CN115820121B - 一种用于医疗器械表面的耐高温抗菌性涂层及其制备方法 - Google Patents

一种用于医疗器械表面的耐高温抗菌性涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于医疗器械表面的耐候性抗菌性涂层及其制备方法，所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐和环氧聚硅氧烷，所述马来海松酸季铵盐的接枝率2.5～3.5％，所述环氧聚硅氧烷的接枝率为1.0～1.8％；所述涂层的接触角为100～125°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为80～85％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为90～95％。胶原多肽单层膜上面的伯氨基与马来海松酸季铵盐上的羧基进行接枝，从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中，使得胶原多肽的抗菌能得到改善。通过在多肽单分子膜表面接枝环氧聚硅氧烷和马来海松酸季铵盐，能够提高涂层表面的疏水性能和耐高温性能，使其适用于医疗器械材料。

Description

一种用于医疗器械表面的耐高温抗菌性涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于天然高分子领域，涉及一种用于医疗器械表面的耐高温抗菌性涂层。
背景技术
钛具有优异的机械和化学性能、良好的耐腐蚀性和适当的力学性能(强度、韧性、相对较低的弹性模量)，而被作为医疗器械材料在临床上得到了广泛的应用。然而钛是一种生物惰性材料且易积累血清蛋白滋生细菌，医疗器械表面的细菌容易给患者造成伤口感染等问题。因此，钛及其合金的生物惰性表面抗菌性仍是一个难以解决的问题。胶原多肽作为优良的天然高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性、低生物毒性和优良的延展性等特征，是一种极具研究价值的环境友好型天然高分子材料。且胶原多肽是由多种氨基酸组成的蛋白质，来源广泛且价格低廉。若将胶原多肽制备成生物固定化涂层，应用于钛材料表面，能够解决钛材料涂层的生物相容性问题。
但是，天然的胶原多肽也具有一定的缺陷，如机械性能差，易吸水，易霉变等，从而限制了胶原多肽在医疗器械涂层中的应用。且胶原多肽分子上含有氨基、羧基、羟基等很多极性基团，使其产生较强的分子间氢键，形成网状结构，再脱水后形成脆性薄膜。这些特性限制了胶原多肽材料它在医疗器械中的应用。
季铵盐作为广谱抗菌剂已广泛应用于工业，纺织业及医疗行业等。高分子化的季铵盐化合物，相对于小分子的季铵盐类抗菌剂，不仅避免了其易溶解渗出、化学稳定性不佳等缺点，并且具有毒性低、物理化学性能稳定、抗菌性优异等特点。相关研究表明，使用表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，将大分子通过共价键接枝到材料表面对钛表面进行改性处理是一种有效改性方法。金露等，2014年10月10日于全国口腔材料学术交流会公开，钛种植表面接枝大分子季铵盐增强其表面抗菌性的研究。通过ATRP技术在钛片表面成功接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)高分子，并利用十六烷基溴进一步使DMAEMA分子末端的叔胺基团发生N-烷基化反应，获得季铵化聚合物。表明改性后的钛片表面对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的杀灭作用。
但是，高分子化的季铵盐化合物在对材料进行改性处理时，具有以下缺陷，高分子聚合物其链段的空间位阻较大，溶液中的聚合物链段很难继续与材料表面接触反应，因此接枝密度往往不高，随着大分子季铵盐分子量的增大，空间位阻变大，接枝效率也会降低。因此会影响改性性能。另外，医疗器械往往需要反复杀菌消毒，因此需要具有较高的耐候性，比如耐高温。并且医疗器械材料需要较强的疏水性、较低对的表面能，因此，需要对材料表面的性能进行改性。
发明内容
本发明为了解决现有技术中小分子季铵盐易溶解渗出、化学稳定性不佳、而高分子季铵盐空间位阻大、接枝率低的缺点，提供一种用于医疗器械表面的耐高温抗菌涂层及其制备方法。本发明通过在钛基胶原多肽单层膜上接枝马来海松酸季铵盐和环氧聚硅氧烷提高材料的抗菌性能和疏水性能。
本发明中的马来海松酸季铵盐分子量为585.09g/mol，不属于高分子化季铵盐。
为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种耐高温抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐和环氧聚硅氧烷(PDMS-E)，所述马来海松酸季铵盐的接枝率为2.5～3.5％，所述环氧聚硅氧烷的接枝率为1.0～1.8％；所述涂层的接触角为100～125°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为84～92％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为90～94％，高温失重率为0.0019～0.0021％。
所述高温失重率为高温处理前后样品的重量变化占高温处理前样品的质量的百分比。
优选的，高温失重率的测试条件为：在300±5℃条件下，2小时的失重率。
优选的，所述马来海松酸季铵盐的接枝率为2.9～3.3％，所述环氧聚硅氧烷的接枝率为1.3～1.7％。
优选的，所述马来海松酸季铵盐的接枝率为3.2±0.05％，所述环氧聚硅氧烷的接枝率为1.6±0.05％；所述涂层的接触角为120.3±0.2°，所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为84±0.5％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为94±0.5％。
所述抑菌率的计算公式为：抑菌率AR(％)＝(CFUcontrol–CFUexperiment)/CFUcontrol×100％；所述细菌浓度为1×106CFU ml-1。其中，CFUcontrol是指空白基底上的菌落数；CFUexperiment是指待测抗菌涂层上的菌落数。
抑菌率测试方法为：
抑菌率测试方法为：金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段，将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度；将被测样品于37℃下，在1mL的细菌悬浮液中培养24h，孵育后，用PBS冲洗两次；用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min，将含有细菌的悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数，计算抑菌率。
所述接枝率的定义为：
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量占接枝反应前膜上伯氨基摩尔量的百分比。
接枝马来海松酸季铵盐，或环氧聚硅氧烷前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量可通过(WD-W0)/MW计算。其中，WD为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐或环氧聚硅氧烷后的质量，W0为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐或环氧聚硅氧烷前的质量，MW为马来海松酸季铵盐或环氧聚硅氧烷的相对分子质量。
优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为5～-9mV；所述膜的接触角为10±1°～84±1°。
优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为-3～-9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°。进一步优选的，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3％，单层膜的厚度为6.6nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV，接触角为61±1°。更进一步优选的，上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111842088A(CN202010753400.5)。
优选的，所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为13.8～14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12～14％，多肽单层膜的Zeta电位为-1～5mV；所述膜的接触角为10±1°。进一步优选的，上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111840661A(CN202010753455.6)。
优选的，所述马来海松酸季铵盐(MPA-N+)的分子式如下所示：
优选的，所述环氧聚硅氧烷的分子式如下所述：
进一步优选的，马来海松酸季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
(1)氮气气氛下，将松香酸加热至一定温度并维持一定时间，然后冷却至120～125℃，加入马来酸酐和乙酸；在120～130℃下回流12～15h；冷却至室温，重结晶得到马来海松酸；松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8～1.2；
(2)将马来海松酸溶解在乙醇中，然后加入N，N-二甲基乙二胺加热，然后冷却至室温，过滤干燥得到化合物(MPA-N，马来海松酸基胺)；马来酸和N，N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0：0.9～1.1；
(3)将化合物(MPA-N)与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中，加热反应，过滤得到产物马来海松酸季铵盐(MPA-N+)。
优选的，步骤(1)中所述加热温度维180～185℃并维持3～3.5h。
优选的，步骤(2)中所述加热温度为85～90℃，并维持搅拌5～5.5h。
优选的，步骤(3)中所述加热温度为40～45℃，并维持搅拌48～50h；化合物(MPA-N)与溴乙烷的物质的量之比为1.0：18～21。
本发明还提供上述抗菌涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将环氧聚硅氧烷加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使环氧聚硅氧烷充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
