CN115804868A - 一种用于牙种植体的促进细胞迁移的抗菌涂层及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于牙种植体的促进细胞迁移的抗菌涂层,所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐,所述接枝率为5~7%;所述涂层的接触角为60~70°,所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为86~91%,所述涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率为92~98%。本发明利用碱性条件下胶原多肽单层膜上面的伯氨基与马来海松酸季铵盐上的羧基进行接枝,从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中,使得胶原多肽的抗菌能得到改善,且马来海松酸季铵盐还具有抗病原体攻击性能,接枝马来海松酸季铵盐可促进细胞迁移,使其更适用于牙种植体材料。
Description
技术领域
本发明属于天然高分子领域,涉及一种用于牙种植体的促进细胞迁移的抗菌涂层及其制备方。
背景技术
目前牙种植体常用的材料主要是纯钛及钛合金,钛金属比重轻,强度高,无磁性,收缩性小,化学性质稳定,具有极佳的耐腐蚀性。但生物机械适应性和组织、骨适应性均较差。另外,由于钛是一种生物惰性材料,不具有生物活性,与组织不易牢固结合,易导致毒性、过敏性。因此,对钛的表面进行改性赋予其生物相容性和抗菌性具有十分重要的意义。
胶原多肽作为优良的天然高分子材料,具有良好的生物相容性、生物可降解性、低生物毒性和优良的延展性等特征,是一种极具研究价值的环境友好型天然高分子材料。且胶原多肽是由多种氨基酸组成的蛋白质,来源广泛且价格低廉。若将胶原多肽制备成生物固定化涂层,应用于钛材料表面,能够解决钛材料的生物相容性问题。但是,天然的胶原多肽也具有一定的缺陷,如机械性能差,易吸水,易霉变等,从而限制了胶原多肽在牙种植体中的应用。
季铵盐作为广谱抗菌剂已广泛应用于工业,纺织业及医疗行业等。高分子化的季铵盐化合物,相对于小分子的季铵盐类抗菌剂,不仅避免了其易溶解渗出、化学稳定性不佳等缺点,并且具有毒性低、物理化学性能稳定、抗菌性优异等特点。相关研究表明,使用表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP),将大分子通过共价键接枝到材料表面对钛表面进行改性处理是一种有效改性方法。金露等,2014年10月10日于全国口腔材料学术交流会公开,钛种植表面接枝大分子季铵盐增强其表面抗菌性的研究。通过ATRP技术在钛片表面成功接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)高分子,并利用十六烷基溴进一步使DMAEMA分子末端的叔胺基团发生N-烷基化反应,获得季铵化聚合物。表明改性后的钛片表面对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的杀灭作用。
但是,上述方法为表面聚合,由于高分子聚合物其链段的空间位阻较大,与材料表面的接枝密度往往不高。从而影响季铵化效率,因此会影响改性性能。且上述改性方法复杂,改性材料的生物相容性不高。
发明内容
本发明为了解决现有技术中小分子季铵盐易溶解渗出、化学稳定性不佳、而大分子季铵盐空间位阻大、接枝率低的缺点,提供一种用于牙种植体的抗菌涂层及其制备方法。本发明通过在钛基胶原多肽单层膜上接枝马来海松酸季铵盐来改变膜表面的生物相容性能和抗菌性能,使其能够应用于种牙植体材料领域。
本发明中的马来海松酸季铵盐分子量为585.09g/mol,接近小分子季铵盐,非高分子化季铵盐。
为了实现以上目的,本发明采用以下技术方案:
一种用于牙种植体的促进细胞迁移的抗菌涂层,其特征在于,所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐,所述接枝率为5~7%;所述涂层的接触角为60~70°,所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为86~91%,所述涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率为92~98%,促细胞迁移率为20~22%。
所述促细胞迁移率为:(样品细胞迁移个数-对照组的细胞迁移个数)/对照组细胞迁移个数。
本发明中是以玻璃片为对照,测试细胞为人脐静脉内皮细胞HUVECs,浓度5×105细胞/孔,用无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕,形成划痕区,12小时后,记录划痕区内的细胞的个数,即细胞迁移个数。
优选的,所述接枝率为5.8~6.5%。
优选的,所述接枝率为6.3±0.2%;所述涂层的接触角为68.9±1.1°,所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为90.5±0.5%,所述涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率为97.5±0.5%。
所述抑菌率的计算公式为:抑菌率AR(%)=(CFUcontrol–CFUexperiment)/CFUcontrol×100%;所述细菌浓度为1×106CFU ml-1。其中,CFUcontrol是指空白基底上的菌落数;CFUexperiment是指上述抗菌涂层上的菌落数。
抑菌率测试方法为:金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段,将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度;将被测样品于37℃下,在1mL的细菌悬浮液中培养24h,孵育后,用PBS冲洗两次;用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min,将含有细菌的悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数,计算抑菌率。
所述接枝率的定义为:
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量占接枝反应前膜上伯氨基摩尔量的百分比。
接枝反应前、后膜上伯氨基摩尔量的变化量可通过(WD-W0)/MW计算,即接枝成功的马来海松酸季铵盐的摩尔量。其中,WD为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐后的质量,W0为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐前的质量,MW为马来海松酸季铵盐的相对分子质量。
优选的,所述马来海松酸季铵盐(MPA-N+)的分子式如下所示:
进一步优选的,马来海松酸季铵盐的合成方法,包括以下步骤:
(1)氮气气氛下,将松香酸加热至一定温度并维持一定时间,然后冷却至120~125℃,加入马来酸酐和乙酸;在120~130℃下回流12~15h;冷却至室温,重结晶得到马来海松酸;松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8~1.2;
(2)将马来海松酸溶解在乙醇中,然后加入N,N-二甲基乙二胺加热,然后冷却至室温,过滤干燥得到化合物(MPA-N,马来海松酸基胺);马来酸和N,N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0:0.9~1.1;
(3)将化合物(MPA-N)与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中,加热反应,过滤得到产物马来海松酸季铵盐(MPA-N+)。化合物(MPA-N)与溴乙烷的物质的量之比为1.0:18~21。
优选的,步骤(1)中所述加热温度维180~185℃并维持3~3.5h。
优选的,步骤(2)中所述加热温度为85~90℃,并维持搅拌5~5.5h。
优选的,步骤(3)中所述加热温度为40~45℃,并维持搅拌48~50h。
优选的,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为6.2~14.9nm,膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%,多肽单层膜的Zeta电位为5~-9mV;所述膜的接触角为10±1°~84±1°。
优选的,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为6.2~9.0nm,膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%,多肽单层膜的Zeta电位为-3~-9mV;所述膜的接触角为61±1°~84±1°。进一步优选的,所述单层膜的厚度为6.6nm,膜表面的伯氨基暴露量为14.51%,多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV;所述膜的接触角为61±1°。
进一步优选的,上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111842088A(CN202010753400.5)。
优选的,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为13.8~14.9nm,膜表面的伯氨基暴露量为12~14%,多肽单层膜的Zeta电位为-1~5mV;所述膜的接触角为10±1°。
进一步优选的,上述多肽单层膜的结构及制备方法参考中国专利文献CN111840661A(CN202010753455.6)。
本发明还提供上述抗菌涂层的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)和马来海松酸季铵盐混合,超声处理,使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液;
(2)将多肽单层膜置于步骤(1)的混合溶液中,于48~52℃水浴中,反应11~13h后,在蒸馏水中提拉10次以上,去除掉弱结合或者未结合的季铵盐,即得到抗菌涂层,用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
优选的,步骤(1)中所述缓冲液的pH=9.6;混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.01~0.015mol/L。
优选的,步骤(1)中n(MPA-N+):n(EDC)=1:420~430;n(MPA-N+):n(NHSS)=1:850~860。
本发明还提供上述抗菌涂层在牙种植体材料中的应用。
本发明还提供一种牙种植体材料,所述牙种植体材料为金属钛或其合金制成,材料表面具有上述抗菌涂层。
本发明的有益效果:
钛是生物惰性材料,这使得它很难和骨组织形成稳定的化学键,且普通种植体周围容易滋生细菌,在一定程度上限制了它与骨组织的结合术后的长期使用必然会导致牙假体松动以及二次种植牙手术,同时由于手术部分的组织受损,局部防御力较差,手术部位很容易被细菌感染。本发明通过在钛及其合金表面进行适当的改性处理并引入抗菌剂以减少病人的痛苦显得十分重要。本发明的多肽单层膜由于具有较高的伯氨基暴露量,易接枝其他目标分子,从而更适用于生物医学领域。
本发明通过提供在金属钛及其合金表面的抗菌涂层,能够解决材料的生物相容性和抗菌性问题。且本发明通过在多肽单分子膜表面接枝马来海松酸季铵盐,能够使材料具有很好的抗菌性能,克服了现有技术中小分子季铵盐作为抗菌成分易溶出、性能不稳定;以及高分子季铵盐接枝率低,从而影响抑菌性能的缺陷。
本发明利用碱性条件下胶原多肽单层膜上面的伯氨基与马来海松酸季铵盐上的羧基进行接枝,胶原多肽单层膜与马来海松酸季铵盐之间以共价键的方式结合,具有较高的化学反应活性,更易于和胶原多肽中的伯氨基发生交联反应,从而将季铵盐本身含有的功能基团引入到胶原多肽单层膜中,使得胶原多肽的抗菌能得到改善,且马来海松酸季铵盐还具有抗病原体攻击性能,接枝马来海松酸季铵盐可促进细胞迁移,使其更适用于牙种植体材料。
附图说明
图1是涂层的水接触角(WCA)图像;
图2是涂层的光学显微镜(OM)图像;
图3是涂层的原子力显微镜(AFM)图像;
图4是涂层的原子力显微镜(AFM)的3D图像;
图5是不同样品的细胞粘附检测结果;
图6是不同样品的细胞迁移检测结果;
图7大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落图片;
图8大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的菌落计数柱状图;
图9大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在不同涂层样品表面经过24h培养后的杀菌率柱状图。
具体实施方式
本发明实施例所用试剂除非特别说明,均为普通市售产品,本发明1g胶原多肽中含有伯氨基5.6×10-4mol。
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法:包括以下步骤:
(1)在氮气气氛下,在恒温回流冷凝器中,将松香酸(100.0g,0.28mol)加热。之后,将反应混合物的温度冷却,并加入马来酸酐(27.5g,0.28mol)和乙酸(400.0mL)。将反应在120℃下回流12h,然后将反应冷却至室温,并使其静置另外2h。沉淀出粗制马来海松酸,并从乙酸中重结晶两次,得到纯马来海松酸(87.0g,纯度:96%,产率:74wt%)。
(2)将马来海松酸(MPA,10.0g,0.025mol)溶解在乙醇(250.0mL)中,然后加入N,N-二甲基乙二胺(2.8mL,0.025mol)后加热搅拌。然后将溶液冷却至室温。当化合物(MPA-N)从溶液中沉淀出来时,将其过滤并干燥(9.0g,纯度:96%,产率:73wt%)。
(3)将上述化合物(MPA-N,1.0g,0.0021mol)与溴乙烷(3.1mL,0.043mol)溶解在干燥的四氢呋喃(THF,30.0mL)中加热搅拌。在40℃下保持反应48h。反应期间,粗产物(MPA-N+)从THF中沉淀出来。过滤产物(MPA-N+),然后用THF(0.96g,纯度:92%,产率:73%)洗涤。
步骤(1)中所述加热温度至180℃并保持3h;所述反应混合物的温度冷却至120℃。步骤(2)中所述加热温度至85℃,并搅拌5h。步骤(3)中所述加热温度至40℃,并搅拌48h。
马来海松酸季铵盐的合成路线如下所示:
本发明中马来海松酸季铵盐的制备方法可参考文献:Li Z,X Yang,Liu H,etal.Dual-functional antimicrobial coating based on a quaternary ammoniumsalt from rosin acid with invitro and in vivo antimicrobial and antifoulingproperties[J].Chemical Engineering Journal,2019,374:564-575。
实施例1
一种用于牙种植体的可促进细胞迁移的抗菌涂层(G(STSo6%wt)-MPA-N+)的制备方法,包括以下步骤:
首先,制备多肽单层膜:(1)配制浓度为4%wt的胶原多肽溶液50mL:精确称取胶原多肽100mL于三口烧瓶中,准确量取去离子水,把去离子水倒入三口烧瓶中,室温溶胀0.5h后,将三口烧瓶放入50±1℃的水浴中,加热搅拌2h,使其完全溶解,然后用2mol/L的氢氧化钠调节溶液的pH值至10.00±0.02,在水浴中稳定0.5h。
(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo,得到胶原多肽-STSo混合溶液,混合溶液中STSo的浓度为7.96mmol/L;在水浴中稳定6h备用。
(3)切割大小为1cm×1cm的方形钛片,使用金相砂纸按照,800,1500,3000,5000,7000目的顺序依次打磨抛光,依次用去离子水、无水乙醇、丙酮超声清洗钛片各15min,然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(4)配制30%H2O2和98%H2SO4体积比为1:1的混酸溶液,冷却至室温后,将上述处理好的钛片用混酸处理1h,然后用自来水冲洗至中性,再用去离子水清洗5次,最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。
(5)配制1mg/mL的PEI(聚乙烯亚胺)溶液,将(4)中的钛片用PEI溶液室温处理0.5h,后用去离子水清洗5次,去除掉弱结合或者未结合的电荷,最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱中干燥12h备用。
(6)将正离子化的钛片放入沉积盒中,分别向沉积盒中加入配置好的STSo-多肽溶液,50℃下沉积10min,然后将其在去离子水中提拉20次,用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得胶原多肽层标记为G-STSo6%wt。可参考专利CN111842088A(CN202010753400.5)。
其次,制备抗菌涂层:
(7)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH=9.6)的配制:精确称取3.432g碳酸氢钠和0.969g碳酸钠于烧杯中,量取适量蒸馏水,用玻璃棒充分搅拌至完全溶解,然后将混合溶液用玻璃棒引流至清洗干净的容量瓶中,然后用蒸馏水润洗烧杯3次,引流至容量瓶中,最后用蒸馏水定容至1L;
(8)向反应瓶内加入上述缓冲液5mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和马来海松酸季铵盐42mg(其中,n(MPA-N+):n(EDC)=1:427.35;n(MPA-N+):n(NHSS)=1:854.70),将反应瓶放置于超声清洗器中10min,使马来海松酸季铵盐尽量分散在缓冲溶液中(马来海松酸季铵盐的浓度为0.0144mol/L(8.4mg/mL));然后将制备好的胶原多肽单层膜放置于上述反应瓶中,于50℃水浴中,反应12h后,在蒸馏水中提拉10次,去除掉弱结合或者未结合的季铵盐,用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。所得涂层标记为G(STSo6%wt)-MPA-N+。
马来海松酸季铵盐的接枝率为6.353%,涂层G(STSo6%wt)-MPA-N+的接触角为68.9°,对大肠杆菌的抗菌率90.9%,对金黄色葡萄球菌的抗菌率为97.9%。
G(STSo6%wt)的接触角61°,该涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎没有抑菌性。说明接枝马来海松酸季铵盐后的多肽单层膜具有优异的抗菌性能。与空白样品相比,G(STSo6%wt)样品组中细胞数量稍微有一点减少,说明痕量表面活性剂对细胞活力没有影响。
实施例2
一种抗菌涂层(G(STSocac)-MPA-N+)的制备方法,与实施例1的区别在于,步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为2.50mmol/L。
所得马来海松酸季铵盐的接枝率为5.965%。接触角为65°;对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为86.8%和92.9%。
实施例3
一种抗菌涂层(G(STSocmc)-MPA-N+)的制备方法,与实施例1的区别在于,步骤(2)胶原多肽-STSo混合溶液中STSo的浓度为7.0mmol/L。马来海松酸季铵盐的接枝率为6.065%,接触角为62°,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为88.3%和93.7%。
实施例4
一种抗菌涂层G(SDS6%)-MPA-N+的制备方法,与实施例1的区别在于,步骤(2)胶原多肽为浓度为8.32mmol/L,多肽单层膜的制备方法参考CN111840661A(CN202010753455.6);其余同实施例1。
所得抗菌涂层的接枝率为5.632%,接触角64°,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为89.3%和94%。
本发明使用自组装单分子层膜(SAMs)技术实现金属表面多官能团化,在分子尺度上创建具有受控表面或界面性质有序的有机表面。在Ti表面组装胶原多肽单层膜,通过加入表面活性剂调控胶原多肽构象调整表面组成,不同的表面活性剂得到的膜的表面性能、二级结构均不相同,从而接枝不同改性分子后,得到的膜的性能也差别较大。
对比例1
一种抗菌涂层(G(STSo6%wt)-DEQAS)的制备方法,与实施例1的区别在于,步骤(2)中加入37mg双环氧季铵盐。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为92.8%和97.6%,接触角为72.1°。接枝率为7.256%。
双环氧季铵盐(DEQAS)的分子式如下所示:
所用双环氧季铵盐的制备方法可参考Shilin Xu等,A multifunctionalgelatine–quaternary ammonium copolymer:An efficient material for reducing dyeemission in leather tanning process by superior anionic dye adsorption[J].Journal of Hazardous Materials,383(2020)121142。
对比例2
一种抗菌涂层的制备方法,与实施例1相比,不同之处在于,在单层膜制备过程中没有加表面活性剂,仅将胶原多肽沉积到正离子化的钛片上,其他条件与实施例1相同,所得胶原多肽单层膜标记为G。所得涂层标记为G-MPA-N+。涂层G-MPA-N+的接枝率为3.627%,接触角为58°,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为36.4%和50.6%。
对比例3
一种抗菌涂层的制备方法,包括以下步骤:
将5g明胶,加水搅拌加热至50℃,待明胶完全溶解后,加入氢氧化钠调节反应pH为10.0,得到质量浓度为5%的明胶溶液,然后加入马来海松酸季铵盐0.11g,并加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)(其中,n(MPA-N+):n(EDC)=1:427.35;n(MPA-N+):n(NHSS)=1:854.70),待反应物全部溶解后,继续搅拌8小时,制备得到马来海松酸季铵盐接枝改性明胶聚合物溶液,将正离子化处理的钛片放置于改性明胶溶液中,于50℃下沉积10min,然后将其在去离子水中提拉20次,用高纯氮气吹干后置于氮气中保存,得到抗菌涂层。
所得涂层对大肠杆菌的抗菌率为60%,对金黄色葡萄球菌的抗菌效果为80%,接触角为67.3°。所得抗菌涂层的厚度为微米级,而本发明实施例所得涂层均为纳米级,且平均厚度为25~101nm。所得涂层的细胞粘附性较差。
由以上结果可以看出,本发明通过将明胶制备成多肽单层膜后,再与季铵盐进行接枝反应,不仅可以将膜的厚度控制在纳米级别,还能提高抗菌率。说明多肽单层膜与明胶聚合物相比,结构、性能均发生了一定程度改变,其与季铵盐接枝后,膜的性能产生了预料不到的变化。另外,先对明胶进行改性后接枝的方法接枝率不易控制,所得涂层中有未接枝成功的小分子季铵盐,在后续使用过程中,易溶解渗出、化学稳定性差。另外现有技术中,有专利先对明胶聚合物进行改性后再涂抹到皮革表面形成改性涂层,其在涂饰过程中,溶液中的水分缓慢挥发,明胶组分与皮胶原之间的同源性促使二者之间产生较强的分子间相互作用而紧密结合,形成涂层。但是该方法无法控制伯氨基暴露,且仅适用于皮革等与明胶具有同源性的材料;该改性明胶与金属等材料没有较强的相互作用,涂层牢固度不好。
测试方法及步骤:
1、抗菌涂层表面润湿性测定
对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司,德国)在室温下测量水接触角(CA)。使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上,并使用Laplace-Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值,并用数码相机(日本索尼有限公司)拍摄图像,结果如图1所示。
2、膜表面形貌测定
本发明抗菌涂层的形貌由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡,德国)上进行,该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。观察前,需先将机器预热15min后使用,后将载玻片清洗干净,取待测样品于清洗干净的载玻片上,放在载物台上固定,先粗略调节载物台高度,随后微调聚焦,用明场找到最清晰的样品细节,先用50X观察分布情况,然后依次把倍数放大,观察其形貌。依次对样品G(STSo6%wt)-(MPA-N+)(实施例1)、样品G(STSo6%wt)进行表面形貌测试。
从光学显微镜图(图2)像看出,与多肽单层膜G(STSo6%wt)(图2a)相比,接枝MPA-N+后的抗菌涂层(图2b)更加致密、均匀、光滑,进一步说明成功接枝了MPA-N+,且接枝后的表面非常均匀。
3、膜表面平整度测定
本发明抗菌涂层的表面平整度由Multimode8型AFM(Bruker,德国)测定,将制备好的样品置于工作台上,以Peak Force模式对样品的形貌和平整度进行了表征,测试时,先用原子力显微镜自带的光学辅助系统找到边界,然后把测试范围设置为20μm以横跨样品区域,用AFM针尖进行扫描,扫描速度为0.977Hz,扫描范围为1μm,数据处理软件为AFM自带的NanoScope Analysis。依次对抗菌涂层G(STSo6%wt)-(MPA-N+)(实施例1)、涂层G(STSo6%wt)进行表面形貌测试。
由图3可以看出,G-(STSo6%wt)涂层(图3a)和涂层G(STSo6%wt)-(MPA-N+)(图3b)表面形成了颗粒堆积,形成了致密有序的膜。由图4可以看出,G-(STSo6%wt)涂层(图4a)和涂层G(STSo6%wt)-(MPA-N+)(图4b)表面较均匀、有序、平整。
4、细胞粘附测定
本发明涂层的细胞粘附由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡,德国)上测定,该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。对不用的样品采用结晶紫染色法来测定细胞粘附性,待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。为便于在显微镜下观察,参照实施例的制备方法将钛片替换为玻璃片制备各涂层,玻璃片无需抛光,其他步骤均相同,在相同的制备条件下,不同基底材料,对于膜的二级结构、接枝率等几乎没有影响。将纯玻璃片、涂层G(STSo6%wt)、实施例1、对比例1、对比例2条件下得到的样品放置在孔内,另外做两组同样的实验(即每个实验重复三次,保证实验结果的准确性)。对培养好的细胞采用结晶紫染色,测试细胞在不同样品表面培养12h后的粘附性如图5所示。具体实验步骤:使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,培养条件为5%CO2、37℃恒温培养,细胞融合90%左右进行传代。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同,将样品放置在孔内,每个样品使用三个平行孔,人脐静脉内皮细胞(HUVECs,细胞/孔)接种于各孔中,对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5%BSA,培养箱中继续培养12h,后将培养基吸出,用PBS冲洗未粘附的细胞两次,粘附的细胞用4%多聚甲醛固定后用0.1%结晶紫染色5min,后用ddH2O清洗三次。然后用Axio Scope.AI光学显微镜在100X下进行拍照。
图5为细胞在不同涂层表面粘附的光学显微镜图像(a,Control,b,Glass,c,G-STSo6%wt,d,G(STSo6%wt)-(MPA-N+),e,G(STSo6%wt)-DEQAS,f,G-(MPA-N+)),其中,Control(图5a)是细胞在水和培养基的条件下生长,里面没有任何样品。细胞数量分别为(a)317个,(b)290个,(c)284个,(d)301个,(e)266个,(f)236个。
从图5中可以看出,与Control(在培养板上生长的细胞)相比,G-STSo6%对细胞粘附没有显著影响,表明胶原多肽中的痕量表面活性剂对细胞活力没有影响。与样品G(STSo6%wt)-DEQAS相比,样品G(STSo6%wt)-(MPA-N+)有更强的细胞粘附力,且相对于G-STSo6%,G(STSo6%wt)-(MPA-N+)的提高了其细胞粘附性。
5、细胞迁移测试
涂层的细胞迁移由DMI3000B倒置光学显微镜(徕卡,德国)上测定,该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。将玻璃片、涂层G(STSo6%wt)、实施例1、对比例1、对比例2样品(为便于在显微镜下观察,参照实施例的制备方法将钛片替换为玻璃片制备各涂层,且从细胞粘附实验可以看出,钛基和玻璃基对于细胞的粘附影响相近)放置在孔内,每个样品使用三个孔。对培养好的细胞(人脐静脉内皮细胞(HUVECs,5×105个/mL)用无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕,形成划痕区,进行细胞在不同样品表面的迁移性测试。
细胞划痕实验原理:将细胞培养在培养皿或平板上,待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线,这条线内的细胞被机械力去除掉了,然后将细胞继续培养,观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况,来判断细胞的迁移能力。细胞划痕实验很好的模拟了细胞的运动形式,是研究细胞迁移的优良模型。具体实验步骤如下:
待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同,样品放置在孔内,每个样品使用三个平行孔,人脐静脉内皮细胞(HUVECs,2×105细胞/孔)接种于各孔中,对数生长期人脐静脉内皮细胞用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗两次后重悬于无血清DMEM/0.5%BSA,培养箱中继续培养12h,后将培养基吸出,用PBS冲洗未粘附的细胞两次,用1个无菌的200μL移液枪枪头在培养孔正中间竖直方向划痕,用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照,后放置于37℃、5%CO2的RPMI 1640培养基中培养12h,使用Axio Scope.AI光学显微镜在50X下进行拍照。
图6为细胞在不同涂层表面迁移的光学显微镜图像(a,Glass,b,G-STSo6%wt,c,G(STSo6%wt)-(MPA-N+),d,G(STSo6%wt)-DEQAS,e,G-(MPA-N+),细胞迁移结果:c>a>b>d>e。
与培养板上生长的细胞相比,不同样品表面上的细胞在划痕区有不同程度的迁移,对比例1(G(STSo6%wt)-DEQAS)、对比例2(G-(MPA-N+))样品划痕区迁移的细胞要比G-STSo6%wt涂层划痕区迁移的细胞少,但是实施例1(G(STSo6%wt)-(MPA-N+))样品样品划痕区迁移的细胞要比G-STSo6%wt涂层划痕区迁移的细胞多。与空白对照(Glass)相比,G(STSo6%wt)-(MPA-N+)的促细胞迁移率为21.1%,说明实施例1样品有很好的生物相容性,能够促进细胞迁移,这也与细胞粘附实验结果相一致。
6、抗菌性测试
金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)生长到中对数阶段。将细菌悬浮液稀释至106CFU/mL的浓度。将样品(Ti、实施例1、对比例1、对比例2样品)分别在1mL细菌悬浮液中37℃培养24h。孵育后,各种钛样品用PBS冲洗两次。用5ml的PBS将附着在标本上的细菌分离5min。将细菌悬浮液培养在Mueller-Hinton琼脂平板上进行菌落计数。抗菌率(AR)按以下公式计算:AR(%)=(CFUcontrol)-CFUexperiment)/CFUcontrol×100%,其中Ti为对照组,实施例1、对比例1、对比例2样品为实验组。拍照比较不同涂层的抗菌性,如图7~9所示,说明接枝季铵盐的样品有很好的抗菌性。
Claims (10)
1.一种用于牙种植体的促进细胞迁移的抗菌涂层,其特征在于,所述涂层为多肽单层膜接枝马来海松酸季铵盐,所述接枝率为5~7%;所述涂层的接触角为60~70°,所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为86~91%,所述涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率为92~98%,促细胞迁移率为20~22%。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂层,其特征在于,所述接枝率为6.3±0.2%;所述涂层的接触角为68.9±1.1°,所述涂层对大肠杆菌的的抗菌率为90.5±0.5%,所述涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率为97.5±0.5%。
4.根据权利要求3所述的抗菌涂层,其特征在于,马来海松酸季铵盐的合成方法,包括以下步骤:
(1)氮气气氛下,将松香酸加热至一定温度并维持一定时间,然后冷却至120~125℃,加入马来酸酐和乙酸;在120~130℃下回流12~15h;冷却至室温,重结晶得到马来海松酸;松香酸和马来酸酐的物质的量之比为1.0:0.8~1.2;
(2)将马来海松酸溶解在乙醇中,然后加入N,N-二甲基乙二胺加热,然后冷却至室温,过滤干燥得到化合物(MPA-N,马来海松酸基胺);马来酸和N,N-二甲基乙二胺的物质的量之比为1.0:0.9~1.1;
(3)将化合物(MPA-N)与溴乙烷溶解在干燥的四氢呋喃中,加热反应,过滤得到产物马来海松酸季铵盐(MPA-N+)。化合物(MPA-N)与溴乙烷的物质的量之比为1.0:18~21;
优选的,步骤(1)中所述加热温度维180~185℃并维持3~3.5h;
优选的,步骤(2)中所述加热温度为85~90℃,并维持搅拌5~5.5h;
优选的,步骤(3)中所述加热温度为40~45℃,并维持搅拌48~50h。
5.根据权利要求1所述的抗菌涂层,其特征在于,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为6.2~14.9nm,膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%,多肽单层膜的Zeta电位为5~-9mV;所述膜的接触角为10±1°~84±1°。
6.根据权利要求5所述的抗菌涂层,其特征在于,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为6.2~9.0nm,膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%,多肽单层膜的Zeta电位为-3~-9mV;所述膜的接触角为61±1°~84±1°;进一步优选的,所述单层膜的厚度为6.6nm,膜表面的伯氨基暴露量为14.51%,多肽单层膜的Zeta电位为-3.33mV;所述膜的接触角为61±1°;
优选的,所述多肽单层膜是由分子量为(1.48±0.2)×105g/mol的多肽分子构成的,单层膜的厚度为13.8~14.9nm,膜表面的伯氨基暴露量为12~14%,多肽单层膜的Zeta电位为-1~5mV;所述膜的接触角为10±1°。
7.权利要求1~6任一项所述抗菌涂层的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和马来海松酸季铵盐混合,超声处理,使马来海松酸季铵盐充分分散在缓冲溶液中得到混合溶液;
(2)将多肽单层膜置于步骤(1)的混合溶液中,于48~52℃水浴中,反应11~13h后,在蒸馏水中提拉10次以上,去除掉弱结合或者未结合的季铵盐,即得到抗菌涂层,用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。
8.根据权利要求7所述的抗菌涂层的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述缓冲液的pH=9.6;混合溶液中马来海松酸季铵盐的浓度为0.01~0.015mol/L。
优选的,步骤(1)中马来海松酸季铵盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为:n(MPA-N+):n(EDC)=1:420~430;
马来海松酸季铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的摩尔比为:n(MPA-N+):n(NHSS)=1:850~860。
9.权利要求1~6任一项所述抗菌涂层在牙种植体材料中的应用。
10.一种牙种植体材料,其特征在于,所述牙种植体材料为金属钛或其合金制成,材料表面具有权利要求1~6任一项所述抗菌涂层。
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