CN111773439A

CN111773439A - 一种可有效固定阳离子抗菌剂且抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层

Info

Publication number: CN111773439A
Application number: CN202010436033.6A
Authority: CN
Inventors: 杨鹏; 田娟华; 胡心怡
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111773439B

Abstract

本发明公开了一种可有效固定阳离子抗菌剂且抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层，通过将待改性基材置于浸渍液种即可在其表面形成涂层，所述浸渍液由蛋白质、阳离子抗菌剂和还原剂混合而成的；本发明利用血清白蛋白、纤维蛋白原、α‑乳白蛋白等天然蛋白质在大于其等电点的环境中呈现的负电荷与阳离子抗菌剂的正电荷相互中和，获得表面接近电中性的涂层，可有效避免蛋白质及细菌残骸吸附，保持长期高效的抗菌及抗生物膜效果，同时克服了传统阳离子抗菌剂杀菌表面生物相容性欠佳的缺点。本发明涂层制备方法简便，生物安全，普遍适用于多种医用器材表面，无需依靠抗生素发挥涂层的杀菌作用，可有效避免不恰当使用抗生素所致的细菌耐药。

Description

一种可有效固定阳离子抗菌剂且抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种可固定阳离子抗菌剂，并抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层。

背景技术

伴随多种医用可植入设备的发展，植入物相关感染不仅会引起局部组织炎症，还会缩短植入物使用寿命甚至引起败血症等严重的并发症，对病患和社会造成重大的经济负担。近年来，尽管多种基于抗生素或纳米银的杀菌涂层表现出较好的杀菌效果，但由于这些表面所致的细菌耐药问题和对环境造成的污染，它们的实际价值受到限制。人类对抗生素长期过量和不恰当的使用，急剧加速了病菌耐药性突变的发生，各类耐药菌不断出现，最终，具有多重耐药性的“超级细菌”问世，使细菌感染的治疗难度增大。据估计到2050年，耐药菌每年在世界范围内所致的死亡可高达1000万人。身处“后抗生素时代”，迫切要求研究者们积极探索新的抗菌材料和方法来应对这一危机。

抗菌肽和季铵盐类活性杀菌成分，通过正电荷片段与带负电的细菌细胞膜相吸引，扰动并破坏磷脂双分子层结构，导致细菌的死亡。不同于抗生素的是，这类抗菌活性物质与细菌细胞膜作用的机制，在发挥广谱抗菌效果的同时，不会引起耐药菌的产生。然而，现有此类阳离子抗菌剂固定在植入物表面通常需要依赖表面聚合、层层自组装(LBL)和贻贝启发化学等策略，通过复杂的分子设计以引入用于物理涂层或共价接枝的界面粘附结构，这些复杂且耗时的过程使其不适用于大规模工业生产。更重要的是，阳离子抗菌剂的表面正电荷对原核生物和真核生物都会表现出杀伤作用，降低涂层的血液相容性和细胞相容性，带正电荷的表面还易被呈现负电荷血浆蛋白及细菌残骸污染，这不仅导致涂层的有效杀菌位点被覆盖，抗菌性能降低，还会引导后续细菌的表面黏附作用，最终大量细菌被自身分泌的细胞外基质包裹形成生物膜，难以受到抗生素、消毒剂和动态环境的影响，引发持续感染。在这种情况下，以简单的方式开发具有广谱杀菌和抗生物膜特性的新材料是提高实用价值和促进商业生产的关键。因此理想的非抗生素抗菌涂层应具备制造简便、生物安全、抗生物膜和广谱杀菌的特点。通过新型的表面涂层技术固定多种阳离子抗菌剂，在防治植入物相关感染方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服基于阳离子抗菌剂的表面易受生物膜污染及生物相容性不佳的缺点，提供一种制备简便，生物安全，不会引起细菌耐药，能稳定黏附在多种医用材料表面的多功能涂层。该涂层在宽pH区间内表面电荷接近中性，不仅能有效避免蛋白质及细菌残骸的污染，保持长期广谱的杀菌及抗生物膜效果，并且具有良好的生物相容性。

针对上述目的，本发明采用的可有效固定阳离子抗菌剂且抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层是将待改性材料在浸渍液中浸泡后，在待改性材料表面形成的一层薄膜。

