CN109879977B - 一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物及其制备方法和应用。本发明首先合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物，再进一步制备具有葡萄糖响应性的负载有胰岛素的两亲性多糖衍生物纳米粒，所述纳米粒中的植物凝集素基团结合周围环境中游离葡萄糖分子的能力高于结合多糖链上葡萄糖基团的能力，使得两亲性多糖衍生物链段变得较为松散，纳米粒体积增大，从而释放胰岛素，实现智能调控。所述两亲性多糖衍生物及纳米粒的制备条件温和，使用原料安全，保持了植物凝集素对葡萄糖分子特异性结合的活性以及胰岛素的结构稳定性和生物活性。本发明制备的智能调控胰岛素释放的两亲性纳米粒，可望作为一种胰岛素递送载体，能够根据糖尿病人体内血糖水平的变化而智能调控释放胰岛素，因而在糖尿病治疗方面有一定的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，更具体地，涉及一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
尿病是一种严重的致命性疾病，主要是由于体内血糖调节紊乱引起的，目前的治疗方式主要依赖每日多次皮下注射胰岛素，这种方式带来的弊端是低血糖、晕厥等多种并发症。
能够根据糖尿病人血糖水平而智能调控胰岛素释放的葡萄糖响应性体系将有希望成为一种治疗糖尿病的新型智能材料(Webber M.J.et al.,Journal of DrugTargeting,2015,23:651-655)，其关键技术是制备具有根据血糖浓度的变化而做出响应的智能材料。
目前文献已报道了一些葡萄糖响应性体系，包括葡萄糖氧化酶体系以及苯硼酸基团体系(Hoare T.et al.,Biomacromolecules,2008,9,733–740)，葡萄糖/半乳糖结合蛋白体系(Ehrick J.D.et al,Macromolecular Bioscience,2009,9,864–868)，但是这些体系均存在一定的缺陷而难以实现实际应用。例如苯硼酸基团体系由于pKa值的限制，不适合在人体中应用，葡萄糖氧化酶存在释放响应滞后的问题，葡萄糖/半乳糖结合蛋白较为昂贵，应用价值较低。作为一种植物凝集素，伴刀豆球蛋白A(ConcanavalinA，ConA)与葡萄糖有特异性结合的能力，显示出较为敏感的葡萄糖响应性(殷晓丽等，中国生物工程杂志，2011,31,133-139)。目前已有文献报道具有葡萄糖响应性的伴刀豆球蛋白A体系主要是水凝胶及微球(Yin R.X.et al,Carbohydrate Polymers,2014,103,369-376，专利CN201710612832.2)，然而，这些体系由于尺寸较大而难以实现皮下或静脉注射。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物，以及利用该两亲性多糖衍生物负载胰岛素制备得到的复合纳米粒，所述纳米粒能够根据环境中葡萄糖浓度的变化而智能调控胰岛素的释放，可应用于糖尿病治疗领域。
本发明的第一个目的是提供一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物。
本发明的第二个目的是提供一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述两亲性多糖衍生物在制备葡萄糖响应性的纳米制剂中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物，其中胆固醇基团通过酯键与多糖发生偶联，植物凝集素基团通过酰胺键与多糖发生偶联，其化学结构式如式(I)所示：
本发明的含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物可与治疗药物通过分子间相互作用力而自组装形成稳定的复合物纳米粒，纳米粒中的植物凝集素基团结合周围环境中游离葡萄糖分子的能力高于结合多糖链上葡萄糖基团的能力，使得两亲性多糖衍生物链段变得较为松散，纳米粒体积增大，从而释放治疗药物，具有葡萄糖响应性，其能够根据周围环境中葡萄糖浓度的变化实现智能释放治疗药物的目的。
一种含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的制备方法，为将羧基化多糖衍生物与胆固醇反应，得到含胆固醇的两亲性多糖衍生物；再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，然后加入猝灭剂猝灭未与两亲性多糖衍生物羧酸基团反应的EDC，随后加入植物凝集素进行反应，反应结束后滴加羟胺，反应溶液经透析、冷冻干燥得到含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物。
上述方法中，加入淬灭剂目的是猝灭未与两亲性多糖衍生物羧酸基团反应的EDC，防止在后续过程中植物凝集素发生自交联反应，否则将无法得到后续的纳米粒；最后加入羟胺的目的是猝灭多糖链上未反应的NHS中间体，以终止多糖衍生物与植物凝集素的酰胺化反应。
优选地，所述多糖为普鲁兰、支链淀粉、瓜尔胶、香菇多糖、直链淀粉、糖原或魔芋多糖等天然多糖，它们生物相容性好且降解产物无毒。