2)将胶原多肽单层膜置于步骤1)的混合溶液中，于48～52℃水浴中，反应2～3h后，在丙酮中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的环氧聚硅氧烷，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到胶原多肽-(PDMS-E)涂层；
3)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和马来海松酸季铵盐加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
4)将步骤2)所得胶原多肽-(PDMS-E)涂层置于步骤3)的混合溶液中，于48～52℃水浴中，反应5～6h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的季铵盐，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
优选的，所述缓冲液的pH＝9.6。
优选的，步骤1)中，环氧聚硅氧烷的浓度为0.004～0.006mol/L，步骤3)中，混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.01～0.02mol/L。
优选的，步骤(1)中马来海松酸季铵盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为：n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:420～430；
马来海松酸季铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的摩尔比为：n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:850～860。
本发明还提供上述抗菌涂层在医疗器械中的应用。
本发明还提供一种医疗器械材料，所述医疗器械材料为金属或合金制成，材料表面具有上述抗菌涂层。优选的，所述金属为钛或钛合金。
本发明的有益效果：
本发明通过在多肽单分子膜表面接枝马来海松酸季铵盐，能够使材料具有很好的抗菌性能，克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、性能不稳定；以及高分子季铵盐接枝率低，从而影响抑菌性能的缺陷。
本发明利用碱性条件下胶原多肽单层膜上面的伯氨基与马来海松酸季铵盐上的羧基进行接枝，胶原多肽单层膜与马来海松酸季铵盐之间以共价键的方式结合，具有较高的化学反应活性，更易于和胶原多肽中的伯氨基发生交联反应，从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中，使得胶原多肽的抗菌能得到改善。本发明通过在多肽单分子膜表面接枝环氧聚硅氧烷和马来海松酸季铵盐，能够提高涂层表面的疏水性能和耐高温性能，使其适用于医疗器械材料。
附图说明
图1是涂层的水接触角(WCA)图像；
图2是涂层的光学显微镜(OM)图像；
图3是涂层的原子力显微镜(AFM)图像；
图4是涂层的原子力显微镜(AFM)的3D图像；
图5是大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过12h培养后的菌落图片；
图6大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落计数柱状图；
图7大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的杀菌率柱状图。
具体实施方式
本发明实施例所用试剂除非特别说明，均为普通市售产品，本发明1g胶原多肽中含有伯氨基5.6×10-4mol。
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法：包括以下步骤：
(1)在氮气气氛下，在恒温回流冷凝器中，将松香酸(100.0g，0.28mol)加热至180℃并保持3h。之后，将反应混合物的温度冷却至120℃，并加入马来酸酐(27.5g，0.28mol)和乙酸(400.0mL)。将反应在120℃下回流12h，然后将反应冷却至室温，并使其静置另外2h。沉淀出粗制马来酸，并从乙酸中重结晶两次，得到纯马来酸(87.0g，纯度：96％，产率：74wt％)。
(2)将马来酸(MPA，10.0g，0.025mol)溶解在乙醇(250.0mL)中，然后加入N，N-二甲基乙二胺(2.8mL，0.025mol)后加热至85℃搅拌5h。然后将溶液冷却至室温。当化合物(MPA-N)从溶液中沉淀出来时，将其过滤并干燥(9.0g，纯度：96％，产率：73wt％)。
(3)将上述化合物(MPA-N，1.0g，0.0021mol)与溴乙烷(3.1mL，0.043mol)溶解在干燥的四氢呋喃(THF，30.0mL)中加热至40℃搅拌48h。在40℃下保持反应48h。反应期间，粗产物(MPA-N+)从THF中沉淀出来。过滤产物(MPA-N+)，然后用THF(0.96g，纯度：92％，产率：73％)洗涤。
马来海松酸季铵盐的合成路线如下所示：
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法可参考文献：Li Z,X Yang,Liu H,etal.Dual-functional antimicrobial coating based on a quaternary ammonium saltfrom rosin acid with invitro and in vivo antimicrobial and antifoulingproperties[J].Chemical Engineering Journal,2019,374:564-575。
双环氧季铵盐的分子式为：
合成路线为：
