CN115814156B - 一种用于人工器官的耐腐蚀抗菌涂层及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于人工器官的耐腐蚀抗菌涂层及其制备方法，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐与马来海松酸季铵盐，双环氧季铵盐的接枝率为3～4％，马来海松酸季铵盐的接枝率为2～3％，所述涂层的接触角为60°～75°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为93～99％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为94～100％。本发明通过在多肽单分子膜表面接枝马来海松酸季铵盐和双环氧季铵盐，能够使材料具有很好的抗菌性能，克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、高分子季铵盐接枝率低的缺陷。相比接枝单一种类的季铵盐，同时接枝马来海松酸季铵盐和双环氧季铵盐，可提高材料抗菌性，且能够提高耐腐蚀性。

Description

一种用于人工器官的耐腐蚀抗菌涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于天然高分子领域，涉及一种用于人工器官的耐腐蚀抗菌涂层及其制备方法。
背景技术
人体在手术安装植入物后，会由于病原体如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的侵入而感染，而所得感染通常难以治疗，并且在大多数情况下更换植入物是唯一的补救。
季铵盐作为广谱抗菌剂已广泛应用于工业，纺织业及医疗行业等。高分子化的季铵盐化合物，相对于小分子的季铵盐类抗菌剂，不仅避免了其易溶解渗出、化学稳定性不佳等缺点，并且具有毒性低、物理化学性能稳定、抗菌性优异等特点。相关研究表明，使用表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，将大分子通过共价键接枝到材料表面对钛表面进行改性处理是一种有效改性方法。金露等，2014年10月10日于全国口腔材料学术交流会公开，钛种植表面接枝大分子季铵盐增强其表面抗菌性的研究。通过ATRP技术在钛片表面成功接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)高分子，并利用十六烷基溴进一步使DMAEMA分子末端的叔胺基团发生N-烷基化反应，获得季铵化聚合物。表明改性后的钛片表面对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的杀灭作用。
但是，高分子化的季铵盐化合物在对材料进行改性处理时，具有以下缺陷，高分子聚合物其链段的空间位阻较大，溶液中的聚合物链段很难继续与材料表面接触反应，因此接枝密度往往不高，随着大分子季铵盐分子量的增大，空间位阻变大，接枝效率也会降低。因此会影响改性性能。另外，植入物需要具有优异的抗腐蚀性能，能够受人体电介质的腐蚀，否则会引起机械性能的下降乃至破坏，而现有的人工器官材料如不锈钢、多孔性金属、Co-Cr合金等长时间使用均会出现不耐腐蚀的情况。腐蚀后的金属不仅溶解于植入材料附近和周围组织之中，而且也溶解于血浓和尿中，危害身休。
发明内容
本发明为了解决现有技术中小分子季铵盐易溶解渗出、化学稳定性不佳、而大分子季铵盐空间位阻大、接枝率低的缺点，以及人体手术植入物易被腐蚀的不足，提供一种用于人体器官的耐腐蚀抗菌涂层及其制备方法。本发明通过在胶原多肽单层膜上接枝双环氧季铵盐与马来海松酸季铵盐来改变膜表面的抗菌性能和耐腐蚀性能。
本发明中的马来海松酸季铵盐分子量为585.09g/mol，非高分子季铵盐，双环氧季铵盐烷基链分子量为301g/mol，为小分子季铵盐。
为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种耐腐蚀抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐与马来海松酸季铵盐，双环氧季铵盐的接枝率3～4％，马来海松酸季铵盐的接枝率为2～3％，所述涂层的接触角为60°～75°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为93～99％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为94～100％；耐酸失重率为0.002～0.0025％；耐碱失重率为0.001～0.002％；耐盐失重率为0.002～0.0025％。
耐酸失重率为样品在0.01mol/L H2SO4中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比。
耐碱失重率为样品在0.01mol/L NaOH中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比。
耐盐失重率为样品在0.01mol/L NaCl中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比。
优选的，双环氧季铵盐的接枝率为3.3～4％，马来海松酸季铵盐的接枝率为2.2～3％。
优选的，双环氧季铵盐的接枝率为4±0.05％，马来海松酸季铵盐的接枝率为2.9±0.05％，所述涂层的接触角为72±0.2°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为98±0.2％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为99±0.5％。优选的，表面粗糙度为4～6.5nm。
所述抑菌率的计算公式为：抑菌率AR(％)＝(CFUcontrol–CFUexperiment)/CFUcontrol×100％；所述细菌浓度为1×106CFU ml-1。其中，CFUcontrol是指空白基底上的菌落数；CFUexperiment是指上述抗菌涂层上的菌落数。
抑菌率测试方法为：金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段，将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度；将被测样品于37℃下，在1mL的细菌悬浮液中培养24h，孵育后，用PBS冲洗两次；用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min，将含有细菌的悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数，计算抑菌率。
所述接枝率的定义为：
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量占接枝反应前膜上伯氨基摩尔量的百分比。
接枝马来海松酸季铵盐前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量分别可通过(WD-W0)/MW计算，接枝双环氧季铵盐前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量分别可通过2(WD-W0)/MW计算。其中，WD为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐或双环氧季铵盐后的质量，W0为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐或双环氧季铵盐前的质量，MW为马来海松酸季铵盐或双环氧季铵盐的相对分子质量。
优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为5～-9mV；所述膜的接触角为10±1°～84±1°。
进一步优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为-3～-9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°。进一步优选的，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3％，单层膜的厚度为6.6nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV，接触角为61±1°。进一步优选的，所述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111842088A(CN202010753400.5)。
进一步优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为13.8～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12～14％，多肽单层膜的Zeta电位为-1～5mV；所述膜的接触角为10±1°。进一步优选的，上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111840661A(CN202010753455.6)。
优选的，所述马来海松酸季铵盐(MPA-N+)的分子式如下所示：
优选的，所述双环氧季铵盐(DEQAS)的分子式如下所示：
马来松酸季铵盐所用原料(松香酸)是从植物中提取出来的，生物相容性好，松香酸具有抗微生物、抗炎、抗病原体供击和抗惊厥活性。双环氧季铵盐中有两个环氧基团，环氧基团具有较高的化学反应活性，更易于和胶原多肽中的活性基团发生交联反应，从而将环氧化合物本身含有的抗菌活性基团引入到胶原多肽链中。这两种季铵盐的分子量相差较大，同时接枝两种不同的季铵盐可以很好的解决只接枝一种大分子量季铵盐造成的空间位阻使接枝率下降的情况。
进一步优选的，所述双环氧季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)将硫酸钾、溶剂以及环氧氯丙烷混合后于45～55℃加热搅拌0.5h～1h；
(2)向步骤(1)的混合溶液中滴加四甲基乙二胺，滴加四甲基乙二胺的时间为25～35min；恒温的温度为45～55℃，恒温搅拌1～2h；
(3)将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐。
优选的，四甲基乙二胺、环氧氯丙烷的摩尔比为1.0:0.5～1.5。
优选的，步骤(1)中硫酸钾与环氧氯丙烷的摩尔比为0.9～1.1：100。
优选的，步骤(1)中环氧氯丙烷与溶剂的质量体积比为0.2～0.3g/mL。进一步优选的，步骤(1)中蒸馏水和甲醇作为溶剂，两者体积比为V(甲醇):V(蒸馏水)＝1:0.8～1.8。
将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐。
进一步优选的，马来海松酸季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)氮气气氛下，将松香酸加热至一定温度并维持一定时间，然后冷却至120～125℃，加入马来酸酐和乙酸；在120～130℃下回流12～15h；冷却至室温，重结晶得到马来海松酸；松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8～1.2；
(2)将马来海松酸溶解在乙醇中，然后加入N，N-二甲基乙二胺加热，然后冷却至室温，过滤干燥得到化合物(MPA-N，马来海松酸基胺)；马来酸和N，N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0：0.9～1.1；
(3)将化合物(MPA-N)与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中，加热反应，过滤得到产物马来海松酸季铵盐(MPA-N+)；化合物(MPA-N)与溴乙烷的物质的量之比为1.0:18～21。
优选的，步骤(1)中所述加热温度维180～185℃并维持3～3.5h。
优选的，步骤(2)中所述加热温度为85～90℃，并维持搅拌5～5.5h。
优选的，步骤(3)中所述加热温度为40～45℃，并维持搅拌48～50h。
本发明还提供上述抗菌涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和双环氧季铵盐混合，超声处理，使双环氧季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
(2)将胶原多肽单层膜置于步骤(1)的混合溶液中，于48～52℃水浴中，反应2～3h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的双环氧季铵盐，即得到防污涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存；
(3)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和马来海松酸季铵盐加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
(4)将胶原多肽单层膜置于步骤(3)的混合溶液中，于48～52℃水浴中，反应11～13h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的马来海松酸季铵盐，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
优选的，所述缓冲液的pH＝9.6。
优选的，步骤(1)中所得混合溶液中双环氧季铵盐的浓度为0.01～0.02mol/L；步骤(3)中所得混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.001～0.002mol/L。
优选的，步骤(1)中马来海松酸季铵盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为：n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:420～430；
马来海松酸季铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的摩尔比为：n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:850～860。
本发明还提供上述抗菌涂层在人体器官材料中的应用。
本发明还提供一种人体器官材料，所述人体器官材料为金属或合金制成，材料表面具有上述抗菌涂层。
应用于人体的材料包括人工关节、人工骨等骨整合材料、心瓣架等人体器官材料、以及牙种植体材料。
本发明的有益效果：
本发明通过提供在金属钛及其合金表面的抗菌涂层，能够解决材料的生物相容性和抗菌性问题。且本发明通过在多肽单分子膜表面接枝马来海松酸季铵盐和双环氧季铵盐，能够使材料具有很好的抗菌性能，克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、性能不稳定；以及高分子季铵盐接枝率低，从而影响抑菌性能的缺陷。
本发明利用碱性条件下胶原多肽单层膜上面的伯氨基与马来海松酸季铵盐上的羧基进行接枝，胶原多肽单层膜与马来海松酸季铵盐之间以共价键的方式结合；伯氨基与双环氧季铵盐上的环氧基开环反应进行接枝，胶原多肽单层膜与双环氧季铵盐之间以共价键的方式结合，环氧基团具有较高的化学反应活性，更易于和胶原多肽中的伯氨基发生交联反应，从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中，使得胶原多肽的抗菌性得到改善。相比单一接枝，同时接枝马来海松酸季铵盐和双环氧季铵盐，可提高材料抗菌性，且能够提高耐腐蚀性。
附图说明
图1为不同涂层的水接触角(WCA)图像；
图2为不同涂层的表面原子力显微镜(OM)图像；
图3为不同涂层的AFM图像；
图4为不同涂层的AFM(3D)图像；
图5为不同样品的细胞粘附检测结果；
图6为不同样品的细胞迁移检测结果；
图7为大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落图片；
图8为大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落计数；
图9为大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的杀菌率；
图10为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LH2SO4中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数100X；
图11为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LH2SO4中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数400X；
图12为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaOH中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数100X；
图13为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaOH中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数400X；
图14为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaCl中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数100X；
图15为涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaCl中浸泡不同时间后的表面形貌图放大倍数400X。
具体实施方式
本发明实施例所用试剂除非特别说明，均为普通市售产品，本发明1g胶原多肽中含有伯氨基5.6×10-4mol。
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法：包括以下步骤：
(1)在氮气气氛下，在恒温回流冷凝器中，将松香酸(100.0g，0.28mol)加热至180℃并保持3h。之后，将反应混合物的温度冷却至120℃，并加入马来酸酐(27.5g，0.28mol)和乙酸(400.0mL)。将反应在120℃下回流12h，然后将反应冷却至室温，并使其静置另外2h。沉淀出粗制马来海松酸，并从乙酸中重结晶两次，得到纯马来海松酸(87.0g，纯度：96％，产率：74wt％)。
(2)将马来海松酸(MPA，10.0g，0.025mol)溶解在乙醇(250.0mL)中，然后加入N，N-二甲基乙二胺(2.8mL，0.025mol)后加热至85℃并搅拌5h，然后将溶液冷却至室温。当化合物(MPA-N)从溶液中沉淀出来时，将其过滤并干燥(9.0g，纯度：96％，产率：73wt％)。
(3)将上述化合物(MPA-N，1.0g，0.0021mol)与溴乙烷(3.1mL，0.043mol)溶解在干燥的四氢呋喃(THF，30.0mL)中加热搅拌。在40℃下保持反应48h。反应期间，粗产物(MPA-N+)从THF中沉淀出来。过滤产物(MPA-N+)，然后用THF(0.96g，纯度：92％，产率：73％)洗涤。
马来海松酸季铵盐的合成路线如下所示：
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法可参考文献：Li Z,X Yang,Liu H,etal.Dual-functional antimicrobial coating based on a quaternary ammonium saltfrom rosin acid with invitro and in vivo antimicrobial and antifoulingproperties[J].Chemical Engineering Journal,2019,374:564-575。
本发明中双环氧季铵盐的制备方法：包括以下步骤：
(1)取250mL三口烧瓶，向其中依次加入蒸馏水(22.0mL)、硫酸钾(0.2g)、甲醇(17.0mL)以及环氧氯丙烷(9.5g)，然后于50℃，加热搅拌0.5h；
(2)在上述搅拌过程中，以12d min-1的速率，将四甲基乙二胺(5.8g)加入到三口烧瓶中，再次搅拌1.5h后停止反应；
(3)将反应后的混合物倒入250mL圆底烧瓶中，进行减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体。
双环氧季铵盐的合成路线如下所示：
双环氧季铵盐的制备方法也可参考Shilin Xu等，Amultifunctional gelatine–quaternary ammonium copolymer:An efficient material for reducing dye emissionin leather tanning process by superior anionic dye adsorption[J].Journal ofHazardous Materials,383(2020)121142。
实施例1
一种抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备多肽单层膜：(1)配制浓度为4％wt的胶原多肽溶液50mL：精确称取胶原多肽100mL于三口烧瓶中，准确量取去离子水，把去离子水倒入三口烧瓶中，室温溶胀0.5h后，将三口烧瓶放入50±1℃的水浴中，加热搅拌2h，使其完全溶解，然后用2mol/L的氢氧化钠调节溶液的pH值至10.00±0.02，在水浴中稳定0.5h。
(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为7.96mmol/L；在水浴中稳定6h备用。
(3)切割大小为1cm×1cm的方形钛片，使用金相砂纸按照，800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光，依次用去离子水、无水乙醇、丙酮超声清洗钛片各15min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(4)配制30％H2O2和98％H2SO4体积比为1:1的混酸溶液，冷却至室温后，将上述处理好的钛片用混酸处理1h，然后用自来水冲洗至中性，再用去离子水清洗5次，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(5)配制1mg/mL的PEI(聚乙烯亚胺)溶液，将(4)中的钛片用PEI溶液室温处理0.5h，后用去离子水清洗5次，去除掉弱结合或者未结合的电荷，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱中干燥12h备用。
(6)将正离子化的钛片放入沉积盒中，分别向沉积盒中加入配置好的SDS-多肽溶液，50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得胶原多肽层标记为G-STSo6％wt。
其次，制备抗菌涂层：
(7)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH＝9.6)的配制：
精确称取3.432g碳酸氢钠和0.969g碳酸钠于烧杯中，量取适量蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌至完全溶解，然后将混合溶液用玻璃棒引流至清洗干净的容量瓶中，然后用蒸馏水润洗烧杯3次，引流至容量瓶中，最后用蒸馏水定容至1L；
(8)向反应瓶内加入上述缓冲液5mL，双环氧季铵盐(21.3mg)，将反应瓶放置于超声清洗器中10min，双环氧季铵盐尽量分散在缓冲溶液中(双环氧季铵盐的浓度0.0142mol/L)；然后将制备好的胶原多肽单层膜放置于上述反应瓶中，于50℃水浴中，反应12h后，在蒸馏水中提拉10次，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，所得涂层标记为G(STSo6％wt)-DEQAS。然后再另取反应瓶，加入上述缓冲液5mL，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和马来海松酸季铵盐(20.30mg)(其中，n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:427.35；n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:854.70)，将反应瓶放置于超声清洗器中10min，使马来海松酸季铵盐尽量分散在缓冲溶液中(马来海松酸季铵盐的浓度为0.00173mol/L)；然后将制备好的胶原多肽单层膜G(STSo6％wt)-DEQAS放置于上述反应瓶中，于50℃水浴中，反应12h后，在蒸馏水中提拉10次，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得涂层标记为G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)。
本实施例所得涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)的接触角为72.1°，当接触角小于90°时，表面为亲水性。G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)的平均面粗糙度Ra＝4.17nm。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为98.1％和99.2％。双环氧季铵盐的接枝率为3.957％；马来海松酸季铵盐的接枝率为2.923％。
G(STSo6％wt)的接触角61°，G(STSo6％wt)的表面粗糙度为：8.62nm，该涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎没有抑菌性。经双环氧季铵盐和马来海松酸季铵盐改性后的涂层抑菌率得到极大提高。
实施例2
一种抗菌涂层G(STSocac)-DEQAS-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为2.50mmol/L。所得涂层中双环氧季铵盐的接枝率为3.318％；马来海松酸季铵盐的接枝率为2.295％。接触角为68.9°，粗糙度为5.34nm。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为93.1％和94.7％。
实施例3
一种防污涂层G(STSocmc)-DEQAS-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为7.0mmol/L。所得涂层中双环氧季铵盐的接枝率为3.725％；马来海松酸季铵盐的接枝率为2.613％。所得接触角为67°，粗糙度为6.06nm。
对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为97.6％和98.4％。
实施例4
一种抗菌涂层G(SDS6％)-DEQAS-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽为浓度为8.32mmol/L，多肽单层膜的制备方法参考CN111840661A(CN202010753455.6)；其余同实施例1。
所得抗菌涂层的粗糙度为6.53nm。接枝率为3.037％和2.015％；接触角70.2°，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为92.1％和95.4％。
本发明使用自组装单分子层膜(SAMs)技术实现金属表面多官能团化，在分子尺度上创建具有受控表面或界面性质有序的有机表面。在Ti表面组装胶原多肽单层膜，通过加入表面活性剂调控胶原多肽构象调整表面组成，不同的表面活性剂得到的膜的表面性能、二级结构均不相同，从而接枝不同改性分子后，得到的膜的性能也差别较大。
对比例1
一种抗菌涂层(G(STSo6％wt)-EPDDMAC)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(8)中季铵盐采用环氧丙基二甲基十二烷基氯化铵(EPDDMAC)，该季铵盐的合成方法参照2016年齐鲁工业大学硕士论文《环氧季铵盐的合成及对胶原多肽的改性》中记载的方法。所得涂层中EPDDMAC的接枝率为4.217％。涂层G(STSo6％wt)-EPDDMAC对大肠杆菌的抑菌率为68％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为71.5％，接触角为43°。
对比例2
一种抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)中仅加入37mg双环氧季铵盐。双环氧季铵盐DEQAS的接枝率为7.256％。抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS表面的接触角为72.1°，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为92.8％和97.6％，粗糙度为2.86nm。
对比例3
一种抗菌涂层G(STSo6％wt)-MPA-N+的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)中仅加入42mg马来海松酸季铵盐。马来海松酸季铵盐的接枝率为6.353％，涂层G(STSo6％wt)-MPA-N+的接触角为68.9°，对大肠杆菌的抗菌率90.9％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为97.9％，粗糙度8.06nm。
对比例4
一种抗菌涂层的制备方法，将10g明胶，加水搅拌加热至50℃，待明胶完全溶解后，加入氢氧化钠调节反应pH为10.0，得到质量浓度为5％的明胶溶液，然后加入双环氧季铵盐0.03g、马来海松酸季铵盐0.1g，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，待反应物全部溶解后，继续搅拌8小时，制备得到改性明胶聚合物溶液，(其中，n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:427.35；n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:854.70)将正离子化处理的钛片放置于改性明胶溶液中，于50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到抗菌涂层。
所得涂层对大肠杆菌的抗菌率为83.6％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为89.3％，接触角为87°。粗糙度为78.37nm。所得抗菌涂层的厚度为微米级，而本发明实施例所得涂层均为纳米级厚度平均厚度为25～100nm。
由以上结果可以看出，本发明通过将明胶制备成多肽单层膜后，再与季铵盐进行接枝反应，不仅可以将膜的厚度控制在纳米级别，还能提高抗菌率。说明多肽单层膜与明胶聚合物相比，结构、性能均发生了一定程度改变，其与季铵盐接枝后，膜的性能产生了预料不到的变化。另外，先对明胶进行改性后接枝的方法接枝率不易控制，所得涂层中有未接枝成功的小分子季铵盐，在后续使用过程中，易溶解渗出、化学稳定性差。现有专利报道可先对明胶聚合物进行改性后再涂抹到皮革表面形成改性涂层，其在涂饰过程中，溶液中的水分缓慢挥发，明胶组分与皮胶原之间的同源性促使二者之间产生较强的分子间相互作用而紧密结合，形成涂层。但是该方法无法控制伯氨基暴露，且仅适用于皮革等与明胶具有同源性的材料；该改性明胶与金属等材料没有较强的相互作用，涂层牢固度不好。
测试方法及步骤：
1、抗菌涂层表面润湿性测定
对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司，德国)在室温下测量水接触角(CA)。使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上，并使用Laplace-Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值，并用数码相机(日本索尼有限公司)拍摄图像，结果如图1所示。
2、膜表面形貌测定
本发明抗菌涂层的形貌由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上进行，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。观察前，需先将机器预热15min后使用，后将载玻片清洗干净，取待测样品于清洗干净的载玻片上，放在载物台上固定，先粗略调节载物台高度，随后微调聚焦，用明场找到最清晰的样品细节，先用50X观察分布情况，然后依次把倍数放大，观察其形貌。图2为涂层的光学显微镜图像；(a)涂层G(STSo6％wt；(b)涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)。从光学显微镜图像看出，与多肽单层膜G(STSo6％wt)相比，接枝MPA-N+和DEQAS后的形貌更加致密、光滑，进一步说明成功接枝了MPA-N+和DEQAS，且接枝后的表面非常均匀，更加有利于作为人工器官材料。
3、膜表面平整度测定
本发明抗菌涂层的表面平整度由Multimode8型AFM(Bruker，德国)测定，将制备好的样品置于工作台上，以Peak Force模式对样品的形貌和平整度进行了表征，测试时，先用原子力显微镜自带的光学辅助系统找到边界，然后把测试范围设置为20μm以横跨样品区域，用AFM针尖进行扫描，扫描速度为0.977Hz，扫描范围为1μm，数据处理软件为AFM自带的NanoScope Analysis。结果如图3所示，图3为涂层的原子力显微镜(AFM)图像；(a)涂层G(STSo6％wt)；(b)涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)，图4为涂层的原子力显微镜(AFM)3D图像，(a)钛片；(b)涂层G(STSo6％wt)；(c)涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)。
由图3、4可以看出，G-(STSo6％wt)涂层(图3a)和涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)(图3b)表面形成了颗粒堆积，形成了致密有序的膜。由图4可以看出，G-(STSo6％wt)涂层(图4a)和涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)(图4b)表面较均匀、有序、平整。G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)的表面粗糙度为Ra＝4.17nm，与其他涂层相比，该涂层表面光滑，蛋白在涂层表面的吸附会随粗糙度的降低而降低，更加有利于作为人工器官材料的应用。
4、细胞粘附测定
本发明涂层的细胞粘附由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上测定，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。对不用的样品采用结晶紫测定细胞粘附性，简言之，待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。为便于在显微镜下观察，参照实施例的制备方法将钛片替换为玻璃片制备各涂层，玻璃片无需抛光，其他步骤均相同，在相同的制备条件下，不同基底材料，对于膜的二级结构、接枝率等几乎没有影响。将样品放置在孔内，另外做两组同样的实验(即每个实验重复三次)。对培养好的细胞采用结晶紫染色，测试细胞在不同样品表面的粘附性如图5所示。具体实验步骤：使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养条件为5％CO2、37℃恒温培养，细胞融合90％左右进行传代。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同，将样品放置在孔内，每个样品使用三个平行孔，人脐静脉内皮细胞(HUVECs,细胞/孔)接种于各孔中，对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5％BSA，培养箱中继续培养12h，后将培养基吸出，用PBS冲洗未粘附的细胞两次，粘附的细胞用4％多聚甲醛固定后用0.1％结晶紫染色5min，后用ddH2O清洗三次。然后用Axio Scope.AI光学显微镜在100X下进行拍照。
图中，(a)Control，(b)Glass，(c)G-STSo6％wt，(d)G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)，(e)G(STSo6％wt)-EPDDMAC，(f)G(STSo6％wt)-DEQAS，(g)G(STSo6％wt)-(MPA-N+)；Control组是指细胞在水和培养基的条件下生长，里面没有任何样品。细胞数量：(a)317个，(b)290个，(c)284个，(d)273个，(e)153个，(f)266个，(g)301，可以看出，所有样品均具有细胞粘附性能，且涂层G(STSo6％wt)-(MPA-N+)的细胞粘附性能最好，G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)次之。结果说明涂层G-STSo6％wt以及接枝氧季铵盐后的抗菌涂层G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)对细胞粘附均没有明显影响，适合应用于人工器官材料中。
5、细胞迁移测试
本发明涂层的细胞迁移性由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上测定，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。简言之，待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。将各样品(参照实施例的制备方法将钛片替换为玻璃片制备各涂层，玻璃片无需抛光，其他步骤均相同)放置在孔内，每个样品使用三个孔，对培养好的细胞用无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕，得到划痕区，12h后，记录细胞在不同样品表面的迁移结果如图6所示。细胞划痕实验原理：将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。细胞划痕实验很好的模拟了细胞的运动形式，是研究细胞迁移的优良模型。具体实验步骤如下：
待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同，样品放置在孔内，每个样品使用三个平行孔，人脐静脉内皮细胞(HUVECs,2×105细胞/孔)接种于各孔中，对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5％BSA，培养箱中继续培养12h，后将培养基吸出，用PBS冲洗未粘附的细胞两次，用1个无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕，用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照，后放置于37℃、5％CO2的RPMI 1640培养基中培养12h，使用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照。
图6中：a，Glass，b，G-STSo6％wt，c，G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)，d，G(STSo6％wt)-EPDDMAC，e，G(STSo6％wt)-DEQAS，f，G(STSo6％wt)-(MPA-N+)。与培养板(Glass)上生长的细胞相比，不同样品表面的细胞在划痕区的迁移数量有不同程度变化。但是，G-STSo6％wt涂层对细胞迁移的影响很小，接枝两种季铵盐的细胞相容性优于接枝双环氧季铵盐的，但是差于仅接枝马来海松酸季铵盐的细胞相容性。
6、抗菌性测试
金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段。将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度。将样品(Ti、实施例1、对比例1、对比例2、对比例3所得涂层)分别在1mL细菌悬浮液中37℃培养24h。孵育后，各种钛样品用PBS冲洗两次。用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min。将细菌悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数。抗菌率(AR)按以下公式计算：AR(％)＝(CFUcontrol)-CFUexperiment)/CFUcontrol×100％，其中Ti为对照组，涂层G-STSo6％wt、实施例1、对比例1、对比例2、对比例3为实验组。拍照比较不同涂层的抗菌性，如图7～9所示，接枝两种季铵盐的涂层相比仅接枝一种季铵盐的涂层具有更优异的抗菌性。
7、耐腐蚀性
本发明涂层的耐腐蚀性由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上测定，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。将多组样品放置于0.01mol/LH2SO4、0.01mol/L NaOH、0.01mol/LNaCl中浸泡0h、2h、4h，后用高纯氮气吹干，用光学显微镜在100X、400X下进行拍照对比前后的形貌变化，最后用石英晶体微天平对质量进行精确称量。
(1)G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L H2SO4中浸泡不同时间后的形貌图见图10(放大倍数100X)、图11(放大倍数400X)。
图10中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LH2SO4中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)。图11中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LH2SO4中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)
表1.涂层在0.01mol/L H2SO4中浸泡不同时间后的质量变化表
(2)G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L的NaOH中浸泡不同时间后的形貌图见图12(放大倍数100X)、图13(放大倍数400X)。
图12中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaOH中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)；图13中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LNaOH中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)。
表2.涂层在0.01mol/L NaOH中浸泡不同时间后的质量变化表
(3)G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L的NaCl中浸泡不同时间后的形貌图见图14(放大倍数100X)、图15(放大倍数400X)。
图14中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/L NaCl中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)；图15中G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)在0.01mol/LNaCl中浸泡不同时间后的表面形貌图(a，浸泡0h，b，浸泡2h，c浸泡4h)。
表3.涂层在0.01mol/L NaCl中浸泡不同时间后的质量变化表
从图10～15中可以看出，G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)涂层在0.01mol/L H2SO4、0.01mol/L NaOH、0.01mol/L NaCl中分别浸泡0h，2h，4h后表面变化很小，且表面平整、均匀。通过石英晶体微天平对样品G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)、样品G(STSo6％wt)、样品G(STSo6％wt)-DEQAS和样品G(STSo6％wt)-(MPA-N+)进行了精确称重，测量在0.01mol/L H2SO4、0.01mol/L NaOH、0.01mol/L NaCl分别浸泡0h，2h，4h后的质量变化，重复三次，取其平均值，从上述表格中可以看出，在紫外光照射下分别放置0h，2h，4h后质量变化很小，样品G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)的质量变化最小，说明酸、碱、盐对样品G(STSo6％wt)-DEQAS-(MPA-N+)几乎没有影响，进一步说明了该涂层在耐酸、碱、盐腐蚀性。

Claims (13)

1.一种耐腐蚀抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝双环氧季铵盐与马来海松酸季铵盐，双环氧季铵盐的接枝率为3~4%，马来海松酸季铵盐的接枝率为2~3%，所述涂层的接触角为60 o~75o，所述涂层对大肠杆菌的抗菌率为93~99%，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为94~100%；耐酸失重率为0.002~0.0025%；耐碱失重率为0.001~0.002%；耐盐失重率为0.002~0.0025%；所述多肽单层膜是由分子量为（1.48±0.2）×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2~14.9nm，所述马来海松酸季铵盐MPA-N+的分子式如下所示：
；
所述双环氧季铵盐DEQAS的分子式如下所示：
。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，双环氧季铵盐的接枝率为4±0.05%，马来海松酸季铵盐的接枝率为2.9±0.05%，所述涂层的接触角为72±0.2o，所述涂层对大肠杆菌的抗菌率为98±0.2%，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为99±0.5%，所述涂层的表面粗糙度为4~6.5nm。
3.根据权利要求2所述的抗菌涂层，其特征在于，膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%，多肽单层膜的Zeta电位为5~-9mV；所述膜的接触角为10±1°~84±1°。
4.根据权利要求3所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜的厚度为6.2~9.0nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3~-9mV；所述膜的接触角为61±1°~84±1°。
5.根据权利要求4所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3%，单层膜的厚度为6.6 nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33 mV，接触角为61±1°。
6.根据权利要求3所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜的厚度为13.8~14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12~14%，多肽单层膜的Zeta电位为-1~5mV；所述膜的接触角为10±1°。
7.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，
所述耐酸失重率为样品在0.01mol/L H2SO4中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比；所述耐碱失重率为样品在0.01mol/L NaOH中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比；所述耐盐失重率为样品在0.01mol/L NaCl中浸泡4h后的质量变化量占处理前样品的质量百分比。
8.根据权利要求7所述的抗菌涂层，其特征在于，所述双环氧季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
（1）将硫酸钾、溶剂以及环氧氯丙烷混合后于45~55℃加热搅拌0.5h~1h；
（2）向步骤（1）的混合溶液中滴加四甲基乙二胺，滴加四甲基乙二胺的时间为25～35min；恒温的温度为45～55℃，恒温搅拌1~2h；
（3）将反应物减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色的液体即双环氧季铵盐；
所述四甲基乙二胺、环氧氯丙烷的摩尔比为1.0:0.5~1.5；
步骤（1）中硫酸钾与环氧氯丙烷的摩尔比为0.9~1.1：100；
步骤（1）中环氧氯丙烷与溶剂的质量体积比为0.2~0.3g/mL，步骤（1）中蒸馏水和甲醇作为溶剂，两者体积比为V甲醇:V蒸馏水=1:0.8~1.8。
9.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，马来海松酸季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
（1）氮气气氛下，将松香酸加热至一定温度并维持一定时间，然后冷却至120~125℃，加入马来酸酐和乙酸；在120~130℃下回流12~15 h；冷却至室温，重结晶得到马来海松酸；松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8~1.2；
（2）将马来海松酸溶解在乙醇中，然后加入N，N-二甲基乙二胺加热，然后冷却至室温，过滤干燥得到化合物MPA-N；马来海松酸和N,N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0:0.9~1.1；
（3）将化合物MPA-N与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中，加热反应，过滤得到产物马来海松酸季铵盐MPA-N+；化合物MPA-N与溴乙烷的物质的量之比为1.0：18~21；
步骤（1）中所述加热温度为180~185℃并维持3~3.5h；
步骤（2）中所述加热温度为85~90℃，并维持搅拌5~5.5h；
步骤（3）中所述加热温度为40~45℃，并维持搅拌48~50h。
10.权利要求1~9任一项所述抗菌涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和双环氧季铵盐混合，超声处理，使双环氧季铵盐充分分散在缓冲液中得到混合溶液；
（2）将胶原多肽单层膜置于步骤（1）的混合溶液中，于48~52℃水浴中，反应2~3h后，在丙酮中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的双环氧季铵盐，即得到防污涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存；
（3）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和马来海松酸季铵盐加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲液中得到混合溶液；
（4）将胶原多肽单层膜置于步骤（3）的混合溶液中，于48~52℃水浴中，反应11~13h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的马来海松酸季铵盐，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
11.根据权利要求10所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH=9.6；
步骤（1）中所得混合溶液中双环氧季铵盐的浓度为0.01~0.02mol/L；
步骤（3）中所得混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.001~0.002mol/L；步骤（3）中马来海松酸季铵盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:420~430；马来海松酸季铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:850~860。
12.权利要求1~ 9任一项所述抗菌涂层在人体器官材料中的应用。
13.一种人体器官材料，其特征在于，所述人体器官材料为金属或合金制成，材料表面具有权利要求1~ 9任一项所述抗菌涂层。
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