CN1552467A - 一种异种脱细胞骨基质材料及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种异种脱细胞骨基质材料及其制备方法。其方法将猪的肋骨或四肢骨经过理化处理、并经过优选的几种蛋白水解酶之一联合Triton－X100作用后脱去细胞及组织中的异种蛋白。该材料保留了骨组织的天然网孔及小梁结构；近似天然骨的成分及生物力学强度。具有抗原性极低，植入后对受体的全身及局部免疫无明显影响。相容性及骨传导性好，来源丰富，制作简便，价廉。既可以作为骨缺损的充填材料，又可以复合细胞因子，种植种子细胞构建组织工程骨，应用于临床骨缺损的修复。

Description

一种异种脱细胞骨基质材料及制备方法

技术领域

本发明涉及骨缺损、骨不连修复所需的替代物及构建骨组织工程的材料，具体讲是异种骨基质材料。

背景技术

作为骨缺损修复及骨组织工程的基质材料可分为以下几种：天然骨及其衍生物；人工合成材料；各种材料组成的复合物等。其中，天然骨及衍生物(经各种方法处理的骨)具有接近自体骨的网状孔隙系统，组成和结构符合生理要求，并具有良好的细胞相容性，有利于种子细胞的生长，故在骨组织工程方面得到了比较广泛的应用。按其来源又分为同种异体骨和异种骨。相比之下，异种骨相对来源丰富、价格低廉。不过，两者都存在免疫原性问题。目前，一般是通过冻干、高温煅烧、γ射线照射和脱钙等方法降低其抗原性，如煅烧骨、脱蛋白骨等无机骨或完全去除骨矿成分的脱钙骨、骨基质明胶等有机成分材料。然而，其中的无机骨不含有机成分，因而疏松易碎，不具备基本力学强度；后者缺乏骨矿，因而质地柔软，不具备基本力学刚度。这些不足均限制了它们在骨组织工程中的应用[刘建中，王臻，胡蕴玉等《异体骨关节移植修复肢体大段骨缺损的术后并发症》  中华外科杂志，2000，38(5)：332～335]。而人工合成材料，存在成本高，性能不稳定，力学强度低，骨诱导活性弱，成骨能力差等问题。即使是在成分和结构上与天然骨基质具有高度仿生性的材料也难于同骨组织的天然结构和生物力学及生物学特性相比较。

发明内容

本发明的第一个目的是克服现有的各种异种骨的缺点，提供一种既消除了抗原，又具有很好的力学强度和刚度，还利于细胞粘附、增殖的异种脱细胞骨基质材料。

本发明的第二个目的是提供一种制备所述异种脱细胞骨基质材料的方法。

实现第一个目的的一种异种脱细胞骨基质材料，它是经过理化处理的猪骨；区别于现有异种骨基质材料的特征是，本发明的材料还是去脱了细胞以及抗原的猪骨。

进一步讲：本发明的材料是经过理化处理、并去脱了细胞以及抗原的猪的肋骨或四肢骨。

实现第二个目的的异种脱细胞骨基质材料的制备方法是：取新鲜猪骨，先对其进行常规的理化处理，包括去除软组织和骨髓，冲洗，在蒸馏水中浸泡等，关键的是该制备方法还至少有以下步骤：①把理化处理后的猪骨放入H₂O₂中反应，以破坏细胞和间质蛋白；②再放入蒸馏水中浸泡、清洗；③放入甲醇-氯仿溶液中脱脂；④放入无水乙醇中除去多余的氯仿；⑤放入成分包括NaOH、Triton-X100和蛋白水解酶的溶液中反应，以脱去细胞和间质蛋白；⑥放入无水乙醇中除尽残留的氯仿；⑦把该骨晾干、封装后用⁶⁰Co照射灭菌。其中，所述的蛋白水解酶为Dispase酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶；所述的新鲜猪骨主要指猪的肋骨或四肢骨。

进一步讲：步骤①所用H₂O₂的浓度为30％，反应时间为12小时左右(以完全破坏掉细胞和间质蛋白为准)。步骤③中的甲醇、氯仿比例约为1∶1～1∶4，脱脂时间为12～24小时(以能完全脱脂为准)。步骤⑤的溶液中NaOH含量为0.1～1.0N；Triton-X100含量为1％～5％；蛋白水解酶的含量为2％～8％；反应时间为18～42小时(以能完全脱去细胞为准)；显然，为保持酶的活性，反应温度应在37℃左右。⁶⁰Co的照射剂量为25～30kGy。

猪的体型大小与人较接近，骨组织也相似，而且猪与人在遗传背景上比牛、羊等动物更接近。所以，采用猪骨这种异种骨更适合于作为骨组织工程及骨缺损修复的材料。与现有的去除抗原的方法不同，本发明是用脱去细胞的方法来去除存在于细胞及组织中的抗原的——因为，存在于细胞和细胞外的非胶原性异种蛋白具有抗原性，而且主要存在于细胞上，脱去了细胞和间质蛋白，就自然去除了细胞和抗原。本发明步骤简单、易于操作，材料和药品的来源丰富。与现有技术相比具有如下优点：

1、采用脱细胞方法制备的异种骨基质材料，由于经酶解及Triton-X100联合作用，无细胞及碎片残留，非胶原蛋白去除彻底，因此抗原性极低，对植入受体的全身及局部免疫无明显影响。

2、采用对猪骨脱细胞的方法制备的骨基质材料，具有天然骨组织的网孔和孔隙率，有适合种子细胞和血管长入；有利于种子细胞黏附、增殖、分化和表型表达的三维空间结构。并且在组织相容性、生物降解性和造价方面明显优于人工合成材料。

3、所述材料具有很好的力学强度和刚度；具有良好的骨传导性和一定的骨诱导性。可以作为骨缺损的填充材料，也可以构建组织工程骨，修复骨缺损。

4、所述材料用⁶⁰Co照射灭菌，可以有效杀灭病毒及细菌，消除生物制品临床应用的后顾之忧。当然，达到这同一目的其他可靠的灭菌方法也是可行的。

在“具体实施方式”中将进一步披露所述材料被制成块状或粉末状。相比较而言，猪肋骨较适合制成块状的，其四肢骨较适合制成粉末状的。其中块状的脱细胞骨基质材料具有与新鲜骨组织近似的生物力学强度、刚度和相同的小梁结构，尤其适合四肢骨缺损的修复；粉末状的脱细胞骨基质复合粘连剂及信息分子(如rh-BMP，VEGF等)后，作为可注射型材料修复骨缺损、骨不连，其特点是对机体创伤小。

以下仅以“具体实施方式”中的块状材料的部分实验来进一步证实本发明的优点。

实验1：用块状的脱细胞异种骨基质材料，修复兔桡骨1.0cm缺损20例。8周时，见新骨形成；16周时，X线及组织学均见骨性愈合，新生血管长入。

实验2：用块状的脱细胞异种骨基质材料，复合重组人骨形态发生蛋白-2修复兔桡骨1.0cm骨缺损、骨不连各15例。4周时见新骨形成，血流量、成骨量较实验1显著增多。8周见骨性愈合。

实验3：分别用块状的脱细胞异种骨基质材料与兔自体骨植入。植入后1～6周，5次检测外周血、局部组织中免疫细胞变化、淋巴细胞增殖反应及母细胞转化等。两者比较无统计学差别，局部组织学观察见有骨诱导作用。

上述实验还进一步表明：用本法所制作脱细胞异种骨基质材料复合重组人骨形态发生蛋白-2修复兔桡骨骨缺损较传统材料明显缩短愈合时间，效果显著，无免疫排斥反应。

具体实施方式

实施例1：一种异种脱细胞骨基质材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜肋骨，去除软组织和骨髓，根据需要、制成块状(为前面介绍的验证性实验，本例的大小为1cm³左右)。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡45分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡40分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶1的甲醇氯仿液中脱脂24小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间为24小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有0.8N的NaOH、2％的Triton-X100、5％的DisDase酶的溶液中反应20小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干。制品封装后，用⁶⁰Co照射灭菌，照射剂量为25kGy。至此，一种块状的异种脱细胞骨基质材料已制备完成，备用。

实施例2：一种异种脱细胞骨基质材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜肋骨，去除软组织和骨髓，根据需要、制成块状(为前面介绍的验证性实验，本例的大小为1cm³左右)。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡50分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡35分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶2的甲醇氯仿液中脱脂18小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间32小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有0.2N的NaOH、1.5％的Triton-X100、2.5％的胃蛋白酶的溶液中反应36小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干。制品封装后，用60Co照射灭菌，照射剂量为30kGy。至此，一种块状的异种脱细胞骨基质支架材料已制备完成，备用。

实施例3：一种异种脱细胞骨基质材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜肋骨，去除软组织和骨髓，根据需要、制成块状(为前面介绍的验证性实验，本例的大小为1cm³左右)。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡60分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡30分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶4的甲醇氯仿液中脱脂12小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间48小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有1.0N的NaOH、4.5％的Triton-X100、8％的胰蛋白酶的溶液中反应18小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干。制品封装后，用⁶⁰Co照射灭菌，照射剂量为25kGy。至此，一种块状的异种脱细胞骨基质支架材料已制备完成，备用。

