敏反应，其余中度反应者(2/20)、重度反应者(2/20)的过敏反应亦明显减轻，仅出现头屑多、头皮潮红、流泪等反应，未发现丘疹、小水疱、皮肤溃烂、继发感染等重度反应表现。

苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物具有与总皂苷类似的效果。

7、代表案例

马××，初次染发后颈部和脸部出现红斑、丘疹和小水疱，“脸肿得连眼睛都睁不开”，从此不敢再染发。取150mg总皂苷粉剂，加适量(约2ml)饮用水溶解，配成总皂苷溶液，将其与上次同一牌子的染发剂充分混合后染发则未发生任何异常反应。卢××，每次染发后都发生红斑、头皮肿胀、面部肿胀、流涕等症状。取100mg总皂苷粉剂，加适量(约1.5ml)饮用水溶解，做成总皂苷溶液。将其与多种牌子的染发剂充分均匀混合后染发则未发生任何异常。于××，马××，有轻度染发反应：头皮瘙痒、轻度刺痛、不适、头屑多、头皮潮红等，每次染发前取15mg/ml、5ml装总皂苷酊剂，用棉球或纱布团蘸取，均匀涂布、润湿头皮、头发后，再按染发剂的说明染发，从此再未出现任何染发反应。每年染发8～10次，于××已连续染发18年，马××已连续染发20年，迄今局部和全身都未发生任何异常。

三、实施例

1、酊剂或水剂

总皂苷200g、300g、400g、600g、800g分别加75％医用乙醇或灭菌去离子水20000ml；得10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml总皂苷75％乙醇溶液或总皂苷水溶液，无菌分装，每安瓶5ml。

上述配方总皂苷酊剂或水剂分别用于不同程度(轻、中、重)染发反应者染发。染发时用棉球或纱布团蘸取总皂苷酊剂或水剂，均匀涂布、润湿全部头皮、头发后，再按染发剂的说明染发。或者染发前倒出瓶内的总皂苷溶液，与市售的染发剂均匀混合，再按各染发剂的说明染发。

上述配方总皂苷水剂与市售的洗发、护发、护肤液均匀混合，再按各洗发、护发、护肤液的说明使用。

苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物与总皂苷同法配方及使用。

2、软膏剂

2.1总皂苷，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比7.5，0.01，92.49混合均匀，然后装入塑料软管。

2.2总皂苷，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比10.0，0.01，89.99混合均匀，然后装入塑料软管。

2.3总皂苷，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比15.0，0.01，84.99混合均匀，然后装入塑料软管。

2.4总皂苷，抗坏血酸，硫酸亚铁，甘氨酸盐酸盐，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比7.5，0.5，0.1，1.5，0.01，90.39混合均匀，然后装入塑料软管。

2.5总皂苷，抗坏血酸，硫酸亚铁，甘氨酸盐酸盐，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比10.0，0.5，0.1，1.5，0.01，87.89混合均匀然后装入塑料软管。

2.6总皂苷，抗坏血酸，硫酸亚铁，甘氨酸盐酸盐，邻苯基苯酚，糊精按重量百分比15.0，0.5，0.1，1.5，0.01，82.89混合均匀，然后装入塑料软管。

上述配方总皂苷软膏剂，与市售的护肤剂混合均匀，按该护肤剂的说明使用。

对不同程度(轻、中、重)染发反应人群，取上述配方总皂苷软膏剂适量，与市售的染发剂混合均匀，按该染发剂的说明使用。

苷甲、苷乙、苷丙单独或其任何两种或两种以上组合物与总皂苷粉同法配方。

3、粉剂

总皂苷，苷甲、苷乙、苷丙单独或它们的任何两种或两种以上组合物，紫外线灭菌，按50mg、75mg、100mg、150m、200mg分装。

临用前加饮用水溶解，再将其与市售的各种染发、洗发、护发、护肤剂均匀混合后按说明使用。

附图说明

图1土贝母苷甲、苷乙和苷丙的化学结构

图2对苯二胺的化学结构

图3土贝母总皂苷抑制对苯二胺诱发的豚鼠接触性皮炎(第5周各组的代表照片)

A：溶剂对照 B：总皂苷对照(20mg/ml) C：PPD(10mg/ml)

D：总皂苷+PPD(1+10)(mg/ml) E：总皂苷+PPD(5+10)(mg/ml)

F：总皂苷+PPD(10+10)(mg/ml) G：总皂苷+PPD(20+10)(mg/ml)

图4土贝母总皂苷对花生四稀酸(AA)诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用AA，30min后用总皂苷)

A：总皂苷(100μg/耳)；B：AA(2mg/耳)；

C：AA+总皂苷(2mg+10μg/耳)；D：AA+总皂苷(2mg+50μg/耳)；

E：AA+总皂苷(2mg+100μg/耳)

图5土贝母总皂苷对花生四稀酸(AA)诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用

(先用总皂苷，1h后用AA)

A：总皂苷(100μg/耳)；B：AA(2mg/耳)；

C：总皂苷+AA(10μg+2mg/耳)；D：总皂苷+AA(50μg+2mg/耳)；

E：总皂苷+AA(100μg+2mg/耳)

图6土贝母总皂苷对12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用(先用TPA，30min后用总皂苷)

A：总皂苷(100μg/耳)；B：TPA(2μg/耳)；

C：TPA+总皂苷(2μg+10μg/耳)；D：TPA+总皂苷(2μg+50μg/耳)；

E：TPA+总皂苷(2μg+100μg/耳)

图7土贝母总皂苷对12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)诱发的鼠耳炎性水肿的抑制作用(先用总皂苷，1h后用TPA)

A：总皂苷(100μg/耳)；B：TPA(2μg/耳)；

C：总皂苷+TPA(10μg+2μg/耳)；D：总皂苷+TPA(50μg+2μg/耳)；

E：总皂苷+TPA(100μg+2μg/耳)。

Claims (2)

1.土贝母总皂苷作为染发、洗发、护发、护肤补充剂，预防或阻止染发剂及各种环境污染物诱发皮肤刺激症状、过敏反应、炎症反应和肿瘤发生，以及保护头发、皮肤和全身健康，促进毛发生长的用途。

2.土贝母总皂苷主要由土贝母苷甲、苷乙、苷丙组成，其标志性成分是土贝母苷甲。土贝母苷甲、苷乙、苷丙单独，或其任何两种或两种以上组合物作为染发、洗发、护发、护肤补充剂，预防或阻止染发剂及各种环境污染物诱发皮肤刺激症状、过敏反应、炎症反应和肿瘤发生，以及保护头发、皮肤和全身健康，促进毛发生长的用途。