本发明中所用双环氧季铵盐的制备方法也可参考Shilin Xu等，A multifunctionalgelatine–quaternary ammonium copolymer:An efficient material for reducing dyeemission in leather tanning process by superior anionic dye adsorption[J].Journal of Hazardous Materials,383(2020)121142。
本发明中所用环氧聚硅氧烷的制备方法，可参考：Zhu C,Xu J,Hou Z,etal.Scale Effect on Interface Reaction between PDMS-E Emulsion Droplets andGelatin[J].Langmuir,2017。本发明所用环氧聚硅氧烷的分子量为1000。
实施例1
一种抗菌涂层G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)的制备方法，包括以下步骤：
首先，制备多肽单层膜：(1)配制浓度为4％wt的胶原多肽溶液50mL：精确称取胶原多肽100mL于三口烧瓶中，准确量取去离子水，把去离子水倒入三口烧瓶中，室温溶胀0.5h后，将三口烧瓶放入50±1℃的水浴中，加热搅拌2h，使其完全溶解，然后用2mol/L的氢氧化钠调节溶液的pH值至10.00±0.02，在水浴中稳定0.5h。
(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为7.96mmol/L；在水浴中稳定6h备用。
(3)切割大小为1cm×1cm的方形钛片，使用金相砂纸按照，800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光，依次用去离子水、无水乙醇、丙酮超声清洗钛片各15min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(4)配制30％H2O2和98％H2SO4体积比为1:1的混酸溶液，冷却至室温后，将上述处理好的钛片用混酸处理1h，然后用自来水冲洗至中性，再用去离子水清洗5次，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(5)配制1mg/mL的PEI(聚乙烯亚胺)溶液，将(4)中的钛片用PEI溶液室温处理0.5h，后用去离子水清洗5次，去除掉弱结合或者未结合的电荷，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱中干燥12h备用。
(6)将正离子化的钛片放入沉积盒中，分别向沉积盒中加入配置好的SDS-多肽溶液，50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得胶原多肽层标记为G-STSo6％wt。
然后，制备抗菌涂层：
(7)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH＝9.6)的配制：精确称取3.432g碳酸氢钠和0.969g碳酸钠于烧杯中，量取适量蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌至完全溶解，然后将混合溶液用玻璃棒引流至清洗干净的容量瓶中，然后用蒸馏水润洗烧杯3次，引流至容量瓶中，最后用蒸馏水定容至1L；
(8)向反应瓶内加入上述缓冲液5mL，环氧聚硅氧烷(27.9mg)，将反应瓶放置于超声清洗器中10min，使环氧聚硅氧烷尽量分散在缓冲溶液中(环氧聚硅氧烷的浓度为0.00558mol/L(5.58mg/mL))；然后将制备好的胶原多肽单层膜放置于上述反应瓶中，于50℃水浴中，反应12h后，在丙酮中提拉10次，去除掉弱结合或者未结合的环氧聚硅氧烷，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到涂层G(STSo6％wt)-(PDMS-E)。后另取反应瓶加入上述缓冲液5mL，加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和马来海松酸季铵盐(22.40mg)(n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:427.35，n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:854.70)，将反应瓶放置于超声清洗器中10min，马来海松酸季铵盐尽量分散在缓冲溶液中(马来海松酸季铵盐的浓度为0.0104mol/L)；然后将涂层放置于上述反应瓶中，将反应瓶放置于50℃水浴中，反应5～6h后，在蒸馏水中提拉10次，去除掉弱结合或者未结合的马来海松酸季铵盐，用高纯氮气吹干。所得涂层标记为G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)。
所得上述抗菌涂层G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)中MPA-N+的接枝率为3.235％；环氧聚硅氧烷的接枝率为1.632％。接触角为120.3°，当接触角大于90°时，表面为疏水性。G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为84.1％和93.8％。而G(STSo6％wt)的接触角61°，该涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎没有抑菌性。经马来海松酸季铵盐和环氧聚硅氧烷改性后的涂层抑菌率得到极大提高，疏水性也极大提高。G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)的热稳定性极好，表面能较低，G(STSo6％wt)的热稳定性较差，表面能较高。
