IT202100017396A1 - Metodica di conservazione a temperatura ambiente di tessuti e organi destinati all’uso clinico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Metodica di conservazione a temperatura ambiente di tessuti e organi destinati all?uso clinico?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per la conservazione a temperatura ambiente di organi e tessuti umani e animali destinati all?uso clinico.
BACKGROUND DELL?INVENZIONE
I tessuti ad uso trapiantologico vengono attualmente conservati mediante la metodica del criocongelamento in vapori di azoto. Nonostante la sua validit?, la metodica di criocongelamento comporta costi elevati per la gestione della Criobanca, in cui viene stoccato il tessuto, e prevede sia lo scongelamento del tessuto presso la Banca dei tessuti prima dell?impiego clinico, sia un suo utilizzo presso la struttura richiedente entro e non oltre 72 ore dallo scongelamento. Tale limite temporale di utilizzo del tessuto crioconservato, una volta scongelato, rappresenta un grosso limite pratico per il medico clinico.
La conservazione a temperatura ambiente di tessuti ? certamente preferibile per i costi limitati e per la facilit? di impiego in clinica.
Un metodo per conservare i tessuti a temperatura ambiente prevede la liofilizzazione degli stessi. Tale metodo ha, per?, lo svantaggio di dover reidratare il tessuto prima dell?utilizzo che, comunque, non recupera la totale vitalit? e struttura.
Sono note tecniche di conservazione a temperatura ambiente dei tessuti destinati al trapianto che prevedono l?impiego di una soluzione di conservazione alcolica oppure a base di glicerolo. Sistemi noti si questo tipo sono, ad esempio:
? Dermacell? che ? una matrice dermica acellulare di origine umana processata usando la tecnologia MATRACELL? della LifeNet Health (LNH) che viene conservata in Preservon?, una soluzione brevettata dalla LNH, a base di glicerolo (soluzione modificata di Dulbecco) per la conservazione dei tessuti freschi decellularizzati e sterili a temperatura ambiente e totalmente idratati;
? AlloPatch Pliable?: ? una matrice dermica acellulare di origine umana immersa in una soluzione alcolica (etanolo 70%).
Queste soluzioni di conservazione contengono glicerolo in elevata concentrazione (e.g. >50%) e/o dei conservanti che devono essere eliminati mediante accurati lavaggi prima di poter utilizzare il tessuto per il trapianto, in quanto il glicerolo in elevate concentrazione pu? essere tossico, cos? come i conservanti. Dermacell? pu? essere utilizzato per conservare derma destinato al riparo delle ferite, ma non ? autorizzato per la conservazione di derma per l?uso nella riparazione delle ustioni. Inoltre, i due sistemi indicati sono tessuti commerciali di origine americana commercializzati nelle rispettive soluzioni di conservazione, che possono essere venduti in Europa solo se gestiti da una Banca dei Tessuti che certifica l?idoneit? del prodotto.
La presente invenzione si propone si superare gli inconvenienti noti nel settore mettendo a disposizione una soluzione di conservazione per tessuti e organi destinati all?uso clinico che abbina la convenienza della temperatura ambiente al mantenimento della necessaria bioattivit? del tessuto e all?impiego di sostanze che non richiedono lavaggi accurati prima del trapianto in quanto non tossiche.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
In un primo aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo di conservazione, preferibilmente a temperatura ambiente, di un tessuto e/o organo, isolato, destinato all?impiego clinico, cio? al trapianto in un paziente che lo necessita, in cui il metodo comprende uno step di immersione di un tessuto e/o organo in una soluzione acquosa comprendente: almeno un agente antisettico, almeno un polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente e almeno un tensioattivo. Preferibilmente, la soluzione comprende anche almeno un agente stabilizzante ed emulsificante e/o almeno un agente chelante.
In un secondo aspetto l?invenzione riguarda la soluzione acquosa comprendente gli ingredienti sopra elencati ed il suo uso per la conservazione di tessuti e/o organi.
In un terzo aspetto l?invenzione riguarda il tessuto e/o organo isolato conservato nella soluzione acquosa sopra descritta ed un contenitore contenente il tessuto e/o organo immerso nella soluzione di conservazione secondo l?invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La Fig.1 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con H&E del derma DEC dopo conservazione nella soluzione dell?invenzione dopo 1 e 2 anni.
La Fig. 2 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome del derma DEC dopo conservazione nella soluzione dell?invenzione dopo 1 e 2 anni.
La Fig. 3 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Weigert del derma DEC dopo conservazione nella soluzione dell?invenzione dopo 1 e 2 anni. La Fig. 4 mostra i risultati dell?analisi di vitalit? cellulare del Derma DEC mantenuto nella soluzione dell?invenzione per 1-2 anni.
La Fig. 5 mostra i risultati dell?analisi di citotossicit? su coltura primaria di fibroblasti umani di un estratto ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C del Derma DEC, mantenuto nella soluzione per 1-2 anni.
La Fig. 6 mostra i risultati dell?analisi di citotossicit? su coltura primaria di cheratinociti umani di un estratto, ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C del Derma DEC, mantenuto nella soluzione per 1-2 anni.
La Fig.7A mostra i dati di rilascio del fattore FGFb da parte del derma DEC dopo 1 e 2 anni dalla conservazione nella soluzione.
La Fig.7B mostra i dati di rilascio del fattore VEGF da parte del derma DEC dopo 1 e 2 anni dalla conservazione nella soluzione.
La Fig. 8 mostra la capacit? di ripopolamento del Derma DEC conservato 1-2 anni nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 9 mostra la capacit? di carico massimo del Derma DEC mantenuto 1-2 anni nella soluzione dell?invenzione rispetto ad un Derma DEC cripreservato; La Fig. 10 mostra la resistenza alla trazione di un Derma DEC mantenuto 1-2 anni nella soluzione dell?invenzione rispetto ad un Derma DEC cripreservato; La Fig. 11 mostra il modulo elastico di Young di un Derma DEC mantenuto 1-2 anni nella soluzione dell?invenzione rispetto ad un Derma DEC cripreservato; La Fig.12 mostra la rigidit? di un Derma DEC mantenuto 1-2 anni nella soluzione dell?invenzione rispetto ad un Derma DEC cripreservato;
La Fig. 13 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con H&E della membrana amniotica dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 14 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome della membrana amniotica dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 15 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Weigert della membrana amniotica dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 16 mostra i risultati dell?analisi di vitalit? cellulare della membrana amniotica dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 17 mostra i risultati dell?analisi di citotossicit? su coltura primaria di fibroblasti umani (hFs) e cheratinociti umani immortalizzati HaCaT di un estratto, ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C della membrana amniotica mantenuta nella soluzione per 1 anno.
