CN113384749A - 用于促进血运长效开放的多功能水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于促进超长皮瓣移植术后血运长效开放的多功能水凝胶及其制备方法，属于多功能水凝胶技术领域。是以天然多糖、明胶为原材料，通过对其简单改性使其具有多种生物功能；具体是将纳米明胶微球掺杂到凝胶内部，然后将CORM直接掺杂到凝胶中，再将GSNO负载到纳米明胶微球中，构建具有生物多功能性、可梯度缓释药物分子，长时促进血管开放的多功能凝胶。本发明生物原材料来源广泛，价格低廉，修饰后无生物毒性。本发明所述的促进血运长效开放的凝胶给药方式简单，可局部术中给药，凝胶具有良好的黏附止血，抗菌效果，减轻术中出血和术后感染风险，可局部缓释两种气体药物分子，可避免静脉给药所带来的过量剂量循环毒性。

Description

用于促进血运长效开放的多功能水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于多功能水凝胶技术领域，具体涉及一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶及其制备方法。
背景技术
皮瓣移植作为临床工作中严重创面缺损和整形修复再造的最重要手段，一直受到血供不足和远端坏死的困扰，而血运的开放程度直接决定了皮肤组织移植的存活率和最终结局。同时修复面积越大，皮瓣坏死的风险也就越高。因此，开发一种有效的可促进超长皮瓣移植术后血运长效开放并可长效维持的生物材料进而解决实际工作中复杂的修复需求成为当前工作的重中之重。
人们开发了多种促进皮肤移植血运长效开放的临床手段，如直流电刺激、choke区血管吻合、小分子药物等。但现有研究往往集中在手术前预处理阶段，操作复杂、干预时间缺点限制了在紧急情况下的使用。因而获得一种更便捷的即时促进血运长效开放并得以长效维持的手段成为关键。人们研究发现，气体分子能很好地透过血管壁进而到达血液中，而一氧化碳(CO)与一氧化氮(NO)气体分子可以激活环磷鸟嘌呤核苷(cGMP)与钾-钙离子运输信号通路，进而很好地促进血管开放，提高血运效果。但由于其两种气体分子具有浓度依赖性，浓度过高具有很大的生物毒性甚至致死性，因此在临床应用中有诸多限制。
水凝胶具有良好的生物相容性，与细胞外基质相似，可根据组织修复客观需求进而对其进行合理的改性，使其具有相应的生物功能，近些年来被人们广泛应用。
基于此，本实验通过对水凝胶合理的设计，以天然多糖和明胶为原材料，合成了负载两种可通过水解缓释气体分子的药物(三羰基氯(甘氨酸基)钌，Cas号，475473-26-8，CO气体分子药物(CORM)；S-亚硝基谷胱甘肽)，Cas号，57564-91-7，NO气体分子药物(GSNO)，使其梯度缓释，使其具有前期促进血管开放，且可长时维持其开放状态的生物多功能凝胶。
发明内容
本发明的目的是以天然多糖、明胶为原材料，通过对其简单改性使其具有多种生物功能；具体是将纳米明胶微球掺杂到凝胶内部，然后将CORM直接掺杂到凝胶中，再将GSNO负载到纳米明胶微球中，构建具有生物多功能性、可梯度缓释药物分子，长时促进血管开放的多功能凝胶。本发明生物原材料来源广泛，价格低廉，修饰后无生物毒性。过程无需复杂操作。
本发明所述的促进血运长效开放的凝胶给药方式简单，可局部术中给药，凝胶具有良好的黏附止血，抗菌效果，减轻术中出血和术后感染风险。可局部缓释两种气体药物分子，可避免静脉给药所带来的过量剂量循环毒性。
本发明所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其步骤如下：
