CN116535474B - 一种抗黏附生物相容性抗菌肽及其在生物涂层中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种来源于枯草芽孢杆菌的抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌肽，及以此为基础制备成的生物相容性抗菌涂层，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都具有极高的抑制率，具有卓越的抗菌性能，具有非常好的生物相容性。本发明的生物相容性抗菌涂层具有高效防护、良好的生物相容性、环保可降解等功能；本发明的生物相容性抗菌涂层可大幅度提高现有涂层的抗菌抗毒效用，并拥有良好的生物相容性，本发明的涂层成为新型防护生物材料的一大突破，可适用范围广阔，在日常生活及医疗卫生中有着巨大的应用价值和广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药制剂领域，具体是一种抗黏附生物相容性抗菌肽及其在生物涂层中的应用。
背景技术
抗菌肽(antibacterial peptides，ABP)是由生物体基因编码、相对分子质量小，具有抗菌活性的肽类物质的总称。它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物和人体内，除有抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还具有抗肿瘤细胞作用。因此，抗菌肽又称为肽抗生素(peptideantibiotics)。它是机体非特异性免疫的重要组成部分，是生物体抗感染免疫的古老机制，所以又叫做＂第二防御体系＂。研究表明，抗菌肽具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点。同时还有高效的抗真菌和(或)抗病毒和(或)原虫和(或)抗肿瘤活性。在临床感染菌对传统抗生素耐药性日益严重的今天，人们希望抗菌肽成为继传统抗生素之后的又一类新型抗感染药物。随着分子生物学技术的发展，抗菌肽已成为近年来分子免疫学和分子生物学的研究热点。研究的内容包括：抗菌肽的分离与纯化，氨基酸序列的分析；蛋白质构型与功能的关系，抗菌肽的作用机理；应用基因工程技术克隆和表达抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等，其中抗菌肽基因工程研究最受重视。研究发现，抗菌肽针对各类微生物病原体具有出色的杀灭能力，因此被广泛应用于抗菌材料的设计中。随着研究的深入，抗菌肽其它的新功能被不断发现，例如抗菌肽针对细菌具有特殊的粘附作用，而对非靶向的生物分子保持高效的抗粘附能力。然而，抗菌肽这些新发现的功能还较少被研究所关注，因而也鲜有被用于材料学的设计中。
随着生物工程学、组织工程学的不断发展，越来越多的“医工结合”产品进入人类日常生活中，尤其在医疗卫生领域中更是欣欣向荣。例如：生物医用材料、高分子复合组织材料、生物可植入性材料等逐渐被应用于医疗卫生行业中，与此同时，在工程学的开发应用下应运而生的微创介入治疗、有创式诊疗方式也在医疗服务中起到举足轻重的作用，然而这些材料的使用也增加了医疗感染的风险，相对应的交叉感染、职业感染现象也随之而来。因此通过高效切实的防护措施来减少相应的感染风险至关重要。抗菌肽与细菌的特异性粘附，能够为我们在生物材料设计上提供了新的思考方式。Gu等利用抗菌肽与细菌的特异性相互作用将细菌的检测和治疗相结合，得到诊断治疗一体化的多功能抗菌材料。他们在牛血清白蛋白稳定的氧化锌量子点上共价接枝抗菌肽UBI和近红外光染料，然后再将抗生素万古霉素负载到纳米粒子上，就可以实现对感染部位细菌的原位诊断、成像和治疗。通过与细菌的特异性粘附，抗菌肽UBI能够精准定位到体内的感染部位。这种利用抗菌肽与细菌的特异性相互作用实现诊疗一体化的抗菌材料，能够快速定位感染部位以及提高局部药物浓度，避免了抗生素的滥用和降低抗生素对健康组织的影响。天然抗菌肽能够与细菌粘附，但是与生理环境中的其它分子或物质，如血细胞、蛋白质、哺乳动物细胞等并不会相互作用，具有很好的抗生物枯附能力(Anti-biofoulin抗菌肽除了能够抵抗血细胞的粘附，保持血细胞的结构和功能，它与其他非特异性分子的相互作用中也观察到了抗粘附现象。万等将抗菌肽RV-23与Hela细胞相互作用一段时间后，发现在细胞的周围，基本看不到红色荧光标记的抗菌肽的存在。这是由于Hela细胞和细菌细胞膜之间的疏水结构和电荷的差异导致的，Hela细胞并不是抗菌肽RV-23的特异性作用对象，因而抗菌肽不会粘附在其表面上，显示出了抗菌肽对非特异性分子的抗粘附行为。因此可以利用这种功能构建具有良好生物相容性的抗菌材料。
