KR101465866B1 - 항균성 및 방오성을 갖는 생체적합성 phema 유도체/은 나노 복합체 - Google Patents

Abstract

본원은 고분자로 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트 및 은을 포함하는, 고분자-은나노 복합체 및 그 제조방법을 개시한다. 본원의 생체 적합성 고분자-은나노 복합체는 항균성, 방오성 및 생체적합성이 우수하여, 항균 방오가 필요한 생체의료 물질, 코팅재료, 필름 등 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 제조 공정 또한 별도의 가교과정이 필요없어 공정의 면에서도 편리성이 증대된다.

Description

항균성 및 방오성을 갖는 생체적합성 PHEMA 유도체/은 나노 복합체{Nanocomposite of Biocompatible PHEMA derivatives/Ag having antibacterial and antifouling activity}

본원은 생체적합성 PHEMA 유도체/은 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

산업 및 의학계에 있어, 재료 등이 박테리아에 오염 혹은 감염됨으로써 제품의 효능이 저하될 뿐만 아니라 생명의 위협이 있을 수 있다. 박테리아는 산업 재료 혹은 생체 재료의 표면에 붙어 군집을 이루어 쉽게 생체 필름을 형성하는 경향이 있다. 이러한 박테리아 생체 필름은 싱크대 배수구나 열전달 장비 등에서 자주 나타나며, 또한 식품가공 시스템 혹은 임플란트 등의 생체의학 재료에서 많이 발견되고 있다. 이러한 이유로 박테리아 제거와 더불어 박테리아의 표면 부착을 막는 것이 산업계와 의학계적 측면에서 매우 중요한 과제로 인식되고 있다.

따라서 박테리아의 표면 부착을 막기 위한 많은 연구들이 진행되어 왔는데, 크게 두 가지 방법을 통하여 표면에 방오성을 부여하고자 하였다. 첫 번째는 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 방오성 재료를 표면에 고정시키는 방법이다. 그러나 이는 박테리아 표면 부착을 막는다는 점에서 효과적이지만 이미 표면에 부착된 박테리아에 의해 만들어진 생체 필름을 제거할 수 없어 지속적인 면에 있어 한계가 있다. 두 번째는 4차 암모늄(quaternary ammonium compounds, QAC)과 같은 항생제나 금속을 표면에 도입하는 것이다. 그러나 이 방법도 항생제가 박테리아를 죽일 수는 있으나, 박테리아의 부착을 막을 수는 없다. 즉, 상기 방법들은 방오성과 항균성을 동시에 지니고 있지는 못하다.

산업 재료 혹은 생체 재료에 사용되는 생체 적합성 고분자를 이용하여 방오성 및 항균성을 확보하고자 하는 시도가 있었다.

TCPS(tissue cell polystyrene)는 생체적합성 재료로서 상업적으로 많이 이용되고 있는데 우수한 세포부착성과 증식이라는 장점을 가지고 있으나 박테리아 부착을 방지하는 면에서 부족한 점이 많다.

PHEMA(poly (2-hydroxyethyl methacrylate))는 뛰어난 생체적합성 및 박테리아 방오성 그리고 세포독성이 없는 고분자이나, 표면에 세포의 부착과 증식이 제한적으로 일어나는 단점을 가지고 있다. 또한 PHEMA의 고분자 측쇄 말단에 히드록시기가 있어서 친수성이 크므로 필름 형성 특성이 좋지 않으며 물 속에서의 장기 안정성이 매우 떨어진다. 안정성을 증가시키기 위해서는 가교(crosslinking)과정을 더 거치면 안정성이 증가하긴 하나, 별도의 가교 공정이 더 필요하게 되는 단점이 있다.

한편, 은나노 입자는 기존 산업계에서 널리 쓰이고 있는 항균성 재료로써 광범위한 종류의 미생물들을 비활성화시킬 수 있다. 그러나 은 나노입자는 세포에 대해 독성이 존재하는 문제점이 있기 때문에 이를 없애거나 감소시키는 것이 요구된다.

