CN115748249A - 重组胶原蛋白水凝胶纤维及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组胶原蛋白水凝胶纤维及其制备方法。所述方法以重组胶原蛋白和PEO为原料，先采用单通道高压静电纺丝电纺、液态旋转接收转盘收集重组胶原蛋白纤维，然后交联形成交联重组胶原蛋白水凝胶纤维，最后酸洗、透析，制得重组胶原蛋白水凝胶纤维。本发明的重组胶原蛋白水凝胶纤维具有优异的生物相容性，其弹性模量、含水量、液体吸收性能均接近人体皮肤组织，可作为修复材料应用于皮肤全层损伤修复。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料制备技术领域，涉及一种重组胶原蛋白水凝胶纤维及其制备方法。
背景技术
皮肤全层损伤导致人体与外界隔绝的保护屏障被破坏。传统创伤修复下伤口自然愈合时间较长，感染风险增加，可能导致严重的残疾甚至死亡。组织工程方法使用具有仿生特性的再生支架材料，更有利于损伤组织重建和功能恢复。
胶原蛋白是动物结缔组织的主要成分之一，广泛存在于皮肤、骨骼、关节、头发中，起到支撑、修复、抗衰老的作用。传统动物源胶原蛋白存在免疫原风险；由毕赤酵母发酵所得的重组胶原蛋白结构和功能与人体自身的胶原蛋白极为近似，具有良好的生物相容性和生物降解性，无免疫原性。重组胶原蛋白具有填补组织缺陷、促进自体胶原蛋白再合成的作用，降解后产物还可供给为细胞养料。
天然皮肤组织的细胞外基质具有直径为0.5～20μm的纤维结构，细胞生长微环境柔软且富有弹性。具有天然细胞外基质相类似的柔软性和弹性、高含水性和高通透性，三维微观结构的支架用于皮肤损伤修复，为细胞生长和迁移提供空间。水凝胶具有类似软组织的含水量和可变的力学特征，调节其浓度、交联程度、凝胶时间等可以实现其含水量、弹性模量的调控。然而块材特性的水凝胶在仿生皮肤纤维结构上难以实现。
发明内容
针对现有传统创伤敷料和创伤修复方法中存在的损伤修复时间长、易感染、修复效果差的问题，本发明提供一种用于皮肤全层损伤修复的重组胶原蛋白水凝胶纤维及其制备方法。该方法通过液态旋转静电纺丝形成微米级水凝胶纤维，其含水量和弹性模量接近人体组织，能够仿生皮肤组织，作为组织工程支架促进创面修复。
本发明所述的重组胶原蛋白水凝胶纤维的制备方法，先采用单通道高压静电纺丝电纺、液态旋转接收转盘收集重组胶原蛋白纤维，然后交联形成交联重组胶原蛋白水凝胶纤维，最后酸洗、透析，具体步骤如下：
步骤1，重组胶原蛋白与聚氧化乙烯(PEO)溶于纯化水中作为电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液，所述的电纺前驱液中，重组胶原蛋白的质量分数为8％～25％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％～0.8％；
步骤2，将电纺前驱液置于静电纺丝注射器中推注电纺，推注速度为2～4mL/h，加载电压为3～5kV，接地金属盘内含步骤1的电纺接收液，水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维，金属旋转接收盘速度为200～700rpm，得到重组胶原蛋白纤维；
步骤3，将重组胶原蛋白纤维置于pH值为9～13的含有交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)的碱性混合溶液中，在45～80℃下水浴加热进行交联反应3～20小时，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维，所述的碱性混合溶液中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.5％～4.5％；
步骤4，交联重组胶原蛋白水凝胶纤维先经酸性溶液清洗，再置于透析袋中进行透析，收集得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
优选地，步骤1中，重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生。
优选地，步骤1中，所述的电纺前驱液中，重组胶原蛋白的质量分数为10％～18％，聚氧化乙烯的质量分数为0.2％～0.4％。
优选地，步骤3中，碱性混合溶液pH值为11～12。
优选地，步骤3中，碱性混合溶液由浓度为0.01～350mmol/L氢氧化钠溶液调节pH值。
优选地，步骤3中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为1％～3％。
优选地，步骤3中，水浴加热温度为60～70℃。
优选地，步骤3中，交联反应时间为6～16小时。
优选地，步骤4中，酸性溶液为盐酸溶液或醋酸溶液，更优选为醋酸溶液。
优选地，步骤4中，醋酸溶液浓度为0.01～5mol/L。
优选地，步骤4中，醋酸溶液洗0.5～3小时。
优选地，步骤4中，透析袋的分子量为8000Da。
优选地，步骤4中，透析用纯化水质量为重组胶原蛋白水凝胶纤维质量的20～70倍，更优选为30～50倍。
优选地，步骤4中，透析时间为8～40小时，更优选为10～24小时。
进一步地，本发明提供上述制备方法制得的重组胶原蛋白水凝胶纤维。
更进一步地，本发明提供上述重组胶原蛋白水凝胶纤维在制备皮肤全层损伤修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明由重组胶原蛋白通过单通道液态旋转静电纺丝技术制得重组胶原蛋白水凝胶纤维，其具有微米级结构，由单根直径为10～20μm的纤维构成；通过酸洗和透析调节重组胶原蛋白水凝胶纤维酸碱度，同时除去残留交联剂，具有较好的生物相容性，适合细胞生长；材料力学性能可控，弹性模量接近人体皮肤组织细胞外基质；含水量高，接近人体真皮层；具有较好的液体吸收性能，可吸收创面渗出物；材料具有良好的细胞粘附性能，可促进细胞增殖。本发明的重组胶原蛋白水凝胶纤维在皮肤全层损伤修复中的应用前景广泛。
附图说明
图1为实施例4制得的重组胶原蛋白水凝胶纤维扫描电镜下微观形貌图；
图2为对比例17、对比例18和实施例4制得的重组胶原蛋白水凝胶材料培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)的细胞活死与CCK-8细胞增殖活力测试结果图；