(1)儿茶酚修饰的壳聚糖(CHI-C)的制备：取2～4g壳聚糖溶于200～300mL、0.5mol/L的HCl中，充分溶解后用0.1g/mL的NaOH溶液将得到的壳聚糖酸性溶液的pH值调节为4～4.5，得到溶液A；取1～2g儿茶酚溶于8～15mL水中，在搅拌下将其倒入溶液A中，得到溶液B；取1～2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于25～50mL、体积比为1：1的水和乙醇的混合溶液中，然后将其缓慢滴入溶液B中，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为4.5～5，反应4～6h后将反应溶液倒入渗析袋，先在pH＝3～4的盐酸溶液中渗析3～5天，然后在去离子水中渗析6～8h，将渗析液完全冻干后得到儿茶酚修饰的壳聚糖，-90℃～-70℃条件下保存；
(2)醛基化修饰的葡聚糖(ODex)的制备：取2～4g葡聚糖溶于200～300mL去离子水中，得到溶液C；取3～5g高碘酸钠溶于60～100mL去离子水中，得到溶液D；在避光条件下将溶液D注入到溶液C中反应24～48h，将反应后的液体倒入渗析袋，在去离子水中渗析2～4天，将渗析液完全冻干后得到醛基化修饰的葡聚糖，-90℃～-70℃条件下保存；
(3)纳米明胶微球(nps)的制备：取1～2g明胶溶于20～50mL去离子水中，完全溶解后向其中加入20～40mL丙酮，静止片刻后将上层液体弃除，再次用20～50mL去离子水溶解，得到溶液E；然后用1mol/L的盐酸将溶液E的pH值调为1～3，再向其中缓慢滴加60～80mL丙酮，滴加完后向其中加入500～1000μL戊二醛的水溶液(质量分数为20～50％)，得到溶液F，反应12～24h后将溶液F离心，离心产物用水清洗3～5次后充分冻干得到纳米明胶微球(nps)，-90℃～-70℃条件下保存；
(4)将步骤(1)得到的儿茶酚修饰的壳聚糖与步骤(2)得到的醛基化修饰的葡聚糖分别溶于磷酸盐缓冲液中，质量分数分别为3～5％与2～5％，得到儿茶酚修饰的壳聚糖溶液和醛基化修饰的葡聚糖溶液；再将药物分子CORM加入到儿茶酚修饰的壳聚糖溶液中，得到载有药物分子CORM的儿茶酚修饰的壳聚糖溶液，其中药物分子CORM的浓度为100～200μM；
(5)将步骤(3)得到的纳米明胶微球溶于磷酸盐缓冲液中，质量分数为1～10％，得到纳米明胶微球溶液；将药物分子GSNO加入到纳米明胶微球溶液中，药物分子GSNO的浓度为200～500μM，然后将其快速置于液氮中冷冻，充分冻干后得到载有GSNO的纳米明胶微球；取载有GSNO的纳米明胶微球加入到步骤(4)获得的醛基化修饰的葡聚糖溶液中，载有GSNO的纳米明胶微球的质量分数为1～10％，然后将其与步骤(4)获得的载有药物分子CORM的儿茶酚修饰的壳聚糖溶液按体积比1：1充分共混后凝胶5～10s，从而得到具有黏附止血、抗菌抗感染、可局部梯度缓释两种气体药物分子进而促进血运长效开放的凝胶。
步骤(1)所使用的壳聚糖黏度值为100～300mpa.s，脱乙酰度为90～95％；所使用的渗析袋截留分子量为10000～15000Da；
步骤(2)所使用的葡聚糖分子量为70000～90000Da；所使用的渗析袋截留分子量为3000～3500Da；
步骤(3)中所使用的明胶为猪皮明胶；
步骤(4)、步骤(5)中所使用的磷酸盐缓冲液的pH＝7.2～7.4；
步骤(5)中多功能性凝胶不仅可以用于皮肤移植过程中(超长皮瓣移植)血运开放，也可用于全身组织器官进而促进其血运长效开放；
步骤(3)中所合成的纳米明胶微球粒径为100～300nm。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、本发明以天然多糖，明胶为原材料,修饰步骤简单，仅一步修饰得到目标产物，经渗析冻干简单处理即可得到目标产物，且整个修饰过程无强生物毒性药品使用，所获得的产物无生物毒性。
2、本发明将多糖功能化基团修饰后，赋予凝胶多种生物功能，针对于皮肤移植，可降低其出血风险，同时材料具有优异的抗菌效果可及减轻术后感染风险。
3、本发明将CORM直接掺杂到凝胶中，将载有GSNO的纳米明胶微球掺杂到凝胶结构内部，构建具有生物多功能性、可梯度缓释，长时促进血管开放的多功能凝胶，局部缓释两种气体药物分子，进而避免静脉给药带来的过量剂量循环毒性。