实施例2
一种抗菌涂层G(STSocac)-(PDMS-E)-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为2.50mmol/L。
所得马来海松酸季铵盐的接枝率为2.917％；环氧聚硅氧烷的接枝率为1.318％。接触角为102°。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为80.3％和90.1％。
实施例3
一种抗菌涂层G(STSocmc)-(PDMS-E)-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为7.0mmol/L。
所得马来海松酸季铵盐的接枝率为3.082％；环氧聚硅氧烷的接枝率为1.527％。接触角为105°。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为83.4％和92.0％。
实施例4
一种抗菌涂层G(SDS6％)-(PDMS-E)-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)胶原多肽为浓度为8.32mmol/L，多肽单层膜的制备方法参考CN111840661A(CN202010753455.6)；其余同实施例1。
所得抗菌涂层的粗糙度为8.03nm。接枝率为2.618％和1.036％；接触角100°，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为82.1％和90.3％。
本发明使用自组装单分子层膜(SAMs)技术实现金属表面多官能团化，在分子尺度上创建具有受控表面或界面性质有序的有机表面。在Ti表面组装胶原多肽单层膜，通过加入表面活性剂调控胶原多肽构象调整表面组成，不同的表面活性剂得到的膜的表面性能、二级结构均不相同，从而接枝不同改性分子后，得到的膜的性能也差别较大。
对比例1
一种抗菌涂层G(STSo6％wt)-(MPA-N+)的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)中不接枝环氧聚硅氧烷。
马来海松酸季铵盐的接枝率为6.353％，涂层G(STSo6％wt)-(MPA-N+)的接触角为68.9°，对大肠杆菌的抗菌率90.9％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为97.9％，热稳定性一般，表面能偏高。
对比例2
一种抗菌涂层的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在单层膜制备过程中没有加表面活性剂，仅将胶原多肽沉积到正离子化的钛片上，其他条件与实施例1相同，所得胶原多肽单层膜标记为G。所得涂层标记为G-MPA-N+，接枝率3.627％。对大肠杆菌的抗菌率36.4％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为50.6％。接触角为58°。
对比例3
一种涂层G(STSo6％wt)--DEQAS的制备方法，与实施例1的区别在于，不接枝马来海松酸季铵盐，步骤(8)中的缓冲液中仅加入双环氧季铵盐(DEQAS)37mg。DEQAS的接枝率为7.256％，所得G(STSo6％wt)-DEQAS涂层的接触角为72.1°。
对比例4
一种抗菌涂层的制备方法，将10g明胶，加水搅拌加热至50℃，待明胶完全溶解后，加入氢氧化钠调节反应pH为10.0，得到质量浓度为5％的明胶溶液，然后加入马来海松酸季铵盐0.11g，并加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)(其中，n(MPA-N+)：n(EDC)＝1:427.35；n(MPA-N+)：n(NHSS)＝1:854.70)待反应物全部溶解后，继续搅拌8小时，制备得到马来海松酸季铵盐接枝改性明胶聚合物溶液(溶液1)；向溶液1中加入0.0024g十四烷基硫酸钠做乳化剂，继续搅拌至完全溶解后，连续或分批加入0.1g环氧聚硅氧烷(Mw＝1000)，反应24小时体系中的伯胺基含量不再发生变化，停止搅拌和加热，得到改性明胶溶液(溶液2)；将正离子化处理的钛片放置于溶液2中，于50℃下沉积10min，然后将其在去离子水、丙酮中各提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到涂层。
所得涂层对大肠杆菌的抗菌率为72.6％，对金黄色葡萄球菌的抗菌效果为80.3％，接触角为89°。粗糙度为8.62nm。所得抗菌涂层的厚度为微米级，而本发明实施例所得涂层厚度均为纳米级，平均厚度为20～100nm。
由以上结果可以看出，本发明通过将明胶制备成多肽单层膜后，再与马来海松酸季铵盐、环氧聚硅氧烷行接枝反应，不仅可以将膜的厚度控制在纳米级别范围内，还能进一步提高抗菌率。说明多肽单层膜与明胶聚合物相比，结构、性能均发生了一定程度改变，其与季铵盐接枝后，膜的性能产生了预料不到的变化。另外，先对明胶进行改性后接枝的方法接枝率不易控制，所得涂层中有未接枝成功的小分子季铵盐，在后续使用过程中，易溶解渗出，加之未接枝的环氧聚硅氧烷存在分布不均匀问题，易导致膜的化学稳定性降低。现有专利中报道，先对明胶聚合物进行改性后再涂抹到皮革表面形成改性涂层，其在涂饰过程中，溶液中的水分缓慢挥发，明胶组分与皮胶原之间的同源性促使二者之间产生较强的分子间相互作用而紧密结合，形成涂层。但是该方法无法控制伯氨基暴露，且仅适用于皮革等与明胶具有同源性的材料；该改性明胶与金属等材料没有较强的相互作用，涂层牢固度不好。