优选地，所述羧基化多糖衍生物参照已公开的发明专利(一种智能调控胰岛素释放的植物凝集素-多糖水凝胶及其制备和应用，林坤华，易菊珍，杨立群，吴昊，专利申请号201710612832.2)中的方法制得。
优选地，所述植物凝集素为豆科凝集素。
更优选地，所述植物凝集素为黑豆凝集素、绿豆凝集素、刀豆凝集素、花生凝集素、鹰嘴豆凝集素、菜豆凝集素或四棱豆凝集素。
优选地，所述猝灭剂为巯基乙醇、巯基丁醇等。
优选地，所述羟胺为10％羟胺水溶液。
具体地，所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的制备方法包括如下步骤：
S1.按照羧基化多糖衍生物：有机溶剂I＝0.1～1g：10～30mL的比例，将羧基化多糖衍生物溶于有机溶剂I中；
S2.按照胆固醇：有机溶剂I＝0.1～1.0g：10～50mL的比例，将胆固醇溶于有机溶剂I，缓慢滴加到S1溶液中；再按照N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)：4-(N,N’-二甲胺基)吡啶(DMAP)：有机溶剂I＝0.1～1.0g：0.1～1.0g：1～100mL的比例，将DCC和DMAP溶于有机溶剂I中，缓慢滴加到S1溶液中，于室温油浴继续搅拌反应1～24h；
S3.上述反应结束后，在反应液中滴加有机溶剂II，离心，收集沉淀；将沉淀溶于有机溶剂I，再滴加有机溶剂II，离心，收集沉淀，重复该溶解-沉淀过程2～3次；
S4.将S3所述沉淀置于反应容器中，待有机溶剂挥发后，加入蒸馏水，搅拌至分散均匀，透析，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性多糖衍生物；
S5.按照两亲性多糖衍生物：缓冲溶液＝0.1～1g：1～10mL，将S4所述两亲性多糖衍生物溶于缓冲溶液中；
S6.按照植物凝集素：缓冲溶液＝0.01～0.05g：1～10mL，将植物凝集素溶于含金属离子的缓冲溶液中，4℃放置1～30h；
S7.按照EDC：NHS：缓冲溶液＝0.01～0.05g：0.1～0.5g：1～10mL，将EDC和NHS溶解于缓冲溶液中，再加入到S5溶液中，室温搅拌活化1～30min；
S8.向S7所述溶液加入巯基乙醇，反应1～10h，加入S6所述植物凝集素，室温搅拌反应1～24h；
S9.向S8所述溶液滴加10％羟胺水溶液，室温反应1～24h，反应溶液透析，冷冻干燥得到含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物；
步骤S5、S6和S7中所述缓冲溶液的pH＝4～7。
步骤S1～S3中有机溶剂I的作用是溶解羧基化多糖衍生物、胆固醇和两亲性多糖衍生物；步骤S3中有机溶剂II的作用是沉淀含有胆固醇的两亲性多糖衍生物。
优选地，步骤S1～S3所述有机溶剂I为氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺或乙腈，所述的有机溶剂II为丙酮、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或异丙酮。
优选地，步骤S4的有机溶剂挥发时间为0.5～4h。
优选地，步骤S3所述离心为500～50000转/min离心5～30min。
优选地，为了保持多糖衍生物及植物凝集素的生物活性，所述室温为15～40℃。
优选地，为了使多糖衍生物充分溶解，提高多糖衍生物反应的程度，步骤S1和S5中所述溶解为搅拌溶解，多糖衍生物溶液的搅拌速度为300～1000rpm/min，搅拌时间为1～24h。
优选地，步骤S4、S9所述透析为使用截流分子量为500～50000Da的透析袋，透析时间为1～5天；目的在于除去溶剂及未反应的原料，采用常规的纯水透析即可。
优选地，步骤S4、S9中所述冷冻干燥的温度是-60～0℃，时间是1～24h，其目的是使多糖衍生物在低温下完成干燥，维持其活性不会发生变化。
步骤S5、S6和S7中采用缓冲溶液(pH＝4～7)作为反应溶剂，避免在后续植物凝集素与的反应中发生植物凝集素的构象改变。可以选择本领域常用的缓冲溶液(pH＝4～7)；优选地，所述缓冲液为乙酸–乙酸钠缓冲液(pH4.0)、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)、柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.3)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液(pH7.4)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液(pH6.2)或磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液(pH6.8)等。
优选地，所述缓冲液为含金属离子的缓冲液。
优选地，步骤S6按照金属离子：缓冲液：植物凝集素＝0.03～3mg：0.1～2mL：0.1～10mg的比例，向缓冲液中加入金属离子和植物凝集素。
步骤S6中加入各种金属离子的目的是为了活化植物凝集素，从而提高植物凝集素与葡萄糖发生特性结合的能力。
再优选地，所述金属离子为氯化镁，氯化钙或氯化锰中的一种或多种。
更优选地，所述S6所述金属离子中氯化镁：氯化钙：氯化锰＝0.01～1mg：0.01～1mg：0.01～1mg。
