CN110754464A - 一种自体颅骨深低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自体颅骨深低温保存方法，用于解决现有技术中容易受到保存介质污染的问题，并提高骨生长活性，依次采用以下步骤进行保存：预处理、冲洗、预冷冻、制备凝胶、辐照灭菌、冻储、后处理，将凝胶的制备过程与自体颅骨的保存相结合，使具有生长活性的凝胶镶嵌在颅骨表面的空袭中，并在回植后促进骨骼生长；本发明将搭载n‑HA的PVA水凝胶的制备过程与自体骨骼的保存结合起来，在凝胶为液态的情况下与骨组织充分接触，在取出时形成凝胶，提高凝胶在骨骼上的附着力，避免了外源性污染，同时能够促进回植后骨骼生长。
Description
技术领域
本发明属于人体组织储存技术领域，具体涉及一种自体颅骨深低温保存方法。
背景技术
去骨瓣减压血肿清除或单纯去骨瓣减压术是基层医院神经外科的常见手术，为脑出血患者和重型颅脑损伤患者度过脑水肿高峰期、减少并发症、降低死亡率具有重要作用，自体颅骨回植相对于钛网、异体骨修补等传统方法优势更明显，不仅形状不需要重新调整，而且不会出现排异反应、伤口愈合良好、使用成本更低，能够保证颅骨的完整性。但是现在针对自体颅骨保存的方法缺乏统一的标准。
现有技术提供了一种骨组织保存的方法：先将供体用1‰洁尔灭溶液刷洗，接下来，在无菌环境下，清除骨表面的肌肉、骨膜等附件，并用生理盐水反复漂洗，接下来，将漂洗后的供体放入血浆袋中，热合封口，用4℃/min的速度梯度降温，在-80℃的环境下保存，复温使用时，先将骨组织放入45℃的林格式液中复温，后用庆大霉素浸泡后方可使用；但由于现有技术是将供体放在血浆中进行冻存，血浆本就是良好培养基，很容易在分装的时候外界污染，并在长时间的冻储中缓慢生长，进而影响供体的使用，如果对血浆杀菌原本其中的正常细胞也会被灭活，血浆维持骨组织生物活性的作用就消失了，而且，就算把供体放入血浆中，因为供体密度更大，会沉在底部，并不会充分接触，使用血浆会达不到预期效果，另外，这种方法仅仅能够用于自体颅骨保存，异体回植就会导致严重的排异反应。
另外，在颅骨回植以后，除了感染，还有就是颅骨修复速度，虽然自体颅骨不会引发排异反应，但是在保存前后均通过灭菌流程，对颅骨活性会有影响，因此可以通过增加促生因子，促进骨骼生长；中国期刊《人工晶体学报》刊登了一篇题为《羟基磷灰石的合成及应用研究进展》的文章，其中介绍了羟基磷灰石在骨组织工程的应用，也证明了羟基磷灰石具有良好的骨诱导性，但是力学性能较差，目前的应用方向是与其他材料进行复合，以改善骨组织性能，并没有公开将羟基磷灰石用于低温保存的方法。
而凝胶类材料因其独特的性能被广泛用于医疗方面，作为伤口敷料或是缓释载体，在骨科领域也有应用，题为《聚乙烯醇羟基磷灰石复合软骨植入材料性能的研究》的中国文献就介绍了一种利用聚乙烯醇羟基磷灰石的材料制作软骨的方法，但是尚未有将凝胶材料用于组织低温保存的情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种自体颅骨深低温保存方法，通过改变骨组织的包装介质，来降低骨组织因感染而废弃的情况，同时能够提高植入后的成骨效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种自体颅骨深低温保存方法，包括以下步骤：
步骤a、预处理：从供体中取出颅骨骨瓣，并剔除骨瓣上的骨膜等组织；
步骤b、冲洗：将颅骨块用生理盐水反复冲洗，去除其中的残留血迹；
步骤c、预冷冻：将颅骨块放入真空冷冻干燥机，在-2℃温度下，冷冻干燥1小时进行真空冷冻；
步骤d、制备凝胶：将聚乙烯醇（PVA）溶于90℃以上去离子水中，配置成PVA水溶液，将纳米羟基磷灰石（n-HA）用超声波分散，然后倒入PVA水溶液中形成复合溶液，搅拌均匀，脱泡后将复合溶液倒入模具中，并放入冷冻柜进行冷冻，然后将冷冻后的溶液放在室温下融化，完全融化后重复上述冷冻、融化过程；
步骤e、辐照灭菌：将颅骨经步骤c处理的颅骨块放入经步骤d处理的溶液中，并将二者通过放射性元素进行辐照灭菌，得到产品e。，得到产品e。
步骤f、冻储：产品e先冷却到0℃左右，再进一步冷冻到-20℃，再放入液氮罐中储存。
进一步地，在回植前，需要通过如下步骤进行后处理：步骤g、除凝胶，颅骨块从液氮罐中取出，放常温下解冻，颅骨块周围的溶液形成凝胶包覆在颅骨块周围，将颅骨块表面的凝胶刮除；
步骤h、将刮除凝胶的颅骨块放在0℃的环境下冷却，向上铺洒壳聚糖粉末并采用重量为1kg的铁球对表面进行辊压，然后恢复常温后，去除其表面的壳聚糖。
进一步地，所述步骤d中，对复合溶液的冷却条件是：冷冻温度为-20℃，冷冻时间为6~8小时。
进一步地，所述步骤c中，真空冷冻1小时后的颅骨块，仍旧放在真空冷冻干燥机中随炉恢复常温。
进一步地，所述步骤e中的放射性元素为钴60，辐照剂量为20kGy。
本发明至少具有以下有益效果：
（1）骨组织的包装介质更换为纳米羟基磷灰石聚乙烯醇凝胶，凝胶能够有效承托骨组织，并将其包裹，将骨组织与外界隔离，同时，凝胶是在无菌环境下直接制备的，不是从外界获取的，不会被外界污染。
（2）通过梯度降温的方式对骨组织进行预冷，预冷之后在与凝胶接触，保证良好接触的同时，使部分凝胶能够与凝胶附着在骨组织上。
（3）凝胶内搭载有能够促进成骨的纳米羟基磷灰石粉末，附着在骨组织上的羟基磷灰石随凝胶植入骨组织以后能够提高成骨速度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明；除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式；如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例
本实施例公开了一种同种颅骨低温保存方法，采用如下步骤进行保存：
a、预处理：将取出的颅骨块在十万尘级无菌操作间进行处理，从供体中取出颅骨骨瓣，并剔除骨瓣上的骨膜等组织，得到颅骨a。
b、冲洗：将颅骨a用生理盐水反复冲洗，去除其中的残留血迹，得到颅骨b。
C、预冷冻：将颅骨b放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻，冷冻温度为-2℃，这一过程颅骨b中的水分降低，冷冻干燥1小时后，关闭真空冷冻干燥机，颅骨b在真空冷冻干燥机中缓慢恢复温度，得到颅骨c。
d、制备凝胶：将聚乙烯醇（PVA）溶于90℃以上去离子水中，配置成PVA水溶液，将纳米羟基磷灰石（n-HA）用超声波分散，然后倒入PVA水溶液中形成复合溶液，搅拌均匀，脱泡后将复合溶液倒入模具中，并放入冷冻柜进行冷冻，冷冻温度为-20℃，冷冻时间为6~8小时，然后将冷冻后的溶液放在室温下融化，完全融化后重复上述冷冻、融化过程，得到溶液d，此时得到的溶液d已经初步形成了部分凝胶块，但整体仍为液态。
e、辐照灭菌：将颅骨c放入溶液d中，并将二者通过钴60进行辐照灭菌，辐照剂量为20kGy，得到产品e。
f、冻储：产品e先冷却到0℃左右，再进一步冷冻到-20℃，再放入液氮罐中储存。
在回植前，需要通过如下方法进行后处理：
g、除凝胶，将产品e放在常温下解冻，使产品e中的溶液形成凝胶，包覆在颅骨c周围，将颅骨取出，刮除表面的凝胶，得到成品g。
h、将颅骨g在0℃的环境下冷冻2~4分钟，在0℃的环境下将壳聚糖粉末洒在颅骨g上并采用重量为1kg的铁球对表面进行辊压，然后恢复常温后，去除其表面的壳聚糖，得到成品h。
对照例1
a、预处理：将取出的颅骨块在十万尘级无菌操作间进行处理，从供体中取出颅骨骨瓣，并剔除骨瓣上的骨膜等组织。
b、冲洗：将预处理后的颅骨块用生理盐水反复冲洗，去除其中的残留血迹。
C、辐照灭菌：将冲洗后的颅骨块通过钴60进行辐照灭菌，辐照剂量为20kGy。
