CN110402918A - 一种保存骨组织材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种保存骨组织材料的方法，包括：(1)骨组织材料清洁；(2)将骨组织材料放入质量浓度为0.01%～0.5%的聚维酮碘保存溶液中，保存在冷冻设备中，保存温度低于0℃；(3)将冷冻保存的骨组织材料与浸渍液转入冷藏，解冻后取出，用0.9%生理盐水、林格氏液或磷酸缓冲液浸泡并清洗干净，即可作为回植骨组织。保存溶液使用碳酸氢钠或磷酸缓冲液作为PH调节剂，使保存液的PH值介于5.8至8.0之间。本发明的冷冻保存袋，其一部分袋体侧边开口，袋体连接一根导流软管，软管外端封闭。本发明的保存方法保持了骨组织结构的完整、力学性能维持不变；骨组织材料的有机质、无机质组成不流失，减轻病人的痛苦和经济负担。

Description

一种保存骨组织材料的方法

技术领域

本发明属于生物材料处理技术领域，特别是保存骨组织材料的方法。

背景技术

在临床医疗技术工作中，特别是颅脑外科、骨科、骨伤科、口腔科、耳鼻喉科、颌面整形外科和骨肿瘤专业范围内，为了保持手术后骨窗融合的速度，减少排异性反应的发生，同时符合患者“物归原主”的心理预期、消除焦虑情绪，在可能的条件下，越来越多的医务工作者和患者积极采用自体骨材料来对手术后的组织缺损部分进行回植。这种临床方法中，自体骨组织材料的无损、活性化保存就成为回植成功与否、病体恢复程度的重要因素。保存骨材料的方法，目前主要有三大类：一类是湿法保存，所用的保存液有：蜂蜜、酒精、洗必泰、甘油液、福尔马林等，其中酒精、福尔马林、洗必泰保存液会产生脱钙作用，损害骨组织密度。蜂蜜、甘油液及其它生物保存液没有杀菌去病毒效果，都不是有效的保存方法。第二类是低温保存法，将骨材料保存于-80℃深低温环境中。回植前，被选用的冻干骨必须在术前1小时取出，于林格氏液中重新水合。操作不当，往往造成骨移植材料的断裂；同时，繁琐的操作容易引起骨材料污染，导致骨回植失败。第三类是冻干后常温保存。只适用于部分允许经脱钙或脱蛋白处理后冻干保存的骨材料，也存在骨材料生物活性和力学强度下降的缺陷。

现有的这些保存方法和保存材料在规模化、临床常备使用的情况下，显然缺乏足够的稳定性、可操作性。尤其是在颅脑外科临床中，为脑损伤、脑出血等颅内压增高患者开颅去骨瓣减压后，自体颅骨骨瓣的保存尤为重要。保存方法的优劣关系到回植时颅骨骨瓣的组织密度、组份保留、灭菌灭毒的效果，对回植后骨窗位置融合的进程有决定性的影响。为保证颅脑外科临床中保存颅骨骨瓣等骨组织方法的有效程度和稳定性，探索改进颅骨骨瓣等骨材料的程序化、长效化的保存方法，具有紧迫性，明显的社会效益和经济效益的前景。

发明内容

本发明的技术研究是为克服目前对于骨组织材料进行湿法保存的各种方法中，存在的保存液保存时间短，无法在保证无菌状态、生物活性、力学强度均保持良好的同时，很好地维持骨材料生物相容性、表面活性和生物降解性等性能的缺陷，造成在实际使用中只能用于短暂保存，不能长期保存的状况。提出一种能够长期保存骨组织材料的低温湿法保存方法，具有保持骨材料力学性能不变、成份结构不变、灭菌灭病毒的生物活性不变的保存期效果，使对自体骨材料的处理达到全部可回植的程度。

本发明采用的技术方案是，一种保存骨组织材料的方法，包括下列步骤：

(1) 骨组织材料清洁，将去除骨膜的骨组织材料表面的毛刺去掉，洗净血迹和骨粉；

(2)浸渍保存，将清洁完成的骨组织材料放入质量浓度为0.01%～0.5%的聚维酮碘保存溶液中，保存在冷冻设备中，保存温度低于0℃；

(3)活化，将冷冻保存的骨组织材料与浸渍液转入冷藏，解冻完全后抽取保存溶液通过微生物培养确认无菌；取出冷藏保存的骨组织材料，用0.9%生理盐水浸泡去除保存溶液并冲洗至冲洗液清亮无色，即可作为回植骨组织。

本发明采用的聚维酮碘是元素碘和聚合物聚乙烯吡咯烷酮载体相结合而成的疏松复合物。聚维酮碘水溶液作为浸泡保存离体骨组织材料的介质，能够快速杀灭骨组织材料自带的各种病菌、病毒细胞、肿瘤细胞，以及离体后受外界环境污染产生的各种细菌、病原体感染。聚维酮碘中的聚维酮起载体和助溶作用，起到一种缓释作用，以保持较长时间的杀菌力。其特点是在保存期间逐渐释放出碘，直接使病原体内的蛋白质变性，沉淀，以致病原体细胞死亡，从而达到高效消毒杀菌、杀灭肿瘤细胞的目的。这种保存溶液具有杀菌谱广、能够长期稳定地杀灭病毒，无腐蚀作用、毒性低的特点。对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌等均有显著的杀灭作用。毒性仅为同浓度的复方碘溶液、碘酊的1/4～1/9。聚维酮碘对骨组织的无机质，尤其是钙质没有减损、溶解作用；对骨组织的哈弗管系统、骨小梁结构没有破坏作用，能够长期保持骨组织材料的力学性能。作为保存溶液无碘酊缺点，着色浅，易洗脱，适合作为回植材料的保存介质。其材料保存效果、临床的可操作效果与现有各种保存介质相比，都有比较大的提升，是一种兼备生物相容性和生物活性的骨材料保存方法。实验室保存的一个月、三个月、半年、一年，甚至保存期长达七年的骨瓣材料，各种物理、化学指标均与自然骨组织没有实质变化，回植后与肌体融合正常，没有坏死现象出现。

作为另一种选择，上述的保存骨组织材料的方法，活化操作采用林格氏液或磷酸缓冲液之一对保存的骨组织材料进行浸泡、清洗。

上述磷酸缓冲液以等摩尔浓度的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶液配对或磷酸二氢钾、磷酸氢二钾溶液配对混合制备，制备的清洗液pH值在5.7-8.0之间。林格氏液和磷酸缓冲液均对骨组织材料附着的聚维酮和碘单体有良好的洗脱效果，同时维持骨组织材料表层的电解质及酸碱平衡，减少回植后的排异反应，加速恢复进程。

优选的是，上述的保存骨组织材料的方法，聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：0.01%～0.5%的聚维酮碘、0.01%～0.02%的氯化钾、0.02%～0.04%的氯化钙、0.01%～0.03%的碳酸氢钠和余量的水。

或者是，聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：0.01%～0.5%的聚维酮碘、0.01%～0.02%的氯化钾、0.02%～0.04%的氯化钙、余量的磷酸缓冲液，保存溶液的PH值介于5.8至8.0之间。

配制上述两种聚维酮碘保存溶液可以在适当浓度的商品聚维酮碘溶液中加入各种组份，碳酸氢钠和磷酸缓冲液作为保存溶液的PH值调节剂添加进保存溶液。也可以采用水或者磷酸缓冲液作为溶剂，加入各种固态的组份，再调节保存溶液的PH值。这两种组成的聚维酮碘保存溶液维持了适当浓度的Na⁺、K⁺、Ca⁺的存在，其离子浓度、渗透压通常与人体相近，使骨组织材料在电解质平衡的环境下能够长期保存，不会对骨组织材料自身的各种无机质元素，特别是Ca的存在产生影响。碳酸氢钠和磷酸缓冲液的作用在于保持保存溶液的PH值，使其与人体体液的酸碱性环境接近，对骨组织材料的微观组织结构具有保护效果，骨组织材料长期保存后物理性状不会褪化。

作为一种离体的人体骨组织材料的保存方法，上述的骨组织材料包括颅骨骨瓣、四肢肢带骨、四肢骨、脊椎骨、上颌骨、下颌骨、颧骨、鼻骨、耳廓软骨、额骨、眶骨。

肢体系统、头颅面额系统的结构骨组织具有密质骨和/或松质骨结构，其基本组成不含蛋白质、脂肪等有机物，主要组成物为无机物和少量有机组份，与本发明的保存溶液有优良的相容性。以聚维酮碘为主要功能物质的保存方法，对上述的骨组织没有溶解流失、钙化脆裂等损害，能够保持骨组织的无机质完整、力学强度性能，在临床和研究工作均可以使用。比如骨肿瘤治疗中，病变骨组织经杀灭瘤细胞后可以原位回植，离体骨组织的保存就可以采用本发明的方法。

本发明的保存骨组织材料的方法，还包括一种用于封装保存液及骨组织材料进行冷冻的保存包装，是一种一部分侧边形成开口的袋体，袋体连接一根导流软管，导流软管的外端封闭。

本发明的保存方法维持骨组织材料从病体上取出到回植到病体上之间的保存期间，骨组织材料保存环境的无菌无病毒状态。为保证保存的质量，需要在不同的时期，特别是回植手术之前抽取保存溶液的样品进行细菌培养、病毒存量的检验。确认保存溶液没有细菌和真菌等微生物感染和病毒细胞存在的状态后，保存样品才可以作为回植的材料。因此，在保存袋上连接导流软管，用于从导流软管的位置取得袋内的保存溶液，随后从抽取针头孔的内侧再进行热熔粘合，保持密封状态。可见，这种结构的保存袋具有结构简洁，存放使用方便，密封性能优良的优点。保存袋优选采用透明塑胶材料制备。

上述记载的保存骨组织材料的方法，克服了现有采用蜂蜜、洗必泰等介质进行保存造成的抗菌、抗病毒效果不佳，骨材料性能下降等不足。使用本发明方法经过长期保存的骨组织材料具有下列几个特点：保持了骨组织结构的完整、力学性能维持不变；骨组织材料的有机质、无机质组成不流失、变异；回植后成骨细胞的相容性良好，成骨速度快；自体骨组织回植减轻病人的痛苦和经济负担。

附图说明

图1是实施例1^#样品骨瓣外板的密质骨部分扫描电镜放大图（Mag×40）

图2是实施例2^#样品骨瓣板障的松质骨骨小梁区扫描电镜放大图（Mag×1000）

图3是实施例3^#样品骨瓣板障的松质骨骨小梁区和网眼区扫描电镜放大图（Mag×215）

图4是本发明保存袋的结构图

1-袋体 2-导流软管 3-袋体开口

具体实施例

下面说明本发明的若干具体实施方式。

1.保存溶液的制备

在常温条件下，以一般实验室的溶液配制方法，按下列组成（质量百分浓度）分别配制聚维酮碘保存溶液。表1所示。

2.保存样品制备

选取4个病例的颅骨骨瓣进行保存，分别是：1^#样品，男性，48岁；2^#样品，女性，68岁；3^#样品，女性，61岁；4^#样品，男性，67岁。将去除骨膜的骨瓣表面的毛刺去掉，用生理盐水洗净血迹和骨粉。

取用容量适合各个样品的保存袋，样式如附图4所示，包括袋体1，导流软管2。袋体的一边是开口3，另一边连接导流软管，导流软管的末端封闭。在保存袋上做好标识编号，放入骨瓣样品，对应编号灌装实施例1～4的聚维酮碘保存溶液，并进行热焊密封保存。密封保存之前抽取少量的保存溶液进行细菌培养和真菌检验，以确保保存开始后骨瓣即处于无菌状态。将密封完成的骨瓣保存袋放置到温度介于-10℃～0℃的冷冻冰箱中进行保存。当需要回植取用时，提前三天将处于冷冻状态的保存袋移放到>0℃的冷藏箱中进行解冻。保存溶液融化后，从导流软管抽取少量的保存溶液进行细菌培养和真菌检验，确认保存溶液没有细菌和真菌感染的状态后，保存样品才可以作为回植的生物材料。

本实施例在配制保存溶液准备浸渍保存之前、保存期间和保存期满取用骨瓣之前，都抽取保存溶液进行细菌培养和真菌、病毒、肿瘤细胞检验，以确认保存环境的无菌状态。再取用经冷冻保存7年后的上述4个颅骨骨瓣样品进行分析试验，得到下面的实验结果。

3.细菌培养、病毒等检验结果

在保存前、保存中和保存后三个时间段抽取保存溶液进行白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌的三天培养观察，均没有检出细菌存留。进行肿瘤细胞、流感病毒等存量检验，没有发现病毒细胞的存在，证明保存溶液具有杀灭病毒、细菌的效果。

4.样品试验结果

（1）样品微观结构

取用经过冷冻保存的上述实施例1、2、3的骨组织材料样品在扫描电镜上进行放大，观察骨组织微观结构，得到附图1、2、3的拍摄照片。

图1是实施例1^#样品骨瓣外板的密质骨部分，照片显示外板质地密实、哈弗管状系统未见塌陷。

图2是实施例2^#样品骨瓣板障的松质骨骨小梁区，照片显示出板障骨组织规整、密实，哈弗管系统无破坏。

图3是实施例3^#样品骨瓣板障的松质骨骨小梁区和网眼区，可见结构平滑、无塌陷，组织致密。

总的看来，经过长期浸渍保存后的颅骨骨瓣样品的骨组织没有发生损坏性变化，骨质保持了与原样骨瓣一致的管腔结构和致密的结构特点。保存期溶液和保存环境没有对骨瓣产生破坏。

（2）成份分析

取用实施例1、2、3、4的骨瓣样品，在扫描电镜上进行多个点位的元素含量分析，得到各样品的主要无机质成份组成，如表2。

可见，作为骨组织重要成份的Ca、O、P、Na、Cl元素在样品中都保留下来。

并且，按照医学分析结论，作为自然骨组织骨钙主要组成的磷酸钙，其约占骨骼的65%-70%，与上述样品中Ca、O、P三种元素含量的分析结果是吻合的。本发明的骨瓣保存方法没有造成对骨组织的成份组成的改变。实践中，经过观察，术后成骨细胞细胞在样品材料表面和孔隙内均可黏附和分布，细胞生长和增殖情况良好。证明经过保存后回植到人体的颅骨骨瓣与其它颅骨组织的相融性良好，已经过临床30例病例的验证。

（3）抗压试验

将保存样品按压力试验样品要求取样后，在万能试验机上进行加压试验，直到样品开裂破坏，得到抗压压力值，如表3

据医学实验统计结果，人体颅骨的抗压破坏压力介于2000N～5000N之间，考虑到个体和年龄的差异，除去2^#样品的数值偏小，其余3个实施例的破坏压力值都自然新鲜颅骨的承压范围内，1^#和3^#样品的数值更是接近高位。说明本发明的保存方法能够维持颅骨骨组织材料的强度，力学性能良好。

（4）抗冲击性能

将保存样品进行制样，在摆锤冲击试验机上进行抗冲击试验。固定好样品后，选择适当重量的摆锤摆动冲击样品，直到样品开裂损坏，得到破坏能数值；再除以试样的截面积，计算出样品的冲击韧性特征值（J/cm²）如表4。

自然人体颅骨骨瓣的冲击韧性特征值，根据资料显示，在>50岁的年龄段中，为2.3～9.9 J/cm²，且随着年龄的增加而减弱。本实验的结果与资料吻合，说明经过长期保存后的颅骨骨瓣的抗冲击性能仍然处于正常的状态，没有减弱的现象。本发明保存方法对骨瓣的抗外界冲击能力没有影响。

以上是对本发明的几种优选实施方式的描述，不表示仅限于实施例的配方、方法。凡属于本发明权利要求所表述的技术范畴内的各种浓度、保存条件的修改、本领域技术人员贯用材料、技术手段的等同替换，比如保存溶液PH值调节剂碳酸氢钠更换为近似功能的其它无机电解质、保存袋的主体材料采用便于密封保存的材料，等等，类似的选择和变换，当然也属于本发明所阐述的技术范围。

Claims (8)

1.一种保存骨组织材料的方法，其特征是，包括下列步骤：

(1) 骨组织材料清洁，将去除骨膜的骨组织材料表面的毛刺去掉，洗净血迹和骨粉；

(2)浸渍保存，将清洁完成的骨组织材料放入质量浓度为0.01%～0.5%的聚维酮碘保存溶液中，保存在冷冻设备中，保存温度低于0℃；

(3)活化，将冷冻保存的骨组织材料与浸渍液转入冷藏，解冻完全后抽取保存溶液确认无菌；取出冷藏保存的骨组织材料，用0.9%生理盐水浸泡去除保存溶液并冲洗至冲洗液清亮无色，即可作为回植骨组织。

2.根据权利要求1所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的活化操作采用林格氏液或磷酸缓冲液之一对保存的骨组织材料进行浸泡、清洗。

3.根据权利要求1或2之一所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的骨组织材料包括颅骨骨瓣、四肢肢带骨、四肢骨、脊椎骨、上颌骨、下颌骨、颧骨、鼻骨、耳廓软骨、额骨、眶骨。

4.根据权利要求1或2之一所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：

聚维酮碘 0.01%～0.5%

氯化钾 0.01%～0.02%

氯化钙 0.02%～0.04%

碳酸氢钠 0.01%～0.03%

余量水。

5.根据权利要求3所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：

聚维酮碘 0.01%～0.5%

氯化钾 0.01%～0.02%

氯化钙 0.02%～0.04%

碳酸氢钠 0.01%～0.03%

余量水。

6.根据权利要求1或2之一所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：

聚维酮碘 0.01%～0.5%

氯化钾 0.01%～0.02%

氯化钙 0.02%～0.04%

磷酸缓冲液 余量

保存溶液的PH值介于5.8至8.0之间。

7.根据权利要求3所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的聚维酮碘保存溶液的组成包括（质量含量）：

聚维酮碘 0.01%～0.5%

氯化钾 0.01%～0.02%

氯化钙 0.02%～0.04%

磷酸缓冲液 余量

保存溶液的PH值介于5.8至8.0之间。

8.根据权利要求1或2之一所述的保存骨组织材料的方法，其特征是，所述的保存溶液封装在保存袋中进行冷冻，保存袋是一部分侧边形成开口的袋体，袋体连接一根导流软管，导流软管的外端封闭。