La Fig.18A e B mostrano la bioattivit?, in termini di rilascio dei fattori di crescita bFGF e VEGF, della membrana amniotica dopo conservazione per 1 anno nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 19 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con H&E del Ded DEC dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 20 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome del Ded DEC dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 21 mostra i risultati dell?analisi istologica e colorazione con Weigert del Ded DEC dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 22 mostra i risultati dell?analisi di vitalit? cellulare del Ded DEC dopo 1 mese e dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
La Fig. 23 mostra i risultati dell?analisi di citotossicit? su coltura primaria di fibroblasti umani (hFs) e cheratinociti umani immortalizzati HaCaT di un estratto, ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C del Ded DEC mantenuto nella soluzione per 1 anno.
La Fig. 24 mostra la capacit? di ripopolamento del Ded DEC conservato per 1 anno nella soluzione dell?invenzione;
La Fig. 25 mostra la capacit? di carico massimo di un Ded DEC mantenuto 1 anno nella soluzione dell?invenzione rispetto al Derma DEC criopreservato;
La Fig. 26 mostra la resistenza alla trazione di un Ded DEC mantenuto 1 anno nella soluzione dell?invenzione rispetto al Derma DEC criopreservato;
La Fig. 27 mostra il modulo elastico di Young di un Ded DEC mantenuto 1 anno nella soluzione dell?invenzione rispetto al Derma DEC criopreservato;
La Fig. 28 mostra la rigidit? di un Ded DEC mantenuto 1 anno nella soluzione dell?invenzione rispetto al Derma DEC criopreservato.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Il metodo di conservazione di un tessuto e/o organo secondo l?invenzione comprende:
a) immergere un tessuto e/o organo isolato in una soluzione acquosa comprendente: almeno un polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente, almeno un agente antisettico e almeno un tensioattivo; c) conservare il tessuto e/o organo nella soluzione acquosa per un periodo di tempo desiderato, preferibilmente fino a 3 anni.
Il metodo di conservazione ? preferibilmente un metodo di conservazione a temperatura ambiente. Per temperatura ambiente, nel contesto della presente invenzione, si intende una temperatura superiore al punto di congelamento della soluzione acquosa, preferibilmente compresa tra 5?C e 35?C, pi? preferibilmente tra 10?C e 30?C, ancora pi? preferibilmente tra 15?C e 25?C oppure tra 18?C e 25?C. La temperatura ideale di mantenimento del contenitore comprendente la soluzione acquosa e il tessuto e/o organo ? tra 18?C e 23?C, preferibilmente tra 20?C e 23?C.
Il tessuto che pu? essere conservato con il metodo dell?invenzione ? scelto tra:
? Tessuto cutaneo o cute: costituita dallo strato epidermico contenente tutte le componenti cellulari che lo costituiscono ed un sottile strato di derma sottostante;
? Derma de-epidermizzato (Ded): costituito da derma privo dello strato epidermico sovrastante;
? Derma Decellularizzato (Derma DEC o Ded DEC): costituito da derma privo dello strato epidermico sovrastante sottoposto a metodica di decellularizzazione, come ad esempio quella descritta in WO2009050571; ? un tessuto placentare o un derivato del tessuto placentare (ad esempio la membrana amniotica, preferibilmente umana (HAM));
? un tessuto muscolo-scheletrico, ad esempio, tendini, ossa, cartilagine, nervi;
? un tessuto oculare, ad esempio, cornea e bulbo oculare;
? un tessuto scelto tra: una valvola, un vaso, aorta e un?arteria, preferibilmente un?arteria femorale;
? un tessuto appartenente all?apparato genitale maschile e/o femminile (ad esempio, prepuzio, ovaio, utero).
I tessuti o gli organi conservati con il metodo dell?invenzione sono isolati dal corpo umano o animale. Tipicamente l?organo e il tessuto sono prelevati, con consenso informato del donatore (se di origine umana) per successivamente impiantarli, previa conservazione con il metodo dell?invenzione, allo stesso soggetto (trapianto autologo) oppure ad un soggetto diverso dal donatore (trapianto omologo o eterologo).
Il tessuto o l?organo conservabile con il metodo dell?invenzione ? sia di origine umana, sia di origine animale.
Il tessuto o organo conservabile con il metodo dell?invenzione ? tessuto o organo ?tal quale? oppure tessuto o organo de-cellularizzato, cio? tessuto o organo sottoposto a metodiche di de-cellularizzazione, ad esempio alla metodica descritta in WO2009050571.
L?organo conservabile con il metodo dell?invenzione ? qualsiasi organo umano o animale.
In una forma di realizzazione, il tessuto e/o organo immerso nella soluzione ? conservato all?interno di un contenitore, preferibilmente un contenitore adatto alla conservazione di materiale biologico, ad esempio una sacca di plastica flessibile.
Il tessuto e/o organo ? immerso totalmente o completamente nella soluzione di conservazione. Pertanto, il quantitativo di soluzione da usare dipender? dalle dimensioni del tessuto o organo da conservare.
Il contenitore contenente il tessuto e/o organo immerso totalmente o parzialmente nella soluzione acquosa ? preferibilmente chiuso ermeticamente, cio? il contenitore ? sigillato.
Preferibilmente il contenitore chiuso ermeticamente ? inserito in un secondo contenitore adatto ad accogliere il contenitore contenente il tessuto e/o organo immerso totalmente o parzialmente nella soluzione acquosa. Preferibilmente il secondo contenitore ? una sovrasacca di dimensioni maggiori rispetto al primo contenitore.
Il secondo contenitore viene posto sottovuoto e chiuso, preferibilmente mediante chiusura ermetica.
Nella soluzione di conservazione, il polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente ? un polyquaternium. Polyquaternium ? il nome INCI (International Nomenclature for Cosmetic Ingredients) usato per descrivere numerosi polimeri policationici appartenenti a classi chimiche differenti ed aventi in comune la presenza di almeno un ammonio quaternario, preferibilmente pi? gruppi ammonio quaternario. All?interno della definizione ?polyquaternium? l?INCI ha approvato almeno 40 diversi polimeri che sono indicati con una numerazione progressiva assegnata in base all?ordine di registrazione e non in base alla loro natura chimica.
Ad esempio, il polyquaternium-2 ? poly[bis(2-chloroethyl) ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]; polyquaternium-6 ? poly(diallyldimethylammonium chloride); polyquaternium-48 ? un sale di ammonio quaternario polimerico formato da methacryloyl ethyl betaine, 2-hydroxyethyl methacrylate e methacryloyl ethyl trimethyl ammonium chloride.
