CN115814157A - 一种用于骨整合材料的抗菌性涂层及其制备方法 - Google Patents

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CN115814157A CN202111089747.5A CN202111089747A CN115814157A CN 115814157 A CN115814157 A CN 115814157A CN 202111089747 A CN202111089747 A CN 202111089747A CN 115814157 A CN115814157 A CN 115814157A
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许静
高春红
李天铎
班青
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Abstract

本发明公开一种用于骨整合的抗菌涂层，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐，所述双环氧季铵盐的接枝率为6～8％；所述涂层的接触角为65～75°，所述抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率为72～93％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为74～98％。本发明通过在多肽单分子膜表面接枝双环氧季铵盐，能够使材料具有很好的抗菌性能，克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、性能不稳定；以及高分子季铵盐接枝率低，从而影响抑菌性能的缺陷。本发明提供的抗菌涂层的接触角为65°～75°，具有适宜的亲疏水性，应用于钛合金表面形成薄膜涂层，当钛合金材料植入人体后有利于骨细胞的粘附以及骨的形成，适用于骨整合材料。

Description

一种用于骨整合材料的抗菌性涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于天然高分子领域，涉及一种用于骨整合材料的抗菌性涂层及其制备方法。
背景技术
骨及骨替代物移植技术发展至今已有200多年历史，成为临床上治疗骨缺损的重要手段，并得到广泛应用。由于金属钛具有优异的机械和化学性能、良好的耐腐蚀性和适当的力学性能(强度、韧性、相对较低的弹性模量)，目前钛合金已成功替代不锈钢成为骨或关节的替代物。但是，由于钛是一种生物惰性材料且易积累血清蛋白滋生细菌，造成骨脱落，使得钛及其合金在体内与骨的结合和固定仍是一个难以解决的问题。因此，对钛的表面进行改性赋予其抗菌性具有十分重要的意义。
季铵盐作为广谱抗菌剂已广泛应用于工业,纺织业及医疗行业等。高分子化的季铵盐化合物，相对于小分子的季铵盐类抗菌剂，不仅避免了其易溶解渗出、化学稳定性不佳等缺点，并且具有毒性低、物理化学性能稳定、抗菌性优异等特点。相关研究表明，使用表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，将大分子通过共价键接枝到材料表面对钛表面进行改性处理是一种有效改性方法。金露等，2014年10月10日于全国口腔材料学术交流会公开，钛种植表面接枝大分子季铵盐增强其表面抗菌性的研究。通过ATRP技术在钛片表面成功接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)高分子，并利用十六烷基溴进一步使DMAEMA分子末端的叔胺基团发生N-烷基化反应，获得季铵化聚合物。表明改性后的钛片表面对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的杀灭作用。
但是，高分子化的季铵盐化合物在对材料进行改性处理时，具有以下缺陷，高分子聚合物其链段的空间位阻较大，溶液中的聚合物链段很难继续与材料表面接触反应，因此接枝密度往往不高，随着大分子季铵盐分子量的增大，空间位阻变大，接枝效率也会降低。且直接接枝高分子季铵盐会影响钛材料的生物相容性。胶原多肽作为优良的天然高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性、低生物毒性和优良的延展性等特征，是一种极具研究价值的环境友好型天然高分子材料。且胶原多肽是由多种氨基酸组成的蛋白质，胶原多肽分子上含有氨基、羧基、羟基等很多极性基团，使其产生较强的分子间氢键，若将胶原多肽制备成生物固定化涂层，应用于钛材料表面，能够解决钛改性材料的生物相容性问题。但是，季铵盐与胶原多肽溶液进行接枝反应，再通过涂抹法制膜的过程中，存在接枝率和厚度均不易控制的问题，且改性明胶与材料表面没有较强的相互作用，涂层牢固度不好。比如，中国专利文献CN103436169A(CN201310369057.4)公开一种含有聚硅氧烷和季铵盐的抗菌性明胶皮革涂饰剂及其制备方法，先对明胶聚合物进行改性后再涂抹到皮革表面形成改性涂层，在涂饰过程中，溶液中的水分缓慢挥发，明胶组分与皮胶原之间的同源性促使二者之间产生较强的分子间相互作用而紧密结合，形成涂层。但是该方法无法控制伯氨基暴露，且仅适用于皮革等与明胶具有同源性的材料。而该改性明胶与金属等材料没有较强的相互作用，涂层牢固度不好。
发明内容
本发明为了解决现有技术中金属材料在抗菌改性时存在的，小分子季铵盐易溶解渗出、化学稳定性不佳、而大分子季铵盐空间位阻大、接枝率低的缺点，提供一种用于骨整合材料的抗菌性涂层及其制备方法。本发明利用伯氨基与环氧基的开环反应，将季铵盐连接到胶原多肽上，制备出具有生物相容性好、高抑菌性能的钛基涂层材料。