图3为对比例17和实施例4制得的重组胶原蛋白水凝胶材料修复大鼠背部2cm×2cm皮肤全层损伤的实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由7.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为11的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例2
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为18％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由7.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为11的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例3
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.4％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以4mL/h推注电纺，加载5kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，700rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为1％交联剂BDDE、由7.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为11的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例4
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为12％、聚氧化乙烯的质量分数为0.3％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以3mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有3％交联剂BDDE、由75mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为12的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例5
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由2.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为9的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例6
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由350mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为13的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例7
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由7.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为11的混合溶液中，70℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例8
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为10％、聚氧化乙烯的质量分数为0.2％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由7.5mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为11的混合溶液中，60℃水浴加热6小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例9
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为12％、聚氧化乙烯的质量分数为0.3％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以3mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为3％交联剂BDDE、由75mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为12的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经5mol/L醋酸溶液洗0.5小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例10
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为12％、聚氧化乙烯的质量分数为0.3％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以3mL/h推注电纺，加载4kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，600rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有3％交联剂BDDE、由75mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为12的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析10小时，透析用水量为材料质量30倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例11
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为8％、聚氧化乙烯的质量分数为0.8％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以2mL/h推注电纺，加载3kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，200rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为0.5％交联剂BDDE、由0.01mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为9的混合溶液中，45℃水浴加热20小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经0.01mol/L醋酸溶液洗0.5小时，再透析8小时，透析用水量为材料质量20倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
实施例12
将重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中，形成重组胶原蛋白的质量分数为25％、聚氧化乙烯的质量分数为0.1％的电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液。电纺前驱液置于静电纺丝注射器中以4mL/h推注电纺，加载5kV电压。接地金属盘内含电纺接收液，700rpm水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维。电纺所得纤维置于含有体积分数为4.5％交联剂BDDE、由350mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为13的混合溶液中，80℃水浴加热3小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维。交联重组胶原蛋白水凝胶纤维经5mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析40小时，透析用水量为材料质量70倍，最终得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
对比例1
本对比例与实施例4基本相同，不同的是重组胶原蛋白的质量浓度为6％。
对比例2
本对比例与实施例4基本相同，不同的是重组胶原蛋白为28％。
对比例3
本对比例与实施例4基本相同，不同的是PEO的质量浓度为1％。
对比例4
本对比例与实施例4基本相同，不同的是PEO的质量浓度为0.05％。
对比例5
本对比例与实施例4基本相同，不同的是推注速度、加载电压、转盘转速分别为1mL/h、2kV、100rpm。
对比例6
本对比例与实施例4基本相同，不同的是推注速度、加载电压、转盘转速分别为5mL/h、6kV、800rpm。
对比例7
本对比例与实施例4基本相同，不同的是采用0.01mmol/L氢氧化钠调pH值为8。
对比例8
本对比例与实施例4基本相同，不同的是BDDE的体积浓度为0.4％。
对比例9
本对比例与实施例4基本相同，不同的是BDDE的体积浓度为5％。
对比例10
本对比例与实施例4基本相同，不同的是交联反应温度为40℃。
对比例11
本对比例与实施例4基本相同，不同的是交联反应温度为85℃。
对比例12
本对比例与实施例4基本相同，不同的是交联反应时间为2小时。
对比例13
本对比例与实施例4基本相同，不同的是交联反应时间为22小时。
对比例14
本对比例与实施例4基本相同，不同的是去掉酸洗步骤。
对比例15
本对比例与实施例4基本相同，不同的是透析用水量为材料质量的10倍。
对比例16
本对比例与实施例4基本相同，不同的是透析时间为6小时。
对比例17
将重组胶原蛋白和聚氧化乙烯纯化水中，再加入交联剂BDDE，使得重组胶原蛋白的质量分数为25％、聚氧化乙烯的质量分数为0.1％、BDDE体积分数为3％，由75mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为12，制成混合溶液。混合溶液倒入2cm×2cm×2cm的模具中，60℃水浴加热16小时进行交联，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。交联重组胶原蛋白水凝胶经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时，再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到块状重组胶原蛋白水凝胶。
对比例18
与实施例4以基本相同的方式进行，除电纺过程由干法纺丝实现。具体为：12％重组胶原蛋白与0.3％聚氧化乙烯溶于纯化水，将溶液装入注射器中置于注射泵，连接15kV高压电。距离注射器喷嘴20cm处放置平行电极，平行电极间距3cm，接通电源后可在电极杆之间形成平行定向纤维。将纤维置于含有3％交联剂BDDE、由75mmol/L氢氧化钠溶液调pH值为12的混合溶液中，60℃水浴加热16小时进行交联。交联纤维经0.05mol/L醋酸溶液洗3小时；再透析24小时，透析用水量为材料质量50倍，最终得到重组胶原蛋白干法纺丝纤维。
测试表征例
1.纺丝效果
对纺丝效果的评价，主要是对电纺过程中电纺液连续性、均匀性、成丝性的评价。纺丝效果主要受到电纺前驱液中重组胶原蛋白、PEO含量，纺丝过程的电纺液推进速度、加载电压、接收盘转速的影响。由对比例2-4与实施例4，重组胶原蛋白或PEO浓度过高使电纺前驱液黏度过大，导致电纺液不连续或堵塞注射器，不利于纺丝进行；PEO浓度过低，纺丝液粘结性较差，无法成丝。对比例5、6与实施例4，推进速度、加载电压、接收盘转速的过高或过低影响成丝性，电纺丝落入接收液后易中断。
2.弹性模量
通过装载50N引伸计传感器的ZWICKZ020万能试验机，对在PBS中浸泡2小时的各实施例和对比例制得的材料进行轴向拉伸测试，拉伸速度为10mm/min直至样品拉断，以5％应变的斜率计算弹性模量。结果如表1所示，重组胶原蛋白浓度增加、反应酸碱度增大、BDDE浓度增加、交联温度上升、交联时间延长，都将使材料交联程度增加，表现为弹性模量增大。材料力学性质影响细胞行为，人体真皮层弹性模量为8～35kPa，实施例弹性模量均能较好匹配人体真皮组织，有利于组织修复。对比例1、对比例7、对比例8、对比例10、对比例12分别因重组胶原蛋白浓度过低、反应酸碱度过低、BDDE浓度过低、交联温度过低、交联时间过短使材料交联度较低，材料弹性模量无法满足应用要求。由实施例4与对比例18可见，液态旋转静电纺丝所得纤维比干法纺丝所得纤维的弹性模量更接近人体真皮层，更适合软组织修复。
3.液体吸收性