附图说明
图1：(a)为构建Sd大鼠背部带蒂皮瓣图片，具体操作为剥离背部皮肤，保留单侧3根带蒂动脉血管；(b)为模拟皮肤移植缺血及术中涂抹凝胶图片，具体操作为用止血夹夹断上游两个动脉，然后保留下游单支动脉进而构建单蒂带蒂皮瓣，用止血夹夹持5h后打开，进而模拟皮肤缺损状态，然后向皮肤choke区涂抹凝胶；(c)为模拟皮肤移植给药后，术后缝合图片。对应实施例5所述的造模与给药阶段。
图2：为凝胶制备流程图，具体将载药的CHI-C分别与ODex或含有nps的ODex共混，然后通过倒置实验验证成胶时间，随着nps的加入对成胶时间无明显影响，最右侧为凝胶SEM结构图像，随着nps的加入对凝胶微结构无明显改变，标尺：50μm。(Sol：液态；Gel：凝胶态)，对应实施例1～5。
图3：(a)为HUVEC细胞活死染色照片，结果显示凝胶具有良好的生物相容性，对细胞正常增值无影响，标尺：200μm；(b)为细胞CCK8活死统计柱状图，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞存活率，结果显示材料无细胞毒性；(c)为Sd大鼠内脏HE切片图片，结果显示凝胶无内脏循环毒性，标尺：100μm。(Control：细胞培养皿；CCOD：载有纳米明胶微球未载药的凝胶组；DCDM-1：质量为1mg的多功能凝胶组：DCDM-5：质量为5mg的多功能凝胶组；DCDM-10：质量为10mg的多功能凝胶组。24h，48h，72h为细胞与材料共混培养时间。Brain、Heart、Liver、Spleen、Lung、Kidney为脑，心，肝，脾，肺，肾内脏HE切片。对应实施例5。
图4：(a)为红外相机照片，通过红外相机拍摄反映出背部血运情况，温度越高，血管开放状态以及血运越好。(b)为背部choke区温度统计，结果显示相对于直接注射药物溶液，凝胶包裹药物可明显促进血运开放以及延长血运开放周期(横坐标为时间，纵坐标为背部choke相对温度)(GSNO组：GSNO分散于生理盐水中，浓度为200μM；CORM组：CORM分散于生理盐水中，浓度为100μM；GSNO+CORM组：GSNO与CORM分散于生理盐水中，浓度分别为200μM与100μM；CCOM组：载有nps的凝胶组，未载药；DCDM组：载有GSNO与CORM双组分药物和纳米明胶微球的凝胶组别，nps浓度为10％，GSNO与CORM浓度分别为200μM与100μM)。对应实施例5。
图5：(a)为背部皮肤choke区HE切片照片，标尺：400μm；(b)为统计血管直径＞0.1mm柱状图，结果显示凝胶组可明显提高血管开放程度。(横坐标为各组别，Control组：缺血空白组；GSNO+CORM组：GSNO与CORM分散于生理盐水中，浓度分别为200μM与100μM；CCOM组：载有nps的凝胶组，未载药；DCDM组：载有GSNO与CORM双组分药物和纳米明胶微球的凝胶组别，nps浓度为10％，GSNO与CORM浓度分别为200μM与100μM。纵坐标为血管直径直径＞0.1mm血管个数)。对应实施例5。
图6：(a)为背部皮肤血运情况的红外相机照片，通过红外相机反应背部皮肤血运情况进而反应皮肤存活面积。(b)为背部皮肤存活面积统计柱状图，相对于缺血组别，注射药物组和空白凝胶组，载有药物分子的凝胶可明显提高皮肤存活面积。(横坐标为各组别，Control组：缺血空白组；CORM+GSNO组：GSNO与CORM分散于生理盐水中，浓度分别为200μM与100μM；CCOM组：载有nps的凝胶组，未载药；DCDM组：载有GSNO与CORM双组分药物和纳米明胶微球的凝胶组别，nps浓度为10％，GSNO与CORM浓度分别为200μM与100μM。纵坐标为皮肤存活面积)。对应实施例5。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例1：儿茶酚修饰的壳聚糖(CHI-C)的制备