한국 공개 특허 제2011-0017180호에는 나노크기의 은 입자를 함유하여 항균성, 살균성을 부여하는 동시에 내구성을 향상시키는 경화성 수지 조성물이 개시되어 있다.

한국 공개 특허 제2009-0074010호에는 은나노를 포함하여 항균 방식의 기능을 갖춘 강관용 도료 조성물 및 그 제조방법에 대하여 개시되어 있다.

이에, 세포 독성이 낮으면서도 항균성 및 방오성을 지녀 박테리아 부착을 막을 수 있는 필름을 실현하기 위하여, 생체적합성 고분자에 적당한 농도의 은 나노 입자를 적용한 복합재료의 발명이 필요하다. 특히 복잡하지 않고 간단한 공정을 통해 제작되며, 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 동시에 갖춘 생체적합성 고분자/은나노 복합체에 대해서는 개시된 바 없다.

본원은 항균성, 방오성 및 생체적합성을 가진 생체적합성 고분자/은나노 복합체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 고분자로 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시) 에틸메타크릴레이트 및 은을 포함하는, 고분자-은나노 복합체를 제공한다. 일 양태에서 상기 고분자는 약 85 내지 99 중량%, 상기 은은 약 0.001 내지 5 중량 %를 함유할 수 있다. 본원에 사용될 수 있는 은은 일 구현예에서, 환원된 은으로, 상기 은은 상기 고분자에 혼입되어 존재한다.

다른 양태에서 본원은 생체 적합성 고분자인 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트 및 은 화합물의 혼합물 용액을 기질에 코팅하는 단계; 및 상기 코팅된 혼합물에 전자선, 광 조사 또는 열을 처리하여 상기 은 화합물을 환원시키는 단계를 포함하는 제 1 항에 따른 고분자-은나노 복합체의 제조방법을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 은 화합물이 과염소산은, 질산은, 또는 탄산은이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 광은 근자외선, 자외선 또는 감마선이 사용될 수 있다.

본원의 방법에 따른 일 구현예에서 열처리는 약 80℃ 내지 120℃의 온도에서 수행된다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 고분자 필름을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 코팅재료를 제공한다.

또다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 생체 의학 재료를 제공한다.

본원의 생체 적합성 고분자/은나노 복합체는 항균성, 방오성 및 생체적합성이 뛰어나고, 또한 물 속에서도 안정성이 증대된 것으로, 생체 의학 재료 등으로 폭넓게 사용될 수 있다.

또한 본원의 생체 적합성 고분자/은나노 복합체는 별도의 가교(crosslinking) 과정을 필요로 하지 않아, 제조 공정의 면에서도 편리성이 증대된다. 본원에 사용된 PHEMAAA는 환원된 은나노 입자들이 응집되지 않게 하는 역할을 하므로, 별도의 가교과정없이도 표면안정성을 지닌다.

또한 복합체 중 은나노 입자의 분산성 역시 매우 우수하여 항균 특성이 제대로 발휘되도록 한다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 실시예 1 및 2의 PHEMAAA/은나노 복합체의 개략도이다.
도 2는 환원과정을 거치기 전 단계의 PHEMAAA/과염소산은 혼합물(a), 본원의 일 구현예에 따른 자외선(UV) 환원을 거친 PHEMAAA/은나노 복합체(b) 및 상기 복합체의 표면을 물에서 모습(c)을 FE-SEM(field emission scanning electron microscopy)을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 환원과정을 거치기 전 단계의 PHEMAAA/과염소산은 혼합물, 본원의 일 구현예에 따른 자외선(UV) 환원을 거친 PHEMAAA/은나노 복합체 및 열처리 환원을 거친 PHEMAAA/은나노 복합체의 표면분석을 위하여 XPS로 필름의 표면 상태를 측정한 XPS스펙트럼 결과이다.
도 4a 및 4b는 PS(polystyrene), PHEMAAA 및 본원의 일 구현예에 따른 PHEMAAA/은나노 복합체(UV 처리)에 부착된 녹농균과 포도상 구균 (4a) 및 S. epidermidis(ATCC 12228) (4b) 에 대한 효과를 CLSM로 촬영한 결과로, 초록 및 적색은 각각 살아있는 박테리아 및 사멸된 박테리아를 나타낸다.
도 5는 PHEMAAA 및 본원의 일 구현예에 따른 PHEMAAA/은나노 복합체(UV 처리)의 녹농균과 포도상구균에 대한 항균효과 측정 결과를 나타낸다.
도 6는 TCPS, PHEMAAA 및 본원의 일 구현예에 따른 PHEMAAA/은 나노 복합체(UV 처리)의 MTT assay로 얻은 미토콘드리아 대사활동(a), 그리고 중성 적 분석에서 얻은 인간진피세포의 세포소멸 활성도(b)를 나타낸다.
도 7은 TCPS, PHEMAAA 및 본원의 일 구현예에 따른 PHEMAAA/은 나노 복합체(UV 처리)의 TUNEL 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 TCPS, PHEMAAA 및 본원의 일 구현예에 따른 PHEMAAA/은 나노 복합체(UV 처리)의 세포 성장에 대한 정량 분석 결과를 나타낸다. TCPS (tissue culture polystyrene).

본원은 본원의 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체가 항균성, 방오성, 생체 적합성 및 안정성 모두를 가지고 있다는 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 생체 적합성 고분자 85 내지 99 중량% 및 은 나노입자 0.001 내지 5 중량 %를 함유하는 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체에 관한 것이다.

본원의 “생체 적합성”은 장기간에 걸쳐 생체에 악영향을 나타내지 않고 원래의 기능을 다하면서 생체와 공존할 수 있는 재료의 속성을 의미한다.

본원에 포함되는 생체 적합성 고분자는 폴리아크릴산, 폴리아크릴산 유도체 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 합성 고분자이다. 본원에 따른 일 구현예에서, 생체 적합성 고분자는 폴리아크릴산 유도체 예를 들면 에스테르 유도체, 아마이드 유도체 등을 들 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트(PHEMAAA)이 사용된다.

본원에 따른 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트)는 에스테르기를 가진 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA)의 유도체로서, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)와 아세톡시 아세틸 클로라이드의 간단한 합성을 통하여 수득될 수 있다. 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)보다는 낮은 친수성 및 낮은 유리전이온도를 지닌다. PHEMA의 경우 고분자 측쇄 말단에 -OH기가 있어서 높은 친수성으로 필름 형성 특성이 좋지 않으며 물 속에서의 장기 안정성이 매우 떨어지는 물질로, 본원에 따른 PHEMAAA는 이와 비교하여 낮은 친수성 및 낮은 유리전이온도를 지녀 안정성이 뛰어나다.

본원의‘은’입자는 항균성을 지니고 있으며, 은 화합물로부터 유리되어 상기 생체적합성 고분자와 더불어 복합체를 이루게 되는 원소이다. 자외선 또는 열처리에 의해 은이온이 환원되어 사용된다.

본원에서, “복합체 (composite)”는 두 종류 이상의 물질이 다양한 화학적 및/또는 물리적 결합에 의해 회합되어 있는 것을 말한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 도 1에 도시된 바와 같이 금속의 은이 폴리머 메트릭스, 즉 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트에 혼입(embedded)되어 있는 것이다.

본원에서 “나노 복합체”는 복합체를 이루는 두 종류 이상의 물질 중 하나 이상이 나노 크기를 갖는 복합체로, 정의는 하기를 참조할 수 있다: the International Union of Pure and Applied Chemistry's Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). 본원에 따른 일 구현예에서 나노 입자의 크기는 약 1 내지 약 100 nm, 특히 약 7 내지 약 100 nm, 더욱 특히 약 1 내지 약 50 nm, 더더욱 특히 약 1 내지 25 nm이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체에서, 생체 적합성 고분자는 전체 복합체에 대하여 약 85 ~ 99 중량%이고, 바람직하게는 약 90 ~ 96 중량%이다. 은 입자의 함량은 0.001 ~ 5 중량 %이다.