实施例4；一种异种脱细胞骨基质支架材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜四肢骨，去除软组织和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的块状。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡60分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡40分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶2的甲醇氯仿液中脱脂20小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间36小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有0.4N的NaOH、2％的Triton-X100、4％的Dispase酶的溶液中反应38小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干后，碾成其颗粒大小在0.2～1mm³的粉末状。制品封装后⁶⁰Co照射灭菌，照射剂量为30kGy。至此，一种粉末状的异种脱细胞骨基质支架材料已制备完成，备用。

实施例5：一种异种脱细胞骨基质支架材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜四肢骨，去除软组织和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的块状。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡50分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡50分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶1的甲醇氯仿液中脱脂28小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间32小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有0.6N的NaOH、3％的Triton-X100、5％的胃蛋白酶的溶液中反应32小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干后，碾成其颗粒大小在0.2～1mm³的粉末状。制品封装后⁶⁰Co照射灭菌，照射剂量为25kGy。至此，一种粉末状的异种脱细胞骨基质支架材料已制备完成，备用。

实施例6：一种异种脱细胞骨基质支架材料的制备方法：取体重为70～100Kg的猪的新鲜四肢骨，去除软组织和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的块状。用自来水冲洗干净，时间不少于30分；再用蒸馏水浸泡60分钟。取出晾干后，在室温条件下，在浓度为30％的H₂O₂中反应12小时，以破坏细胞和间质蛋白。蒸馏水浸泡30分钟。取出晾干后，于室温条件下，在浓度为1∶3的甲醇氯仿液中脱脂18小时。再用无水乙醇溶解、除去多余的氯仿，时间48小时。取出晾干后，在37℃±1.5℃的条件下，在含有0.8N的NaOH、5％的Triton-X100、6％的胰蛋白酶的溶液中反应20小时，以脱去细胞。然后，再用无水乙醇溶解并彻底清除残余的氯仿，时间为48小时，第24小时后更换该乙醇一次。取出彻底晾干后，碾成其颗粒大小在0.2～1mm³的粉末状。制品封装后⁶⁰Co照射灭菌，照射剂量为30kGy。至此，一种粉末状的异种脱细胞骨基质支架材料已制备完成，备用。

从上述制备方法的实施例中不难看出，本发明中关于产品——“异种脱细胞骨基质材料”的发明内容也同时披露了出来，故不再另举出该材料本身的实施例了。

除猪骨外，同样可以用其他动物骨，如牛骨、羊骨等异种骨、依照本发明所述的方法制备出脱细胞骨基质材料，以供临床应用。

Claims (6)

1、一种异种脱细胞骨基质材料，它是经过理化处理的猪骨，其特征在于，该材料是脱去了细胞以及抗原的猪骨。

2、根据权利要求1所述的异种脱细胞骨基质材料，其特征在于，该材料是经过理化处理、并脱去了细胞以及抗原的猪的肋骨或四肢骨。

3、一种异种脱细胞骨基质材料的制备方法，取新鲜猪骨，先对其进行常规的理化处理，包括去除软组织和骨髓，冲洗，在蒸馏水中浸泡，其特征在于，该制备方法还至少有以下步骤：①把理化处理后的猪骨放入H₂O₂中反应，以破坏细胞和间质蛋白，②再放入蒸馏水中浸泡、清洗；③放入甲醇-氯仿溶液中脱脂；④放入无水乙醇中除去多余的氯仿；⑤放入含有NaOH、Triton-X100和蛋白水解酶的溶液中反应，以脱去细胞和间质蛋白；⑥放入无水乙醇中除尽残留的氯仿；⑦把该骨晾干、封装后用⁶⁰Co照射灭菌。

4、根据权利要求3所述的异种脱细胞骨基质材料的制备方法，其特征在于，所述的新鲜猪骨是猪的肋骨或四肢骨。

5、根据权利要求3所述的异种脱细胞骨基质材料的制备方法，其特征在于，H₂O₂的浓度为30％；甲醇、氯仿比例为1∶1～1∶4；NaOH含量为0.1～1.0N，Triton-X100含量为1％～5％，蛋白水解酶的含量为2％～8％；⁶⁰Co的照射剂量为25～30kGy。

6、根据权利要求3所述的异种脱细胞骨基质材料的制备方法，其特征在于，所述的蛋白水解酶为Dispase酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶。