CN117679563A - 一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法。以新鲜牛骨为原料,提取骨胶原,通过协同的纳米限域技术来制备高性能压电甘氨酸薄膜,通过氢键连接在骨胶原侧链,构建高压电性改性骨胶原,制备多孔压电改性海绵支架。本发明通过β‑甘氨酸纳米结晶对骨胶原蛋白进行改性,采用冷冻干燥法制备多孔压电改性海绵支架,在外界施加机械刺激,以海绵支架为媒介,建立内源电场,并探究压电改性对于海绵支架压电效应的影响,能够大幅度提高骨缺损修复效果。

Description

一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法
技术领域
本发明属于骨缺损修复技术领域,具体涉及一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法。
背景技术
创伤、感染、肿瘤等导致的骨缺损一直是临床医生治疗的难题。传统的自体骨、异体骨植骨材料存在来源有限,免疫排斥的问题,开发一种具有高诱导活性的骨修复材料是目前研发的重点。
骨组织中的胶原和蛋白多糖具有天然的压电效应,在应力的作用下产生压电信号,但其压电系数较低,在生物材料中,甘氨酸等氨基酸晶体表现出高剪切压电性和超高的压电电压系数。多孔结构会极大程度影响骨修复材料的骨诱导性。理想的孔径大小不仅利于细胞间物质运输和交换,为成骨细胞的增殖迁移和血管神经长入提供优越的环境,而且具有足够的强度承受骨长入的应力;孔隙率是材料中孔隙体积与材料在自然状态下总体积的百分比,植入物的孔隙率可影响物质在不同孔隙间的自由移动能力和交换能力,进而影响材料的骨生长水平。原则上多孔植入物的孔隙率越接近人体松质骨孔隙率(75-85%),则越有利于骨生长。孔隙率过高,会降低植入物的抗压性能及强度,难以承受骨的应力,导致使用寿命缩短;孔隙率过低,则阻碍细胞的物质交换,影响成骨能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法。
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成80-120目粒径的骨粉颗粒,低浓度NaOH去除非胶原杂质,低浓度盐酸和苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至0.8-1.5,加入胃蛋白酶,室温摇床2-5d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析18-30h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.01mol/L-0.05mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌2-4 h,得到甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面,混匀后得到压电改性的骨胶原;
压电改性的骨胶原含有β-甘氨酸纳米结晶,β-甘氨酸纳米结晶是通过电流体喷雾沉积技术喷涂到骨胶原表面制备的,并且通过氢键相互作用力连接到骨胶原表面;在喷雾过程中,在喷嘴尖端和导电支撑之间施加电场,以克服甘氨酸水溶液的表面张力,产生大量的纳米液滴;随着纳米液滴的迅速蒸发和越来越大的表面积与体积比,通过纳米限域效应,甘氨酸成核结晶为β晶相并通过氢键接枝到骨胶原表面,补齐了胶原本身具有的弱压电性能的短板,大幅度提升了压电作用效果并可在较小作用力下产生压电效应;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型,放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,18-30h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥4-6h,制得压电改性胶原海绵。
步骤(1)所述小块的大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm。
步骤(1)所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌10-30min。
步骤(2)所述低浓度NaOH的质量浓度为0.3-0.7%,所述低浓度盐酸的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L,所述低浓度苹果酸的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L。
步骤(3)所述调节pH采用1mol/L的乙酸。
步骤(3)所述胃蛋白酶的加入量为骨粉颗粒质量的5-10%。
步骤(5)所述甘氨酸溶液中甘氨酸的质量浓度为8-12%。
步骤(5)所述甘氨酸溶液的喷涂量为骨胶原蛋白重量的10-15%。
本发明的有益效果:本发明通过β-甘氨酸纳米结晶对胶原蛋白进行改性,采用冷冻干燥法将压电改性胶原凝胶制备成多孔压电改性海绵支架,在外界施加机械刺激,以海绵支架为媒介,建立内源电场,并探究海绵支架孔隙率对压电效应的影响,能够大幅度提高骨缺损修复效果。
附图说明
图1 为-20℃冷冻制备海绵支架SEM图像。
图2为压电改性海绵支架在压电激发下对BMSCs迁移的影响。
图3为压电改性海绵支架在压电激发下对BMSCs成骨活性的影响。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌20min。
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成100目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.5%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.1mol/L盐酸和摩尔浓度为0.1mol/L苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至1(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的8%,室温摇床3d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析24h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.01mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌3 h,得到质量浓度为10%的甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面混匀,喷涂量为骨胶原蛋白重量的12%,得到压电改性的骨胶原;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,24h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥5h,制得压电改性胶原海绵。
实施例2
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌12min;
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成80目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.3%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.05mol/L盐酸和摩尔浓度为0.05mol/L苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至0.9(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的5%,室温摇床5d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析18h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.03mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌2 h,得到质量浓度为8%甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面混匀,喷涂量为骨胶原蛋白重量的10%,得到压电改性的骨胶原;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型,放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,18h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥4h,制得压电改性胶原海绵。
实施例3
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞,所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌30min;
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成120目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.7%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.15mol/L盐酸和摩尔浓度为0.15mol/L苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至1.5(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的10%,室温摇床5d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析30h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.05mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌4 h,得到质量浓度为12%甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面混匀,得到压电改性的骨胶原;所述甘氨酸溶液的喷涂量为骨胶原蛋白重量的15%;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型,放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,30h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥6h,制得压电改性胶原海绵。
对比例1
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌20min。
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成100目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.5%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.1mol/L盐酸和摩尔浓度为0.1mol/L苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至1(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的8%,室温摇床3d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析24h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将步骤(4)制备的骨胶原蛋白溶于0.01mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶,压制成型放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,24h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥5h,制得胶原海绵。
对比例2
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌20min。
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成100目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.5%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.2mol/L盐酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至1(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的8%,室温摇床3d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析24h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.01mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌3 h,得到质量浓度为10%的甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面混匀,喷涂量为骨胶原蛋白重量的12%,得到压电改性的骨胶原;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,24h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥5h,制得压电改性胶原海绵。
对比例3
一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌20min。
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成100目粒径的骨粉颗粒,采用质量浓度为0.5%NaOH去除非胶原杂质,摩尔浓度为0.2mol/L盐酸苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至1(调节pH采用1mol/L的乙酸),加入胃蛋白酶,加入量为骨粉颗粒质量的8%,室温摇床3d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析24h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干,获得骨胶原蛋白;
(5)将骨胶原蛋白溶于0.01mol/L盐酸,-4℃溶解得到骨胶原蛋白凝胶;将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌3 h,得到质量浓度为10%的甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白表面混匀,喷涂量为骨胶原蛋白重量的12%,得到压电改性的骨胶原;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型,放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,24h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥5h,制得压电改性胶原海绵。
实验例:
(1)通过扫描电子显微镜(SEM)表征实施例1(交联)和对比例1(未交联)海绵支架的表面微观结构,如图1所示。
结果说明:由图1可知,该材料具有三维多孔结构,孔隙形状不规则,材料表面相对规整,孔隙直径在20-150μm。
(2)孔隙率测定:应用排液法测定实施例1-3及对比例1-3样品的孔隙率,即用分析天平称重后放入盛有一定容积(V1)无水乙醇的量筒中,然后密封量筒,静置8分钟,使试样被无水乙醇完全浸透且试样表面无明显气泡,此时的总体积为V2;取出试样,量筒中无水乙醇的容积为V3。试样的体积(V)、孔隙率(K),按下列公式计算:V=(V2-V1)+(V1-V3)=V2-V3;K=(V2-V1)/V2-V3。
每组实验平行测定5次取平均值,采用SPSS 24.0软件进行统计学分析,计量资料结果用x̅±s(均数士标准差)表示,采用Kolmogorov-Smirnov检验法进行数据正态性检验,对于符合正态分布数据,两组间均值差异比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。
测定结果见表1:
表1
(3)BMSCs细胞迁移:在实施例1制备的压电改性胶原海绵上按照2×104cell/ml的比例接种BMSCs,5% CO2、37℃培养箱中培养24h后,用移液器吸枪头垂直于材料表面进行划痕,PBS清洗去除悬浮细胞,每天外界施加物理刺激激发压电。分别在4h、8h后在显微镜下拍照观察,计算划痕间距的变化,评价不同孔隙海绵支架在压电刺激下对BMSCs迁移的影响。
如图2所示,显示了不同方法处理的胶原海绵对BMSCs细胞迁移的图像。在培养8h后,两组BMSCs细胞均向中间迁移,与未压电改性海绵支架组相比,压电改性海绵支架组的细胞迁移数量更明显,表明在外界物理压电激发情况下,压电改性胶原海绵能更显著的提高BMSCs细胞的迁移能力。
(4)碱性磷酸酶染色:在实施例1制备的压电改性胶原海绵上按照2×104cell/ml的比例接种BMSC,每组设三个复孔,放置在37℃,5%CO2的培养中培养24h,更换成骨诱导培养基,每天外界施加物理刺激激发压电,每2天换液一次,培养7d后,用PBS轻轻洗涤3遍,然后使用4%的多聚甲醛进行固定15min,再用PBS轻轻清洗3次,每次5min。使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行染色,根据显色程度使用蒸馏水终止反应,光学显微镜下观察染色情况,评价胶原海绵支架在压电刺激下对BMSCs成骨活性的影响。
如图3所示,显示了不同方法处理的胶原海绵对BMSCs细胞ALP染色的图像。在培养7d后,两组BMSC细胞均不同程度地表达ALP,表明胶原海绵本身对BMSC细胞有一定的促进分化作用。压电改性组海绵支架中的细胞分化水平高于未压电改性组,表明配合外界刺激下,压电改性胶原海绵能更显著的促进BMSCs细胞的成骨分化。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,按照如下步骤进行:
(1)取新鲜牛骨,去除软组织,将皮质骨切成小块,高压水枪冲洗去除血液及骨髓残留,脱脂、脱细胞;
(2)采用研磨仪将步骤(1)处理好的牛骨研磨成80-120目粒径的骨粉颗粒,低浓度NaOH去除非胶原杂质,低浓度盐酸和苹果酸动态脱钙;
(3)将步骤(2)脱钙处理好的骨粉颗粒调节pH至0.8-1.5,加入胃蛋白酶,室温摇床2-5d提取胶原;
(4)将步骤(3)处理好的骨粉颗粒离心,取上清,调节pH至中性,盐析18-30h,乙酸、去离子水先后透析过夜,透析结束后沉淀物采用冷冻干燥机冻干保存,获得骨胶原蛋白;
(5)骨胶原蛋白溶于0.01mol/L-0.05mol/L盐酸,-4℃过夜溶解得到骨胶原蛋白凝胶,将甘氨酸粉溶于去离子水中,在60℃下搅拌2-4 h,得到甘氨酸溶液,在室温下,将甘氨酸溶液置于有机薄膜打印机的小注射器中,喷涂在骨胶原蛋白凝胶表面,混匀后得到压电改性的骨胶原凝胶;
(6)将步骤(5)制备的压电改性的骨胶原压制成型,放入-20℃的恒温冰箱中过夜保存,18-30h后将得到的凝固体在冷冻干燥机干燥4-6h,制得压电改性胶原海绵。
2.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述小块的大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm。
3.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述脱脂、脱细胞是采用质量浓度5%TritonX-100、1.5%H2O2的溶液浸没,搅拌10-30min。
4.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述低浓度NaOH的质量浓度为0.3-0.7%,所述低浓度盐酸的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L,所述低浓度苹果酸的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L。
5.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述调节pH采用1mol/L的乙酸。
6.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述胃蛋白酶的加入量为骨粉颗粒质量的5-10%。
7.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述甘氨酸溶液中甘氨酸的质量浓度为8-12%。
8.根据权利要求1所述具有多孔结构的压电改性胶原海绵的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述甘氨酸溶液的喷涂量为骨胶原蛋白重量的10-15%。
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