参照《YY/T 1511-2017胶原蛋白海绵》中6.3液体吸收性试验的方法，对本发明各实施例与对比例制得的材料液体吸收性能进行测试。结果如表1所示，材料交联程度增大，使水凝胶网络致密，液体吸收性能降低，各实施例的液体吸收性为3～4倍，表明材料液体吸收性能较好。良好的液体吸收性能可在创面修复中吸收渗出物，保持创面清洁度。对比例1、对比例7、对比例8、对比例10、对比例12因交联度过低导致微观网络松散，液体吸收性能下降；对比例9因交联程度过高导致微观网络孔径过小，液体吸收性能较差。
4.含水量
将实施例与对比例制得的材料用滤纸吸去表面溶液，称量失水前质量，再将样品置于烘箱72小时后再测量其质量，前后质量之差与原质量之比为材料含水量。结果如表1所示，材料交联程度越大，水凝胶网络越致密，自身锁水性能越好，含水量越高。各实施例的含水量为65～75％，与人体真皮层含水量70％相符，含水量较高的材料有利于细胞物质运输。对比例1、对比例7、对比例8、对比例10、对比例12因交联度过低导致材料锁水性能较差；对比例13因反应时间过长，材料在高温下失水而导致含水量较低。由实施例4与对比例18可见，液态旋转静电纺丝所得纤维比干法纺丝所得纤维的含水量更接近人体真皮层，利于组织细胞再生。
5.BDDE残留量
参照《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中6.12交联剂残留量的方法，对实施例与对比例制得的材料的BDDE残留量进行检测，根据5.12规定BDDE残留量应不大于2.0μg/g。结果如表1所示，BDDE残留量主要受到透析条件的影响，各实施例的BDDE残留检测结果均符合标准规定。对比例15、对比例16分别因透析水量不足、透析时间过短，导致交联剂残留量超标，BDDE残留过多对生物体产生毒性。
6.pH值
参照《2020版药典(四部)0631pH值测定法》对实施例与对比例制得的材料的pH值进行测试。结果如表1所示，酸洗条件对pH值有直接影响，透析进一步调节材料酸碱度。重组胶原蛋白水凝胶纤维的交联反应在强碱环境中进行，通过酸洗和透析使pH值适合人体皮肤酸碱度。正常皮肤表面pH值为5～7，各实施例的pH值测试结果为5.5～6.5，满足人体皮肤对材料pH值的要求。对比例14因无酸洗导致材料pH值偏高，对比例16因透析时间过短导致材料pH值偏低，酸性或碱性较强的材料会对皮肤造成二次伤害。
表1
7.微观形貌
通过场发射扫描电子显微镜对实施例4制得的重组胶原蛋白水凝胶纤维的微观结构进行观察。结果如图1所示，可见单根重组胶原蛋白水凝胶纤维的直径为10～20μm，交联反应未发生在单根纤维之间。交联使重组胶原蛋白水凝胶纤维表面出现较多孔洞，利于材料锁水、细胞粘附和吸收创面渗出物。
8.细胞培养
将对比例17、对比例18和实施例4制得的材料用于培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)，考察液态旋转静电纺丝技术所制得的重组胶原蛋白水凝胶纤维的生物相容性。如图2所示，通过细胞活死与细胞增殖实验结果可知，重组胶原蛋白水凝胶纤维具有较好的生物相容性，较块体水凝胶和干法纺丝所制纤维能明显促进细胞黏附生长与细胞增殖。
9.大鼠皮肤损伤修复
将对比例17、实施例4制得的材料用于修复大鼠背部2cm×2cm皮肤全层损伤实验，考察重组胶原蛋白水凝胶纤维对皮肤损伤的修复效果。如图3所示，由苏木精-伊红染色(HE)图可见，重组胶原蛋白水凝胶纤维能较好恢复损伤皮肤组织结构，促进毛囊生长。由胶原蛋白、CD31免疫荧光染色密度统计图可见，重组胶原蛋白水凝胶纤维显著促进损伤处胶原蛋白、血管组织再生。由创面愈合率统计图可知，纤维形式的修复材料较块体水凝胶能引导再生细胞迁移，促进皮肤损伤修复。
Claims (10)
1.重组胶原蛋白水凝胶纤维的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，重组胶原蛋白与聚氧化乙烯溶于纯化水中作为电纺前驱液，取无水乙醇置于-20℃待用，作为电纺接收液，所述的电纺前驱液中，重组胶原蛋白的质量分数为8％～25％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％～0.8％；
步骤2，将电纺前驱液置于静电纺丝注射器中推注电纺，推注速度为2～4mL/h，加载电压为3～5kV，接地金属盘内含步骤1的电纺接收液，水平旋转接收得到重组胶原蛋白纤维，金属旋转接收盘速度为200～700rpm，得到重组胶原蛋白纤维；
步骤3，将重组胶原蛋白纤维置于pH值为9～13的含有交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性混合溶液中，在45～80℃下水浴加热进行交联反应3～20小时，得到交联重组胶原蛋白水凝胶纤维，所述的碱性混合溶液中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为0.5％～4.5％；
步骤4，交联重组胶原蛋白水凝胶纤维先经酸性溶液清洗，再置于透析袋中进行透析，收集得到重组胶原蛋白水凝胶纤维。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的电纺前驱液中，重组胶原蛋白的质量分数为10％～18％，聚氧化乙烯的质量分数为0.2％～0.4％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，碱性混合溶液pH值为11～12，碱性混合溶液由浓度为0.01～350mmol/L氢氧化钠溶液调节pH值。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚的体积分数为1％～3％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，水浴加热温度为60～70℃，交联反应时间为6～16小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，酸性溶液为盐酸溶液或醋酸溶液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，醋酸溶液浓度为0.01～5mol/L，醋酸溶液洗0.5～3小时，透析袋的分子量为8000Da，透析用纯化水质量为重组胶原蛋白水凝胶纤维质量的20～70倍，更优选为30～50倍，透析时间为8～40小时，更优选为10～24小时。
9.根据权利要求1～8任一所述的制备方法制得的重组胶原蛋白水凝胶纤维。
10.根据权利要求9所述的重组胶原蛋白水凝胶纤维在制备皮肤全层损伤修复材料中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |