TWI723615B - 促進骨再生的生物支架、其用途及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種促進骨再生的生物支架,包含一支架本體以及一改質層。支架本體呈中空圓柱狀並包含複數個放射狀格片。改質層均勻分布於支架本體的至少一表面。前述之支架本體的材質為聚乳酸,前述之改質層包含複數個第二型骨生成蛋白,且促進骨再生的生物支架的平均孔隙率為75%至90%。藉此,本發明提供一種促進骨再生的生物支架可在優異的使用安全性與生物相容性的前提下提升平均孔隙率與機械強度,並具有相關領域的應用潛力。
Description
本發明係關於一種生物支架、生物支架的用途及生物支架的製備方法,特別是關於一種促進骨再生的生物支架、促進骨再生的生物支架的用途及促進骨再生的生物支架的製備方法。
骨骼是組成脊椎動物內骨骼的堅硬器官,其包含礦物質化的骨骼組織、骨髓、骨膜、神經、血管、軟骨等軟組織以及少數的骨骼細胞。骨骼的缺損或缺陷可能肇因於先天性缺陷或後天引起之疾病、衰老或創傷。習知用以治療骨骼缺損的方法多透過手術方式切除病灶後,進一步將骨植入物植入患者的骨組織中,以達成骨骼重建的目的。
理想的骨植入物除了需具有的足夠的機械強度,更需具備高度的生物相容性、孔隙率與再吸收能力,以使骨植入物可在骨骼組織的再吸收(resorption)與形成的重塑過程中緩慢降解,進而促使新生的骨骼組織填充並佔據被降解之骨植入物所遺留的空間而防止軟組織入侵,以免去為了取出骨植入物所進行之二次手術的額外傷害。
然而,習知的骨植入物的材質多為陶瓷、金屬等複合材料,使其並無法有效地在骨質重塑的過程中被降解,並有引發骨植入物被體液腐蝕或引起過敏的可能。再者,市面上雖有使用聚甲基丙烯酸甲酯等高分子聚合物製得之骨植入物,其孔隙率與強度皆可視需求而進行調整,然聚甲基丙烯酸甲酯等高分子聚合物須搭配有機溶劑以進行骨植入物的成形與製作,恐有毒害人體之疑慮。
因此,如何發展一種具同時具備優異之生物相容性、孔隙率、機械強度以及使用便利性之細胞生長支架,實為本領域之技術人員所共同努力的目標。
本發明之一態樣在於提供一種促進骨再生的生物支架,包含一支架本體以及一改質層。支架本體呈中空圓柱狀並包含複數個放射狀格片。改質層均勻分布於支架本體的至少一表面。前述之支架本體的材質為聚乳酸,前述之改質層包含複數個第二型骨生成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),且促進骨再生的生物支架的平均孔隙率為75%至90%。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中前述之支架本體可以積層製造方法製得。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中前述之改質層可更包含複數個聚多巴胺,且前述之第二型骨生成蛋白可以聚多巴胺接枝至前述之支架本體的至少一表面。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中前述之第二型骨生成蛋白於支架本體的至少一表面的一固定濃度可為200ng/scaffod至800ng/scaffod。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中促進骨再生的生物支架的一平均孔徑可為750μm至1200μm。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中促進骨再生的生物支架的一抗壓強度可為20Mpa至70Mpa。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中促進骨再生的生物支架的一膨潤度可為5%至40%。
依據前述之促進骨再生的生物支架,其中前述之放射狀格片的形狀可為四芒放射狀、六芒放射狀或八芒放射狀。
藉此,本發明之促進骨再生的生物支架使用聚乳酸作為支架本體的材質並於其表面設置一包含第二型骨生成蛋白的改質層,使本發明之促進骨再生的生物支架具有良好的生物相容性,並可有效促進骨質增生,而包含放射狀格片的中空圓柱狀支架本體則可在維持高度機械強度的前提下,使本發明之促進骨再生的生物支架具有75%至90%的平均孔隙率,進而使本發明之促進骨再生的生物支架具有優異的使用安全性與生物相容性,並具有相關領域的應用潛力。
本發明之另一態樣在於提供一種如前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,包含下述步驟:進行一支架本體製備步驟、進行一塗佈步驟以及進行一改質層形成步
驟。支架本體製備步驟包含提供一高分子材料及進行一成型步驟。前述之高分子材料包含聚乳酸。成型步驟係以前述之高分子材料為基材進行積層製造,以形成前述之支架本體。進行一塗佈步驟係將支架本體浸泡於一塗佈溶液中並反應一反應時間,以形成一預反應塗層。進行一改質層形成步驟係將包含前述之預反應塗層的支架本體浸泡於一第一溶液中,其中第一溶液包含前述之第二型骨生成蛋白,藉以形成所述之促進骨再生的生物支架。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之塗佈溶液可為一聚多巴胺溶液。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之反應時間可為3小時至48小時。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之反應時間可為12小時。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之第二型骨生成蛋白於第一溶液中的濃度可為250ng/ml至1000ng/ml。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之第二型骨生成蛋白於支架本體的至少一表面的一固定濃度可為200ng/scaffod至800ng/scaffod。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中促進骨再生的生物支架的一平均孔徑可為750μm至1200μm。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中促進骨再生的生物支架的一抗壓強度可為20Mpa至70Mpa。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中促進骨再生的生物支架的一膨潤度可為5%至40%。
依據前述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中前述之放射狀格片的形狀可為四芒放射狀、六芒放射狀或八芒放射狀。
藉此,本發明之促進骨再生的生物支架的製備方法透過包含聚乳酸的高分子材料做為基材進行積層製造,以形成支架本體後,並於支架本體外形成包含第二型骨生成蛋白的改質層,進而使本發明之促進骨再生的生物支架的製備方法所製得之促進骨再生的生物支架具有高度的機械強度、高度的生物相容性以及優良的孔隙率,使其具有相關領域的應用潛力。再者,以包含聚乳酸的高分子材料做為基材進行積層製造可有效提升本發明之促進骨再生的生物支架的製備效率,並可根據實際應用需求而調整本發明之促進骨再生的生物支架的尺寸與型態,進而達成快速進行客製化製備的訴求。
本發明之又一態樣在於提供一種如前述之促進骨再生的生物支架的用途,其係用以製備一促進骨組織修復的生醫材料。
藉此,本發明之促進骨再生的生物支架因具有高度生物相容性以及促進骨細胞生長的效果,使其可應用於
製備促進骨細胞增生與骨組織修復之生醫材料,進而達成對人體提供一高效且安全的輔助治療的目標。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要,以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述,且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100:促進骨再生的生物支架
110:支架本體
111:放射狀格片
120:改質層
200:促進骨再生的生物支架的製備方法
210:進行一支架本體製備步驟
211:提供一高分子材料
212:進行一成型步驟
220:進行一塗佈步驟
230:進行一改質層形成步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:
第1圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體的掃描式電子顯微鏡影像圖;
第2圖係繪示本發明之一實施方式之促進骨再生的生物支架的製備方法的步驟流程圖;
第3圖係繪示不同型態之本發明之促進骨再生的生物支架的掃描式電子顯微鏡影像圖;
第4圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的平均孔隙率的分析結果圖;
第5圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的抗壓強度的分析結果圖;
第6圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的膨潤度的分析結果圖;
第7圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的乳酸釋出分析的分析結果圖;
第8圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的降解率分析結果圖;
第9圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的酸鹼穩定度的分析結果圖;
第10圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架其第二型骨生成蛋白於支架本體的固定濃度的分析結果圖;
第11圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的細胞存活分析的結果圖;
第12圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的鹼性磷酸酶含量的分析結果圖;
第13圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的骨鈣素含量的分析結果圖;
第14圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養人類間質幹細胞的鹼性磷酸酶含量的分析結果圖;
第15圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養人類間質幹細胞的骨鈣素含量的分析結果圖;
第16圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的電腦斷層掃描影像;
第17圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨組織修復率的分析結果圖;
第18圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑數量的分析結果圖;
第19圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑厚度的分析結果圖;
第20圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑間距的分析結果圖;
第21圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的蘇木精-伊紅染色結果圖;以及
第22圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的馬森三色染色結果圖。
以下將參照圖式示範說明本發明之具體試驗例,以利於本發明所屬領域之通常知識者,可在不需過度解讀與實驗的情形下完整利用並實踐本發明。然而,閱讀者應瞭解到,這些實務上的細節不應用以限制本發明,也就是說,在本發明部分試驗例中,這些實務上的細節是非必要的,而是用以說明如何實施本發明之材料與方法。
請參照第1圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架100的掃描式電子顯微鏡影像圖。促進骨再生的生物支架100包含一支架本體110以及一改質層120。
支架本體110呈中空圓柱狀並包含複數個放射狀格片111。如第1圖所示,放射狀格片111係一體設置在中空圓柱狀的支架本體110的內部,而由支架本體110之另一視角觀之,支架本體110與其內部之放射狀格片111之間存有充足的孔隙,進而使本發明之促進骨再生的生物支架100的平均孔隙率可達75%至90%。支架本體110的材質為聚乳
酸(polylactic acid,PLA),詳細而言,聚乳酸為一具有高度生物相容性的高分子材料,在生物體中可被水解為乳酸和乙醇酸,而乳酸和乙醇酸將可進一步整合至三羧酸循環中而排出體外,是以利用聚乳酸作為本發明之支架本體110的材質不僅不具毒性,亦可降低人體產生過敏反應的機率,而聚乳酸材質的支架本體110亦可於後續骨質重塑的過程中被降解而排出體外,進而提升本發明之促進骨再生的生物支架100的使用安全性與應用廣度。
改質層120均勻分布於支架本體110的至少一表面(未另標號),其中改質層120包含複數個第二型骨生成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),第二型骨生成蛋白在誘發軟骨及硬骨的生成與成骨細胞的分化的方面扮演重要的角色,是以在支架本體110及放射狀格片111的表面設置包含第二型骨生成蛋白的改質層120將有助於骨細胞於其上增生與進行骨質重塑,使本發明之促進骨再生的生物支架100可應用於作為促進骨細胞增生與骨組織修復之生醫材料,進而提供人體一高效且安全的輔助治療。較佳地,改質層120可更包含複數個聚多巴胺(polydopamine),且第二型骨生成蛋白可以聚多巴胺接枝至支架本體110的至少一表面。詳細而言,聚多巴胺的兒茶酚基團可與多種不同的官能基共價鍵結,進而使第二型骨生成蛋白可穩定地連接與分布於支架本體110及放射狀格片111的表面。較佳地,第二型骨生成蛋白於支架本體110的
至少一表面的一固定濃度可為200ng/scaffold(單位支架)至800ng/scaffod。
在本發明之促進骨再生的生物支架100中,支架本體110可以積層製造方法製得。積層製造(Additive Manufacturing,AM)又稱3D列印(3D printing),具體而言,積層製造技術係將工件的三維電腦模型轉換成二維的分層切片模型,再按前述之二維分層切片模型將材料堆疊至欲成型的位置,並透過重複堆疊的動作直至工件成型。因此,以積層製造的方式製備本發明之支架本體110將可避免習知以大塊材料切削雕琢的加工方式所造成的材料浪費問題,並可有效提升本發明之促進骨再生的生物支架100的製備效率。
在本發明之促進骨再生的生物支架100中,放射狀格片111的形狀可為四芒放射狀、六芒放射狀或八芒放射狀,以針對不同的骨骼的缺損或缺陷進行不同型態之設計,進而提升本發明之促進骨再生的生物支架100的應用廣度。另外,本發明之促進骨再生的生物支架100的平均孔徑可為750μm至1200μm,本發明之促進骨再生的生物支架100的抗壓強度可為20Mpa至70Mpa,而本發明之促進骨再生的生物支架100的膨潤度則可為5%至40%。
藉此,本發明之促進骨再生的生物支架100使用聚乳酸作為支架本體110的材質並於其表面設置包含第二型骨生成蛋白的改質層120,使本發明之促進骨再生的生物支架100具有良好的生物相容性,並可有效促進骨質增
生,而包含放射狀格片111的中空圓柱狀支架本體110則可在維持高度機械強度的前提下使其具有75%至90%的平均孔隙率,進而使本發明之促進骨再生的生物支架具有優異的使用安全性與生物相容性,並具有相關領域的應用潛力。
請參照第2圖,第2圖係繪示本發明之一實施方式之促進骨再生的生物支架的製備方法200的步驟流程圖。促進骨再生的生物支架的製備方法200包含步驟210、步驟220以及步驟230。
步驟210為進行一支架本體製備步驟,其中支架本體製備步驟包含步驟211及步驟212。
步驟211為提供一高分子材料,其中前述之高分子材料包含聚乳酸,進而提升本發明之促進骨再生的生物支架的製備方法200製得之支架本體的使用安全性與應用廣度。
步驟212為進行一成型步驟,其係以前述之高分子材料為基材進行積層製造,以形成支架本體。以積層製造技術形成支架本體的方式可有效提升本發明之促進骨再生的生物支架的製備效率,並可根據實際應用需求而調整本發明之促進骨再生的生物支架的尺寸與型態,以在減低材料成本的前提下提升製備效率,並可達成快速進行客製化製備的訴求。
步驟220為進行一塗佈步驟,其係將支架本體浸泡於一塗佈溶液中並反應一反應時間,以形成一預反應塗
層。具體而言,塗佈溶液可為一聚多巴胺溶液,聚多巴胺將會在經過反應時間的反應後固定於支架本體的至少一表面,以形成前述之預反應塗層。較佳地,前述之反應時間可為3小時至48小時。更佳地,前述之反應時間可為12小時。
步驟230為進行一改質層形成步驟,其係將包含前述之預反應塗層的支架本體浸泡於一第一溶液中,其中第一溶液包含第二型骨生成蛋白,藉以形成本發明之促進骨再生的生物支架。具體而言,第一溶液中的第二型骨生成蛋白將會與預反應塗層之聚多巴胺反應產生共價鍵結,以進一步將第二型骨生成蛋白接枝至支架本體的至少一表面。而在第二型骨生成蛋白與聚多巴胺的反應飽和後,預反應塗層與接枝其上之第二型骨生成蛋白將會轉變為改質層,藉以形成本發明之促進骨再生的生物支架。較佳地,第二型骨生成蛋白於第一溶液中的濃度可為250ng/ml至1000ng/ml,而第二型骨生成蛋白於支架本體的至少一表面的一固定濃度則為200ng/scaffod至800ng/scaffod。
藉此,本發明之促進骨再生的生物支架的製備方法200透過包含聚乳酸的高分子材料做為基材進行積層製造形成支架本體,並於支架本體外形成包含第二型骨生成蛋白的改質層,進而使本發明之促進骨再生的生物支架的製備方法所製得之促進骨再生的生物支架具有高度的機械強度、高度的生物相容性以及優良的孔隙率,使其具有相關領域的應用潛力。
以下將提出本發明之具體實施例以詳細說明本發明之促進骨再生的生物支架的孔隙率、平均孔徑、抗壓強度、膨潤度與支架穩定度,並進一步進行相關之生物相容性的測試。下述實施例中的本發明之促進骨再生的生物支架係以前述之促進骨再生的生物支架的製備方法200製備而得,是以相關之製備細節在此不再贅述。
本發明之促進骨再生的生物支架的物理與化學性質係以實施例1、實施例2與實施例3之本發明之促進骨再生的生物支架以及比較例1之生物支架進行分析,其中實施例1、實施例2、實施例3與比較例1係以未包含改質層之支架本體進行實驗,以利於進行孔隙率、平均孔徑、抗壓強度、膨潤度與支架穩定度的分析。實施例1的支架本體包含四芒放射狀的放射狀格片,實施例2的支架本體包含六芒放射狀的放射狀格片,實施例3的支架本體則包含八芒放射狀的放射狀格片,而比較例1則為利用冷凍乾燥法直接製備成形的聚乳酸支架。
請參照第3圖與表一,第3圖係繪示不同型態之本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體的掃描式電子顯微鏡影像圖,而表一則為比較例1、實施例1、實施例2與實施例3的詳細平均孔徑數值。
由第3圖可見,實施例1、實施例2與實施例3的促進骨再生的生物支架其放射狀格片的厚度並無顯著差異,且其平均孔徑則介於750μm至1200μm之間,而比較例1之聚乳酸支架在結構上較為鬆散,且無特定之支架形狀。再者,比較例1之聚乳酸支架的平均孔徑由不同方向觀之分別為55μm與159μm,甚小於實施例1至實施例3的平均孔徑,顯示本發明之促進骨再生的生物支架的平均孔徑大小適中並具有特定的外型與結構,使其適合用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
本發明之促進骨再生的生物支架的平均孔隙率係以比重法進行分析,在實驗上首先將實施例1、實施例2與實施例3的支架本體樣品於室溫條件下浸泡於100%之乙醇溶液中,以使乙醇充分浸潤其孔隙,接著取出浸泡後的樣品秤重。上述試驗重複五重複,並依照下述公式I計算而得其平均孔隙率:
其中Ms為支架樣品的重量,M0為乙醇的原始重量加上實驗容器的重量,M1為支架樣品浸泡後之重量加上實驗容器的
重量,而M2則為浸泡處理後乙醇的剩餘重量加上實驗容器的重量。
請參照第4圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的平均孔隙率的分析結果圖。如第4圖所示,實施例1、實施例2與實施例3的平均孔隙率分別為90.1±0.9%、87.7±2.3%以及80.0±2%,相較於比較例1之平均孔隙率為90.9±2.5%差異甚小,顯示本發明之促進骨再生的生物支架在設置有放射狀格片以及特殊構型的前提下仍具有優異的平均孔隙率,使其適合用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
本發明之促進骨再生的生物支架的抗壓強度係參照試驗方法ASTM D5024-95a進行分析,並進行五重複之試驗。
請參照第5圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的抗壓強度的分析結果圖。如第5圖所示,實施例1、實施例2與實施例3的抗壓強度約為20Mpa至70Mpa,且抗壓強度係隨著放射狀格片之芒狀分支數量的增加而增加,並明顯高於比較例1的聚乳酸支架的抗壓強度,進而使本發明之促進骨再生的生物支架用於製備促進骨組織修復的生醫材料時具有較佳的機械強度,並具有較廣的應用潛力。
在本發明之促進骨再生的生物支架的膨潤度實驗方面,首先取實施例1、實施例2與實施例3的支架本體樣品於室溫條件下浸泡於磷酸緩衝溶液並反應3、6、12、24和48小時後,取出樣品並秤重,接著將秤重完之樣品以冷凍乾燥處理後再次秤重,並依照下述公式II計算而得不同浸泡時間的膨潤度:
其中Wt為樣品浸泡後之重量,而W0則為樣品進行冷凍乾燥後的乾重。
請參照第6圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的膨潤度的分析結果圖。如第6圖所示,比較例1之聚乳酸支架與實施例1、實施例2與實施例3的支架本體在浸泡磷酸緩衝溶液12小時後其膨潤度增加趨勢趨近緩和,且比較例1、實施例1、實施例2與實施例3的膨潤度於各浸泡時間的變化趨勢並無明顯差異,且實施例1、實施例2與實施例3的膨潤度皆低於40%以下,顯示本發明之促進骨再生的生物支架在植入患者之患部後並不會因吸收體液而過度膨脹與變形,使其適合用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
在本發明之促進骨再生的生物支架的乳酸釋出分析係用以評估支架本體的結構穩定度,在實驗方面,首先取實施例1、實施例2與實施例3的支架本體樣品浸泡於3mL
之磷酸緩衝溶液中,並於37℃的條件下反應4、8、12、16、20和24周,並於不同時間點採集反應後的磷酸緩衝溶液,接著使用乳酸比色測定試劑盒(Lactate Colorimetric Assay Kit,K627,Biovision)進行比色分析,以檢測溶液中乳酸含量。
請參照第7圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的乳酸釋出分析的分析結果圖。如第7圖所示,比較例1的聚乳酸支架在浸泡於磷酸緩衝溶液第4周後即有明顯的乳酸釋出,且緩衝溶液樣本中的乳酸含量係隨著浸泡時間的增長而逐漸增加,然而,實施例1、實施例2與實施例3的緩衝溶液樣本於第4、8、12、16、20和24周的乳酸含量並無明顯增加,並顯著低於比較例1的緩衝溶液樣本的乳酸含量,顯示本發明之促進骨再生的生物支架具有優良的結構穩定度,並具有相關領域的應用潛力。
在本發明之促進骨再生的生物支架的降解率係參照國際標準化組織之醫療器材生物相容性試驗(ISO 10993)進行分析,在實驗上首先取實施例1、實施例2與實施例3的支架本體樣品秤重後並浸泡於3mL之磷酸緩衝溶液中,並於37℃的條件下反應4、8、12、16、20和24周,接著取出樣品進行冷凍乾燥處理後並秤重,並依照下述公式III計算而得不同處理時間的降解率:
其中W0為樣品浸泡前的乾重,而Wt則為樣品浸泡後進行冷凍乾燥後的乾重。
此外,在本實驗中更包含一控制組,其係直接以未經任何處理之磷酸緩衝溶液進行分析,以進一步說明本發明之促進骨再生的生物支架的降解率。
請參照第8圖與第9圖,第8圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的降解率分析結果圖,而第9圖係繪示本發明之促進骨再生的生物支架的酸鹼穩定度的分析結果圖。如第8圖所示,比較例1的聚乳酸支架在浸泡於磷酸緩衝溶液第4周後已有產生降解現象發生,並於浸泡第12周後開始隨浸泡時間的增長而增加其降解率,而實施例1、實施例2與實施例3在浸泡於磷酸緩衝溶液24周後的降解率與其浸泡於磷酸緩衝溶液4周後的降解率並無甚大差異。而如第9圖所示,比較例1於第4周開始其pH值係隨浸泡時間的增長而降低,並在24周降低至6.92,然實施例1、實施例2與實施例3的pH值在浸泡第24周後仍可維持7.16以上,並與控制組之pH值變化趨勢相仿,顯示本發明之促進骨再生的生物支架具有優良的物理與化學穩定度,使本發明之促進骨再生的生物支架適合用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
本發明之促進骨再生的生物支架的改質層性質分析係以前述之實施例3與實施例4及實施例5、實施例6和實施例7之本發明之促進骨再生的生物支架進行分析。詳細
而言,實施例4與前述之實施例3的支架本體同樣包含八芒放射狀的放射狀格片,並在後續僅以聚多巴胺溶液進行處理而進行分析,並另以實施例4命名之,而實施例5、實施例6與實施例7係將包含八芒放射狀的放射狀格片的支架本體以濃度2mg/mL的聚多巴胺溶液處理後,再另行以不同濃度的第二型骨生成蛋白溶液(即本發明之第一溶液)進行處理,其中實施例5係以濃度為250ng/ml之第二型骨生成蛋白溶液進行處理,實施例6係以濃度為500ng/ml之第二型骨生成蛋白溶液進行處理,而實施例7的支架本體係以濃度為1000ng/ml之第二型骨生成蛋白溶液進行處理。
本發明之促進骨再生的生物支架的聚多巴胺固定濃度與性質係以實施例4進行分析。在實驗方面,首先將實施例4的支架本體浸泡於濃度2mg/mL的聚多巴胺溶液中,於室溫條件下以25rpm振盪反應3、6、12和24小時,以在支架本體上形成預反應塗層。接著取300μL的BCA溶液(Pierce,Rockford)與經聚多巴胺溶液處理之實施例4的樣品反應後,於37℃的條件下反應2小時後以分光光譜儀(SpectraMAX M2e.Molecular Device,Sunnyvale)測量波長562nm的吸光值,並使用化學分析影像能譜儀(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis,ESCA)分析實施例4之支架本體的表面元素。
請參照表二,其係列示本發明之促進骨再生的生物支架的預反應塗層之聚多巴胺固定濃度與性質分析結
果。由表二的結果可見,實施例4之促進骨再生的生物支架的聚多巴胺含量係隨浸泡時間增長而增加,而在表面元素方面,在聚多巴胺尚未固定於支架本體時並未有N原子出現(即0小時之0%),而隨著反應時間的增加,碳原子與氧原子的濃度並無顯著之差異,但是氮原子的濃度則有明顯的增加,而在反應12小時後,碳原子、氧原子與氮原子的濃度則大致持平,顯示本發明之促進骨再生的生物支架在製備過程中,支架本體可在包含聚多巴胺之塗佈溶液中反應3小時至48小時後即可獲得優質的預反應塗層,較佳為12小時。
本發明之促進骨再生的生物支架其第二型骨生成蛋白於支架本體的固定濃度係以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析實施例5、實施例6與實施例7之促進骨再生的生物支架其第二型骨生成蛋白於支架本體的固定濃度。
請參照第10圖,其係繪示本發明之促進骨再生的生物支架其第二型骨生成蛋白於支架本體的固定濃度的分析結果圖。如第10圖所示,第二型骨生成蛋白於支架本
體的固定濃度分別為實施例5之219.1±20.4ng/scaffod、實施例6之375.4±44.3ng/scaffod以及實施例7之741.4±127.3ng/scaffod,顯示第二型骨生成蛋白確實已固定在支架本體的表面,由此可知,當第二型骨生成蛋白於第一溶液中的濃度為250ng/ml至1000ng/ml時皆可有效的使第二型骨生成蛋白接枝於支架本體的表面,且其固定率皆可達75%以上。
本發明之促進骨再生的生物支架的生物相容性分析係以前述之實施例3的支架本體浸泡液處理MG63骨母細胞,以分析MG63骨母細胞的細胞存活率、鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的表現量以及骨鈣素(Osteocalcin)的表現量。
在試驗方面,首先取實施例3的支架本體浸泡於磷酸緩衝溶液中,並於室溫條件下反應4、8、12、16、20和24周後,分別取不同浸泡時間的支架本體浸泡液與DMEM培養基以1:9的比例混合後得一試驗培養基,而前述之試驗培養基將用以作為後續處理MG63骨母細胞的樣品。
另外,本實驗更包含未經支架本體浸泡液處理之控制組以及以前述之冷凍乾燥法製得之聚乳酸支架的浸泡液進行處理之比較例1,以進一步說明本發明之促進骨再生的生物支架的生物相容性。
在本發明之促進骨再生的生物支架的細胞存活分析實驗方面,首先於48孔盤中分別植入每孔5×103個MG63骨母細胞並加入300μl之不同浸泡時間的試驗培養基,於37℃、5% CO2的培養箱中培養48小時後移除試驗培養基,接著於每孔加入20μl之MTT試劑與180μl之DMEM培養基,於37℃的條件下孵育4小時,接著以免疫分析儀測試波長570nm之吸光度值,並依照前述之吸光度值結果換算為細胞存活之個數。
請參照第11圖,其係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的細胞存活分析的結果圖。如第11圖所示,在經不同浸泡時間的支架本體浸泡液處理後,實施例3的細胞存活數顯著多於控制組的細胞存活數以及比較例1的細胞存活數,顯示本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體在塗覆改質層前即具有良好的生物相容性,並可有效促進MG63骨母細胞的增生。
鹼性磷酸酶為骨細胞活性的指標性蛋白,是以本實驗係以不同浸泡時間的試驗培養基處理MG63骨母細胞7天後分析其鹼性磷酸酶含量,以進一步分析本發明之促進骨再生的生物支架的生物相容性。在實驗上首先於48孔盤中分別植入每孔5×103個MG63骨母細胞並加入300μl之不同浸泡時間的試驗培養基,於37℃、5% CO2的培養箱中培養7天後移除試驗培養基,接著以PBS緩衝溶液潤洗三
次後於每孔加入200μl之鹼性磷酸酶檢測試劑(SIGMA FAST pNPP substrate,N2770),接著於暗室反應30分鐘以免疫分析儀測試波長405nm之吸光度值,當波長405nm之吸光度值越高,則表示樣品中的鹼性磷酸酶含量越高。
請參照第12圖,其係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的鹼性磷酸酶含量的分析結果圖。如第12圖所示,經浸泡時間為4周至24周的支架本體浸泡液處理後,比較例1與實施例3之鹼性磷酸酶含量皆高於控制組,顯示以聚乳酸做為本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體的材質並不會影響MG63骨母細胞的活性。而在經浸泡時間為24周的試驗培養基處理後,實施例3之鹼性磷酸酶含量顯著高於比較例1之鹼性磷酸酶含量,顯示本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體在塗覆改質層前即具有良好的生物相容性,並可有效提升MG63骨母細胞的增生與活性。
骨鈣素是骨骼生長過程中細胞外基質的重要蛋白質指標,是以本實驗係以不同浸泡時間的試驗培養基處理MG63骨母細胞18天後以酵素結合免疫吸附分析法分析MG63骨母細胞的骨鈣素含量,以進一步推知本發明之促進骨再生的生物支架的生物相容性。
請參照第13圖,其係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養MG63骨母細胞的骨鈣素含量的分析結果圖。如第13圖所示,經浸泡時間為4周至24周的試驗培養
基處理後,比較例1與實施例3之骨鈣素含量皆高於控制組,顯示以聚乳酸做為本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體材質並不會影響MG63骨母細胞的活性,且本發明之促進骨再生的生物支架的支架本體在塗覆改質層前即具有良好的生物相容性,並可有效促進MG63骨母細胞的增生與提升其活性。
本發明之促進骨再生的生物支架的體外細胞培養分析係將人類間質幹細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)植入前述之實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架培養7天與18天後,以觀察人類間質幹細胞的鹼性磷酸酶表現量以及骨鈣素表現量。
另外,本實驗更包含比較例2與比較例3,詳細而言,為了說明改質層對於人類間質幹細胞的增長促進效果,前述之未設置有改質層之實施例3的支架本體將另行命名為比較例2,而前述之僅設置有聚多巴胺預反應塗層之實施例4則另行命名為比較例3,以進一步說明本發明之促進骨再生的生物支架在包含改質層時之促進骨細胞增生的潛力。
在鹼性磷酸酶的表現量分析的實驗方面,首先人類間質幹細胞將以每平方公分2×104的數量植入置於培養皿中的實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架後,以
DMEM培養基培養7天與18天,接著以PBS緩衝溶液潤洗三次並加入350μl之鹼性磷酸酶檢測試劑(SIGMA FAST pNPP substrate,N2770),於暗室反應30分鐘後以免疫分析儀測試波長405nm之吸光度值,當波長405nm之吸光度值越高,則表示樣品中的鹼性磷酸酶含量越高。
請參照第14圖,其係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養人類間質幹細胞的鹼性磷酸酶含量的分析結果圖。如第14圖所示,人類間質幹細胞以實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架培養7天後,其鹼性磷酸酶含量係高於比較例2與比較例3的鹼性磷酸酶含量,並在培養18天後明顯高於比較例2與比較例3,顯示本發明之促進骨再生的生物支架在包含以聚多巴胺接枝的第二型骨生成蛋白時可提供長時間之促進人類間質幹細胞分化為骨細胞的效果,使其可進一步用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
在骨鈣素的表現量分析的實驗方面,首先人類間質幹細胞將以每平方公分2×104的數量植入置於培養皿中的實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架,並以DMEM培養基培養18天後,以酵素結合免疫吸附分析法分析細胞中的骨鈣素含量。
請參照第15圖,其係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架培養人類間質幹細胞的骨鈣素含量的分析結果圖。如第15圖所示,在培養18天後,實施例6的骨鈣素含
量可達5.3ng/ml,其明顯高於比較例2之2.3ng/ml以及比較例3之3.2ng/ml,顯示本發明之促進骨再生的生物支架在包含以聚多巴胺接枝的第二型骨生成蛋白的前提下可提供長時間之促進人類間質幹細胞分化為骨細胞的促進效果,使其可進一步用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
本發明之促進骨再生的生物支架的體內骨組織修復分析係以實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架進行實驗,以觀察本發明之促進骨再生的生物支架在活體生物中促進骨組織修復的能力。另外,本實驗更包含前述之比較例1與比較例2,以進一步說明本發明之促進骨再生的生物支架促進骨細胞增生的潛力。
在實驗方面,首先分別於實驗動物之紐西蘭大白兔的二後肢的股骨髁處形成一尺寸為6×8mm2的骨骼缺口,並將實施例6之本發明之促進骨再生的生物支架植入其中一後肢的骨骼缺口中,而另一後肢則不植入骨植入物以作為對照組,並在12周後以微米級電腦斷層掃描造影系統(Micro Computed Tomography Imaging System,Micro CT)觀察紐西蘭大白兔的二後肢,以評估並量化其骨組織修復率、骨小樑數量、骨小樑厚度與骨小樑間距。詳細而言,股骨髁處之海綿骨是由骨小樑互相交織而成,而骨小樑是依照不同骨骼之壓力和張力方向進行規則排列,以達到最大的
堅固性,是以本試驗細分析骨小樑的數量、厚度與間距,以進一步評估體內之骨組織修復的程度。
請參照第16圖、第17圖、第18圖、第19圖與第20圖,第16圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的電腦斷層掃描影像,第17圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨組織修復率的分析結果圖,第18圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑數量的分析結果圖,第19圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑厚度的分析結果圖,而第20圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的骨小樑間距的分析結果圖。
如第16圖所示,在紐西蘭大白兔的股骨髁植入支架12周後,實施例6的新生骨明顯多於比較例1、比較例2以及對照組,而如第17圖、第18圖、第19圖與第20圖所示,實施例6的骨組織修復率、骨小樑數量與骨小樑厚度皆明顯高於對照組、比較例1與比較例2,且實施例6的骨小樑間距同樣低於對照組、比較例1與比較例2的骨小樑間距,顯示本發明之促進骨再生的生物支架不僅具有良好的生物適應性,改質層的設置亦可有效提升骨組織修復的能力,進而使本發明之促進骨再生的生物支架可用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
再請參照第21圖與第22圖,第21圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的蘇
木精-伊紅染色結果圖,而第22圖係繪示以本發明之促進骨再生的生物支架植入兔體股骨髁12周後的馬森(Masson)三色染色結果圖。詳細而言,第21圖與第22圖中的10倍放大影像的黑色虛線框選部位為骨骼缺口或骨植入物所植入的區域,而紅色虛線框選部位則進一步放大為100倍之放大圖,其中第21圖為蘇木精-伊紅染色的結果圖,其紅色部分代表新生骨組織,並以文字「NB」進行標註,而文字「M」標註部分則代表支架所佔據的位置,而第22圖則為馬森三色染色的結果圖,其藍色部分代表膠原纖維,紅色部分代表細胞質,黑色部分代表細胞核,而文字「M」標註部分則同樣代表支架所佔據的位置。
由第21圖可見,在植入12周後,實施例6、比較例1與比較例2皆可見新生骨組織於宿主骨組織與支架界面之間生成,且實施例6、比較例1與比較例2皆有被新生骨組織取代的現象發生,其中實施例6的新生骨組織已近乎填滿放射狀格片的空隙。而由第22圖可見,實施例6、比較例1與比較例2的膠原纖維數量明顯多於對照組,且實施例6的新生骨組織與膠原纖維更進一步均勻地分布於支架本體中的空隙,顯示本發明之促進骨再生的生物支架不僅具有良好的生物適應性,改質層的設置亦可有效提升骨組織修復的能力,進而使本發明之促進骨再生的生物支架可用以製備促進骨組織修復的生醫材料,並具有相關領域的應用潛力。