将2g壳聚糖与250mL、0.5mol/L HCl加入到500mL锥形瓶中，充分溶解后用0.1g/mLNaOH将溶液pH调为4.5，得到溶液A。取1.89g儿茶酚溶于10mL去离子水中，溶解后将其加入溶液A中得到溶液B。取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.24g溶于40mL水和乙醇的混合溶液中(水和乙醇体积比为1：1，)，将其缓慢滴入溶液B中并用1mol/L NaOH调节溶液pH为4.5，反应5h后将反应液倒入渗析袋(纤维素，截留分子量为12000Da)，用pH＝3的盐酸溶液渗析三天，然后在去离子水中渗析7h，渗析液液氮冷冻后冻干放入-80℃环境下封存，得到儿茶酚修饰的壳聚糖。
实施例2：醛基化修饰的葡聚糖(ODex)的制备
取2g葡聚糖溶于200mL去离子水中充分搅拌溶解，得到溶液C；取3g高碘酸钠溶于60mL去离子水，得到溶液D；将溶液D加入溶液C中，全程避光反应24h后倒入渗析袋(纤维素，截留分子量为3500Da)，去离子水渗析3d，渗析液液氮冷冻后冻干放入-80℃环境下封存，得到醛基化修饰的葡聚糖。
实施例3：纳米明胶微球(nps)的制备
取1.5g猪皮明胶溶于30mL去离子水中，完全溶解后向其中加入30mL丙酮，然后静止片刻后将上层液体弃除，然后再次用30mL去离子水溶解，得到溶液E。然后用1mol/L的盐酸将溶液E的pH值调为2，向其中缓慢滴加75mL丙酮，滴加完后向其中加入750μL戊二醛的水溶液(质量分数为25％)，得到溶液F。反应16h后将溶液F取出离心，离心产物用水清洗3次后充分冻干得到纳米明胶微球(nps)，-80℃条件下保存。
实施例4：载GSNO纳米明胶微球的制备
将实施例3得到的纳米明胶微球(nps)溶于pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中，质量分数为5％，得到纳米明胶微球溶液；将药物分子GSNO加入到纳米明胶微球溶液中，浓度为200μM，然后将其快速置于液氮中冷冻，冻干后取出置于-80℃环境下，得到载GSNO纳米明胶微球；
实施例5：多功能凝胶的制备
将所得到的儿茶酚修饰的壳聚糖(CHI-C)与醛基化修饰的葡聚糖(ODex)溶于pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中，质量分数分别为3％与3％；再将药物分子CORM加入到儿茶酚修饰的壳聚糖溶液中，得到载有药物分子CORM的儿茶酚修饰的壳聚糖溶液，其中药物分子CORM的浓度为100μM；将载有GSNO的纳米明胶微球加入到ODex溶液中(纳米明胶微球质量分数为10％)，然后将其与载有药物分子CORM的CHI-C溶液充分共混(共混时体积比为1：1)，将其快速涂抹至皮肤Choke区，10s后凝胶化，从而合成了具有黏附止血、抗菌抗感染、可局部梯度缓释两种气体药物分子进而长时促进血运开放的多功能凝胶。

Claims (8)

1.一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其步骤如下：
(1)儿茶酚修饰的壳聚糖的制备：取2～4g壳聚糖溶于200～300mL、0.5mol/L的HCl中，充分溶解后用0.1g/mL的NaOH溶液将得到的壳聚糖酸性溶液的pH值调节为4～4.5，得到溶液A；取1～2g儿茶酚溶于8～15mL水中，在搅拌下将其倒入溶液A中，得到溶液B；取1～2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于25～50mL、体积比为1：1的水和乙醇的混合溶液中，然后将其缓慢滴入溶液B中，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH为4.5～5，反应4～6h后将反应溶液倒入渗析袋，先在pH＝3～4的盐酸溶液中渗析3～5天，然后在去离子水中渗析6～8h，将渗析液完全冻干后得到儿茶酚修饰的壳聚糖，-90℃～-70℃条件下保存；