d、冻储：将冲洗后的颅骨块放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻，将颅骨块中的水分降低，冷冻干燥1小时后，将颅骨块装入无菌袋中热压封口，并将颅骨块放入液氮罐中进行冷冻，得到对照样a。
回植前采用下列方法进行后处理
e、将对照样a置于0℃的环境下解冻，并将壳聚糖粉末洒在颅骨g上并采用重量为1kg的铁球对表面进行辊压，然后恢复常温后，去除其表面的壳聚糖，得到对照样b。
对照例2
a、预处理：将取出的颅骨块在十万尘级无菌操作间进行处理，从供体中取出颅骨骨瓣，并剔除骨瓣上的骨膜等组织。
b、冲洗：将预处理后的颅骨块用生理盐水反复冲洗，去除其中的残留血迹。
C、辐照灭菌：将冲洗后的颅骨块通过钴60进行辐照灭菌，辐照剂量为20kGy。
d、冻储：将冲洗后的颅骨块放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻，将颅骨块中的水分降低，冷冻干燥1小时后，将颅骨块装入盛有与供体血型相同的血浆的无菌袋中，热压封口，待血浆凝固，将其放入液氮罐中进行冷冻，得到对照样c。
回植前采用下列方法进行后处理
e、将对照样c放在40℃的林格式液中解冻，解冻后，用生理盐水冲洗两到三次并干燥。
f、将干燥后的对照样c置于0℃的环境下2~4分钟，并将壳聚糖粉末中洒在颅骨g上并采用重量为1kg的铁球对表面进行辊压，然后恢复常温后，去除其表面的壳聚糖，得到对照样d。
实验例
实验材料：取自健康尸体的面积约为0.01㎡的颅骨片6片，0.9%的生理盐水，聚乙烯醇（1799型），微米级羟基磷灰石99%，乙醇钙，牛血清蛋白。
将颅骨片分别按照实施例、对照例1、对照例2的方法进行制作，分别得到成品h、对照样b、对照样d，另外三片颅骨片未进行上述三种方法中的后处理，得到成品g、对照样a、对照样c，将上述产品制成两份，一部分直接使用生物显微镜进行微生物检测，另一部分称重后，分别置于以牛血清蛋白为培养基的培养皿中培养5~7天，第一天半量换液，以后每三天全量换液，与第七日再次称重，得到重量的增加量，得到以下结果：
表1 实验结果表
实验结果分析：
上面三种处理方法主要的不同点在于：使用的包裹介质不同，对照例1不使用任何包裹介质，直接进行冻储，对照例2使用血浆作为包裹介质，通过血浆包裹来提高颅骨片的生物活性，以保证在回植过程中能够更好地愈合。
实施例中采用的是搭载有纳米羟基磷灰石（n-HA）的聚乙烯醇（PVA）水凝胶作为包裹介质，采用重复冷冻法进行制备，并将制备凝胶的过程与颅骨块冷却的过程相结合，首先需要将颅骨块进行预冷冻，脱去其中水分，避免在低温环境下水膨胀而体积增加，导致颅骨片内大量出现微骨裂，影响颅骨片的力学性能，其次，不是直接放入深低温环境，而是通过梯度降温的方法，避免突然温度降低造成的微骨折；再次，由于凝胶的制备需要反复冷冻三次，最后一次解冻前溶液中的交联度都不够，最后一次冷冻前放入冷冻干燥后的颅骨块，颅骨块骨皮质在低温环境下收缩，出现较多的孔隙，因此能够与液态的凝胶溶液充分接触，且部分凝胶溶液进入颅骨块表面的孔隙之中，经过深低温冷冻后，颅骨块被取出，颅骨块外的凝胶成型，颅骨块在升温过程中，骨皮质表面孔隙变小，在刮除凝胶过程中，原本位于骨块表面空隙中的凝胶不会被去除，由于搭载n-HA的PVA水凝胶具有良好的生物相容性，n-HA有良好的骨诱导性，所以能够加快愈合速度，最后，在0℃的环境下，将颅骨块在壳聚糖粉末表面按压，使壳聚糖粉末能够部分填入骨皮质的间隙中或是骨皮质上残留的凝胶中，壳聚糖与n-HA联合使用有更好的骨诱导性，能够更好地加快骨愈合，因此经实施例方法处理的骨块增重最多。
在上述实验结果中，微生物检测是通过利用显微镜对样品直接观察，能够直观的观察到颅骨表面的细菌情况，更为直观，这项数据可以看出，仅有对照样c、对照样d上检出了微小的棒状菌，结合试验环境分析，由于始终是在无菌室内进行的操作，且实验材料基本都做过消毒，只有血浆未充分灭菌，避免损伤血浆内细胞，影响使用效果，而血浆是良好的培养基，稍微的操作失误就可能被感染，因此需要操作过程中额外小心，所以在对照例中检出的棒状菌可能就是血浆中带有的，而其他产品由于原料都是经过灭菌的，所以不存在被外界污染的情况。
而重量增长这一项上，将成品h、对照样a、对照样c作为一组，另外三件样品视为一组，同组之间样品不同点在于包裹介质的不同，将每一组组内的四个样品的重量增长进行对比，得到：成品h>对照样c>对照样a，另一组中：成品g>对照例d>对照例b，所以使用凝胶的促进骨生长的效果要好于使用血浆以及不使用介质保存的对照组，通过血浆作为保存介质，也可以提高骨生长的速度，由于上述处理方法均是采用辐照进行灭菌，因此，对颅骨块内的成骨细胞损伤较大，所以在不添加任何骨诱导元素的情况下，骨生长速度较慢。
而将采用成品h、成品g视为一组，对照样a、对照样b视为一组，对照样c、对照样d视为一组，将这三组进行比较分析，这三组组内样品的不同之处都在于是否后处理，根据表1中的数据，得到以下结论：成品h>成品g；对照样a>对照样b；对照样c>对照样d，所以，通过后处理添加壳聚糖能够提高骨诱导性，而且在上述方法中，均是在低温下进行添加，颅骨块骨密质部分会在低温下收缩，使得骨皮质表面的孔隙增大，部分粒径较小的壳聚糖就会进行其中，恢复常温后，骨皮质表面的孔隙减小，在常温下去除壳聚糖，部分壳聚糖就会固定在空隙中，在培养过程中，促进新骨形成。
另外，由于成品h>成品g，且添加壳聚糖以后的重量增加量明显高于其他两组，说明壳聚糖与羟基磷灰石共同使用会有协同作用，进一步提高新骨形成速度，同时搭载有n-HA的水凝胶能够固定壳聚糖，避免被清理。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种自体颅骨深低温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤a、预处理：从供体中取出颅骨骨瓣，并剔除骨瓣上的骨膜等组织；
步骤b、冲洗：将颅骨块用生理盐水反复冲洗，去除其中的残留血迹；
步骤c、预冷冻：将颅骨块放入真空冷冻干燥机，在-2℃温度下，冷冻干燥1小时进行真空冷冻；
步骤d、制备凝胶：将聚乙烯醇（PVA）溶于90℃以上去离子水中，配置成PVA水溶液，将纳米羟基磷灰石（n-HA）用超声波分散，然后倒入PVA水溶液中形成复合溶液，搅拌均匀，脱泡后将复合溶液倒入模具中，并放入冷冻柜进行冷冻，然后将冷冻后的溶液放在室温下融化，完全融化后重复上述冷冻、融化过程；
步骤e、辐照灭菌：将颅骨经步骤c处理的颅骨块放入经步骤d处理的溶液中，并将二者通过放射性元素进行辐照灭菌，得到产品e；
步骤f、冻储：产品e先冷却到0℃左右，再进一步冷冻到-20℃，再放入液氮罐中储存。
2.根据权利要求1所述的一种自体颅骨深低温保存方法，其特征在于：在回植前，需要通过如下步骤进行后处理：步骤g、除凝胶，颅骨块从液氮罐中取出，放常温下解冻，颅骨块周围的溶液形成凝胶包覆在颅骨块周围，将颅骨块表面的凝胶刮除；
步骤h、将刮除凝胶的颅骨块放在0℃的环境下冷却，向上铺洒壳聚糖粉末并采用重量为1kg的铁球对表面进行辊压，然后恢复常温后，去除其表面的壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种自体颅骨深低温保存方法，其特征在于：所述步骤d中，对复合溶液的冷却条件是：冷冻温度为-20℃，冷冻时间为6~8小时。
4.根据权利要求1所述的一种自体颅骨深低温保存方法，其特征在于：所述步骤c中，真空冷冻1小时后的颅骨块，仍旧放在真空冷冻干燥机中随炉恢复常温。
5.根据权利要求1所述的一种自体颅骨深低温保存方法，其特征在于：所述步骤e中的放射性元素为钴60，辐照剂量为20kGy。
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