Pertanto, i polyquaternium sono polimeri di diversa natura chimica contenenti almeno un ammonio quaternario che pu? essere salificato ad esempio con un cloruro, un solfuro ecc.
Preferibilmente, il polyquaternium impiegato nella presente soluzione di conservazione ? scelto tra uno qualsiasi dei polyquaternium da polyquaternium-1 a polyquaternium-48, cio? uno qualsiasi dei polyquaternium da 1 a 10, da 10 a 20, da 20 a 30, da 30 a 40, da 40 a 48 e loro combinazioni. In una forma di realizzazione, il polyquaternium impiegato nella presente soluzione ? una miscela di due o pi? polyquaternium scelti tra i polyquaternium da 1 a 48.
La corrispondenza tra la numerazione dei polyquaternium ed i rispettivi nomi chimici ? nota e quindi non ? interamente riportata qui.
Il polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente ? presente nella soluzione in quantit? compresa tra 0,001% e 0,010% in peso, preferibilmente tra 0,003% e 0,006% in peso.
L?almeno un agente antisettico ? scelto tra: poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente poliesametilenbiguanidina o poliesaetilenbiguanidina, glicerolo e una loro combinazione.
L?almeno un agente antisettico ? presente nella soluzione in quantit? compresa tra 0,0001% e 1%, preferibilmente tra 0,0001% e 0,8% in peso.
Nel caso in cui l?agente antisettico ? glicerolo, esso ? preferibilmente compreso nella soluzione in quantit? da 0,1% a 1% in peso, preferibilmente da 0,4% a 0,8% in peso.
Alternativamente, l?almeno un agente antisettico ? presente nella soluzione in quantit? compresa tra 0,0001% e 0,005% in peso, preferibilmente tra 0,00015% e 0,003% in peso.
L?almeno un tensioattivo ? preferibilmente un tensioattivo non ionico e idrofilico. Preferibilmente il tensioattivo ? un poloxamero. I poloxameri sono una classe di tensioattivi non ionici polimerici con una struttura a tre blocchi comprendente una catena idrofobica centrale di propileneglicole legata ai lati a due catene idrofiliche di polietilene glicole (PEG). Un esempio di poloxamero che pu? essere impiegato nella soluzione dell?invenzione ? il poloxamero 407 che ha una lunghezza della catena PEG di circa 100 unit? ripetitive e una lunghezza del blocco di propileneglicole di circa 56 unit? ripetitive.
L?almeno un tensioattivo ? presente nella soluzione acquosa in quantit? compresa tra 0,05% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso.
Preferibilmente, la soluzione acquosa di conservazione comprende ulteriormente almeno un ingrediente scelto tra: un agente stabilizzante ed emulsificante e/o un agente chelante.
L?agente chelante ? preferibilmente scelto tra: EDTA e/o suoi sali, preferibilmente il sale di sodio dell?EDTA, e acetilacetonato poliammine. La quantit? di agente chelante presente nella soluzione ? compresa tra 0,005% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,01% e 0,1% in peso.
L?almeno un agente stabilizzante ed emulsificante, se presente, ? scelto tra idrossialchilcellulosa, preferibilmente idrossimetilcellulosa.
L?almeno un agente stabilizzante ed emulsificante ? presente nella soluzione nella quantit? necessaria (q.b., quanto basta) ad ottenere un?adeguata emulsione degli ingredienti.
In una forma di realizzazione, la soluzione acquosa comprende: poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente poliesametilenbiguanidina, o glicerolo, almeno un polyquaternium da 1 a 48 oppure una miscela di polyquaternium e un poloxamero o una miscela di poloxameri.
In una forma di realizzazione, la soluzione acquosa comprende: poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente poliesametilenbiguanidina in quantit? compresa tra 0,0001% e 0,005% in peso, preferibilmente tra 0,00015% e 0,003% in peso, almeno un polyquaternium da 1 a 48 oppure una miscela di polyquaternium in quantit? compresa tra 0,001% e 0,010% in peso, preferibilmente tra 0,003% e 0,006% in peso e almeno un tensioattivo, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri, in quantit? compresa tra 0,05% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso.
In una forma di realizzazione, la soluzione acquosa comprende glicerolo in quantit? da 0,1% a 1% in peso, preferibilmente da 0,4% a 0,8% in peso, almeno un polyquaternium da 1 a 48 oppure una miscela di polyquaternium in quantit? compresa tra 0,001% e 0,010% in peso, preferibilmente tra 0,003% e 0,006% in peso e almeno un tensioattivo, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri, in quantit? compresa tra 0,05% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso.
In una forma di realizzazione, la soluzione acquosa comprende: poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente poliesametilenbiguanidina, o glicerolo, almeno un polyquaternium da 1 a 48 oppure una miscela di polyquaternium, almeno un tensioattivo, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri, idrossialchilcellulosa, preferibilmente idrossimetilcellulosa, e/o EDTA.
In una forma di realizzazione preferita la soluzione acquosa di conservazione comprende:
? poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente, poliesametilenbiguanidina, in una quantit? compresa tra 0,0001% e 0,005% in peso, preferibilmente tra 0,00015% e 0,003% in peso, e/o glicerolo in quantit? da 0,1% a 1% in peso, preferibilmente da 0,4% a 0,8% in peso;
? almeno un polyquaternium da 1 a 48 oppure una miscela di polyquaternium, cio? uno qualsiasi dei polyquaternium da 1 a 10, da 10 a 20, da 20 a 30, da 30 a 40, da 40 a 48 e loro combinazioni, in quantit? compresa tra 0,001% e 0,010% in peso, preferibilmente tra 0,003% e 0,006% in peso;
? un tensioattivo idrofilo non ionico, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri, in quantit? compresa tra 0,05% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso;
? preferibilmente, idrossialchilcellulosa, pi? preferibilmente idrossimetilcellulosa, in quantit? quanto basta (q.b.) per ottenere un?adeguata emulsione degli ingredienti; e/o
? preferibilmente, EDTA e/o un suo sale, pi? preferibilmente il sale di sodio di EDTA, in una quantit? compresa tra 0,005% e 0,5% in peso, preferibilmente tra 0,01% e 0,1% in peso.
La presenza del glicerolo nella soluzione presenta numerosi vantaggi. In particolare, il glicerolo possiede numerose propriet? ed ? anche presente in natura (glicerolo vegetale): ? idratante e agisce come potente antibatterico e antivirale, pertanto garantisce la sterilit? del prodotto finale conservato a temperatura ambiente. Inoltre, ? pi? efficace dal punto di vista biochimico rispetto ai classici antisettici/antimicrobici utilizzati nelle formulazioni cosmetiche.
Il glicerolo ? gi? utilizzato per conservare tessuti, in particolare i tessuti molli e muscoloscheletrici, tuttavia il suo utilizzo avviene in concentrazioni elevate, ad esempio > 50%. A queste quantit?, il glicerolo pu? risultare tossico sulle cellule, inficiando quindi le propriet? fisiologiche del tessuto stesso. Per tale motivo il tessuto conservato in glicerolo, ad esempio la cute glicerolata distribuita da alcune Banche della Cute italiane, deve essere sottoposto a numerosi lavaggi prima del suo utilizzo clinico.
La Richiedente ha trovato che impiegando il glicerolo in quantit? ridotte (massimo 1% in peso) in miscela con almeno un polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente e almeno un tensioattivo, si realizza la conservazione dei tessuti senza che si manifestino gli effetti negativi dovuti alla possibile tossicit? di concentrazioni elevate di glicerolo e alla necessit? di dover lavare il tessuto conservato in glicerolo ripetutamente prima del suo utilizzo. Lo stesso effetto si ottiene anche con una soluzione acquosa in cui al posto del glicerolo si usa poliesaalchilenbiguanidina, preferibilmente, poliesametilenbiguanidina.
Il metodo di conservazione dell?invenzione permette di conservare il tessuto e/o l?organo per un tempo uguale o inferiore a 3 anni, preferibilmente uguale o inferiore a 2 anni, pi? preferibilmente per un tempo compreso tra 7 giorni e 2 anni, ancora pi? preferibilmente per un tempo tra 30 giorni e 2 anni. La richiedente ha verificato, mediante gli esperimenti inclusi nella presente domanda di brevetto, che un tessuto conservato nella soluzione dell?invenzione fino a 2 anni mantiene caratteristiche morfologiche e strutturali integre ed una buona bioattivit?. Per bioattivit? si intende la capacit? del tessuto di rilasciare fattori di crescita quali FGFb e VEGF.
La capacit? di ripopolamento del tessuto, intesa come capacit? di ri-crescita di cellule vitali, si mantiene ottimale fino a 2 anni di conservazione.
Anche le propriet? meccaniche del tessuto sono conservate intatte.
Inoltre, il tessuto si mantiene sterile fino a 2 anni, cio? privo di contaminazioni batteriche o fungine e privo di endotossine batteriche e non risulta essere citotossico.
Lo scopo della conservazione del tessuto e/o organo ? quello di effettuare un trapianto di tale tessuto e/o organo in un individuo che lo necessita. Tale individuo pu? essere lo stesso soggetto dal quale ? stato prelevato il tessuto e/o organo (trapianto autologo) oppure pu? essere un soggetto diverso (trapianto omologo o eterologo).
L?invenzione riguarda anche un tessuto e/o organo immerso, parzialmente o totalmente, in una soluzione acquosa di conservazione come sopra descritta, nonch? un contenitore comprendente il tessuto e/o organo come sopra descritto immerso parzialmente o totalmente nella soluzione acquosa come sopra descritta.
Pertanto, l?invenzione si riferisce ad una composizione comprendente un tessuto e/o organo ed una soluzione acquosa di conservazione come descritta sopra, in cui il tessuto e/o organo ? parzialmente o totalmente ricoperto dalla soluzione. Il contenitore comprendente il tessuto o l?organo immerso nella soluzione acquosa di conservazione ? preferibilmente un contenitore adatto alla conservazione di materiale biologico, ad esempio una sacca di plastica flessibile. Preferibilmente, tale contenitore ? chiuso con una chiusura ermetica.
Il contenitore ? inserito in un secondo contenitore adatto ad accogliere il contenitore contenente il tessuto e/o organo immerso nella soluzione acquosa. Preferibilmente il secondo contenitore ? una sovrasacca di dimensioni maggiori rispetto al primo contenitore.
Il secondo contenitore viene posto sottovuoto e chiuso, preferibilmente mediante chiusura ermetica.
La soluzione acquosa ? presente nel contenitore contenente il tessuto e/o organo cos? da ricoprire parzialmente, preferibilmente completamente, il tessuto e/o organo. Pertanto, il quantitativo di soluzione presente nel contenitore dipender? dalle dimensioni del tessuto o organo da conservare.
L?invenzione riguarda anche una soluzione acquosa di conservazione come sopra descritta e il suo uso per conservare un tessuto e/o un organo come sopra descritti.
Esempi
Tutte le sperimentazioni qui descritte sono state eseguite con la seguente soluzione di conservazione:
? Glicerolo 0,25%
? Polyquaternium 0,004%
? EDTA 0,01%
? Poloxamer 0,18%
? Hydroxyethylcellulose (q.b)
Quantit?: 10-30 ml soluzione per campione di tessuto.
Glicerolo: 25 ?l in 10 ml e 75 ?l in 30 ml.
Sperimentazione 1: ?Conservazione a temperatura ambiente di Derma Decellularizzato (Derma DEC)?
Il Derma DEC ? stato inserito all?interno di sacche di confezionamento alle quali ? stata successivamente aggiunta la soluzione di conservazione secondo l?invenzione.
La sacca contenente il Derma DEC e la soluzione di conservazione ? stata poi sigillata ed inserita all?interno di sovrasacche sottoposte a vuoto e sigillate. Dopo 1-2 anni di conservazione del Derma DEC nella soluzione sono state effettuate le seguenti analisi:
? Analisi morfologica
? Analisi istologica e colorazione con H&E, Masson?s trichrome e Weigert ? Analisi vitalit? cellulare
? Analisi microbiologica: coltura su piastra e LAL test
? Analisi citotossicit? su colture primarie fibroblasti e linee cellulari
? Bioattivit?
? Ripopolamento
? Test meccanici
Risultati Sperimentazione 1: ?Conservazione a temperatura ambiente di Derma DEC?
Di seguito sono riportate le analisi ed i risultati ottenuti riguardo la sperimentazione 1:
Analisi morfologica
Il Derma DEC mantenuto nella soluzione per 1 e 2 anni mantiene le caratteristiche morfologiche simili al tessuto scongelato.
Analisi istologica e colorazione con H&E
Il Derma DEC mantenuto nella soluzione per 1 e 2 anni mantiene delle caratteristiche strutturali compatibili con l?utilizzo clinico (Fig.1).
Analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome
La colorazione specifica dei campioni con Masson?s trichrome identifica un mantenimento delle fibre collagene del Derma DEC - conservato nella soluzione per 1 e 2 anni - compatibile con l?utilizzo clinico (Fig.2).
Analisi istologica e colorazione con Weigert
La colorazione specifica dei campioni con Weigert identifica la perdita delle fibre elastiche del Derma DEC conservato nella soluzione per 1-2 anni (Fig.3).
Analisi vitalit? cellulare
L?analisi della vitalit? cellulare, effettuata mediante test MTT, ? stata effettuata per dimostrare la rimozione totale della componente cellulare. ? da considerare che la metodica di decellularizzazione applicata al Derma ? gi? capace di rimuovere le cellule. Tale analisi applicata su Derma DEC mantenuto in soluzione per 1-2 anni risulta quindi essere solo un?analisi di conferma della rimozione cellulare anche nei tessuti in esame. Come atteso, il Derma DEC mantenuto nella soluzione per 1-2 anni mostra la rimozione della componente cellulare Fig. 4).
Analisi microbiologica
Coltura su piastra: l?analisi microbiologica ? stata effettuata su porzioni di Derma DEC (1cm<2>), conservato nella soluzione per 1-2 anni, che sono state incubate a 37?C su piastre COS e Sabouraux rispettivamente per 3 e 14 giorni, al fine di valutare l?eventuale crescita di batteri e/o miceti. L?analisi microbiologica ha identificato l?assenza di contaminazione batterica e fungina dopo 1-2 anni di conservazione del Derma DEC nella soluzione.
LAL test: il LAL test ? stato effettuato per valutare l?eventuale presenza di endotossine batteriche, rilasciate dal tessuto, nel liquido di conservazione. I risultati mostrano che non sono presenti endotossine batteriche nella soluzione utilizzata per conservare 1-2 anni il Derma DEC.
Analisi citotossicit? su coltura primaria di fibroblasti umani e su linea cellulare di cheratinociti umani
L?analisi della citotossicit? cellulare ? stata effettuata trattando:
? coltura primaria di fibroblasti umani (hFs)
? la linea cellulare di cheratinociti umani immortalizzati HaCaT
con un estratto, ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C del Derma DEC, mantenuto nella soluzione per 1-2 anni, con il terreno di coltura RPMI 1640 1% antibiotici, in un rapporto Derma DEC/RPMI di 25cm<2>/100 ml. Le cellule sono state successivamente trattate con l?estratto per 2, 24 e 72h e sono state successivamente sottoposte a test MTT per valutarne la vitalit? (campioni: SS 1 aa e SS 2aa). ? stato utilizzato un estratto ottenuto da Derma DEC criocongelato, scongelato e immediatamente immerso in RMPI 1640, come controllo (campione CRIO). Cellule non trattate e mantenute in terreno di coltura RPMI 1640 1% antibiotici in presenza o assenza di siero fetale bovino, sono state utilizzate come controllo della vitalit? e crescita cellulare nei tempi di analisi (campioni SIERO e NO SIERO). I risultati dimostrano che l?estratto non risulta tossico per le cellule (Fig.5-6).
Bioattivit?
L?analisi della bioattivit? del Derma DEC conservato 1-2 anni nella soluzione ? stata effettuata incubando per 3 giorni a 4?C il tessuto con il terreno di coltura RPMI 1640 1% antibiotici, in un rapporto Derma DEC/RPMI di 25cm<2>/100 ml. Il terreno incubato con il tessuto ? stato quindi centrifugato dopo 3 giorni e sottoposto a saggio ELISA, al fine di identificare il rilascio dei fattori di crescita FGFb e VEGF, importanti per la rigenerazione tissutale e l?angiogenesi.
I risultati dimostrano che:
? Il Derma DEC rilascia il fattore di crescita FGFb a livelli paragonabili dopo 1 e 2 anni di conservazione nella soluzione. La quantit? di FGFb rilasciata dal derma DEC dopo 1-2 anni di conservazione nella soluzione risulta inferiore circa del 40% rispetto al suo rilascio dal Derma DEC criopreservato. Il Derma DEC liofilizzato mostra un rilascio del fattore FGFb notevolmente inferiore rispetto agli altri tre campioni (Fig 7 A). ? Il Derma DEC conservato nella soluzione rilascia il fattore di crescita VEGF a livelli paragonabili dopo 1 e 2 anni. La quantit? di VEGF rilasciata dal derma DEC dopo 1-2 anni di conservazione nella soluzione risulta paragonabile al suo rilascio da parte del Derma DEC criopreservato e liofilizzato (Fig 7 B).
Il Derma DEC conservato nella soluzione mantiene quindi capacit? bioattive. Ripopolamento
La capacit? di ripopolamento del Derma DEC conservato 1-2 anni nella soluzione ? stata effettuata mettendo in coltura in vitro su di esso, precedentemente lavato e asciugato su garza, colture primarie di fibroblasti umani. Il saggio MTT identifica la capacit? di ripopolamento del Derma DEC in vitro con cellule vitali paragonabile al controllo, ovvero Derma DEC criocongelato (Fig.8).
Test meccanici
I test meccanici sono stati effettuati presso ?Scienze e Tecnologie Chirurgiche? ? Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna ? utilizzando strumentazioni convalidate per la clinica. In particolare, i test meccanici sono stati effettuati su Derma DEC conservato 1-2 anni in soluzione, al fine di valutarne le propriet? biomeccaniche. Il Derma DEC criopreservato ? stato utilizzato come controllo. In particolare, lo spessore, la larghezza, la lunghezza e l?area (mm<2>) di ogni campione sono stati misurati usando un calibro digitale. I test tensili sono stati effettuati bloccando la parte inferiore e superiore dei campioni all?impugnatura inferiore fissa e all?impugnatura superiore mobile dell?apparato di prova di trazione. Per ogni campione sono stati misurati il carico massimo (peak load), la resistenza alla trazione (peak stress), il modulo elastico di Young (Young?s modulus) e la rigidit? (slope).
I risultati dimostrano che il Derma DEC mantenuto 1-2 anni in soluzione ha una capacit? di carico massimo paragonabile (1 anno) o significativamente superiore (p<0,5) (2 anni) del Derma DEC criopreservato (Fig. 9), una resistenza alla trazione paragonabile al Derma DEC criopreservato (Fig.10), un modulo elastico di Young significativamente superiore (p<0,5) rispetto al Derma DEC criopreservato (Fig.11) ed una rigidit? paragonabile (1 anno) o significativamente superiore (p<0,05) (2 anni) rispetto al Derma DEC criopreservato (Fig.12). ? da considerare che la metodica enzimatico-fisica utilizzata per la decellularizzazione ? capace di aumentare nel tempo alcuni parametri biologici tra cui il carico massimo e la rigidit?.
Conclusioni sperimentazione 1
La soluzione di conservazione dell?invenzione ? capace di mantenere l?integrit? strutturale e la sterilit? del Derma DEC fino a 2 anni di conservazione. Il derma DEC cos? conservato non risulta essere citotossico, si ripopola facilmente e, da un?analisi macroscopica, sembrerebbe mantenere le sue propriet? biomeccaniche, nonostante siano necessari specifici test meccanici a supporto di tali considerazioni. Inoltre, il Derma DEC conservato 1-2 anni nella soluzione mantiene, anche se parzialmente, la sua bioattivit? che risulta comunque apprezzabile.
Il derma DEC mantenuto in soluzione 1-2 anni mantiene o addirittura aumenta le sue propriet? biomeccaniche rispetto al Derma DEC criopreservato.
Sperimentazione 2
In seguito alla processazione, la membrana amniotica umana (HAM) ? stata conservata in sacche di confezionamento alle quali ? stata successivamente aggiunta la soluzione di conservazione. La sacca contenente la HAM e la soluzione di conservazione ? stata poi sigillata ed inserita all?interno di sovrasacche sottoposte a vuoto e sigillate. Una volta terminato il tempo sperimentale, la HAM ? stata sottoposta alle seguenti analisi:
? Analisi istologica e colorazione con H&E
? Analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome
? Analisi istologica e colorazione con Weigert
? Analisi vitalit? cellulare
? Analisi microbiologica: coltura su piastra e LAL test
? Analisi citotossicit? su colture primarie fibroblasti e linee cellulari
? Bioattivit?
Risultati sperimentazione 2
Analisi istologica e colorazione con H&E
L?analisi istologica e la colorazione con ematossilina ed eosina effettuata sulla membrana amniotica dopo 1 anno di conservazione nella soluzione identifica il mantenimento della sua integrit? strutturale (Fig. 13). Lo strato epiteliale presenta il mantenimento della componente cellulare. Alcune cellule risultano per? prossime al distacco dallo strato basale (Fig.13).
Analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome
L?analisi istologica e la colorazione specifica dei campioni con Masson?s trichrome identifica il mantenimento delle fibre collagene della HAM conservata 1 anno in soluzione (Fig.14).
Analisi istologica e colorazione con Weigert
L?analisi istologica e la colorazione specifica dei campioni con Weigert identifica una condizione paragonabile tra HAM appena prelevata e HAM conservata 1 anno in soluzione (Fig.15).
Analisi vitalit? cellulare
L?analisi della vitalit? cellulare, effettuata mediante test MTT, ? stata effettuata per valutare il mantenimento di cellule vitali nella HAM dopo 1 anno di conservazione in soluzione (campione: membrana amniotica 1 anno in SS). ? stata anche effettuata una valutazione intermedia dopo 6 mesi di conservazione in soluzione (campione: Membrana amniotica 6 mesi in SS). La HAM mantenuta in soluzione per 6 mesi mantiene il 50% della vitalit? cellulare rispetto alla HAM appena prelevata (Fig.16). La HAM mantenuta in soluzione per 1 anno mantiene il 30% della vitalit? rispetto alla HAM iniziale non processata (Fig.12).
Analisi microbiologica
Coltura su piastra: l?analisi microbiologica ? stata effettuata su porzioni di HAM (1cm<2>), conservate in soluzione per 6 mesi e 1 anno, che sono state incubate a 37?C su piastre COS e Sabouraux rispettivamente per 3 e 14 giorni, al fine di valutare la crescita di batteri e/o miceti. L?analisi microbiologica ha identificato l?assenza di contaminazione batterica e fungina dopo 6 mesi e 1 anno di conservazione della HAM in soluzione.
LAL test: il LAL test ? stato effettuato per valutare l?eventuale presenza di endotossine batteriche, rilasciate dal tessuto, nel liquido di conservazione. I risultati mostrano che non ? stata identificata la presenza di endotossine batteriche nella soluzione utilizzata per conservare 1 anno la HAM.
Analisi citotossicit? su colture primarie di fibroblasti e linee cellulari L?analisi della citotossicit? cellulare ? stata effettuata trattando:
? colture primarie di fibroblasti umani (hFs)
? la linea cellulare di cheratinociti umani immortalizzati HaCaT
con un estratto ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C della HAM, mantenuta in soluzione per 1 anno, con il terreno di coltura RPMI 1640 1% antibiotici, in un rapporto HAM/RPMI di 25cm<2>/100 ml. Le cellule sono state trattate con l?estratto per 2, 24 e 72h e sono state successivamente sottoposte a test MTT per valutarne la vitalit? (campioni: SS 1aa). Sono state utilizzate cellule non trattate, messe in coltura in presenza o assenza di siero, come controllo (campioni: SIERO e NO SIERO). I risultati dimostrano che l?estratto non risulta tossico per le cellule (Fig.17).
Bioattivit?
La bioattivit? ? stata effettuata valutando il rilascio dei fattori di crescita bFGF e VEGF, importanti per la rigenerazione tissutale e l?angiogenesi, dalla HAM conservata 1 anno in soluzione (campione: HAM SS 1aa). La bioattivit? della HAM appena prelevata (campione: HAM) e della HAM criopreservata (campione: HAM CRIO) ? stata utilizzata come controllo.
I risultati dimostrano che:
? il rilascio di bFGF dalla HAM conservata 1 anno in soluzione ? paragonabile al rilascio dalla HAM controllo criopreservata (Fig.18A). ? il rilascio di VEGF dalla HAM conservata 1 anno in soluzione ? paragonabile al rilascio dalla HAM controllo criopreservata (Fig.18B). La HAM conservata nella soluzione dell?invenzione mantiene quindi capacit? bioattive.
Conclusioni sperimentazione 2
La soluzione di conservazione ? capace di mantenere la struttura e una buona percentuale di cellule vitali nella HAM. Nonostante ci?, le cellule dello strato epiteliale risultano vitali ma prossime al distacco dalla membrana basale. La HAM conservata nella soluzione per 1 anno risulta inoltre sterile, non ? citotossica e mantiene le sue capacit? bioattive.
Sperimentazione 3 ?Conservazione a temperatura ambiente di Derma deepidermizzato (Ded), precedentemente sottoposto a metodica di decellularizzazione, per indurre sia la rimozione totale della componente cellulare sia la sua conservazione a temperatura ambiente?
Il Derma De-epidermizzato (Ded), presenta una maggiore componente cellulare rispetto al Derma. Per questo motivo la metodica di decellularizzazione attualmente utilizzata per il Derma (ad esempio la tecnica descritta in PCT/IB2008/002753) non ? capace di rimuovere completamente la componente cellulare quando applicata al Ded che, di conseguenza, non pu? essere preso in considerazione come tessuto di partenza da decellularizzare e utilizzare come scaffold in ambito clinico.
Considerando le crescenti richieste cliniche di Derma Decellularizzato, il Ded ? stato sottoposto alla metodica di decellularizzazione attualmente in uso per il Derma (ad esempio quella descritta in PCT/IB2008/002753), utilizzata per ottenere il Derma DEC, aggiungendo come ulteriore step il suo mantenimento nella soluzione di conservazione dell?invenzione per 1 mese, al fine di indurre la rimozione della componente cellulare residua ed ottenere quindi Ded decellularizzato. ? comunque da sottolineare che il Derma utilizzato per la produzione di Derma DEC ? da prediligere come tessuto di partenza in quanto permette di ottenere uno scaffold decellularizzato pi? compatto. Il Ded presenta infatti pi? annessi cutanei che, quando il tessuto ? sottoposto a decellularizzazione, si trasformano in zone acellulari poco compatte, che, di conseguenza, potrebbero inficiare le propriet? biomeccaniche del tessuto. ? comunque da considerare che tali regioni potrebbero essere pi? facilmente ripopolate una volta innestate sul paziente. Al fine di valutare se il Ded decellularizzato sia in grado di mantenere le sue caratteristiche nel tempo, sono state effettuate delle analisi anche dopo 1 anno di conservazione nella soluzione dell?invenzione.
Il Ded ? stato quindi mantenuto nella soluzione per:
? 1 mese, al fine di valutare la rimozione cellulare e, di conseguenza, la produzione di Ded decellularizzato (Ded DEC)
? 1 anno, al fine di valutare nel tempo il mantenimento delle caratteristiche del Ded decellularizzato
Una volta terminati i tempi sperimentali, il tessuto ? stato sottoposto alle seguenti analisi:
? Analisi istologica e colorazione con H&E
? Analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome
? Analisi istologica e colorazione con Weigert
? Analisi vitalit? cellulare
? Analisi microbiologica: coltura su piastra e LAL test
? Analisi citotossicit? su colture primarie di fibroblasti umani e linea cellulare di cheratinociti
? Ripopolamento cellulare
? Test meccanici
Risultati Sperimentazione 3
Analisi istologica e colorazione con H&E
Il Ded parzialmente decellularizzato mantenuto in soluzione per 1 mese perde del tutto la sua componente cellulare residua, mantenendo al tempo stesso inalterate le sue caratteristiche strutturali. Le caratteristiche strutturali del Ded DEC si mantengono inalterate fino ad un anno in soluzione (Fig.19).
Analisi istologica e colorazione con Masson?s trichrome
La colorazione specifica dei campioni con Masson?s trichrome identifica un mantenimento delle fibre collagene del Ded DEC compatibile con l?utilizzo clinico dopo 1 mese e 1 anno di conservazione in soluzione (Fig.20).
Analisi istologica e colorazione con Weigert
La colorazione specifica dei campioni con Weigert identifica il mantenimento delle fibre elastiche del Ded DEC dopo 1 mese e 1 anno di conservazione in soluzione (Fig.21).
Analisi vitalit? cellulare
L?analisi della vitalit? cellulare, effettuata mediante test MTT, identifica che la vitalit? cellulare del Ded viene notevolmente ridotta nel Ded DEC in seguito all?applicazione della metodica di decellularizzazione (Fig. 22). La vitalit? cellulare del Ded DEC viene del tutto rimossa dopo 1 mese di mantenimento del tessuto in soluzione (campione: Ded DEC 1 mese in SS) (Fig.22). La rimozione della vitalit? cellulare risulta confermata, come atteso, dopo 1 anno di mantenimento del Ded DEC in soluzione (campione: Ded DEC 1 anno in SS) (Fig.22).
Analisi microbiologica
Coltura su piastra: l?analisi microbiologica ? stata effettuata su porzioni di Ded (1cm<2>), conservato in soluzione per 1 mese e 1 anno, incubate a 37?C su piastre COS e Sabouraux, rispettivamente per 3 e 14 giorni, al fine di valutare la crescita di batteri e/o miceti. L?analisi microbiologica ha identificato l?assenza di contaminazione batterica e fungina dopo 1 mese e 1 anno di conservazione del Ded decellularizzato in soluzione.
LAL test: il LAL test ? stato effettuato per valutare l?eventuale presenza di endotossine batteriche, rilasciate dal tessuto, nel liquido di conservazione. I risultati mostrano che non ? stata identificata la presenza di endotossine batteriche nella soluzione utilizzata per conservare 1 mese e 1 anno il Ded decellularizzato.
Analisi citotossicit? su colture primarie di fibroblasti umani e linea cellulari di cheratinociti HaCaT
L?analisi della citotossicit? cellulare ? stata effettuata trattando:
? colture primarie di fibroblasti umani (hFs)
? la linea cellulare di cheratinociti umani immortalizzati HaCaT
con un estratto ottenuto dall?incubazione per 3 giorni a 4?C del Ded decellularizzato, mantenuto in soluzione per 1 anno, con il terreno di coltura RPMI 1640 1% antibiotici, in un rapporto tessuto/RPMI di 25cm<2>/100 ml. Le cellule sono state trattate con l?estratto per 2, 24 e 72h e sono state successivamente sottoposte a test MTT per valutarne la vitalit? (campione: SS 1aa). I risultati dimostrano che l?estratto non risulta tossico per le cellule (Fig.23).
Ripopolamento
La capacit? di ripopolamento del Ded DEC conservato 1 anno in soluzione ? stata effettuata mettendo in coltura in vitro su di esso, precedentemente lavato e asciugato su garza, colture primarie di fibroblasti umani. Il saggio MTT identifica una buona capacit? di ripopolamento del Ded DEC in vitro con cellule vitali (campione: Ded DEC 1aa in soluzione hFs) rispetto al controllo, ovvero Derma DEC criocongelato (campione: Derma DEC CRIO hFs) (Fig. 24). Il derma DEC liofilizzato (campione: Derma DEC LIOF hFs) presenta una minore capacit? di ripopolamento rispetto sia al Ded DEC mantenuto 1 aa in CONTACTA SOLUTION, sia al Derma DEC criocongelato (Fig.24).