本发明中的双环氧季铵盐烷基链分子量为301g/mol，为小分子季铵盐。
为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于骨整合材料的抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐，所述双环氧季铵盐的接枝率为6～8％；所述涂层的接触角为65～75°，所述抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率为72～93％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为74～98％。
优选的，所述双环氧季铵盐的接枝率为7.2±0.02％；所述涂层的接触角为72.1±0.8°，所述抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率为92±0.02％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为98±0.05％。
所述抑菌率的计算公式为：抑菌率AR(％)＝(CFUcontrol–CFUexperiment)/CFUcontrol×100％；所述细菌浓度为1×106CFU ml-1。其中，CFUcontrol是指空白基底上的菌落数；CFUexperiment是指上述抗菌涂层上的菌落数。
抑菌率测试方法为：金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段，将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度；将被测样品于37℃下，在1mL的细菌悬浮液中培养24h，孵育后，用PBS冲洗两次；用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min，将含有细菌的悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数，计算抑菌率。
所述接枝率的定义为：
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量占接枝反应前膜上伯氨基摩尔量的百分比。
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量可通过2(WD-W0)/MW计算，即接枝成功的双环氧季铵盐的摩尔量的2倍。其中，WD为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐后的质量，W0为多肽单层膜接枝反应前的质量，MW为双环氧季铵盐的相对分子质量。
优选的，所述双环氧季铵盐(DEQAS)，分子式如下所示：
Figure BDA0003265659690000031
进一步优选的，所述双环氧季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)将硫酸钾、溶剂以及环氧氯丙烷混合后于45～55℃加热搅拌0.5h～1h；
(2)向步骤(1)的混合溶液中滴加四甲基乙二胺，滴加四甲基乙二胺的时间为25～35min；恒温的温度为45～55℃，恒温搅拌1～2h；
(3)将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐。
优选的，四甲基乙二胺、环氧氯丙烷的摩尔比为1.0:0.5～1.5。
优选的，步骤(1)中硫酸钾与环氧氯丙烷的摩尔比为0.9～1.1：100。
优选的，步骤(1)中环氧氯丙烷与溶剂的质量体积比为0.2～0.3g/mL。进一步优选的，步骤(1)中蒸馏水和甲醇作为溶剂，两者体积比为V(甲醇):V(蒸馏水)＝1:0.8～1.8。
将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐。
优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为5～-9mV；所述膜的接触角为10±1°～84±1°。
进一步优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为-3～-9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°。进一步优选的，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3％，单层膜的厚度为6.6nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV，接触角为61±1°。进一步优选的，所述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111842088A(CN202010753400.5)。
进一步优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为13.8～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12～14％，多肽单层膜的Zeta电位为-1～5mV；所述膜的接触角为10±1°。进一步优选的，上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111840661A(CN202010753455.6)。
本发明还提供上述用于骨整合的抗菌性涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和双环氧季铵盐混合，超声处理，使双环氧季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
2)将胶原多肽单层膜置于步骤(1)的混合溶液中，于48～52℃下，反应11～13h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，即得到抗菌性涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
优选的，步骤1)中混合溶液中双环氧季铵盐的浓度为7.2～7.6mg/mL(0.0239～0.0252mol/L)。
优选的，所述缓冲液的pH＝9.6。
本发明还提供一种骨整合材料，所述骨整合材料为金属钛或其合金制成，材料表面具有上述抗菌性涂层。
本发明的有益效果：
钛及其合金是生物惰性材料，在作为骨组织的修复和替代材料时，使得它很难和骨组织形成稳定的化学键，在一定程度上限制了它与骨组织的结合术后的长期使用必然会导致假体松动以及翻修手术，同时由于手术部分的组织受损，局部防御力较差，手术部位很容易被细菌感染。本发明通过提供在金属钛及其合金表面的抗菌涂层，能够解决上述问题，尤其是材料的生物相容性问题。且本发明通过在多肽单分子膜表面接枝双环氧季铵盐，能够使材料具有很好的抗菌性能，克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、性能不稳定；以及高分子季铵盐接枝率低，从而影响抑菌性能的缺陷。
本发明利用碱性条件下胶原多肽单层膜上面的伯氨基与双环氧季铵盐上的环氧基开环反应进行接枝，胶原多肽单层膜与双环氧季铵盐之间以共价键的方式结合，环氧基团具有较高的化学反应活性，更易于和胶原多肽中的伯氨基发生交联反应，从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中，使得胶原多肽的物理和化学性能得到改善。
本发明提供的抗菌涂层的接触角为65°～75°，具有适宜的亲疏水性，应用于钛合金表面形成薄膜涂层，当钛合金材料植入人体后有利于骨细胞的粘附以及骨的形成，适用于骨整合材料，本发明的抗菌涂层具有适宜的亲疏水性能使其能够应用于骨整合材料。
附图说明
图1为不同涂层的水接触角(WCA)图像；
图2为不用涂层表面的光学显微镜(OM)图像；其中，(a)：未打磨的钛片；(b)：打磨后的钛片；(c)：G-STSo6％wt；(d)：G-(STSo6％wt)-DEQAS；
图3为不用涂层表面的原子力显微镜(AFM)图像；其中，(a)：经过抛光打磨后的钛片；(b)：G-STSo6％wt；(c)：G-STSo6％wt-DEQAS；
图4为细胞在不同涂层表面粘附的光学显微镜图像，其中(a)：Ti；(b)：G-STSo6％wt；(c)：G-DEQAS；(d)：G(STSocac)-DEQAS；(e)：G(STSocmc)-DEQAS；(f)：G(STSo6％wt)-DEQAS；(g)：G(STSo6％wt)-EPDDMPC)；
图5为细胞在不同涂层表面迁移的光学显微镜图像，其中(a)：Glass；(b)：G-STSo6％wt；(c)：G-DEQAS；(d)：G(STSocac)-DEQAS；(e)：G(STSocmc)-DEQAS；(f)：G(STSo6％wt)-DEQAS；(g)：G(STSo6％wt)-EPDDMPC；
图6大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落图片；
图7大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落计数柱状图；
图8大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的杀菌率柱状图。
具体实施方式
本发明实施例所用试剂除非特别说明，均为普通市售产品。本发明1g胶原多肽中含有伯氨基5.6×10-4mol。
本发明中双环氧季铵盐的制备方法：包括以下步骤：
(1)取250mL三口烧瓶，向其中依次加入蒸馏水(22.0mL)、硫酸钾(0.2g)、甲醇(17.0mL)以及环氧氯丙烷(9.5g)，然后于50℃，加热搅拌0.5h；
(2)在上述搅拌过程中，以12d min-1的速率，将四甲基乙二胺(5.8g)加入到三口烧瓶中，再次搅拌1.5h后停止反应；
(3)将反应后的混合物倒入250mL圆底烧瓶中，进行减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体。
双环氧季铵盐的合成路线如下所示：
Figure BDA0003265659690000061
本发明中所用双环氧季铵盐的制备方法也可参考Shilin Xu等，Amultifunctional gelatine–quaternary ammonium copolymer:An efficient materialfor reducing dye emission in leather tanning process by superior anionic dyeadsorption[J].Journal of Hazardous Materials,383(2020)121142。
实施例1
一种抗菌涂层(G(STSo6％wt)-DEQAS)的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备多肽单层膜：(1)配制浓度为4％wt的胶原多肽溶液50mL：精确称取胶原多肽100mL于三口烧瓶中，准确量取去离子水，把去离子水倒入三口烧瓶中，室温溶胀0.5h后，将三口烧瓶放入50±1℃的水浴中，加热搅拌2h，使其完全溶解，然后用2mol/L的氢氧化钠调节溶液的pH值至10.00±0.02，在水浴中稳定0.5h。
(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为7.96mmol/L；在水浴中稳定6h备用。
(3)切割大小为1cm×1cm的方形钛片，使用金相砂纸按照，800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光，依次用去离子水、无水乙醇、丙酮超声清洗钛片各15min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(4)配制30％H2O2和98％H2SO4体积比为1:1的混酸溶液，冷却至室温后，将上述处理好的钛片用混酸处理1h，然后用自来水冲洗至中性，再用去离子水清洗5次，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(5)配制1mg/mL的PEI(聚乙烯亚胺)溶液，将(4)中的钛片用PEI溶液室温处理0.5h，后用去离子水清洗5次，去除掉弱结合或者未结合的电荷，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱中干燥12h备用。
(6)将正离子化的钛片放入沉积盒中，分别向沉积盒中加入配置好的SDS-多肽溶液，50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得胶原多肽层标记为G-STSo6％wt。可参考专利CN111842088A(CN202010753400.5)。
其次，制备抗菌涂层：
(7)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH＝9.6)的配制：精确称取3.432g碳酸氢钠和0.969g碳酸钠于烧杯中，量取适量蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌至完全溶解，然后将混合溶液用玻璃棒引流至清洗干净的容量瓶中，然后用蒸馏水润洗烧杯3次，引流至容量瓶中，最后用蒸馏水定容至1L；
(8)向反应瓶内加入上述缓冲液5mL，加入双环氧季铵盐(37mg)，将反应瓶放置于超声清洗器中10min，使双环氧季铵盐尽量分散在缓冲溶液中(双环氧季铵盐的浓度为7.4mg/mL)；然后将制备好的胶原多肽单层膜G-STSo6％wt放置于反应瓶中，将反应瓶放置于50℃水浴中，反应12h后，在蒸馏水中提拉10次，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得涂层标记为G(STSo6％wt)-DEQAS。双环氧季铵盐DEQAS的接枝率为7.256％。表面粗糙度为2.86nm。
涂层表面的润湿性可以直接通过水的接触角值反映出来，如图1所示。涂层G-STSo6％wt表面的接触角为61°，该涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎没有抑菌性。
抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS表面的接触角为72.1°，可见接枝小分子季铵盐DEQAS之后，多肽分子膜涂层的疏水性也得到一定改善，使其更适用于骨整合材料。该涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为92.8％和97.6％。
实施例2
一种抗菌涂层(G(STSocac)-DEQAS)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为2.5mmol/L。双环氧季铵盐的接枝率为6.279％。
该涂层的接触角为66°。G(STSocac)的接触角为63°。该涂层(G(STSocac)-DEQAS)对大肠杆菌的抑菌率为72％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为74.5％。
实施例3
一种抗菌涂层(G(STSocmc)-DEQAS)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为7.0mmol/L。
双环氧季铵盐的接枝率为7.018％。涂层(G(STSocmc)-DEQAS)对大肠杆菌的抑菌率为75.6％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为75.1％。接触角为70°。而G(STSocmc)涂层的接触角为84°。
实施例4
一种抗菌涂层G(SDS6％)-DEQAS的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽为浓度为8.32mmol/L，多肽单层膜的制备方法参考CN111840661A(CN202010753455.6)；其余同实施例1。
所得抗菌涂层的粗糙度为4.672nm。接枝率为6.848％，接触角68°，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为71％％和75％。
本发明使用自组装单分子层膜(SAMs)技术实现金属表面多官能团化，在分子尺度上创建具有受控表面或界面性质有序的有机表面。在Ti表面组装胶原多肽单层膜，通过加入表面活性剂调控胶原多肽构象调整表面组成，不同的表面活性剂得到的膜的表面性能、二级结构均不相同，从而接枝不同改性分子后，得到的膜的性能也差别较大。
对比例1
一种抗菌涂层(G(STSo6％wt)-EPDDMAC)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(8)中季铵盐为，加入环氧丙基二甲基十二烷基氯化铵(EPDDMAC)29mg，该季铵盐的合成方法参照2016年齐鲁工业大学硕士论文《环氧季铵盐的合成及对胶原多肽的改性》中记载的方法。
EPDDMAC的接枝率为4.217％。该涂层(G(STSo6％wt)-EPDDMAC)对大肠杆菌的抑菌率为68％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为71.5％。接触角为43°。
对比例2
一种抗菌涂层的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在单层膜制备过程中没有加表面活性剂，仅将胶原多肽沉积到正离子化的钛片上，其他条件与实施例1相同，所得胶原多肽单层膜标记为G。所得涂层标记为G-DEQAS。DEQAS的接枝率为3.034％。
该涂层G-DEQAS对大肠杆菌的抑菌率为34％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为61.3％。接触角为63°。
对比例3
一种抗菌涂层的制备方法，包括以下步骤：
将5g明胶，加水搅拌加热至50℃，待明胶完全溶解后，加入氢氧化钠调节反应pH为10.0，得到质量浓度为5％的明胶溶液，然后加入双环氧季铵盐0.03g，待反应物全部溶解后，继续搅拌8小时，制备得到环氧季铵盐接枝改性明胶聚合物溶液，将正离子化处理的钛片放置于改性明胶溶液中，于50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到抗菌涂层。
该方法所得涂层对大肠杆菌的抗菌率为73.8％，对金黄色葡萄球菌的抗菌效果为85.2％，接触角为87°。所得抗菌涂层的厚度为微米级别，粗糙度为78.37nm。而本发明实施例所得涂层的厚度均为纳米级，平均厚度为20～100nm。且该涂层的生物相容性差于本发明实施例1～3的细胞相容性，且细胞粘附性要比实施例1～3差很多。
由以上结果可以看出，本发明通过将明胶制备成多肽单层膜后，再与双环氧季铵盐进行接枝反应，不仅可以控制膜的厚度在纳米级别，还能提高抗菌率。说明多肽单层膜与明胶聚合物相比，其结构、性能均发生了一定程度改变，其与季铵盐接枝后，膜的性能产生了预料不到的变化。另外，先对明胶进行改性后接枝的方法接枝率不易控制，所得涂层中有未接枝成功的小分子季铵盐，部分在洗脱过程中溶出，对膜的表面及稳固性造成影响，未溶出部分在后续使用过程中，易溶解渗出、化学稳定性差。
测试方法及步骤：
1、抗菌涂层表面润湿性测定
对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司，德国)在室温下测量水接触角(CA)。使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上，并使用Laplace-Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值，并用数码相机(日本索尼有限公司)拍摄图像。接触角图见图1所示。
2、膜表面形貌测定
本发明所得抗菌涂层的形貌由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上进行，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。观察前，需先将机器预热15min后使用，后将载玻片清洗干净，取待测样品于清洗干净的载玻片上，放在载物台上固定，先粗略调节载物台高度，随后微调聚焦，用明场找到最清晰的样品细节，先用50X观察分布情况，然后依次把倍数放大，观察其形貌。
从图2光学显微镜的测试图中可以看出，打磨后的钛片(图2b)相比未打磨的钛片(图2a)更加光滑、平整，与纯钛片(图2b)相比，G-(STSo6％wt)涂层(图2c)形成了均匀紧密的膜，说明G-(STSo6％wt)涂层在钛片上成功沉积(图2c)。与G-(STSo6％wt)涂层(图2c)相比，G-(STSo6％wt)-DEQAS(图2d)抗菌涂层表面更加均匀、光滑，说明了DEQAS在G-(STSo6％wt)上已成功接枝。
3、膜表面平整度测定
本发明抗菌涂层的表面平整度由Multimode8型AFM(Bruker，德国)测定，将制备好的样品置于工作台上，以Peak Force模式对样品的形貌和平整度进行了表征，测试时，先用原子力显微镜自带的光学辅助系统找到边界，然后把测试范围设置为20μm以横跨样品区域，用AFM针尖进行扫描，扫描速度为0.977Hz，扫描范围为1μm，数据处理软件为AFM自带的NanoScope Analysis。
依次对样品Ti(纯钛片，图3a)，G-(STSo6％wt)涂层(图3b)，G-(STSo6％wt)-DEQAS(实施例1，图3c)进行膜表面平整度测定。由图3可以看出，与纯钛片相比，G-(STSo6％wt)涂层(图3b)和G-(STSo6％wt)-DEQAS(图3c)抗菌涂层表面形成了颗粒堆积，形成了均匀、紧密的膜。
