CN114681685B - 杂化蛋白涂层的制备方法、杂化蛋白涂层材料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了杂化蛋白涂层的制备方法、杂化蛋白涂层材料及应用，涉及生物材料技术领域。杂化蛋白涂层的制备方法包括：将基材置于含有至少两种蛋白的蛋白溶液中，在氧化剂存在的条件下反应形成涂层。将两种或多种蛋白在氧化剂存在的条件下在基材上形成杂化蛋白涂层，在涂层中蛋白二硫键被氧化成磺酸基团，改变了蛋白原来的二级结构，暴露出更多的亲疏水基团，蛋白通过自组装形成涂层，这种杂化涂层可以协同发挥蛋白各自的特异性性能。

Description

杂化蛋白涂层的制备方法、杂化蛋白涂层材料及应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及杂化蛋白涂层的制备方法、杂化蛋白涂层材料及应用。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者，蛋白质在各种生命活动中发挥特别重要的作用，是各种生命活动的终极控制者和首要执行者，几乎参与并影响生物体内所有生命活动。而不同蛋白具有不同的生理功能，如何将其稳定固定在材料表面并且发挥其生理功能一直是一个挑战性的难题。
现有蛋白改性工艺通过加入还原剂或有机试剂达到蛋白组装形成涂层的工艺，但是只能得到单一的蛋白涂层，并且得到的蛋白涂层难以保持蛋白质的生理功能。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，其能够在涂层中引入两种或多种蛋白，并保持蛋白质的生理功能。
本发明的第二目的在于提供一种杂化蛋白涂层材料，其表面存在两种或多种蛋白，且能够稳定发挥其生理功能。
本发明的第三目的在于提供上述杂化蛋白涂层材料在制备血液接触类器件中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括：
将基材置于含有至少两种蛋白的蛋白溶液中，在氧化剂存在的条件下反应形成涂层。
在可选的实施方式中，氧化剂在反应体系中的浓度为0.05-50mg/mL；优选为0.5-20mg/mL。
在可选的实施方式中，氧化剂选自过硫酸盐、高碘酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、无机过氧化物、硝酸盐和高锰酸盐中的至少一种；
优选地，无机过氧化物选自Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2和H2O2中的至少一种。
在可选的实施方式中，蛋白溶液中含有两种蛋白，且两种蛋白的摩尔比为0.01-10:1，两种蛋白在反应体系中的总浓度为0.001-10mmol/mL；
优选地，两种蛋白的摩尔比为0.5-5:1，两种蛋白在反应体系中的总浓度为0.01-5mmol/mL。
在可选的实施方式中，蛋白溶液中的蛋白种类选自血清白蛋白、溶菌酶、胃蛋白、胰岛素、α-乳清白蛋白、胶原蛋白、球蛋白、角蛋白、乳铁蛋白和纤维蛋白原中的至少两种；
优选地，蛋白溶液中的蛋白为血清白蛋白和溶菌酶。
在可选的实施方式中，控制反应温度为0-50℃，反应时间为2h以上；
优选地，控制反应温度为20-40℃，反应时间为2-96；
优选地，在反应完成之后，进行清洗、干燥。
在可选的实施方式中，基材选自金属材料、无机非金属材料、高分子材料、生物医用微纳米粒子、天然生物材料和人工合成多肽类水凝胶材料中的至少一种；
其中，生物医用微纳米粒子选自四氧化三铁纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、氧化钛纳米粒子和氧化锌纳米粒子中的至少一种；
天然生物材料选自可塑性淀粉基材料、明胶、胶原蛋白、透明质酸钠、纤维蛋白、海藻酸钠、琼脂糖、丝蛋白、角质蛋白、纤维素、半纤维素、木质素、甲壳素及其衍生物、动物来源的脱细胞组织和动物来源的器官中的至少一种；
人工合成多肽类水凝胶材料选自聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸中的至少一种。
在可选的实施方式中，金属材料选自不锈钢、钴基合金、钛及其合金、镍钛合金、铂及其合金、镁及其合金、铁及其合金和锌及其合金中的至少一种；
优选地，无机非金属材料选自氧化钛及其纳米管、碳素材料、硅、二氧化硅、羟基磷灰石、磷酸钙、氮化硅、碳化硅、硅铝酸盐、钙铝系、生物玻璃、羟基磷灰石、磷酸钙和氮化钛中的至少一种；
优选地，高分子材料选自涤纶、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚甲醛、聚碳酸酯、聚氨酯、碳共聚物、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醋酸乙烯酯、聚乳酸、乙交酯-丙交酯共聚物、聚三亚甲基碳酸酯、聚己内酯、聚羟基脂肪酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚酰胺、聚二(恶)烷酮、环氧树脂、硅橡胶、硅凝胶、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物和聚乙烯醇中的至少一种。