优选地，步骤S8为向S7所述溶液中加入巯基乙醇0.1～0.5g。
优选地，向S8反应结束后的溶液中，滴加10％羟胺水溶液0.1～0.5g。
本发明还请求保护所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物在制备葡萄糖响应性的两亲性多糖衍生物纳米粒中的应用。
一种葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒，将含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物，进一步在临界聚集浓度时得到纳米粒，负载药物后得到具有葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒。
优选地，所述药物为胰岛素，得到智能调控胰岛素释放的纳米制剂，用于治疗糖尿病；其智能调控胰岛素释放的机理是，纳米粒中植物凝集素基团结合周围环境中游离葡萄糖分子的能力高于结合多糖链上葡萄糖基团的能力，使得两亲性多糖衍生物链段变得较为松散，纳米粒体积增大，从而释放胰岛素。
所述纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.按照含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物：缓冲溶液＝0.001～0.1g：10～100mL，将含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物溶于缓冲溶液中；
S2.按照胰岛素：缓冲溶液＝0.001～0.05g：1～50mL，将胰岛素溶于缓冲溶液中，再加入到S1溶液中，混合搅拌1～24h；
S3.将步骤S2得到的溶液进行离心，沉淀即为负载胰岛素的两亲性多糖衍生物纳米粒；
S4.所述S3离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外可见分光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性多糖衍生物的总量之比)。
优选地，为了保持多糖衍生物、植物凝集素和胰岛素的生物活性，所述室温为15～40℃。
优选地，步骤S1、S2中所述缓冲液可以选择本领域常用的缓冲溶液(pH＝4～7)；优选地，所述缓冲液为乙酸–乙酸钠缓冲液(pH4.0)、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)、柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.3)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液(pH7.4)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液(pH6.2)或磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液(pH6.8)等。
本发明还请求保护所述葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒在制备治疗糖尿病药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物含有能与葡萄糖发生特异性结合的植物凝集素基团，其结合周围环境中游离葡萄糖分子的能力高于结合多糖链上葡萄糖基团的能力，使得两亲性多糖衍生物链段变得较为松散，纳米粒体积增大，从而实现根据周围环境中葡萄糖浓度的变化而智能释放药物的目的。
(2)本发明所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的合成反应条件温和，有利于保持植物凝集素的生物活性。
(3)本发明所述负载胰岛素的含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物纳米粒径为200～300nm，可实现根据周围环境中葡萄糖浓度的变化而智能释放胰岛素的目的，在糖尿病治疗领域具有一定的应用前景；且所述纳米粒制备条件温和，工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。
附图说明
图1为本发明葡萄糖响应性的胰岛素/两亲性多糖衍生物纳米粒的制备工艺流程图。
图2为本发明合成两亲性多糖衍生物的反应机理图。
图3为本发明所述负载胰岛素的两亲性多糖衍生物纳米粒智能释放胰岛素的示意图。
图4为本发明合成的两亲性直链淀粉衍生物的1H NMR图：(A)羧基化直链淀粉衍生物，(B)含有胆固醇基团的两亲性直链淀粉衍生物，(C)含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性直链淀粉衍生物。
图5为本发明所述负载胰岛素的两亲性直链淀粉衍生物纳米粒的扫描电镜图。
图6为本发明所述负载胰岛素的两亲性直链淀粉衍生物纳米粒在不同葡萄糖浓度的PBS溶液中智能释放胰岛素的行为图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的合成路线及其与胰岛素形成复合纳米粒的工艺流程图如图1所示。
两亲性多糖衍生物的合成路线的反应路线如图2所示，以羧酸化多糖衍生物为原料，首先合成含胆固醇基团的两亲性多糖衍生物，然后合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物。
负载胰岛素的两亲性多糖衍生物纳米智能释放胰岛素的示意图如图3所示，含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物与胰岛素在水溶液中通过分子间相互作用力自组装形成负载胰岛素的两亲性多糖衍生物纳米，纳米粒中植物凝集素基团结合周围环境中游离葡萄糖分子的能力高于结合多糖链上葡萄糖基团的能力，使得两亲性多糖衍生物链段变得较为松散，纳米粒体积增大，从而释放胰岛素。
实施例1
1、合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性直链淀粉衍生物
(1)称取0.1克羧基化直链淀粉衍生物，溶于20毫升的二甲基亚砜中，于油浴中15℃搅拌溶解2小时；
(2)称取0.2克胆固醇于10毫升乙醇中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，再称取0.5克DCC和1.1克DMAP溶解于100毫升有机溶剂中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，于15℃油浴继续搅拌反应1小时；
(3)上述反应结束后，在反应液中滴加1mL丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性直链淀粉衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。将沉淀溶解于20mL乙醇，滴加1～20mL丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性直链淀粉衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。重复该溶解-沉淀过程两次；
(4)将步骤(3)所述沉淀置于烧杯中，待乙醇挥发后，加入2mL蒸馏水，搅拌12h至分散均匀(5000转/min)。用蒸馏水透析1天(截留分子量1000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性直淀粉衍生物；
(5)称取步骤(4)所述两亲性直链淀粉衍生物0.1克，溶解于2毫升乙酸–乙酸钠缓冲液中，15℃搅拌溶解2h(5000转/min)；
(6)称取刀豆凝集素0.01克溶解于含氯化镁：氯化钙：氯化锰＝0.01mg：0.01mg：0.01mg的1mL乙酸–乙酸钠缓冲液，放置于4℃冰箱中2小时。
(7)称取EDC 0.01克和NHS 0.2克，溶解于1mL乙酸–乙酸钠缓冲液，加入到步骤(6)溶液中，15℃搅拌(500转/min)活化1min。
(8)称取巯基乙醇0.2克加入到步骤(7)溶液中，反应1h，加入步骤(6)所述刀豆凝集素，15℃搅拌反应2h(500转/min)。
(9)所述反应结束后，加入10％羟胺水溶液0.1克，15℃反应2h。得到的反应溶液用蒸馏水透析1天(截留分子量5000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇和刀豆凝集素基团的两亲性直链淀粉衍生物。
图4为羧基化直链淀粉衍生物原料、含有胆固醇基团的两亲性直链淀粉衍生物及含有胆固醇和刀豆凝集素基团的两亲性直链淀粉衍生物的1HNMR谱图。对比羧基化直链淀粉衍生物的1H NMR谱图(图4A)，在含有胆固醇基团的两亲性直链淀粉衍生物的1H NMR谱图中(图4B)，2.4～0.6ppm处出现了胆固醇的质子峰，证实合成出含有胆固醇的两亲性直链淀粉衍生物。进一步通过1H NMR积分法，对羧基化直链淀粉衍生物的H1峰(a峰)和胆固醇质子峰进行积分，根据公式(1)计算出含有胆固醇的两亲性直链淀粉衍生物中胆固醇基团的取代度为0.02。取代度的定义：含有胆固醇基团的两亲性直链淀粉衍生物中平均每个葡萄糖单元中胆固醇基团的数目。
DSchol＝Nchol/NGlc＝Ichol/(43Ia) (1)
式中，43是胆固醇的质子数，DSChol为含有胆固醇的两亲性直链淀粉衍生物中胆固醇的取代度，Nchol是胆固醇的数目，NGlc是葡萄糖单元的数目，Ichol和Ia分别为胆固醇质子峰的积分面积以及a峰的积分面积。
对比图4B和图4C，在含有胆固醇和刀豆凝集素的两亲性直链淀粉衍生物的1HNMR谱图中(图4C)，10.0～6.0ppm处出现刀豆凝集素酰胺键的质子峰，证实合成出含有胆固醇和刀豆凝集素基团的两亲性直链淀粉衍生物。进一步通过1H NMR积分法，对羧基化直链淀粉衍生物的H1峰(a峰)和豆凝集素酰胺键质子峰进行积分，根据公式(2)计算出含有胆固醇和刀豆凝集素的两亲性直链淀粉衍生物中刀豆凝集素的取代度为0.006。取代度的定义：含有胆固醇和刀豆凝集素的两亲性直链淀粉衍生物中平均每个葡萄糖单元中刀豆凝集素的数目。
DSConA＝NConA/NGlc＝(M氨基酸/MConA)×(I-NH-/Ia) (2)
式中，DSConA为含有胆固醇和刀豆凝集素的两亲性直链淀粉衍生物中刀豆凝集素的取代度，NConA为刀豆凝集素的分子量(25500Da)，M氨基酸为刀豆凝集素中氨基酸残基的平均相对分子量(110Da)，I-NH-和Ia分别为酰胺键质子峰的积分面积以及a峰的积分面积。(推导公式(2)的备注条件：①假设1个刀豆凝集素分子中酰胺键的数量与氨基酸残基的数量相等，那么，1个刀豆凝集素分子酰胺键的数量＝MConA/M氨基酸，则NConA＝N-NH-/(MConA/M氨基酸)；②1个葡萄糖单元中含有1个a位的质子，那么，葡萄糖单元数量则与a位质子的数量相等，即NGlc＝Na；③根据NMR积分法的原则，NNH-/Na＝I-NH-/Ia。)