다른 양태에서, 본 발명은 금속 나노입자를 폴리머 중에서 직접 "in situ"로 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 생체 적합성 고분자 및 은 혼합물 용액을 기질 (substrate) 예를 들면 유리, 실리콘, 각종 고분자 표면, 섬유, 종이, 금속을 포함하는 기질에 코팅하는 단계(단계 1) 및 상기 단계 1의 혼합물에 광을 조사 또는 열처리하여 은을 환원시키는 단계(단계 2)를 포함하는, 상기 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

상기 단계 1에서 코팅은 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 수평원심주조법(spin-casting)을 이용할 수 있다. 수평원심주조법은 회전하는 원통 주형 내에 혼합물을 넣고 적절한 속도 예를 들면 약 300 내지 3000 rpm으로 회전시켜 원심력에 의하여 몰드(mold)하는 것을 말한다. 회전 시간은 적절하게 조절될 수 있으며 약 10초 내지 5분간, 바람직하게는 약 20초 내지 1분간 회전시킬 수 있다. 사용될 수 있는‘은 화합물’에는 염류와 콜로이드 상이 있으며, 초산은, 과염소산은 등이 사용될 수 있다. 상기 혼합물 용액에 사용되는 용매로는 불활성용매를 사용하며 예를 들면 THF(tetrahydrofuran) 등이 사용될 수 있다.

상기 단계 2의 환원반응은 통상 2 가지 방법을 이용될 수 있다. 하나는 다양한 광에너지를 이용할 수 있는데, 예를 들면 근적외선, 근자외선, 자외선, 가시광선, 감마선, 전자선 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 자외선을 이용할 수 있다. 광에너지는 적절한 시간 예를 들면 약 2 내지 10시간 동안 조사할 수 있으며, 조사는 약 5 내지 20cm 떨어진 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 하나는 열처리를 이용한 환원 반응이다. 열처리 온도는 90℃ 내지 99℃의 온도에서 이루어 질 수 있다.

이러한 환원반응에 의하여 1가 은이온(Ag⁺)이 환원은(Ag⁰)으로 된다.

또다른 양태에서, 본원은 상기 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체를 이용하여 제조된, 항균성, 박테리아 방오성 및 생체 적합성을 지닌 고분자 필름에 관한 것이다. 상기 고분자 필름은 두께가 0.25 mm(1/100 inch)이하의 비섬유형 평판상의 플라스틱 성형물을 말한다.

또다른 양태에서, 본원은 상기 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체를 이용하여 제조된, 항균성, 박테리아 방오성 및 생체 적합성을 지닌 코팅 재료에 관한 것이다.

또다른 양태에서, 본원은 상기 생체 적합성 고분자/은 나노 복합체가 혼합되어 제조된, 항균성, 박테리아 방오성 및 생체 적합성을 지닌 생체 의학 재료에 관한 것이다. 상기 ‘생체 의학 재료’는 생체 내외에서 혈액, 체액 또는 생체 조직과 접촉할 때 생체의 거부반응이나 생체에 이상 반응없이 의도된 기능을 수행할 수 있도록 고안된 의료용 목적으로 사용되는 물질을 말한다. 좁게는 생체의 상호작용없이 생체의 기능을 대체 또는 보완하기 위하여 생체 내에 이식될 수 있는 재료를 말한다. 임플란트 재료, 생체 센서, 조직 공학 등에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 은-나노복합체 제조

PHEMAAA는 다음과 같이 제조하였다. PHEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate))를 피리딘에 용해하였다. PHEMA에 대해 1.5 당량의 아세톡시 아세틸 클로라이드를 THF (tetrahydrofuran)에 녹인 후 위의 것에 적하한 후 50℃에서 12시간동안 반응시켰다. 50% 메탄올 1ml에 세척 한 후 이를 클로로포름에 녹여 메탄올에 침전시켜 분리해내었다.

먼저, 실리콘 웨이퍼를 피라냐 용액(piranha solution, 70 부피% 황산과 30 부피% 과산화수소)으로 세척한 후, 3시간 동안 질소흐름에서 건조시켰다. 그 후 PHEMAAA 95%와 과염소산은 5%를 섞어 혼합물을 만들고 이를 THF에 1중량 %로 녹였다. 이를 수평원심주조법(spin-casting)을 이용하여 실리콘 웨이퍼에 3000rpm으로 30초간 분사하였다. 이를 통해 제조된 필름을 진공상태에서 12시간동안 상온을 유지하며 건조시켰다.

이어, 제조된 필름을 하기 자외선 조사 및 열처리의 두 가지 방법을 이용하여 환원시켰다. 첫 번째 방법은 제조된 필름에 자외선을 9cm 떨어진 곳에서 3 시간 동안 조사함으로써, PHEMAAA/과염소산은 혼합물을 환원시켜 PHEMAAA/은나노 복합체를 얻었다.

두 번째 방법은 제조된 필름을 3시간 동안 95 ℃에서 정치하여 PHEMAAA/과염소산은 혼합물을 환원시켜 PHEMAAA/은나노 복합체를 얻었다.

이어, PHEMAAA/과염소산은 혼합물과 상기와 같이 제조된 PHEMAAA/은나노 복합체의 표면 형태(morphology)를 FE-SEM(field emission scanning electron microscopy, SUPRA 55VP (Carl Zeiss, Germany))을 통해 확인하였다. 그 결과 도 2 의 (a)에 나타난 바와 같이, PHEMAAA/과염소산은 혼합물을 환원처리 전임에도 불구하고 자가환원 또는 과염소산은의 뭉침이 일어나면서 균일하게 나노입자들이 분포된 표면을 나타내었다. 반면, 도 2의 (b)에 나타난 바와 같이, PHEMAAA/은나노 필름 또한 균일한 은나노 입자들이 뭉침없이 표면에 균일하게 분산되어 있는 형태를 보였다. 또한 도 2의 (c)에 나타난 바와 같이, 물 속에서도 필름의 표면이 손상되지 않고 안정하게 유지된다는 것을 알 수 있어, 물 안에서의 안정성도 확인할 수 있었다.

더욱 자세한 표면분석을 위하여, XPS(X-ray photoelectron spectroscopy, Sigma Probe, Thermo Scientific, U.K.)로 필름의 표면 상태를 측정하였다. 도 3의 그래프는 환원 전의 PHEMAAA/은나노 혼합물(a), 자외선을 이용하여 3시간 동안 환원한 PHEMAAA/은나노 복합체(b) 및 열처리를 이용하여 3시간 동안 환원한 PHEMAAA/은나노 복합체(c)를 비교한 XPS스펙트럼이다. 은나노 입자의 3d 피크 이동과 1가 은이온(Ag⁺)과 환원은 (Ag⁰)의 표면에 대한 결합에너지(binding energy)를 비교한 것이다. 우선 PHEMAAA/과염소산은 혼합물을 자외선 또는 열 환원처리과정을 거친 두 PHEMAAA/은나노 복합필름의 은 3d5/2 피크에서의 결합에너지를 비교해 보았을 때, 368.2eV에서 358.5, 358.4eV로 더 높아진 것을 볼 수 있다. 이는 Ag⁺에서 Ag⁰로 환원되었다는 것을 증명해준다. 또한 3d_{5 / 2}피크와 3d3/2피크 사이 간격이 6eV로 나타난 것 역시 Ag⁰를 나타낸다. 남아있는 염화 이온이 박테리아를 막는 역할을 했을 수도 있으나, 염화 이온에 대한 피크는 나타나지 않았다.

실험예 1. 박테리아 부착 또는 방오성 조사

본원의 PHEMAAA/은나노 복합체가 박테리아가 표면에 부착되는 것을 막는 성질이 있다는 것을 확인하기 위해 박테리아 생존활성검사(live/dead bacterial viability test)를 녹농균, 표피포도상구균, 포도상구균 (각각 1×10⁸, 5×10⁷ , 1×10⁸ CFU) 세 종류의 균을 이용하여 조사하였다. 구체적으로 위 3 종류의 박테리아를 37℃에서 12시간동안 LB (Luria?Bertani)에서 배양하고 원심분리한 후 PBS로 세척하였다. 이어 각각의 박테리아를 1×10⁸, 5×10⁷ , 1×10⁸ CFU(colony forming unit)/mL로 희석하였다. 도 4에 기재된 바와 같은 3가지 시료를 1.2 cm×1.2 cm의 실리콘 웨이퍼에 코팅한 것을 각각의 박테리아 현탁액 2.5ml에 24시간동안 50rpm으로 흔들어주면서 25℃에서 침지하였다. 하루 후에 이 시료를 3차 증류수로 조심스럽게 씻어주고, BacLight Live/Dead bacterial viability kit (L7012, Molecular probes, USA) 1.5 μL를 1ml의 증류수로 희석한 후 15분동안 암조건에서 각 박테리아를 염색하였다. 살아있는 박테리아는 초록색, 죽은 박테리아는 빨간색으로 염색된다. 이 때 표면 이미지는 confocal laser scanning microscopy (CLSM, Eclipse 90i, Nikon, Japan)로 확인하였다.

결과는 도 4a 및 b에 기재되어 있다. 도 4는 PS (poly styrene 음성대조군), PHEMAAA 및 실시예 1의 PHEMAAA/은나노 복합체 필름에 부착된 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 및 포도상구균(Staphylococcus aureus)들에 대한 CLSM(confocal laser scanning microscopy)촬영 이미지로, 여기에 나타난 바와 같이 본원의 PHEMAAA/은나노 복합체필름은 상기 3가지 박테리아에 대하여 방오성이 있음을 나타낸다. 도 4b에서 a) PS, b) PHEMAAA, c) PHEMAAA/Ag nanocomposite (3 h UV irradiation), 및 d) PHEMAAA/Ag nanocomposite (가열 3 h, 95℃)을 나타낸다 (5×10⁷CFU/mL의 농도로 25℃에서 24시간 동안 배양한 후 처리).

실험예 2. 항균성 검사

항균 효과를 보다 자세히 조사하기 위하여 10⁶ CFU/ml의 녹농균 및 포도상구균을 2시간 동안 PHEMAAA/은나노 복합필름에 도말한 후, 일정 시간 경과 후 부착된 박테리아의 수를 확인하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

우선 녹농균과 포도상구균을 각각 LB 아가배지와 NB(Nutrient Broth) 아가배지에 도말한 후, 이것을 37℃의 인큐베이터에서 18시간 동안 교반하면서 배양하였다. 그 후 하나의 박테리아 콜로니를 30ml의 액체배지에 접종하였다. 이어 상기 배양액을 인산 완충액(phosphate buffer, Potassium Dihydrogen Phosphate 0.2M, Sodium Carbonate 0.07M pH 7.1)을 이용하여 1 x 10⁶ CFU/ml로 희석하였다. 이 박테리아 현탁액을 고분자 샘플(25 x 25 mm²)(실시예 1에서 제조한 은-나노 복합체)에 떨어뜨린 후, PET 필름을 위에 붙혀서 박테리아가 균일하게 퍼지도록 하였다. 상온에서 3시간 후 필름을 떼어내고 계면활성제(Tween^® 20, 증류수에 (0.2 부피%)와 소거제(quenching agent, 14.6 중량% % 티오황산나트륨, 10.0 중량% % 티오글리콜레이트)를 1 : 0.025 부피비율로 포함하는 용액을 540㎕ 넣어 주어, 부착된 박테리아를 손실 없이 분리하고, 더 이상의 항균 활동을 막아주었다. 마지막으로 아가플레이트에 상기 박테리아를 도말한 뒤 37℃에서 18 시간 배양한 후, 콜로니의 수를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타나있는 바와 같이, 본원의 은-나노 복합체의 경우, 두 박테리아 모두 99.9% 제거되었고, 이는 자외선과 열처리했을 때 모두에서 나타난 결과이다. 이와 비교하여, 은이 포함되지 않은 PHEMAAA는 2시간 접촉 후 살아있는 박테리아의 수에 변함이 없었다.

실험예 3. 독성 검사 및 생체적합성검사

본 발명의 PHEMAAA/은나노 복합체를 생체의학분야에 적용시킬 수 있는지 확인해보기 위하여 하기 6 가지 검사, 즉 i) 미토콘드리아 대사활성도 분석(MTT 분석(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), ii) 중성 적 분석(neutral red assay), iii) TUNEL 분석(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling), iv) 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction), v) 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석 및 vi) 세포성장분석을 수행 하였다.