第二方面，本发明提供一种杂化蛋白涂层材料，由前述实施方式中任一项的制备方法制备而得。
第三方面，本发明提供前述实施方式的杂化蛋白涂层材料在制备血液接触类器件中的应用。
本发明具有以下有益效果：将两种或多种蛋白在氧化剂存在的条件下在基材上形成杂化蛋白涂层，在涂层中蛋白二硫键被氧化成磺酸基团，改变了蛋白原来的二级结构，暴露出更多的亲疏水基团，蛋白通过自组装形成涂层，这种杂化涂层可以协同发挥蛋白各自的特异性性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明所制备的硅橡胶表面沉积的牛血清白蛋白和溶菌酶杂化涂层的抗菌涂板实验；
图2为本发明所制备的硅橡胶表面沉积的牛血清白蛋白和溶菌酶杂化涂层的体内抗凝血实验。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
发明人通过加入氧化剂可以使两种或多种蛋白相互作用而沉积得到均匀的涂层，并且还能维持蛋白原有的生理功能，不用调节pH值，就能在金属、非金属、高分子等材料表面快速成膜。本发明实施例所提供的制备方法简便易行，具有很好的工业化应用前景。
本发明实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括：将基材置于含有至少两种蛋白的蛋白溶液中，在氧化剂存在的条件下反应形成涂层。在氧化剂的作用下，蛋白中的二硫键会被氧化成磺酸基团，改变了蛋白原来的二级结构，可以暴露出更多的亲疏水基团，蛋白可以通过自组装形成涂层。
蛋白的种类可以为两种或多种，氧化剂的种类也不限。
在一些实施例中，蛋白溶液中的蛋白种类选自血清白蛋白、溶菌酶、胃蛋白、胰岛素、α-乳清白蛋白、胶原蛋白、球蛋白、角蛋白、乳铁蛋白和纤维蛋白原中的至少两种，可以为两种的任意组合，也可以为多种的任意组合。在优选的实施例中，蛋白溶液中的蛋白为血清白蛋白和溶菌酶，通过优化蛋白的组合，便于形成最优的杂化蛋白涂层，协同发挥蛋白各自的特异性性能。
在一些实施例中，蛋白溶液中含有两种蛋白，且两种蛋白的摩尔比为0.01-10:1，两种蛋白在反应体系中的总浓度为0.001-10mmol/mL；优选地，两种蛋白的摩尔比为0.5-5:1，两种蛋白在反应体系中的总浓度为0.01-5mmol/mL。通过进一步控制两种蛋白的摩尔比以及浓度，有利于形成最优的涂层，更好地发挥蛋白各自的特异性性能。
具体地，两种蛋白的摩尔比可以为0.01:1、0.1:1、0.5:1、1:1、10:1等，也可以为以上相邻摩尔比值之间的任意值。
在一些实施例中，氧化剂选自过硫酸盐、高碘酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、无机过氧化物、硝酸盐和高锰酸盐中的至少一种；无机过氧化物选自Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2和H2O2中的至少一种。氧化剂可以为一种或几种。
在一些实施例中，氧化剂在反应体系中的浓度为0.05-50mg/mL；优选为0.5-20mg/mL。通过进一步优化氧化剂的浓度，有利于形成最优的杂化蛋白涂层，充分发挥蛋白各自的特异性性能。
具体地，氧化剂在反应体系中的浓度可以为0.05mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL等，也可以为以上相邻浓度值之间的任意值。
在一些实施例中，控制反应温度为0-50℃，反应时间为2h以上；优选地，控制反应温度为20-40℃，反应时间为2-96。反应温度可以在较宽的范围内进行，反应时间在2h以上为宜，若低于2h部分种类的蛋白无法实现沉积。
具体地，反应温度可以为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等，也可以为以上相邻温度值之间的任意值；反应时间可以为2h、5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、95h、96h等，也可以为更长时间，也可以为以上相邻时间值之间的任意值。
在一些实施例中，在反应完成之后，进行清洗、干燥。具体地，清洗可以采用超声仪器进行，能够有效去除表面未粘附的蛋白，再用氮气吹干，即可获得目标杂化蛋白涂层。
基材可以为人类所知的任何几何形状和材质的固体材料，在此不做限定。
在一些实施例中，基材选自金属材料、无机非金属材料、高分子材料、生物医用微纳米粒子、天然生物材料和人工合成多肽类水凝胶材料中的至少一种，可以为一种，也可以为多种形成的复合材料。
其中，金属材料选自不锈钢、钴基合金、钛及其合金、镍钛合金、铂及其合金、镁及其合金、铁及其合金和锌及其合金中的至少一种。
其中，无机非金属材料选自氧化钛及其纳米管、碳素材料(C)、硅、二氧化硅、羟基磷灰石、磷酸钙氮化硅(Si3N4)、碳化硅(SiC)、硅铝酸盐(Na2O·Al2O3·SiO2)、钙铝系(CaO·Al2O3)、生物玻璃(SiO2·CaO·Na2O·P2O5)、羟基磷灰石、磷酸钙和氮化钛等无机材料中的至少一种。具体地，钙铝系是指CaO和Al2O3形成的复合材料。
其中，高分子材料选自涤纶(PET)、聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯(PU)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯醇(PVALC)、聚丙烯(PP)、聚甲醛(POM)、聚碳酸酯(PC)、聚氨酯(PU)、碳共聚物(PDC)、聚乙醇酸(PGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚乳酸(PLA)、乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)，聚己内酯(PCL)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酰胺(PA)、聚二(恶)烷酮(PDS)、环氧树脂(Epoxy)、硅橡胶、硅凝胶、聚丙烯酸(PAA)及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、聚乙烯醇(PVA)等高分子材料中的至少一种。
其中，生物医用微纳米粒子选自四氧化三铁纳米粒子、(介孔)二氧化硅纳米粒子(量子点)、氧化钛纳米粒子(量子点)和氧化锌纳米粒子(量子点)中的至少一种。
其中，天然生物材料选自可塑性淀粉基材料(PSM)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)、透明质酸钠(sodium hyaluronate)、纤维蛋白(fibrous protein)、海藻酸钠(sodium alginate)、琼脂糖(agarose)、丝蛋白、角质蛋白、纤维素、半纤维素、木质素、甲壳素及其衍生物、动物来源的脱细胞组织和动物来源的器官中的至少一种，器官可以为血管、瓣膜、心脏、骨、肺、韧带、膀胱、粘膜、角膜等。
其中，人工合成多肽类水凝胶材料选自聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸中的至少一种，可以为一种，也可以为两种原料形成的复合材料。
本发明实施例提供一种杂化蛋白涂层材料，由上述制备方法制备而得，其具有两种或多种蛋白，且能够协同发挥蛋白各自的特异性性能，可以进一步制备形成血液接触类器件。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用洁净硅橡胶片材，在其表面先加入过硫酸钠溶液，再加入牛血清白蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在37℃孵箱中反应20h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为1mg/mL，牛血清白蛋白的浓度为0.035mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.035mmol/mL。
(2)超声清洗20s，然后用超净水清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例2
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用洁净PVC片材，在其表面先加入过硫酸钾溶液，再加入牛血清白蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在37℃孵箱中反应24h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钾的浓度为2mg/mL，牛血清白蛋白的浓度为0.05mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.05mmol/mL。
(2)超声清洗30s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例3
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用硅片，在其表面先加入K2O2溶液，再加入浓度为羊血清白蛋白溶液，最后加入浓度为溶菌酶溶液，放置在4℃孵箱中反应48h，溶剂为超净水，控制反应体系中K2O2的浓度为50mg/mL，羊血清白蛋白的浓度为0.1mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.2mmol/mL。
(2)超声清洗30s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例4
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)用洁净硅橡胶片材，在其表面先加入过硫酸钾和过硫酸钠溶液，再加入牛血清白蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在4-50℃孵箱中反应2h，溶剂为超净水，控制反应体系过硫酸钠的浓度为和就硫酸钾浓度为50mg/mL，牛血清白蛋白的浓度为0.83mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.83mmol/mL。
(2)超声清洗30s，然后用超净水清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例5
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用聚氨酯片材，在其表面先加入过硫酸钠溶液和高碘酸钠，再加入兔血清白蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在25℃孵箱中反应10h。溶剂为超净水，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为40mg/mL，高碘酸钠的浓度为20mg/mL，兔血清白蛋白的浓度为1mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.5mmol/mL。
(2)超声清洗30s，然后用超净水清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例6
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用316L SS不锈钢圆片，在其表面先加入高碘酸钠溶液，再加入α-乳清白蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在30℃孵箱中反应36h，溶剂为超净水，控制反应体系高碘酸钠的浓度为20mg/mL，α-乳清白蛋白的浓度为1mmol/mL，溶菌酶的浓度为2mmol/mL。
(2)超声清洗15s，然后用超净水清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例7
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用TiO2薄片，在其表面先加入过硫酸钠溶液，再加入α-乳清白蛋白溶液，最后加入牛血清白蛋白溶液，放置在40℃孵箱中反应8h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为50mg/mL，α-乳清白蛋白的浓度为2mmol/mL，牛血清白蛋白的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗20s，然后用超净水清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例8
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用TiO2薄片，在其表面先加入过硫酸钠溶液，再加入胰岛素溶液，最后加入牛血清白蛋白溶液，放置在50℃孵箱中反应6h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为50mg/mL，胰岛素的浓度为5mmol/mL，牛血清白蛋白的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例9
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用PVC，在其表面先加入过硫酸钾溶液，再加入胰岛素溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在5℃孵箱中反应30h，溶剂为超净水，控制过硫酸钾的浓度为50mg/mL，胰岛素的浓度为2.5mmol/mL，溶菌酶的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例10
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用玻璃，在其表面先加入过硫酸钠溶液和K2O2溶液，再加入胰岛素溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在30℃孵箱中反应20h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为50mg/mL，K2O2的浓度为10mg/mL，控制胰岛素的浓度为2.5mmol/mL，溶菌酶的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗15s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例11
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用PVC，在其表面先加入过硫酸钾溶液，再加入乳铁蛋白溶液，最后加入牛血清白蛋白溶液，放置在30℃孵箱中反应10h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钾的浓度为50mg/mL，乳铁蛋白的浓度为1.5mmol/mL，牛血清白蛋白的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗25s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例12
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用聚氨酯片材，在其表面先加入过硫酸钠溶液，再加入乳铁蛋白溶液，最后加入溶菌酶溶液，放置在30℃孵箱中反应15h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钠的浓度为50mg/mL，乳铁蛋白的浓度为0.5mmol/mL，溶菌酶的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗30s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
实施例13
本实施例提供一种杂化蛋白涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用PVC，在其表面先加入过硫酸钾溶液和过硫酸钠溶液，再加入胰岛素溶液，再加入溶菌酶溶液，最后加入牛血清白蛋白放置在30℃孵箱中反应30h，溶剂为超净水，控制反应体系中过硫酸钾的浓度为20mg/mL，过硫酸钠的浓度为40mg/mL，胰岛素的浓度为0.5mmol/mL，溶菌酶的浓度为0.5mmol/mL，控制牛血清白蛋白的浓度为1mmol/mL。
(2)超声清洗10s，然后用超净水清洗三次，最后用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境下保存。
对比例1与实施例1的区别仅在于：不加入溶菌酶。
基材选用硅橡胶，控制牛血清白蛋白的浓度为0.07mmol/mL，氧化剂过硫酸钠1mg/mL在37℃反应12h。超声清洗5s取出，然后用纯净水清洗三次。用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境备用。
对比例2与实施例1的区别仅在于：不加入牛血清白蛋白。
基材选用硅橡胶，控制溶解酶浓度为0.07mmol/mL，氧化剂过硫酸钠1mg/mL。在37℃反应12h。超声清洗3s取出，然后用纯净水清洗三次。用氮气吹去表面水分，放入37℃干燥环境备用。
试验例1
对实施例1、对比例1、对比例2和未改性硅橡胶表面进行抗菌涂板实验，结果如图1所示。详细步骤如下：
1.样品准备：将所有样品、培养皿、PE膜(疏水性好的柔性聚合物材料，用于覆盖在菌液上面防止水分蒸发)中紫外灯下灭菌30min。随后按使用说明配置固体培养基和液体培养基，并使用高压蒸汽锅灭菌。
2.细菌活化：在超净工作台上，利用细菌接种环从斜面菌种中取出一环细菌，并将其放入放入无菌液体培养基里。在37℃孵箱中孵育24h。即可得到活化后的细菌。
3.细菌培养：首先将配置好固体培养基进行灭菌，得到熔融状液体后，在超净工作台里，将其倒入无菌培养皿里进行冷却固化。随后使用接种环取一环活化细菌，并根据分区划线分离法在固化后的培养基表面划线。最后将培养皿倒置放入37℃孵箱中孵育24h。
4.细菌纯化及营养液制备：配置液体培养基高温灭菌，待其冷却后，放入无菌环境中备用。使用接种环从细菌培养皿里取出单克隆菌落于液体培养中，放入37℃孵箱中孵育24h，即得到纯化细菌。营养液选用液体培养基并用生理盐水稀释，其中大肠杆菌营养液稀释500倍，表皮葡萄球菌营养液稀释100倍。
5.样品表面接种细菌：营养液稀释纯化菌液大约10000倍后，可获得浓度为5.0×105～1.0×106CFU/mL的菌液(可用分光光度计600nm波长下检测)。随即在无菌工作台上，将灭好菌的样品置于24孔板中，并在每个样品表面滴加稀释后的100uL菌液,使用枪头将菌液覆盖于整个涂层表面，切忌不要使菌液从样品表面滴落，随后用干净PE膜覆盖在样品上。放入37℃孵箱中孵育24h。
6.平板培养：配置固体培养基并灭菌完成后，在洁净工作台里将其倒入培养皿里冷却凝固。在每个样品里加入1ml生理盐水，并用移液枪反复吹打，使细菌完全从样品表面和PE膜上脱落。随后吸取100μL菌液均匀涂覆至事先准备好的固体培养基上，37℃恒温孵育24h。最后拍照记录。
从图1可以看出，实施例1与对比例2涂层作为接触型抗菌，在大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和表皮葡萄球菌(革兰氏阳性菌)具备良好的杀菌效果。
试验例2
对实施例1、对比例1、对比例2和未改性硅橡胶表面进行抗凝实验，实验对象为新西兰白兔，结果如图2所示。