2、制备负载胰岛素的两亲性直连淀粉衍生物纳米粒
(1)称取0.001克含有胆固醇和刀豆凝集素的两亲性直链淀粉衍生物，溶解于20毫升的乙酸–乙酸钠缓冲液中，15℃搅拌(500转/min)2小时。
(2)称取0.001克的胰岛素，溶解于1毫升的乙酸–乙酸钠缓冲液中，加入到上述步骤(1)溶液中，混合搅拌2小时。
(3)将步骤(2)得到的溶液进行离心(500转/min，5min)，得到的凝胶沉淀为胰岛素/两亲性直链淀粉衍生物纳米粒。
(4)所述步骤(3)离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外-可见分光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性直链淀粉衍生物的总量之比)。
图5为负载胰岛素的两亲性直连淀粉衍生物纳米粒的扫描电镜照片。可以清晰的看到圆球状的纳米粒，并且粒径大约在200～300nm之间。
图6是负载胰岛素的两亲性直连淀粉衍生物纳米粒分别在无葡萄糖溶液、低浓度葡萄糖溶液以及高浓度葡萄糖溶液中的释放曲线，可以看到胰岛素释放率随着葡萄糖浓度的提高而增大，表现出较好的根据葡萄糖浓度的变化智能调控胰岛素释放的性能。
实施例2
1、合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性糖原衍生物
(1)称取0.3克羧基化糖原衍生物，溶于15毫升的乙腈中，于油浴中40℃搅拌溶解5小时；
(2)称取0.2克胆固醇于10毫升丙酮中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，再称取1.0克DCC和1.0克DMAP溶解于100毫升丙酮中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，继续搅拌反应5小时。
(3)上述反应结束后，在反应液中滴加1mL丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性糖原衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。将沉淀溶解于20mL乙醇，滴加1～20mL丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性糖原衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。重复该溶解-沉淀过程两次。
(4)将步骤(3)所述沉淀置于烧杯中，待丙酮挥发后，加入10mL蒸馏水，搅拌5h至分散均匀(50000转/min)。用蒸馏水透析2天(截留分子量10000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性糖原衍生物。
(5)称取步骤(4)所述两亲性糖原衍生物1克，溶解于10毫升柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中，40℃搅拌溶解24h(1000转/min)。
(6)称取花生凝集素0.02克溶解于含氯化镁：氯化锰＝0.05mg：0.05mg的10mL柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液，放置于4℃冰箱中20小时。
(7)称取EDC 0.05克和NHS 0.5克，溶解于5mL柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液，加入到步骤(6)溶液中，室温搅拌(1000转/min)活化30min。
(8)称取巯基乙醇0.5克加入到步骤(7)溶液中，反应5h，加入步骤(6)所述花生凝集素，40℃搅拌反应5h(1000转/min)。
(9)所述反应结束后，加入10％羟胺水溶液0.5克，40℃反应5h。得到的反应溶液用蒸馏水透析2天(截留分子量10000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇和刀豆凝集素基团的两亲性糖原衍生物。
2、制备负载胰岛素的两亲性糖原衍生物纳米粒
(1)称取0.1克含有胆固醇和花生凝集素基团的两亲性糖原衍生物，溶解于100毫升的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中，40℃搅拌(1000转/min)5小时。
(2)称取0.002克的胰岛素，溶解于50毫升的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中，加入到上述步骤(1)溶液中，混合搅拌5小时。
(3)将步骤(2)得到的溶液进行离心(10000转/min，30min)，得到的凝胶沉淀为胰岛素/两亲性糖原衍生物纳米粒。
(4)所述步骤(3)离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外可见风光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性糖原衍生物的总量之比)。
实施例3
1、合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性瓜尔胶衍生物
(1)称取0.5克羧基化瓜尔胶衍生物，溶于15毫升的甲酰胺中，于油浴中20℃搅拌溶解20小时；
(2)称取0.5克胆固醇于15毫升二甲基甲酰胺中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，再称取0.5克DCC和1.5克DMAP溶解于100毫升二甲基甲酰胺中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，继续搅拌反应20小时。
(3)上述反应结束后，在反应液中滴加1mL异丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性糖原衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。将沉淀溶解于20mL二甲基甲酰胺，滴加1～20mL异丙酮沉淀含有胆固醇的两亲性糖原衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。重复该溶解-沉淀过程两次。
(4)将步骤(3)所述沉淀置于烧杯中，待二甲基甲酰胺挥发后，加入5mL蒸馏水，搅拌12h至分散均匀(7000转/min)。用蒸馏水透析1天(截留分子量7000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性鹰嘴豆衍生物。
(5)称取步骤(4)所述两亲性瓜尔胶衍生物0.1克，溶解10毫升柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液中，20℃搅拌溶解10h(600转/min)。
(6)称取鹰嘴豆凝集素0.02克溶解于含氯化钙：氯化锰＝1mg：0.01mg的1mL柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液，放置于4℃冰箱中1小时。
(7)称取EDC 0.02克和NHS 0.4克，溶解于1mL柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液，加入到步骤(6)溶液中，20℃搅拌(700转/min)活化30min。
(8)称取巯基乙醇0.4克加入到步骤(7)溶液中，反应1h，加入步骤(6)所述鹰嘴豆凝集素，20℃搅拌反应20h(6000转/min)。
(9)所述反应结束后，加入10％羟胺水溶液0.4克，反应20h。得到的反应溶液用蒸馏水透析1天(截留分子量7000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇和鹰嘴豆凝集素基团的两亲性瓜尔胶衍生物。
2、制备负载胰岛素的两亲性瓜尔胶衍生物纳米粒
(1)称取0.008克含有胆固醇和鹰嘴豆凝集素基团的两亲性瓜尔胶衍生物，溶解于70毫升的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液中，20℃搅拌(1000转/min)20小时。
(2)称取0.03克的胰岛素，溶解于10毫升的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液中，加入到上述步骤(1)溶液中，混合搅拌20小时。
(3)将步骤(2)得到的溶液进行离心(7000转/min，30min)，得到的凝胶沉淀为胰岛素/两亲性瓜尔胶衍生物纳米粒。
(4)所述步骤(3)离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外可见风光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性瓜尔胶衍生物的总量之比)。
实施例4
1、合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性香菇多糖衍生物
(1)称取1.0克羧基化香菇多糖衍生物，溶于30毫升的二甲亚砜中，于油浴中30℃搅拌溶解1～24小时；
(2)称取1.0克胆固醇于30毫升二甲基亚砜中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，再称取1.0克DCC和0.5克DMAP溶解于100毫升二甲基亚砜中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，继续搅拌反应15小时。
(3)上述反应结束后，在反应液中滴加1mL乙醇沉淀含有胆固醇的两亲性香菇多糖衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。将沉淀溶解于20mL二甲基亚砜，滴加1～20mL乙醇沉淀含有胆固醇的两亲性香菇多糖衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。重复该溶解-沉淀过程两次。
(4)将步骤(3)所述沉淀置于烧杯中，待二甲基亚砜挥发后，加入10mL蒸馏水，搅拌12h至分散均匀(30000转/min)。用蒸馏水透析3天(截留分子量30000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性香菇多糖衍生物。