綜上所述,本發明之促進骨再生的生物支架以及促進骨再生的生物支架的製備方法使用聚乳酸作為支架
本體的材質,而包含放射狀格片的中空圓柱狀支架本體則可在高空隙綠的前提下維持高度的機械強度。再者,於支架本體的表面設置一包含第二型骨生成蛋白的改質層可使本發明之促進骨再生的生物支架具有良好的生物相容性,進而使本發明之促進骨再生的生物支架具有優秀的使用安全性,並具有相關領域的應用潛力。
然本發明已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明的精神和範圍內,當可作各種的更動與潤飾,因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
200‧‧‧促進骨再生的生物支架的製備方法
210‧‧‧進行一支架本體製備步驟
211‧‧‧提供一高分子材料
212‧‧‧進行一成型步驟
220‧‧‧進行一塗佈步驟
230‧‧‧進行一改質層形成步驟
Claims (18)
- 一種促進骨再生的生物支架,包含:一支架本體,呈中空圓柱狀並包含複數個放射狀格片;以及一改質層,均勻分布於該支架本體的至少一表面;其中,該支架本體的材質為聚乳酸,該改質層包含複數個第二型骨生成蛋白,該促進骨再生的生物支架的平均孔隙率為75%至90%,且該支架本體係以積層製造方法製得。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架,其中該改質層更包含複數個聚多巴胺,且該些第二型骨生成蛋白係以該些聚多巴胺接枝至該支架本體的該至少一表面。
- 如申請專利範圍第2項所述之促進骨再生的生物支架,其中該些第二型骨生成蛋白於該支架本體的該至少一表面的一固定濃度為200ng/scaffod至800ng/scaffod。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架,其中該促進骨再生的生物支架的一平均孔徑為750μm至1200μm。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架,其中該促進骨再生的生物支架的一抗壓強度為20Mpa至70Mpa。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架,其中該促進骨再生的生物支架的一膨潤度為5%至40%。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架,其中該些放射狀格片的形狀為四芒放射狀、六芒放射狀或八芒放射狀。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,包含下述步驟:進行一支架本體製備步驟,其中該支架本體製備步驟包含:提供一高分子材料,其中該高分子材料包含該聚乳酸;及 進行一成型步驟,其係以該高分子材料為基材進行積層製造,以形成該支架本體;進行一塗佈步驟,其係將該支架本體浸泡於一塗佈溶液中並反應一反應時間,以形成一預反應塗層;以及進行一改質層形成步驟,其係將包含該預反應塗層的該支架本體浸泡於一第一溶液中,其中該第一溶液包含該些第二型骨生成蛋白,藉以形成該促進骨再生的生物支架。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該塗佈溶液為一聚多巴胺溶液。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該反應時間為3小時至48小時。
- 如申請專利範圍第10項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該反應時間為12小時。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該第二型骨生成蛋白於該第一溶液中的濃度為250ng/ml至1000ng/ml。
- 如申請專利範圍第12項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該些第二型骨生成蛋白於該支架本體的該至少一表面的一固定濃度為200ng/scaffod至800ng/scaffod。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該促進骨再生的生物支架的一平均孔徑為750μm至1200μm。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該促進骨再生的生物支架的一抗壓強度為20Mpa至70Mpa。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該促進骨再生的生物支架的一膨潤度為5%至40%。
- 如申請專利範圍第8項所述之促進骨再生的生物支架的製備方法,其中該些放射狀格片的形狀為四芒放射狀、六芒放射狀或八芒放射狀。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之促進骨再生的生物支架的用途,其係用以製備一促進骨組織修復的生醫材料。
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CN109199649A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-15 | 中国人民解放军总医院 | 组织工程半月板复合支架及其制备方法 |
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