위의 6 가지 검사들은 모두 다음 과정을 기본으로 시작하였다. 우선 인간 진피세포(human dermal fibroblast)를 TCP(tissue culture polystyrene), PHEMAAA, 또는 PHEMAAA/은나노 복합필름에 시딩한 후 10%(v/v) 소단백질(fetal bovine serum)과 1% (w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 둘배코 변형 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM)에서 배양하였다.

(i) MTT assay

먼저 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석를 실시하여 인간진피세포의 미토콘드리아 대사 활동 확인을 통한 세포에 대한 독성 여부를 확인 하였다. MTT 용액(2mg/ml in PBS)을 인간진피세포에 넣어 37℃에서 4시간동안 배양했다. 그리고 디메틸설폭사이드로 대체하여 포마잔 크리스탈(formazan crystal)을 녹였다. 같은 온도에서 흔들면서 30분간 더 배양시키고 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 미토콘드리아 대사활동은 PS 그룹(TCPS)에 대한 흡광도 %로 결정하였다.

(ii) 중성 적색염색제(neutral red) 분석

중성 적색 분석은 인간진피세포의 활성도(viability)를 평가하기 위해 실시되며, 활성도는 중성 적색염색제(3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride)의 흡수 정도를 기준으로 결정된다. 인간진피세포는 PBS로 세척후 50 ㎍/ml의 염색제를 포함하는 DMEM에서 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. DMEM을 제거한 후 1 %(v/v) 아세트산과 50%(v/v) 에탄올을 혼합한 용액을 추가하여 염색제를 추출했다. 5분 후에 상온에서 배양한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

MTT 분석 및 중성 적색염색제 분석 결과는 도 6에 나타나 있다. 이에 나타난 바와 같이 PHEMAAA/은 나노 복합체는 세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며, 세포활성도에 미치는 영향도 일반적으로 많이 사용되는 TCPS 및 PHEMAAA와 같은 수준을 나타내었다.

(iii) TUNEL 분석

인간진피세포에 미치는 세포사멸 활성을 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석을 통해 확인하였다. 인간진피세포를 PBS와 4%(v/v) 파라포름알데히드의 혼합용액에 고정시켜 10분 동안 상온에 정치하였다. 이어 에탄올과 아세트산(2:1) 혼합용액을 추가한 후 5분간 -20℃에서 고정시키고 세포사멸 검출 키트(ApopTag^® apoptosis Detection kit)를 제조자의 방법대로 사용하여 염색하였다. 세포는 4,6-디아미디노-2-페닐인돌로 대조 염색되며 콘포칼레이저 현미경 (CLSM, Eclipse 90i, Nikon, Japan, 400배) 으로 관찰 하였다. 그 결과, 도 7의 a,b,c에 나타난 바와 같이, PHEMAAA/은나노 복합필름의 경우, 세포사멸에 미치는 영향은 전체의 3% 보다 낮은 수치(붉은색)로 매우 적었다.

(iv) 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction)

실험예 3의 각각의 고분자샘플에서 키운 세포를 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 혼합하였다. 이어 클로로폼으로 세포의 RNA를 추출하고 80% 부피 중량의 isopropanol에 침전시켰다. 상청액(supernatant)을 제거하고 RNA를 75%에탄올로 씻고 건조시킨다. 0.1% diethyl pyrocarbonate로 처리된 물에 녹였다. 이어 5μg의 순수한 RNA와 SuperScript^TMIIreversetranscriptase(Invitrogen)을 이용하여 역전사를 제조자의 방법대로 수행하여 cDNA를 합성하고, 이를 하기의 조건을 이용하여 PCR로 증폭하였다: 변성 94℃, 30 sec; 어닐링 58℃, 45 sec, 신장 72℃, 45sec-35주기; 최종 신장 72℃, 45sec. PCR 결과물은 2%(w/v) 아가로스젤에서 전기영동을 통해 시각적으로 확인이 가능하며 이를 gel documentation system(Gel Doc 1000, Bio-Rad, Hercules, CA)를 통해 분석하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. 도 7d에서 알 수 있듯이, Bax, 및 p53이 3가지 시료 모두에서 검출되지 않았으며 이는 본원의 나노복합체가 독성이 없음을 나타내는 것이다. 본 발명에서는 RNA로부터 Bax, p53, PCNA와 같은 유전자를 분리하여 확인하였다. P53 은 세포주기를 조절하는 유전자로 DNA가 손상되었을 때 작동하여 세포주기를 멈추고 손상을 복구하도록 하거나, 아니면 아예 손상된 세포에 세포사멸을 유도한다. 따라서 p53이 손상된 경우, 암세포로 발전하게 된다. BAX는 세포사멸 관련 단백질인데 간단히 말하면 Bax가 많이 발현되면 세포의 사멸이 촉진된다.