Test meccanici
I test meccanici sono stati effettuati presso ?Scienze e Tecnologie Chirurgiche? ? Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna ? utilizzando strumentazioni convalidate per la clinica. In particolare, i test meccanici sono stati effettuati su Ded DEC conservato 1 anno in soluzione, al fine di valutarne le propriet? biomeccaniche. Il Derma DEC criopreservato ? stato utilizzato come controllo. In particolare, lo spessore, la larghezza, la lunghezza e l?area (mm<2>) di ogni campione sono stati misurati usando un calibro digitale. I test tensili sono stati effettuati bloccando la parte inferiore e superiore dei campioni all?impugnatura inferiore fissa e all?impugnatura superiore mobile dell?apparato di prova di trazione. Per ogni campione sono stati misurati il carico massimo (peak load), la resistenza alla trazione (peak stress), il modulo elastico di Young (Young?s modulus) e la rigidit? (slope).
I risultati dimostrano che il Ded DEC mantenuto 1 anno in soluzione ha una capacit? di carico massimo significativamente inferiore (p<0,1) al Derma DEC criopreservato (Fig. 25), una resistenza alla trazione significativamente inferiore (p<0,5) rispetto al Derma DEC criopreservato (Fig. 26), un modulo elastico di Young significativamente superiore (p<0,5) rispetto al Derma DEC criopreservato (Fig. 27) ed una rigidit? significativamente inferiore (p<0,5) rispetto al Derma DEC criopreservato (Fig.28).
Conclusioni sperimentazione 3
La soluzione dell?invenzione ? capace di rimuovere la componente cellulare residua dal Ded precedentemente sottoposto alla metodica di decellularizzazione, attualmente in uso per il Derma, mantenendone l?integrit? strutturale e la sterilit? dopo 1 mese. La soluzione ? capace di mantenere l?integrit? strutturale e la sterilit? del Ded decellularizzato per 1 anno. Il Ded decellularizzato cos? conservato non risulta essere citotossico, si ripopola facilmente e, da un?analisi macroscopica, sembrerebbe mantenere le sue propriet? biomeccaniche, nonostante siano necessari specifici test meccanici a supporto di tali considerazioni.
Questi risultati permettono di ipotizzare un ampliamento della disponibilit? di derma decellularizzato in quei casi in cui il Derma, che comunque rimane il tessuto di partenza da prediligere, non sia sufficientemente disponibile per soddisfare le crescenti richieste cliniche.
Il Ded DEC mantenuto in soluzione 1 anno ha alcune propriet? biomeccaniche inferiori (carico massimo, resistenza alla trazione, rigidit?) e altre superiori (modulo elastico di Young) rispetto al Derma DEC criopreservato.
Claims (13)
1. Metodo di conservazione di un tessuto e/o organo, preferibilmente a temperatura ambiente, comprendente:
a) immergere un tessuto e/o organo isolato in una soluzione acquosa comprendente: almeno un polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente, almeno un agente antisettico scelto tra poliesaalchilenbiguanidina e/o glicerolo, e almeno un tensioattivo;
c) conservare il tessuto e/o organo nella soluzione acquosa per un periodo desiderato, preferibilmente fino a 3 anni.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il periodo di conservazione ? uguale o inferiore a 2 anni, pi? preferibilmente compreso tra 7 giorni e 2 anni, ancora pi? preferibilmente tra 30 giorni e 2 anni.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il tessuto ? scelto tra: tessuto cutaneo o cute, Derma de-epidermizzato (Ded), Derma Decellularizzato (Derma DEC o Ded DEC), un tessuto placentare o un derivato del tessuto placentare, preferibilmente la membrana amniotica, preferibilmente umana (HAM), un tessuto muscolo-scheletrico, preferibilmente scelto tra: tendini, ossa, cartilagine, nervi, un tessuto oculare, preferibilmente scelto tra: cornea e bulbo oculare, un tessuto scelto tra: una valvola, un vaso, aorta e un?arteria, preferibilmente un?arteria femorale, un tessuto appartenente all?apparato genitale maschile e/o femminile, preferibilmente scelto tra prepuzio, ovaio, utero.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, in cui detto polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente ? un polyquaternium, preferibilmente ? scelto tra uno qualsiasi dei polyquaternium da polyquaternium-1 a polyquaternium-48, pi? preferibilmente uno qualsiasi dei polyquaternium da 1 a 10, da 10 a 20, da 20 a 30, da 30 a 40, da 40 a 48 e loro combinazioni.
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 4, in cui detta poliesaalchilenbiguanidina ? scelta tra: poliesametilenbiguanidina e poliesaetilenbiguanidina.
6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 5, in cui detto glicerolo ? compreso nella soluzione in quantit? da 0,1% a 1% in peso, preferibilmente da 0,4% a 0,8% in peso.
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 6, in cui detto tensioattivo ? un tensioattivo non ionico e idrofilico, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 7, in cui la soluzione acquosa comprende ulteriormente un agente stabilizzante ed emulsificante, preferibilmente idrossialchilcellulosa, e/o un agente chelante, preferibilmente il sale sodico dell?EDTA o acetilacetonato poliammine.
9. Composizione acquosa comprendente almeno un polimero contenente almeno un ammonio quaternario caricato positivamente, almeno un agente antisettico scelto tra poliesaalchilenbiguanidina e/o glicerolo e almeno un tensioattivo, in cui detto polimero ? un polyquaternium, preferibilmente scelto tra uno qualsiasi dei polyquaternium da polyquaternium-1 a polyquaternium-48, pi? preferibilmente uno qualsiasi dei polyquaternium da 1 a 10, da 10 a 20, da 20 a 30, da 30 a 40, da 40 a 48 e loro combinazioni; e detto almeno un tensioattivo ? un tensioattivo non ionico e idrofilico, preferibilmente un poloxamero o una miscela di poloxameri.
10. Composizione acquosa secondo la rivendicazione 9, comprendente ulteriormente un agente stabilizzante ed emulsificante, preferibilmente idrossialchilcellulosa, e/o un agente chelante, preferibilmente il sale sodico dell?EDTA o acetilacetonato poliammine.
11. Uso della composizione acquosa secondo la rivendicazione 9 o 10 per conservare un tessuto e/o un organo isolato, preferibilmente per un periodo fino a 3 anni, preferibilmente per un periodo uguale o inferiore a 2 anni, pi? preferibilmente compreso tra 7 giorni e 2 anni, ancora pi? preferibilmente tra 30 giorni e 2 anni.
12. Contenitore comprendente un tessuto e/o organo isolato immerso totalmente o parzialmente nella composizione acquosa secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui detto contenitore ? preferibilmente chiuso ermeticamente ed ? preferibilmente una sacca flessibile di materiale plastico.
13. Contenitore comprendente un ulteriore contenitore contenente un tessuto e/o organo immerso totalmente o parzialmente nella composizione acquosa secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui detto contenitore ? preferibilmente una sovrasacca in plastica e detto ulteriore contenitore ? una sacca in plastica.
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| WO2023275819A1 (en) | 2023-01-05 |
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