(2)醛基化修饰的葡聚糖的制备：取2～4g葡聚糖溶于200～300mL去离子水中，得到溶液C；取3～5g高碘酸钠溶于60～100mL去离子水中，得到溶液D；在避光条件下将溶液D注入到溶液C中反应24～48h，将反应后的液体倒入渗析袋，在去离子水中渗析2～4天，将渗析液完全冻干后得到醛基化修饰的葡聚糖，-90℃～-70℃条件下保存；
(3)纳米明胶微球的制备：取1～2g明胶溶于20～50mL去离子水中，完全溶解后向其中加入20～40mL丙酮，静止片刻后将上层液体弃除，再次用20～50mL去离子水溶解，得到溶液E；然后用1mol/L的盐酸将溶液E的pH值调为1～3，再向其中缓慢滴加60～80mL丙酮，滴加完后向其中加入500～1000μL、质量分数20～50％的戊二醛水溶液，得到溶液F，反应12～24h后将溶液F离心，离心产物用水清洗3～5次后充分冻干得到纳米明胶微球，-90℃～-70℃条件下保存；
(4)将步骤(1)得到的儿茶酚修饰的壳聚糖与步骤(2)得到的醛基化修饰的葡聚糖分别溶于磷酸盐缓冲液中，质量分数分别为3～5％与2～5％，得到儿茶酚修饰的壳聚糖溶液和醛基化修饰的葡聚糖溶液；再将药物分子CORM加入到儿茶酚修饰的壳聚糖溶液中，得到载有药物分子CORM的儿茶酚修饰的壳聚糖溶液，其中药物分子CORM的浓度为100～200μM；CORM：三羰基氯(甘氨酸基)钌，Cas号475473-26-8，CO气体分子药物；
(5)将步骤(3)得到的纳米明胶微球溶于磷酸盐缓冲液中，质量分数为1～10％，得到纳米明胶微球溶液；将药物分子GSNO加入到纳米明胶微球溶液中，药物分子GSNO的浓度为200～500μM，然后将其快速置于液氮中冷冻，充分冻干后得到载有GSNO的纳米明胶微球；取载有GSNO的纳米明胶微球加入到步骤(4)获得的醛基化修饰的葡聚糖溶液中，载有GSNO的纳米明胶微球的质量分数为1～10％，然后将其与步骤(4)获得的载有药物分子CORM的儿茶酚修饰的壳聚糖溶液按体积比1：1充分共混后凝胶5～10s，得到具有黏附止血、抗菌抗感染、可局部梯度缓释两种气体药物分子进而促进血运长效开放的凝胶；GSNO：S-亚硝基谷胱甘肽，Cas号57564-91-7，NO气体分子药物。
2.如权利要求1所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所使用的壳聚糖黏度值为100～300mpa.s，脱乙酰度为90～95％；所使用的渗析袋截留分子量为10000～15000Da。
3.如权利要求1所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的葡聚糖分子量为70000～90000Da；所使用的渗析袋截留分子量为3000～3500Da。
4.如权利要求1所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所使用的明胶为猪皮明胶。
5.如权利要求1所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(4)和步骤(5)中所使用的磷酸盐缓冲液的pH＝7.2～7.4。
6.如权利要求1所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所合成的纳米明胶微球粒径为100～300nm。
7.一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶，其特征在于：是由权利要求1～6任何一项所述的方法制备得到。
8.如权利要求7所述的一种用于促进血运长效开放的多功能水凝胶，其特征在于：用于皮肤移植过程中血运开放，或用于全身组织器官进而促进其血运长效开放。
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