发明内容
本发明基于上述理论和技术基础，首先公开了一种源自枯草芽孢杆菌的抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明提供一种抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌涂层的制备方法，所述方法为：
精确称取 1份聚己内酯二元醇，1份聚乙二醇，在超净台上溶于15-30份体积的乙酸乙酯中，超声震荡后在所得溶液中加入0.1-0.5份抗菌肽，超声震荡获得分散均匀的悬浊液。
基材的预处理，具体为：选用常规载玻片，用清洁剂清洁，去离子水润洗，甲醇润洗后氮气干燥，然后用氨基丙基三乙氧基硅烷进行硅烷化处理；
超净台通风条件下在准备好的 基材载药面滴加步骤（1）中的悬浊液至铺满，静置15 分钟待乙酸乙酯完全挥发后重复 3 次，室温干燥后备用。
优选的，基材预处理之前用激光雕刻机对载玻片表面进行激光蚀刻加工，
进一步优选的，激光能量强度为200-400w，扫描速度为200-500mm/s；
进一步的，本发明提供一种抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌肽的应用，所述应用为制备一种提高生物相容性的抗菌涂层，所述抗菌涂层具有卓越的抗菌和抗非特异性粘附性能，同时具有非常好的生物相容性。
进一步的，本发明提供一种上述抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌涂层在制备抗菌医疗器械中的应用，优选的，所述抗菌医疗器械为载玻片，进一步优选的，为用于免疫细胞染色的多孔位载玻片，包括二孔位载玻片、八孔位载玻片和十孔位载玻片。
有益效果
本发明提供的来源于枯草芽孢杆菌的抗菌肽制备成的生物相容性抗菌涂层对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都具有极高的抑制率，具有卓越的抗菌性能，具有非常好的生物相容性。上述生物涂层可以广泛的应用于抗菌医疗器械的制备过程中，尤其是多孔位载玻片的制备过程中，可以实现抗菌、抗非特异性粘附、良好生物相容性的效果。本发明的生物相容性抗菌涂层具有高效防护、良好的生物相容性、环保可降解等功能；本发明的生物相容性抗菌涂层可大幅度提高现有涂层的抗菌抗毒效用，并拥有良好的生物相容性，本发明的涂层成为新型防护生物材料的一大突破，可适用范围广阔，在日常生活及医疗卫生中有着巨大的应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1抗菌肽对金黄色葡萄球菌CMCC 26003的最小抑菌浓度试验，其中，A-F分别为4mg/ml、2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、750μg/ml、500μg/ml 的不同浓度的抗菌肽的实验结果。
具体实施方式
实施例1抗氧化抗菌肽的筛选鉴定
由公司研发中心经过长期分离纯化实验筛选，从污泥中分离制备出的枯草芽孢杆菌菌株（KB001）进行活化、种子发酵、扩增培养等常规发酵。
所述枯草芽孢杆菌发酵培养基由以下质量百分比成分组成：葡萄糖10%、酵母浸膏0.75%、豆粕5%、玉米浆干粉1%、氯化钠0.15%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸锰0.02%，调节发酵液pH7.0。具体培养和发酵都是本领域常规技术手段，本领域技术人员可以参考常见工具书进行实施。
发酵培养液9000r/min离心取上清，用能提截2000Da超滤膜超滤，透过液用反渗透膜浓缩，2000Da超滤的浓液和反渗透膜的浓缩液混合，微波干燥机进行干燥，控制真空度0.04mpa-0.08mpa，控温60℃，得多肽粗提物，真空浓缩，冷冻干燥，得到粉末；
将高效液相色谱仪的定量环由20μL改为80μL；缩短从检测器到废液的管路长度，使之更适于样品的收集。将多肽粗提液于色谱条件下用65％乙腈和10％甲醇为流动相进行色谱分离。其中65％乙腈和10％甲醇为流动相，样品的洗脱时间缩短，可使样品获得很好的分离。使用多阶梯度洗脱使初次分离的样品获得103个洗脱峰，样品分离的流动相浓度确定为流动相A(0.10％TFA的水溶液)和流动相B(0.03％TFA的乙腈溶液)。经多次优化色谱条件，初次分离洗脱条件为在第0，5，10，45，60，75分钟的不同时间点，其流动相B的浓度依次为0、0、15％、40％、100％、100％；第二次分离洗脱条件为在第0，5，10，35，40分钟的不同时间点，其流动相B的浓度依次为0、0、10％、50％、100％。使用215nm的检测波长检测。215nm的检测波长可获得较多的色谱峰，且色谱峰吸收强度较高，便于观察和收集。
多肽粗提液经过高效液相色谱仪初次分离，共获得107个色谱峰，经过抑菌试验，共有24个色谱峰具有抑菌活性，抑菌试验选取实验室细菌感染中常见的感染细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌)进行培养并做抑菌试验。
抗菌活性检测采用杯碟法，细菌培养采用普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测样品溶液0.lml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后观察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作为最小抑菌浓度。试验重复五次，取平均值。
结果如表1所示，其中第16号峰的抑菌效果最强，对于大肠杆菌CMCC44817、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、变形杆菌、铜绿假单胞菌CMCC10104都具有显著的抑制作用，说明该多肽具有良好的广谱抑制细菌生长的作用。
表1. 目的蛋白对各菌株的抑菌效果
| 菌种 | 平均直径 |
| 大肠杆菌CMCC 44817 | 16.21±0.39 |
| 金黄色葡萄球菌CMCC 26003 | 29.44±3.10 |
| 变形杆菌 | 24.81±1.27 |
| 绿脓假单胞菌CMCC 10104 | 14.08±2.17 |
通过对16号峰进行第二次分离纯化，共获得5个色谱峰，经抑菌活性检测，3号色谱峰具有最强的抑菌活性，初步筛选为本发明的抗菌肽。
取1μL二次纯化后的3号色谱峰有活性的产物，点靶，交由华大基因（北京）公司进行质谱鉴定，得到其氨基酸序列为GWWCQAGAWHQIGGNYVSQRNQRSFT（SEQ ID NO.1）。并通过固相合成制备相应的抗菌肽备用。
进一步的，对获得的抗菌肽选用细胞实验感染中最常见的金黄色葡萄球菌作为指示菌（图1），测定抗菌肽的最小抑菌浓度。取一支 100mg抗菌肽于超净台上溶于 50mlPBS中，超声震荡 5min，按照预实验结果所确定抗菌肽最小抑菌浓度的大致范围在超净台上依次稀释得到 4mg/ml、2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、750μg/ml、500μg/ml 的不同浓度的抗菌肽标准溶液。将 2.1 所复苏培养的 3 代之后的金黄色葡萄球菌使用比浊法调整浓度至108，取 6 只 MH 琼脂平板均匀涂布制成指示板，在所得每只指示板正中位置依次滴加梯度浓度的抗菌肽溶液 10μl，后放入 5%CO2 的 37℃培养箱中培养 24 小时，取出后观察。最终确定所选用抗菌肽的最小抑菌浓度范围为 1mg/ml-1.5mg/ml。
实施例2 抗菌肽生物膜的制备
取常规载玻片，先利用激光雕刻机对载玻片表面进行激光加工，激光能量强度为150w，扫描速度为500mm/s，处理完毕后用乙醇清洁，去离子水润洗，甲醇润洗后氮气干燥，然后用浓度为15wt％的氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液进行硅烷化处理，在80-100℃下反应6-10h，之后取出用水洗涤除去未反应的氨基丙基三乙氧基硅烷，并用N2吹干，得到涂覆有硅烷偶联剂的载玻片；
精确称取 1g聚己内酯二元醇，1g聚乙二醇，在超净台上溶于30ml的乙酸乙酯中，超声震荡后在所得溶液中加入0.1g抗菌肽，超声震荡获得分散均匀的悬浊液，备用。超声参数为500W，超声3s，间歇3s，超声15min；
超净台通风条件下在准备好的载玻片载药面滴加上述悬浊液至铺满，静置 15 分钟待乙酸乙酯完全挥发后重复 3 次，室温干燥后备用。
所制备的仿生结构亲水抗菌载玻片表面的接触角为55.3°，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率分别为98.89％和99.20％。
实施例3 抗菌双孔载玻片的制备
取双孔载玻片（尺寸为75*25mm，厚度1.2mm，其中小孔位尺寸为10mm*10mm的圆孔，大孔位尺寸为13mm*13mm的圆孔），先利用激光雕刻机对载玻片表面进行激光加工，激光能量强度为200w，扫描速度为400mm/s，处理完毕后用乙醇清洁，去离子水润洗，甲醇润洗后氮气干燥，然后用浓度为15wt％的氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液进行硅烷化处理，在80-100℃下反应6-10h，之后取出用水洗涤除去未反应的氨基丙基三乙氧基硅烷，并用N2吹干，得到涂覆有硅烷偶联剂的双孔载玻片；
精确称取 2g聚己内酯二元醇，2g聚乙二醇，在超净台上溶于50ml的乙酸乙酯中，超声震荡后在所得溶液中加入0.2g抗菌肽，超声震荡获得分散均匀的悬浊液，备用。超声参数为500W，超声3s，间歇3s，超声15min；
超净台通风条件下在准备好的载玻片正面向上，滴加上述悬浊液至铺满，静置 15分钟待乙酸乙酯完全挥发后重复 3 次，室温干燥后备用。
所制备的仿生结构亲水抗菌载玻片表面的接触角为62.5°，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率分别为97.64％和98.16％。
实施例4抗菌八孔载玻片的制备
取八孔位载玻片（尺寸为75*25mm，厚度1.2mm，孔位尺寸为10mm*8mm的椭圆孔），先利用激光雕刻机对载玻片表面进行激光加工，激光能量强度为200w，扫描速度为500mm/s，处理完毕后用乙醇清洁，去离子水润洗，甲醇润洗后氮气干燥，然后用浓度为15wt％的氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液进行硅烷化处理，在100℃下反应10h，之后取出用水洗涤除去未反应的氨基丙基三乙氧基硅烷，并用N2吹干，得到涂覆有硅烷偶联剂的载玻片；
精确称取 2g聚己内酯二元醇，2g聚乙二醇，在超净台上溶于60ml的乙酸乙酯中，超声震荡后在所得溶液中加入0.2g抗菌肽，超声震荡获得分散均匀的悬浊液，备用。超声参数为500W，超声3s，间歇3s，超声15min；
超净台通风条件下在准备好的载玻片载药面滴加上述悬浊液至铺满，静置 15 分钟待乙酸乙酯完全挥发后重复 3 次，室温干燥后备用。
所制备的仿生结构亲水抗菌载玻片表面的接触角为70.1°，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率分别为92.84％和97.19％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种源自枯草芽孢杆菌的具有良好生物相容性的抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌涂层的制备方法，其特征在于所述方法为：
（1）精确称取 1份聚己内酯二元醇，1份聚乙二醇，在超净台上溶于15-30份体积的乙酸乙酯中，超声震荡后在所得溶液中加入0.1-0.5份如权利要求1所述的抗菌肽，超声震荡获得分散均匀的悬浊液；
（2）基材的预处理，具体为：选用常规载玻片，用清洁剂清洁，去离子水润洗，甲醇润洗后氮气干燥，然后用氨基丙基三乙氧基硅烷进行硅烷化处理；
（3）超净台通风条件下在准备好的基材载药面滴加步骤（1）中的悬浊液至铺满，静置15 分钟待乙酸乙酯完全挥发后重复 3 次，室温干燥后获得覆盖有抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌涂层的基材。
3.如权利要求2所述的方法，基材预处理之前用激光雕刻机对载玻片表面进行激光蚀刻加工。
4.如权利要求3所述的方法，其中激光能量强度为200-400w，扫描速度为200-500mm/s。
5.如权利要求2-4之一所述的方法制备获得的抗黏附的具有良好生物相容性的抗菌涂层。
6.如权利要求1所述的抗菌肽的应用，所述应用为制备一种提高生物相容性的抗菌涂层，所述抗菌涂层具有抗菌和抗非特异性粘附性能，同时具有生物相容性。
7.一种权利要求1所述的抗菌肽或者权利要求5所述的抗菌涂层在提高抗菌医疗器械的生物相容性和抗黏附能力中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，抗菌医疗器械为载玻片。
9.如权利要求8所述的应用，所述载玻片为免疫细胞染色的多孔位载玻片，包括二孔位载玻片、八孔位载玻片和十孔位载玻片。
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