(5)称取步骤(4)所述两亲性香菇多糖衍生物1克，溶解于10毫升磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液中，30℃搅拌溶解24h(1000转/min)。
(6)称取黑豆凝集素0.03克溶解于含氯化镁：氯化钙＝1mg：0.06mg的1mL磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液，放置于4℃冰箱中20小时。
(7)称取EDC 0.02克和NHS 0.4克，溶解于10mL磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液，加入到步骤(6)溶液中，30℃搅拌(1000转/min)活化15min。
(8)称取巯基乙醇0.5克加入到步骤(7)溶液中，反应10h，加入步骤(6)所述黑豆凝集素，30℃搅拌反应24h(1000转/min)。
(9)所述反应结束后，加入10％羟胺水溶液0.5克，反应24h。得到的反应溶液用蒸馏水透析1天(截留分子量30000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇和刀豆凝集素基团的两亲性香菇多糖衍生物。
2、制备负载胰岛素的两亲性香菇多糖衍生物纳米粒
(1)称取0.006克含有胆固醇和黑豆凝集素基团的两亲性香菇多糖衍生物，溶解于100毫升的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液中，30℃搅拌(700转/min)24小时。
(2)称取0.05克的胰岛素，溶解于10毫升的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液中，加入到上述步骤(1)溶液中，混合搅拌24小时。
(3)将步骤(2)得到的溶液进行离心(30000转/min，30min)，得到的凝胶沉淀为胰岛素/两亲性香菇多糖衍生物纳米粒。
(4)所述步骤(3)离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外可见风光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性香菇多糖衍生物的总量之比)。
实施例5
1、合成含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性普鲁兰多糖衍生物
(1)称取1克羧基化普鲁兰多糖衍生物，溶于30毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，于油浴中25℃搅拌溶解15小时；
(2)称取1.0克胆固醇于50毫升氯仿中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，再称取1.0克DCC和1.0克DMAP溶解于100毫升氯仿中，缓慢滴加到步骤(1)溶液中，继续搅拌反应24小时。
(3)上述反应结束后，在反应液中滴加1mL乙醇沉淀含有胆固醇的两亲性普鲁兰多糖衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。将沉淀溶解于20mL二甲基亚砜，滴加1～20mL乙醇沉淀含有胆固醇的两亲性普鲁兰多糖衍生物，离心(5000转/min，5min)，收集沉淀。重复该溶解-沉淀过程两次。
(4)将步骤(3)所述沉淀置于烧杯中，待氯仿挥发后，加入8mL蒸馏水，搅拌12h至分散均匀(8000转/min)。用蒸馏水透析3天(截留分子量8000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性普鲁兰多糖衍生物。
(5)称取步骤(4)所述两亲性普鲁兰多糖衍生物1.0克，溶解10毫升磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液中，25℃搅拌溶解24h(800转/min)。
(6)称取四棱豆凝集素0.05克溶解于含氯化镁：氯化钙：氯化锰＝0.05mg：0.05mg：0.05mg的10mL磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，放置于4℃冰箱中24小时。
(7)称取EDC 0.013克和NHS 0.3克，溶解于8mL磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液，加入到步骤(6)溶液中，25℃搅拌(5800转/min)活化30min。
(8)称取巯基乙醇0.3克加入到步骤(7)溶液中，反应10h，加入S6所述四棱豆凝集素，25℃搅拌反应24h(800转/min)。
(9)所述反应结束后，加入10％羟胺水溶液0.5克，反应24h。得到的反应溶液用蒸馏水透析3天(截留分子量7000Da)，冷冻干燥得到含有胆固醇和四棱豆凝集素基团的两亲性普鲁兰多糖衍生物。
2、制备负载胰岛素的两亲性普鲁兰多糖衍生物纳米粒
(1)称取0.1克含有胆固醇和四棱豆凝集素基团的两亲性普鲁兰多糖衍生物，溶解于100毫升的磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液中，25℃搅拌(1000转/min)24小时。