4、细胞粘附测定
本发明涂层的细胞粘附由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上测定，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。将Ti片、涂层G(STSo6％wt)-EPDDMAC(对比例1)、涂层G-STSo6％wt、抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS(实施例1)、抗菌涂层G(STSocac)-DEQAS(实施例2)、抗菌涂层G(STSocmc)-DEQAS(实施例3)、涂层G-DEQAS(对比例2)样品放置在孔内，另外做两组同样的实验(即每个实验重复三次，增加数据的准确性)。培养12h后，对培养好的细胞采用结晶紫染色，测试细胞在不同样品表面的粘附结果如图4所示。具体实验步骤：使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为5％CO2、37℃恒温培养，细胞融合90％左右进行传代。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同，将样品放置在孔内，每个样品使用三个平行孔，人脐静脉内皮细胞(HUVECs,细胞/孔)接种于各孔中，对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5％BSA，培养箱中继续培养12h，后将培养基吸出，用PBS冲洗未粘附的细胞两次，粘附的细胞用4％多聚甲醛固定后用0.1％结晶紫染色5min，后用ddH2O清洗三次。然后用Axio Scope.AI光学显微镜在100X下进行拍照。
粘附的细胞数(a)>(b)>(c)>(d)>(e)>(g)，可以看出，所有样品均具有细胞粘附性能，且涂层G(STSo6％wt)-DEQAS的细胞粘附性能好于G(STSo6％wt)-EPDDMPC)。结果说明涂层G-STSo6％wt以及接枝双环氧季铵盐后的抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS对细胞粘附均没有明显影响，该涂层材料适合应用于骨整合材料中。
5、细胞迁移测试
本发明样品的细胞迁移由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上测定，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。简言之，待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同(为便于在显微镜下观察，参照实施例的制备方法将钛片替换为玻璃片制备各涂层，玻璃片无需抛光，其他步骤均相同，在相同的制备条件下，不同基底材料，对于膜的二级结构、接枝率等几乎没有影响)。将各样品放置在孔内，每个样品使用三个孔。对培养好的细胞用无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕，形成划痕区，12h后，测试细胞在不同样品表面的迁移性如图5所示。细胞划痕实验原理：将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。细胞划痕实验很好的模拟了细胞的运动形式，是研究细胞迁移的优良模型。具体实验步骤如下：
待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同，样品放置在孔内，每个样品使用三个平行孔，人脐静脉内皮细胞(HUVECs,2×105细胞/孔)接种于各孔中，对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5％BSA，培养箱中继续培养12h，后将培养基吸出，用PBS冲洗未粘附的细胞两次，用1个无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕，用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照，后放置于37℃、5％CO2的RPMI 1640培养基中培养12h，使用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照。
如图5所示，与培养板(Glass)上生长的细胞相比，不同样品表面上的细胞在划痕区的迁移数量有不同程度的减少。但是，G-STSo6％wt涂层对细胞迁移的影响较小，而G-DEQAS、G(STSocac)-DEQAS、G(STSocmc)-DEQAS、G(STSo6％wt)-DEQAS涂层划痕区细胞也有明显的迁移，G(STSo6％wt)-EPDDMPC细胞迁移不明显。表明G-STSo6％wt、G(STSo6％wt)-DEQAS均具有良好的生物相容性。且G(STSo6％wt)-DEQAS的生物相容性优于G(STSo6％wt)-EPDDMPC。
6、抗菌性测试
金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段。将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度。将样品(Ti、对比例1(G(STSo6％wt)-EPDDMAC)、对比例2(G-DEQAS)、实施例1的G(STSo6％wt)-DEQAS、实施例2(G(STSocac)-DEQAS)、实施例3(G(STSocmc)-DEQAS))分别在1mL细菌悬浮液中37℃培养24h。孵育后，各种样品用PBS冲洗两次。用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min。将细菌悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数。抗菌率(AR)按以下公式计算：AR(％)＝(CFUcontrol)-CFUexperiment)/CFUcontrol×100％，其中Ti为对照组、对比例1(G(STSo6％wt)-EPDDMAC)涂层、对比例2(G-DEQAS)涂层、实施例1的G(STSo6％wt)-DEQAS涂层、实施例2(G(STSocac)-DEQAS)涂层、实施例3(G(STSocmc)-DEQAS)涂层为实验组。
由附图6～8可以看出，接枝DEQAS后的多肽单层膜比未接之前的抗菌性能更好，且接枝双环氧季铵盐的抗菌性能高于接枝单环氧季铵盐。

Claims (10)

1.一种用于骨整合材料的抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐，所述双环氧季铵盐的接枝率为6～8％；所述涂层的接触角为65～75°，所述抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率为72～92％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为74～98％。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，
所述季铵盐的接枝率为7.2±0.02％；所述涂层的接触角为72.1±0.8°，所述抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率为92±0.02％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为98±0.05％。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌涂层，其特征在于，所述双环氧季铵盐的分子式如下所示：
Figure FDA0003265659680000011
4.根据权利要求3所述的抗菌涂层，其特征在于，所述双环氧季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)将硫酸钾、溶剂以及环氧氯丙烷混合后于45～55℃加热搅拌0.5h～1h；
(2)向步骤(1)的混合溶液中滴加四甲基乙二胺，滴加四甲基乙二胺的时间为25～35min；恒温的温度为45～55℃，恒温搅拌1～2h；
(3)将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐。
优选的，四甲基乙二胺、环氧氯丙烷的摩尔比为为1.0:0.5～1.5；
优选的，步骤(1)中硫酸钾与环氧氯丙烷的摩尔比为0.9～1.1：100；
优选的，步骤(1)中环氧氯丙烷与溶剂的质量体积比为0.2～0.3g/mL；进一步优选的，步骤(1)中蒸馏水和甲醇作为溶剂，两者体积比为V(甲醇):V(蒸馏水)＝1:0.8～1.8。
5.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为5～-9mV；所述膜的接触角为10±1°～84±1°。
6.根据权利要求5所述的抗菌涂层，其特征在于，所述单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为-3～-9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°；进一步优选的，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3％，单层膜的厚度为6.6nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV，接触角为61±1°。
7.根据权利要求5所述的抗菌涂层，其特征在于，所述单层膜的厚度为13.8～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12～14％，多肽单层膜的Zeta电位为-1～5mV；所述膜的接触角为10±1°。
8.权利要求1～7任一项所述抗菌性涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和双环氧季铵盐混合，超声处理，使双环氧季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
2)将胶原多肽单层膜置于步骤1)的混合溶液中，于48～52℃下，反应11～13h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，即得到抗菌性涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中混合溶液中双环氧季铵盐的浓度为7.2～7.6mg/mL；
优选的，步骤1)所述缓冲液的pH＝9.6。
10.一种骨整合材料，其特征在于，所述骨整合材料为金属钛或其合金制成，材料表面具有权利要求1～5任一项所述抗菌涂层或者权利要求8～9任一项所述方法制备的抗菌涂层。
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