上述的浸渍液是将蛋白质和阳离子抗菌剂加入pH为2～9的还原剂水溶液中制成，其中所述的蛋白质为溶菌酶或等电点为1～7且能够被所述还原剂还原的蛋白质。

上述的等电点为1～7且能够被所述还原剂还原的蛋白质包括乳铁蛋白、α-乳白蛋白、胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、β-乳球蛋白、纤维蛋白原、α-淀粉酶、辣根过氧化物、胃蛋白酶中的任意一种或多种。

上述的阳离子抗菌剂包括天然或人工合成的阳离子抗菌肽、季铵盐类抗菌剂、烷基双胍类杀菌剂、芳基双胍类杀菌剂、聚合双胍类杀菌剂中的任意一种或多种。其中，所述的天然或人工合成阳离子抗菌肽由10～100个氨基酸残基构成，具有净正电荷；所述的季铵盐类抗菌剂为苯扎氯铵、十六基卤化吡啶鎓、烷基三甲基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、双癸基二甲基氯化铵、双癸基二甲基溴化铵、十四烷基-2-甲基吡啶溴化铵、双癸基甲基羟乙基/羟丙基氯化铵中的任意一种或多种；所述的烷基双胍类杀菌剂为十二烷基醋酸胍、阿立西定中的任意一种或两种；所述的芳基双胍类杀菌剂为醋酸氯已定、葡萄糖酸氯已定中的任意一种或两种；所述聚合双胍类杀菌剂为聚亚己基双胍、聚氨丙基双胍、聚六甲基双胍中的任意一种或多种。

上述pH为3～8的还原剂水溶液是将还原剂水溶液用NaOH调节pH值后获得，其中所述的还原剂包括三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和还原性谷胱甘肽中的任意一种或多种。

上述浸渍液中，优选蛋白质的浓度为0.5～15mg/mL、阳离子抗菌剂的浓度为0.03～1g/mL、还原剂的浓度为1～15mg/mL。进一步优选将待改性材料在浸渍液中浸泡的时间为1～180分钟，浸泡温度为10～50℃。

上述的待改性材料可以为现有的任何用于成膜的材料，几乎不限于形状和材质。具体可以包括：(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金等；(2)无机材料：二氧化硅、二氧化钛、碳素材料(C)、硅、二氧化钛、氧化钛、氮化钛等无机材料等；(3)高分子材料：涤纶(PET)、聚乙烯醇(PVALC)、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯(PU)、聚丙烯(PP)、聚酰胺、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯腈、聚丙烯酸(PAA)及其衍生物、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯等；(4)天然生物材料：可塑性淀粉基材料(PSM)、海藻酸钠(sodiumalginate)胶原蛋白(collagen)、纤维蛋白(fibrous protein)、透明质酸钠(sodiumhyaluronate)、明胶(gelatin)等；(5)人工合成多肽类水凝胶材料：聚L-谷胺酸、聚L-赖氨酸等。基底材料的种类不限于以上材料，也可以为以上几种材料的混合材料。

本发明的有益效果如下：

1、本发明无需利用抗生素发挥涂层的杀菌作用，有效避免不恰当使用抗生素所致的细菌耐药。

2、本发明涂层利用蛋白质在大于其等电点的环境中呈现的负电荷与阳离子抗菌剂的正电荷相互中和，获得表面接近电中性的涂层。一方面可有效避免蛋白质及细菌残骸在表面的黏附，保持长期高效的抗菌及抗生物膜效果，另一方面还极大改善了基于阳离子抗菌剂的杀菌表面生物相容性欠佳的缺点。

3、本发明涂层制备方法简便，生物安全，普遍适用于多种医用器材表面，尤其是在生物惰性基材表面，无需复杂的分子设计和表面预处理，通过简单浸涂即可实现。且制备完成后涂层稳定，便于后续使用。

附图说明

图1是制备浸渍液时不同聚赖氨酸投料浓度(0.03～0.17g/mL)对涂层的聚赖氨酸平均固定密度的影响。

图2是空白硅片(a)、相转变牛血清白蛋白涂层修饰的硅片(b)和固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅片(c)的表面Zeta电位。

图3是实施例2所制备的抗菌涂层对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌杀菌率。

图4是空白QCM芯片(a)以及QCM芯片表面修饰相转变纤维蛋白原涂层(b)和修饰固定有聚赖氨酸的相转变纤维蛋白原涂层(c)对全脂牛奶、胎牛血清、大肠杆菌细菌裂解液、酵母菌真菌裂解液、细胞裂解液、胶原蛋白吸附量的比较。

图5是空白玻璃片以及玻璃片表面修饰相转变牛血清白蛋白涂层和修饰固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层(简称聚赖氨酸抗菌涂层)与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌共同培养1天后表面生物膜中细菌的负载量比较。

图6是是空白硅胶片、对比例2中硅胶片表面修饰相转变纤维蛋白原涂层和实施例9中硅胶片表面修饰固定有苯扎氯铵的相转变纤维蛋白原抗菌涂层分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌共同培养1天后表面生物膜中细菌的负载量比较。

图7是实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层的硅胶片经过不同条件的处理前后，涂层对金黄色葡萄球菌杀菌率的比较。

图8是实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层的硅胶片经过不同条件的处理前后，涂层对预防金黄色葡萄球生物膜形成的性能对比。

图9是实施例2所制备的抗菌涂层的浸提液对培养小鼠成纤维细胞3T3 24小时、48小时、72小时测定的细胞增殖实验结果。

图10是实施例2所制备的抗菌涂层的溶血试验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

将10mL 10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、10mL 0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中牛血清白蛋白的浓度为3.33mg/mL、聚赖氨酸的浓度为0.13g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将长宽各为1.8cm的硅胶片在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，得到固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅胶片。

实施例2

将10mL 10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、10mL 0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中牛血清白蛋白的浓度为3.33mg/mL、聚赖氨酸的浓度为0.13g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将长宽各为1.8cm的硅胶片在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅胶片。

对比例1

在实施例2中，将10mL 0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液用等体积的超纯水替换，替他步骤与实施例2相同，得到相转变牛血清白蛋白涂层修饰的硅胶片。

实施例3

将10mL 15mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、10mL 0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液混合均匀后，加入10mL 10mg/mL pH为5.0的β-巯基乙醇水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中牛血清白蛋白的浓度为3mg/mL、聚赖氨酸的浓度为0.13g/mL、β-巯基乙醇的浓度为3.33mg/mL。将聚氨酯在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的聚氨酯。

实施例4

将10mL 10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、10mL 0.3g/mL的氯已定水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中牛血清白蛋白的浓度为3.33mg/mL、氯已定的浓度为0.1g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将生物陶瓷在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有氯已定的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的生物陶瓷。

实施例5

将10mL 6mg/mL的人血清白蛋白水溶液、10mL 0.3g/mL的苯扎氯铵水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中人血清白蛋白的浓度为2mg/mL、苯扎氯铵的浓度为0.1g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将钛合金在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有苯扎氯铵的相转变人血清白蛋白抗菌涂层修饰的钛合金。

实施例6

将10mL 6mg/mL的α-乳白蛋白水溶液、10mL 0.3g/mL的苯扎氯铵水溶液混合均匀后，加入10mL 6mg/mL pH为5.5的半胱氨酸水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中α-乳白蛋白的浓度为2mg/mL、苯扎氯铵的浓度为0.1g/mL、半胱氨酸的浓度为2mg/mL。将聚氨酯导管在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有苯扎氯铵的相转变α-乳白蛋白抗菌涂层修饰的聚氨酯。

实施例7

将10mL 10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、10mL 0.2g/mL的氯已定水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中牛血清白蛋白的浓度为3.33mg/mL、氯已定的浓度为0.07g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将聚醚醚酮片材在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有氯已定的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的聚醚醚酮。

实施例8

将10mL 15mg/mL的α-乳白蛋白水溶液、10mL 0.4g/mL的抗菌肽GL13K水溶液混合均匀后，加入10mL 20mg/mL pH为5的二硫苏糖醇水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中α-乳白蛋白的浓度为5mg/mL、抗菌肽GL13K的浓度为0.13g/mL、二硫苏糖醇的浓度为6.67mg/mL。将聚氨酯导管在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有抗菌肽GL13K的相转变α乳白蛋白抗菌涂层修饰的聚氨酯。

实施例9

将10mL 10mg/mL的纤维蛋白原水溶液、10mL 0.9g/mL的苯扎氯铵水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为6.0的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中纤维蛋白原的浓度为3.33mg/mL、苯扎氯铵的浓度为0.3g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将长宽各为1.8cm的硅胶片在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有苯扎氯铵的相转变纤维蛋白原抗菌涂层修饰的硅胶片。