测试方法及步骤：
1、抗菌涂层表面润湿性测定
对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司，德国)在室温下测量水接触角(CA)。使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上，并使用Laplace-Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值，并用数码相机(日本索尼有限公司)拍摄图像。
2、膜表面形貌测定
本发明抗菌涂层的形貌由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡，德国)上进行，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。观察前，需先将机器预热15min后使用，后将载玻片清洗干净，取待测样品于清洗干净的载玻片上，放在载物台上固定，先粗略调节载物台高度，随后微调聚焦，用明场找到最清晰的样品细节，先用50X观察分布情况，然后依次把倍数放大，观察其形貌。图2为样品的光学显微镜图像，(a)涂层G(STSo6％wt)的光学显微镜图像；(b)G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)涂层的光学显微镜图像。
从光学显微镜图(图2)像看出，与多肽单层膜G(STSo6％wt)相比，接枝MPA-N+和PDMS-E表面非常均匀、光滑、平整，进一步反映了成功接枝了MPA-N+和PDMS-E，且接枝后的表面非常均匀、致密、平整，接枝季铵盐后可以减少细菌在医疗器械表面的附着，减少意外医疗事故的发生；另外接枝环氧聚硅氧烷可以提高医疗器械表面的抗氧化、抗辐射能力。
3、膜表面平整度测定
本发明抗菌涂层的表面平整度由Multimode8型AFM(Bruker，德国)测定，将制备好的样品置于工作台上，以Peak Force模式对样品的形貌和平整度进行了表征，测试时，先用原子力显微镜自带的光学辅助系统找到边界，然后把测试范围设置为20μm以横跨样品区域，用AFM针尖进行扫描，扫描速度为0.977Hz，扫描范围为1μm，数据处理软件为AFM自带的NanoScope Analysis。
图3为涂层的原子力显微镜(AFM)图像；(a)涂层G(STSo6％wt)的表面形貌图；(b)G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)涂层的表面形貌图，可以看出表面的形貌和表面的平整度。图4为涂层的原子力显微镜(AFM)3D图像；(a)涂层G(STSo6％wt)的表面形貌图；(b)G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)涂层的表面形貌图。表面粗糙度越小，表示表面越光滑，而涂层G(STSo6％wt)的平均表面粗糙度Ra＝8.62nm，G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)平均面粗糙度Ra＝6.06nm；说明接枝季铵盐和环氧聚硅氧烷能改善钛基多肽膜表面的粗糙度。说明接枝(MPA-N+)和PDMS-E后的胶原多肽单层膜的表面非常均匀、致密、平整，接枝季铵盐后可以减少细菌在医疗器械表面的附着，减少意外医疗事故的发生；另外接枝环氧聚硅氧烷可以提高医疗器械表面的抗氧化、抗辐射能力。
4、抗菌性测试
金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段。将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度。将样品(Ti、实施例1、对比例1)分别在1mL细菌悬浮液中37℃培养24h。孵育后，各种钛样品用PBS冲洗两次。用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min。将细菌悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数。抗菌率(AR)按以下公式计算：AR(％)＝(CFUcontrol)-CFUexperiment)/CFUcontrol×100％，其中Ti为对照组，实施例1、对比例1为实验组。拍照比较不同涂层的抗菌性，如图5所示，接枝季铵盐和环氧聚硅氧烷的样品有很好的抗菌性。
5、耐高温性
将多组样品G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)等放置在红外灯(红外线加热灯泡，250W，东莞市毅万光源有限公司)下，在300±5℃下，红外灯分别照射0h，0.5h，1h，1.5h，2h，取出。用光学显微镜在100X、400X下进行拍照对比，最后用石英晶体微天平对质量进行精确称量。
表1.样品在红外灯照射下放置不同时间后的质量变化表
涂层G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)在红外灯下分别照射0h，0.5h，1h，1.5h，2h后表面变化很小，且表面平整、均匀。又通过石英晶体微天平对样品进行了精确称重，测量在紫外灯下分别放置射0h，0.5h，1h，2h，4h后的质量变化，重复三次，取其平均值，从上述表1中可以看出，在紫外光照射下分别放置0h，0.5h，1h，1.5h，2h后质量变化，样品G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)质量变化最小，说明高温对涂层G(STSo6％wt)-(PDMS-E)-(MPA-N+)影响较小，进一步说明了该涂层具有耐高温的特性。

Claims (6)