PCNA([proliferating cell nuclear antigen)는 DNA 복제가 일어날 때 작용하는 DNA합성효소 일부분을 이루는 단백질로 PCNA는 증식하는 세포를 찾는 마커로 많이 이용된다.

반면 세포 증식활동과 관련있는 PCNA는 검출이 되었는데, 이는 복합체 필름이 세포의 증식을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.

(v) 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석

인간 피부 세포아섬유 (human dermal fibroblast)를 4%(v/v) paraformaldehyde에 25도에서 10분간 고정시킨 후, PBS로 세척하였다. PCNA( proliferating cell nucleus antigen)를 단클론 항체와 반응하였다 (1:100, Abcam, Cambridge, UK). 이어 세포가 부착된 상기 슬라이드를 로다민 컨쥬게이트 2차 항체(1:100, Jackson-Immunoresearch, West Grove, PA, USA)를 포함한 PBS에서 1시간동안 25℃에서 배양하였다. 핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 염색하였다.

(vi) 세포성장분석

세포 성장 분석을 위해 인간진피세포의 영양분으로 쓰였던 단백질을 트립신으로 분해, 제거하고 나서 2일 및 4일 후 혈구계수기(hemacytometer)로 그 수를 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 세 개의 샘플이 거의 동일한 결과를 나타냈으며, 이는 은-나노 복합체의 은이 세포 성장을 저해하지 않는다는 것을 나타낸다.

상기 실험예 1 내지 3을 통해 본원의 복합체가 항균성, 박테리아 방오성 및 생체적합성을 지녔다는 것을 알 수 있으며, 또한 물 속에서도 안정성을 지닌다는 것을 알 수 있다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

1. 고분자로 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트 및 환원된 은을 포함하며, 상기 환원된 은은 상기 고분자에 혼입되어 있는 것인, 고분자-은나노 복합체.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자는 85 내지 99 중량%, 상기 은은 0.001 내지 5 중량 %를 함유하는 것인, 고분자-은나노 복합체.
   
3. 삭제
4. 생체 적합성 고분자인 폴리(2-(2-아세톡시아세톡시)에틸메타크릴레이트 및 은 화합물의 혼합물 용액을 기질에 코팅하는 단계; 및
   상기 코팅된 혼합물에 전자선, 광 조사 또는 열을 처리하여 상기 은 화합물을 환원시키는 단계를 포함하며, 상기 환원된 은은 상기 고분자에 혼입되어 존재하는 것인 제 1 항에 따른 고분자-은나노 복합체의 제조방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 은 화합물이 과염소산은, 질산은, 또는 탄산은인 것을 특징으로 하는 생체 적합성 고분자/은나노 복합체의 제조방법.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 광은, 근자외선, 자외선 또는 감마선인 것을 특징으로 하는 생체 적합성 고분자/은나노 복합체의 제조방법.
   
7. 제 4 항에 있어서, 상기 열처리는 80℃ 내지 120℃의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 적합성 고분자/은나노 복합체의 제조방법.
   
8. 제 1 항의 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 고분자 필름.
   
9. 제 1 항의 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 코팅재료.
   
10. 제 1 항의 생체 적합성 고분자-은나노 복합체를 이용하여 제조된 항균성, 방오성 및 생체 적합성을 갖는 생체 의학 재료.

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