测试方法：样品制备：硅橡胶管剪取长度为8cm，内径为4mm，在用固定工艺依次制备涂层。将三通管，留置针等浸泡在肝素钠溶液(100u/ml)中10小时，然后将实验样品与三通管组装好。
动物麻醉：使用生理盐水配置30mg/ml的戊巴比妥溶液，充分溶解后使用滤器过滤除菌待用。在兔耳缘静脉注射麻药实施麻醉，剂量为1ml/kg。
样品介入：先使用手术器械剥离分开兔的颈部左侧静脉和右侧动脉，再使用留置针刺入颈静脉和颈动脉血管中，并利用缝合线将留置针与血管绑定，随后将组装好的样品先插入动脉血管一段，待其血液充满整个硅橡胶管内(切忌有空气进入)，再立即将其与静脉留置针连接。之后，时刻关注导管的颜色和温度变化。
从图2可以看出，实施例1蛋白涂层表现出良好的抗凝血功能。对照例1同样具备抗凝血功能。
将两种牛血清白蛋白和溶菌酶在过硫酸钠的作用下能构建出抗凝抗菌表面。
综上所述，本发明提供一种杂化蛋白涂层的制备方法、杂化蛋白涂层材料及应用，将两种或多种蛋白在氧化剂存在的条件下在基材上形成杂化蛋白涂层，具备以下优点：
(1)实验操作简单，容易实现，原材料容易获得，且蛋白涂层具有较好的生物相容性；
(2)可广泛应用于生物医用材料的表面改性，还可适用于任意材料表面改性；
(3)在材料表面改性后而得到蛋白特异性的生理功能，通过控制氧化剂和蛋白相互的摩尔量配比制备出性能优异的涂层。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种杂化蛋白涂层的制备方法，其特征在于，包括：
将基材置于含有至少两种蛋白的蛋白溶液中，在氧化剂存在的条件下反应形成涂层；
所述蛋白溶液中的蛋白为血清白蛋白和溶菌酶；两种蛋白的摩尔比为0.5-5:1，两种蛋白在反应体系中的总浓度为0.01-5mmol/mL；
所述氧化剂选自过硫酸盐、高碘酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、无机过氧化物、硝酸盐和高锰酸盐中的至少一种；所述氧化剂在反应体系中的浓度为0.05-50mg/mL；
控制反应温度为20-40℃，反应时间为2-96h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂在反应体系中的浓度为0.5-20mg/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，无机过氧化物选自Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2和H2O2中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在反应完成之后，进行清洗、干燥。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基材选自金属材料、无机非金属材料、高分子材料、生物医用微纳米粒子和人工合成多肽类水凝胶材料中的至少一种；
其中，所述生物医用微纳米粒子选自四氧化三铁纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、氧化钛纳米粒子和氧化锌纳米粒子中的至少一种；
所述人工合成多肽类水凝胶材料选自聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述金属材料选自不锈钢、钴基合金、钛及其合金、铂及其合金、镁及其合金、铁及其合金和锌及其合金中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述无机非金属材料选自氧化钛及其纳米管、碳素材料、硅、二氧化硅、氮化硅、碳化硅、硅铝酸盐、钙铝系、生物玻璃、羟基磷灰石、磷酸钙和氮化钛中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述高分子材料选自涤纶、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲醛、聚碳酸酯、聚氨酯、碳共聚物、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醋酸乙烯酯、聚乳酸、乙交酯-丙交酯共聚物、聚三亚甲基碳酸酯、聚己内酯、聚羟基脂肪酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚酰胺、聚二（恶）烷酮、环氧树脂、硅橡胶、硅凝胶、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物和聚乙烯醇中的至少一种。
9.一种杂化蛋白涂层材料，其特征在于，由权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备而得。
10.权利要求9所述的杂化蛋白涂层材料在制备血液接触类器件中的应用。
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