(2)称取0.05克的胰岛素，溶解于30毫升的磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液中，加入到上述步骤(1)溶液中，混合搅拌24小时。
(3)将步骤(2)得到的溶液进行离心(8000转/min，30min)，得到的凝胶沉淀为胰岛素/两亲性普鲁兰多糖衍生物纳米粒。
(4)所述步骤(3)离心得到的上清液中含有未被纳米粒负载的胰岛素，通过紫外可见风光光度法可计算出未被纳米粒负载胰岛素的量，进而可计算纳米粒中胰岛素的载药量(定义为纳米粒中胰岛素的重量与两亲性普鲁兰多糖衍生物的总量之比)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒，将含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物，进一步在临界聚集浓度时得到纳米粒，负载药物后得到具有葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒；
所述含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物的化学结构式如式（I）所示：
式（I）；
所述两亲性多糖衍生物中胆固醇基团的取代度为0.02，植物凝集素基团的取代度为0.006，两亲性多糖衍生物中胆固醇基团和植物凝集素基团的数量比为10:3；
所述两亲性多糖衍生物的制备方法为，将羧基化多糖衍生物与胆固醇反应，得到含胆固醇的两亲性多糖衍生物；再加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，然后加入猝灭剂猝灭未与两亲性多糖衍生物羧酸基团反应的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，随后加入植物凝集素进行反应，反应结束后滴加羟胺，反应溶液经透析、冷冻干燥得到含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为胰岛素。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述多糖为普鲁兰、支链淀粉、瓜尔胶、香菇多糖、直链淀粉或糖原。
4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，所述植物凝集素为黑豆凝集素、绿豆凝集素、刀豆凝集素、花生凝集素、鹰嘴豆凝集素、菜豆凝集素或四棱豆凝集素。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述两亲性多糖衍生物的制备方法具体包括如下步骤：
S1.按照羧基化多糖衍生物：有机溶剂I=0.1～1g：10～30mL的比例，将羧基化多糖衍生物溶于有机溶剂I中；
S2.按照胆固醇：有机溶剂I=0.1～1.0g：10～50mL的比例，将胆固醇溶于有机溶剂I，缓慢滴加到S1得到的溶液中；再按照DCC：DMAP：有机溶剂I=0.1～1.0g：0.1～1.0g：1～100mL的比例，将DCC和DMAP溶于有机溶剂I中，缓慢滴加到S1得到的溶液中，于室温油浴继续搅拌反应1～24h；
S3.上述反应结束后，在反应液中滴加有机溶剂II，离心，收集沉淀；将沉淀溶于有机溶剂I，再滴加有机溶剂II，离心，收集沉淀，重复溶解-沉淀过程2～3次；
S4.将S3得到的沉淀置于反应容器中，待有机溶剂挥发后，加入蒸馏水，搅拌至分散均匀，透析，冷冻干燥得到含有胆固醇的两亲性多糖衍生物；
S5.按照两亲性多糖衍生物：缓冲溶液=0.1～1g：1～10mL，将S4所述两亲性多糖衍生物溶于缓冲溶液中；
S6.按照植物凝集素：缓冲溶液=0.01～0.05g：1～10mL，将植物凝集素溶于含金属离子的缓冲溶液中，4℃放置1～30h；
S7.按照EDC：NHS：缓冲溶液=0.01～0.05g：0.1～0.5g：1～10mL，将EDC和NHS溶解于缓冲溶液中，再加入到S5得到的溶液中，室温搅拌活化1～30min；
S8.向S7得到的溶液中加入巯基乙醇，反应1～10h，加入S6得到的溶液，室温搅拌反应1～24h；
S9.向S8得到的溶液滴加10%羟胺水溶液，室温反应1～24h，反应溶液透析，冷冻干燥得到含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物；
步骤S5、S6和S7中所述缓冲溶液的pH=4～7。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述葡萄糖响应性的药物/两亲性多糖衍生物纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.按照含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物：缓冲溶液=0.001～0.1g：10～100mL，将含有胆固醇和植物凝集素基团的两亲性多糖衍生物溶于缓冲溶液中；
S2.按照胰岛素：缓冲溶液=0.001～0.05g：1～50mL，将胰岛素溶于缓冲溶液中，再加入到S1得到的溶液中，混合搅拌1～24h；
S3.将步骤S2得到的溶液进行离心，沉淀即为胰岛素/两亲性多糖衍生物纳米粒。
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