对比例2

在实施例9中，10mL 0.9g/mL的苯扎氯铵水溶液用等体积的超纯水替换，替他步骤与实施例9相同，得到相转变纤维蛋白原涂层修饰的硅胶片。

实施例10

将10mL 10mg/mL的溶菌酶水溶液、10mL 0.2g/mL的氯已定水溶液混合均匀后，加入10mL 14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液(其pH通过NaOH调节)，混合均匀，得到浸渍液，所得浸渍液中溶菌酶的浓度为3.33mg/mL、氯已定的浓度为0.07g/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为4.67mg/mL。将钛合金片材在所得浸渍液中30℃浸泡2小时，然后用去离子水清洗后干燥，再次浸泡于上述浸渍液中，重复4次，得到固定有氯已定的相转变溶菌酶抗菌涂层修饰的钛合金。

上述实施例中的蛋白质、阳离子抗菌剂、还原剂、待改性材料也可以用发明内容部分中相应的其他具体物质替换，均在本发明的保护范围内。

为了证明本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究实验，具体试验如下：

试验1

为了探索不同初始聚赖氨酸投料浓度对抗菌涂层中聚赖氨酸平均负载密度的影响，我们采用异硫氰酸荧光(FITC)标记的聚赖氨酸(0.1～0.5g/mL)水溶液、10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液和14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液以1:1:1的体积比均匀混合得到浸渍液。将玻璃片浸入上述溶液中，并在30℃下浸泡2小时，以获得具有不同聚赖氨酸负载密度的抗菌涂层。通过重复此过程4次，获得不同厚度的涂层，然后将该涂层浸泡在1mol/L的Vc水溶液中分解6小时。通过荧光分光光度计测量溶液的荧光强度来估计聚赖氨酸的平均负载密度，结果如图1所示。由图1可见，随着浸渍液中聚赖氨酸浓度的增加，固定密度显著增加，继续提高聚赖氨酸的投料浓度，则对其平均负载密度影响不大。

试验2

将10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液和14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液以1:1:1的体积比均匀混合得到浸渍液。将硅片浸泡其中，30℃下浸泡2小时，去离子水清洗干燥后，再次浸泡于浸渍液中，重复4次，得到固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅片。将上述浸渍液中的聚赖氨酸水溶液替换为等体积的超纯水，其余步骤同上得到相转变牛血清白蛋白涂层修饰的硅片。分别测试空白硅片、相转变牛血清白蛋白涂层修饰的硅片以及固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅片的表面Zeta电位，结果如图2所示。由图可见，相比相转变牛血清白蛋白涂层，阳离子抗菌剂的引入使涂层在宽的pH区间内接近于电中性。

试验3

基于菌落计数法评估了抗菌涂层的抗菌活性。本研究使用了三种细菌，包括金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌，ATCC 6538)、大肠杆菌(大肠杆菌，ATCC 25922)和奇异变形杆菌(奇异变形杆菌，ATCC 51286)。在进行体外抗菌测试之前，将细菌在70rpm的摇动下于37℃在50mL MHB中进行有氧培养过夜，以使细菌处于对数生长期。将1mL细菌悬浮液收集在无菌的eppendorf管中，以5000rpm离心，并用PBS洗涤以除去培养基。将该过程重复三遍。最后，将测试细菌以10⁷CFU/mL的浓度重悬于PBS中。将10μL上述细菌悬浮液滴在裸露硅胶片或实施例2所得硅胶片表面，并用另一块相同的样品覆盖使得细菌悬液均匀分布在两片硅胶片之间。在37℃的潮湿环境中孵育8小时后，用镊子小心分离，然后将样品完全浸入装有10mL无菌PBS的离心管中。对该离心管进行超声处理，以将附着在该材料上的细菌完全转移到PBS中。将细菌悬浮液连续稀释并铺在MHA板上。将这些MHA板在37℃下孵育24小时后，记录菌落数。抗菌活性由杀菌率表示，杀菌率根据以下公式计算：

其中C₀表示裸露硅胶片菌落数目，C为实施例2所得硅胶片菌落数目。结果显示，硅胶表面修饰固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层后可以分别杀灭99.42％、99.72％和99.29％的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌(见图3)。

试验4

将10mg/mL的纤维蛋白原水溶液、0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液和14mg/mL pH为5的三(2-羧乙基)膦水溶液以1:1:1的体积比均匀混合得到浸渍液。将QCM芯片浸泡其中，30℃下浸泡2小时，去离子水清洗干燥后，得到固定有聚赖氨酸的相转变纤维蛋白原抗菌涂层修饰的QCM芯片。将上述浸渍液中的聚赖氨酸水溶液替换为等体积的超纯水，其余步骤同上得到相转变纤维蛋白原涂层修饰的QCM芯片。

将QCM芯片放入到模块的样品槽中。在开始通入样品前，先通入超纯水，待信号稳定后，接着通入未稀释的全脂牛奶、胎牛血清、大肠杆菌细菌裂解液、酵母菌真菌裂解液、hela细胞裂解液、胶原蛋白，记录频率和能量耗散的变化。待信号稳定后，用超纯水冲洗芯片，记录信号变化。在实验过程中液体流速为200μL/min，实验温度控制为25℃。芯片基频为5MHz，记录3、5、7、9、11、13倍频。蛋白质在不同表面的吸附质量通过软件D Find的Smartfit模式进行计算。由图4可见，与未经修饰的QCM芯片和相转变纤维蛋白原涂层修饰的QCM芯片相比，固定有聚赖氨酸的相转变纤维蛋白原抗菌涂层修饰的QCM芯片表现出对一系列生物流体混合物非特异性吸附的优异抵抗力，有利于防止涂层表面在长期使用过程中被污染和形成细菌生物膜。

试验5

将10mg/mL的牛血清白蛋白水溶液、0.4g/mL的聚赖氨酸水溶液和14mg/mL pH为4.5的三(2-羧乙基)膦水溶液以1:1:1的体积比均匀混合得到浸渍液。将玻璃片浸泡其中，30℃下浸泡2小时，去离子水清洗干燥后，再次浸泡于浸渍液中，重复4次，得到固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的玻璃片。将上述浸渍液中的聚赖氨酸水溶液替换为等体积的超纯水，其余步骤同上得到相转变牛血清白蛋白涂层修饰的玻璃片。将处于对数生长期的细菌离心并悬浮在PBS中，将200μL浓度为10⁶CFU/mL的细菌悬浮液均匀地铺展在空白玻璃片、相转变牛血清白蛋白涂层修饰的玻璃片和固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白涂层修饰的玻璃片上。为了防止细菌悬浮液蒸发，将所有样品放在潮湿的室内。在37℃下孵育24小时后，将样品用PBS洗涤以除去漂浮的细菌，然后将玻璃片放入装有10mLPBS的离心管中，并在200W/40Hz的频率下超声处理5分钟，以使附着的细菌重新悬浮在PBS表面。将细菌悬浮液连续稀释并铺在MHA板上。在37℃下孵育24小时后，对克隆数进行计数，以评估涂层上生物膜中的细菌载量。如图5所示，尽管与空白玻璃片相比，玻璃片表面修饰相转变牛血清白蛋白涂层后可以显著降低细菌在表面的黏附，但是当向涂层中引入聚赖氨酸后，不仅赋予了涂层高效的杀菌性能，并且可以进一步抑制多种致病菌黏附和生物膜形成。

试验6

将处于对数生长期的细菌离心并悬浮在PBS中，分别将200μL浓度为10⁶CFU/mL的细菌悬浮液均匀地铺展在空白硅胶片、实施例9所得硅胶片和对比例2所得硅胶片上。为了防止细菌悬浮液蒸发，将所有样品放在潮湿的室内。在37℃下孵育24小时后，将样品用PBS洗涤以除去漂浮的细菌，然后将硅胶片放入装有10mL PBS的离心管中，并在200W/40Hz的频率下超声处理5分钟，以使附着的细菌重新悬浮在PBS表面。将细菌悬浮液连续稀释并铺在MHA板上。在37℃下孵育24小时后，对克隆数进行计数，以评估涂层上生物膜中的细菌载量。如图6所示，尽管与空白硅胶片相比，对比例2中在硅胶片表面修饰相转变纤维蛋白原涂层后可以显著降低细菌在表面的黏附，但是当向涂层中引入苯扎氯铵后，可以进一步抑制多种致病菌黏附和生物膜形成。

试验7

将实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层修饰的硅胶片分别经过超声波处理10分钟、高压蒸汽灭菌(121℃，21分钟)、3M粘力胶带撕拉和浸泡于有机溶剂DMSO、模拟唾液或尿液中6小时后，测试经过不同严苛条件处理前后涂层的杀菌和抗细菌生物膜性能。结果显示，在经历上述严苛的处理后，实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层的杀菌活性依然保持在99％以上(见图7)，抗生物膜活性基本维持不变(见图8)。

试验8

为了评价抗菌涂层的生物相容性，将实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层(简称聚赖氨酸抗菌涂层)的硅胶片经过紫外线消毒灭菌1小时后，与空白硅胶片分别浸泡于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中浸提1天，获得抗菌涂层浸提液和空白浸提液。将小鼠成纤维细胞3T3按照3000个/孔的密度接种于96孔板中培养，待细胞贴壁后，加入浸提液继续在37℃、5％二氧化碳培养箱内孵育，培养24小时、48小时和72小时后利用MTT检测两组细胞的增殖活力，结果如图8所示。结果表明，使用抗菌涂层浸提液培养小鼠成纤维细胞3T3 24小时、48小时和72小时后，细胞存活率均在95％以上，表明该抗菌涂层具有良好的细胞相容性(见图9)。

根据ISO 10993-4：2017(E)，通过溶血试验确定抗菌涂层的血液相容性。将新鲜的兔血用生理盐水按4：5的体积比稀释，并将实施例2中固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层的硅胶片浸入装有2mL生理盐水的试管中，该试管事先在37℃下温育72小时，以空白硅胶片作为对照组。然后将40μL稀释的血液添加到试管中，并将混合物在37℃下孵育60分钟。同时分别使用生理盐水和去离子水作为阴性和阳性对照。最后，将所有试管以3000rpm离心5分钟，并通过UV/vis光谱仪测量上清液，以记录540nm的光密度(OD)。使用下述方程计算溶血率。如图10所示，硅胶片表面修饰固定有聚赖氨酸的相转变牛血清白蛋白抗菌涂层(简称聚赖氨酸抗菌涂层)所致的溶血率低于5％，显示出良好的血液相容性。

Claims

1.一种可有效固定阳离子抗菌剂且抗细菌生物膜的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述涂层是将待改性材料在浸渍液中浸泡后，在待改性材料表面形成的一层薄膜；

2.根据权利要求1所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述等电点为1～7能够被所述还原剂还原的蛋白质包括乳铁蛋白、α-乳白蛋白、胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、β-乳球蛋白、纤维蛋白原、α-淀粉酶、辣根过氧化物酶、胃蛋白酶中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述的阳离子抗菌剂包括天然或人工合成的阳离子抗菌肽、季铵盐类抗菌剂、烷基双胍类杀菌剂、芳基双胍类杀菌剂、聚合双胍类杀菌剂中的任意一种或多种。

4.根据权利要求3所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述的天然或人工合成阳离子抗菌肽由10～100个氨基酸残基构成，具有净正电荷。

5.根据权利要求3所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述的季铵盐类抗菌剂为苯扎氯铵、十六基卤化吡啶鎓、烷基三甲基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、双癸基二甲基氯化铵、双癸基二甲基溴化铵、十四烷基-2-甲基吡啶溴化铵、双癸基甲基羟乙基/羟丙基氯化铵中的任意一种或多种。

6.根据权利要求3所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述的烷基双胍类杀菌剂为十二烷基醋酸胍、阿立西定中的任意一种或两种；所述的芳基双胍类杀菌剂为醋酸氯已定、葡萄糖酸氯已定中的任意一种或两种；所述聚合双胍类杀菌剂为聚亚己基双胍、聚氨丙基双胍、聚六甲基双胍中的任意一种或多种。

7.根据权利要求2所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述pH为3～8的还原剂水溶液是将还原剂水溶液用NaOH调节pH值后获得，其中所述的还原剂包括三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和还原性谷胱甘肽中的任意一种或多种。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：所述浸渍液中，蛋白质的浓度为0.5～15mg/mL、阳离子抗菌剂的浓度为0.03～1g/mL、还原剂的浓度为1～15mg/mL。

9.根据权利要求1所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于所述待改性材料包括下述材料中任意一种：

(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金；

(2)无机材料：二氧化硅、二氧化钛、碳素材料、硅、二氧化钛、氧化钛、氮化钛；

(3)高分子材料：涤纶、聚乙烯醇、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚丙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸及其衍生物、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯；

(4)天然生物材料：可塑性淀粉基材料、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸钠、明胶；

(5)人工合成多肽类水凝胶材料：聚L-谷胺酸、聚L-赖氨酸。

10.根据权利要求1所述的生物友好型抗菌涂层，其特征在于：将待改性材料在浸渍液中浸泡的时间为1～180分钟，浸泡温度为10～50℃。