1.一种耐高温抗菌涂层，其特征在于，所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐和环氧聚硅氧烷，所述马来海松酸季铵盐的接枝率为3.2±0.05%，所述环氧聚硅氧烷的接枝率为1.6±0.05%；所述涂层的接触角为120.3±0.2o，所述涂层对大肠杆菌的抗菌率为84±0.5%，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为94±0.5%，高温失重率为0.0019~0.0021%，所述高温失重率为高温处理前后样品的重量变化占高温处理前样品的质量的百分比，高温失重率的测试条件为：在300±5℃条件下，2小时的失重率；
所述耐高温抗菌涂层的制备方法，包括以下步骤：
1）将环氧聚硅氧烷加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使环氧聚硅氧烷充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
2）将多肽单层膜置于步骤1）的混合溶液中，于48~52℃水浴中，反应2~3h后，在丙酮中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的环氧聚硅氧烷，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存，得到多肽单层膜接枝环氧聚硅氧烷涂层；
3）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和马来海松酸季铵盐加入到碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，超声处理，使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液；
4）将步骤2）所得多肽单层膜接枝环氧聚硅氧烷涂层置于步骤3）的混合溶液中，于48~52℃水浴中，反应5~6h后，在蒸馏水中提拉10次以上，去除掉弱结合或者未结合的马来海松酸季铵盐，即得到抗菌涂层，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存；
所述多肽单层膜是由分子量为（1.48±0.2）×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2~14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%，多肽单层膜的Zeta电位为5~-9mV；所述膜的接触角为10±1°~84±1°；
步骤1）中，所述缓冲液的pH=9.6；环氧聚硅氧烷的浓度为0.004~0.006mol/L；
步骤3）中，混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.01~0.02mol/L；马来海松酸季铵盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:420~430；马来海松酸季铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:850~860；
所述马来海松酸季铵盐的分子式如下所示：
；
所述环氧聚硅氧烷的分子式如下所述：
；
马来海松酸季铵盐的合成方法，包括以下步骤：
（1）氮气气氛下，将松香酸加热至180~185℃并维持3~3.5h，然后冷却至120~125℃，加入马来酸酐和乙酸；在120~130℃下回流12~15 h；冷却至室温，重结晶得到马来海松酸；松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8~1.2；
（2）将马来海松酸溶解在乙醇中，然后加入N，N-二甲基乙二胺加热，然后冷却至室温，过滤干燥得到化合物；马来海松酸和N，N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0:0.9~1.1；
（3）将化合物与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中，加热反应，过滤得到产物马来海松酸季铵盐。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜是由分子量为（1.48±0.2）×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2~9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%，多肽单层膜的Zeta电位为-3~-9mV；所述膜的接触角为61±1°~84±1°。
3.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜的伯氨基暴露量为14.51±0.3%，单层膜的厚度为6.6 nm，多肽单层膜的Zeta电位为-3.33 mV，接触角为61±1°。
4.根据权利要求1所述的抗菌涂层，其特征在于，所述多肽单层膜是由分子量为（1.48±0.2）×105g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为13.8~14.9nm，膜表面的伯氨基暴露量为12~14%，多肽单层膜的Zeta电位为-1~5mV；所述膜的接触角为10±1°。
5.权利要求1~4任一项所述抗菌涂层在医疗器械中的应用。
6.一种医疗器械材料，其特征在于，所述医疗器械材料为金属钛或其合金制成，材料表面具有权利要求1~4任一项所述抗菌涂层。
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