NO329374B1

NO329374B1 - Polyuretan kovalent bundet til sulfatert hyaluronsyre/sulfatert hyaluronsyrederivat, fremgangsmate for fremstilling, hemokompatibelt materiale samt industrielle/medisinske artikler eller anordninger

Info

Publication number: NO329374B1
Application number: NO20004210A
Authority: NO
Inventors: Rolando Barbucci; Marco Consumi; Agnese Magnani; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2010-10-04
Also published as: AU3029999A; JP4280962B2; WO1999043728A1; HUP0100775A3; ITPD980037A1; CA2321890C; HUP0100775A2; EP1060204B1; IL137988A0; IL137988A; ATE219116T1; NO20004210D0; JP2002504601A; EP1060204A1; CA2321890A1; US7345117B1; ES2177263T3; DE69901800D1; AU745199B2; NO20004210L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et polyuretan som er kovalent bundet til sulfatert hyaluronsyre eller til dets sulfaterte derivater, fremgangsmåten for deres fremstilling og de hemokompatible materialene som innbefatter nevnte polyuretan. Oppfinnelsen vedrører også industrielle/medisinske artikler eller anordninger fremstilt med eller overtrukket med det hemokompatible materialet ifølge oppfinnelsen.

Betraktelige anstrengelser ble gjennomført i løpet av de siste tiårene med hensyn på syntese og overflatemodifikasjon av stadig nye polymerklasser for å tilveiebringe hemokompatible materialer for anvendelse i kirurgi.

Polyuretaner anvendes i stort omfang i biomedisinske anvendelser på grunn av deres gode mekaniske og hemokompatible egenskaper.

For å forbedre den sistnevnte egenskapen ble molekyler som er i stand til å inhibere den koagulative prosessen bundet til overflaten av polyuretan.

Disse substansene velges vanligvis blant de som kan forhindre blodplateadhesjon og aggregering eller blokk-koaguleirngsfaktorer.

Heparin er ett av de anvendte modifikatormidlene og det kan bindes til polymeroverflaten ved hjelp av både ionebindinger (US 4.944.767) og kovalente bindinger (W. Marconi et al., Makkromol. Chem. 194,1347-1356,1993).

Disse bindingene kan oppnås med en gang når polymeroverflaten har blitt kjemisk modifisert ved å introdusere reaktive grupper som karboksy, hydroksy og aminogrupper.

Likevel er en av hovedulempene med hensyn til anvendelsen av heparin dets høye nedbrytningshastighet på grunn av enzymet heparinase som begrenser dets mulige anvendelser i kirurgiområder som kardiovaskulær kirurgi som kan ha behov for implantering av utstyr hvor fraværet av kromogenisitet må garanteres i løpet av en forlenget periode.

Andre modifikatorer med antikoaguleringsegenskaper er O-sulfatert hyaluronsyre og dets O-sulfaterte derivater, fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i den internasjonale patentsøknaden WO 95/25751.

Også av betydelig viktighet er N-sulfatert hyaluronsyre og dets N-sulfaterte derivater, muligens saltbehandlet, hvori glukosaminene er delvis N-sulfatert eller delvis N-sulfatert og delvis eller totalt O-sulfatert i posisjon 6, som beskrevet i den internasjonale patentsøknaden til søkeren, nr. WO 98/45335.

Disse sulfaterte derivatene har antikoagulerings-, ikke-trombose-, antivirus- og antibetennelsesegenskaper og det har vist seg at de inhiberer blodplateadhesjon, aggregering og aktivering.

Dessuten har de sulfaterte derivatene vist seg å være spesielt fordelaktige ved å være motstandsdyktige mot enzymet hyaluronidase og de garanterer derfor antikoaguleirngsaktivitet for en mye lengre tidsperiode enn heparin (G. Abatangelo et al., Biomaterials 18,1997,1411-1415).

US4487865 omtaler polymer materialer inkludert bla. polyuretan som er gjort biokompatible ved å inkludere hyaluronsyre eller et salt derav. Eksempel 3 viser et polyuretan produkt som består av hyaluronsyre natrium salt kovalent bundet til polyuretan. Nevnte eksempel 3 sier dog ingenting om egenskapene av polyuretan produkter som består av av hyaluronsyre natrium salt kovalent bundet til polyuretan.

Dessuten kan ikke alle de ovenfor nevnte derivatene som sådan fremstilles i form av biomaterialer på grunn av at jo høyere prosentandelen av sulfateringen er, jo større er deres hydrofilisitet.

Derfor føler man behov for nye bio- og hemokompatible forbindelser som også har de fordelaktige egenskapene av den sulfaterte hyaluronsyren og derivatene derav og som kan anvendes som sådan for fremstilling av biomaterialer og for overtrekking av biomedisinske gjenstander.

Foreliggende oppfinnelse angår polymerer med en høy grad av biokompatibilitet og hemokompatibilitet, som formidles av et polyuretan kovalent bundet til en sulfatert hyaluronsyre og derivater derav.

Nevnte polymerer opprettholder de mekaniske egenskapene (motstand mot slitasje, bøyning, elastisitet, osv.) og stabiliteten av polyuretan, som også viser antikoaguleringsaktiviteten, effektiviteten i å inhibere blodplateadhesjon, aktivering og aggregering og motstand mot hyaluronidase av den sulfaterte hyaluronsyren og av de sulfaterte derivatene derav.

Dessuten viser derivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen som utgjør et polyuretan bundet kovalent til sulfatert hyaluronsyre eller dets sulfaterte derivater, den betydelige fordel av å være enkelt mobilisert på polymeroverflaten av biomedisinske gjenstander som i de fleste tilfeller utnytter oppløseligheten i organiske oppløsningsmidler.

Riktignok kan overflaten av en gjenstand som er fremstilt av polymermaterialer behandles med den organiske oppløsningen av derivatet som utløser oppløsningen av de ytre lagene av polymeren og, på grunn av den etterfølgende fordampningen av oppløsningsmiddelet, adhererer derivatet til overflaten og kobles til polymermaterialet av hvilket gjenstanden er fremstilt.

På basis av det forut nevnte tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen hemokompatible materialer som inneholder polyuretanet bundet kovalent til den sulfaterte hyaluronsyren eller sulfaterte hyaluronsyrederivatet.

Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere industrielle eller medisinske gjenstander eller anordninger overtrukket med hemokompatible materialer som innbefatter polyuretanet bundet kovalent til den sulfaterte hyaluronsyren eller sulfaterte hyaluronderivater. Figur 1 viser infrarød-spekteret av den O-sulfaterte hyaluronsyren med en sulfateringsgrad på 3,5 og av dets polyuretanderivat i de tørre og våte formene, som oppnådd i Eksempel 1. Figurene 2, 3 og 4 viser SEM (Scanning Electron Microscope; forstørrelse = 1022x) avbildninger av blodplateadhesjonstesten på polyuretanderivatet av O-sulfatert hyaluronsyre oppnådd i Eksempel 1.

Sulfatert hyaluronsyre og sulfaterte hyaluronsyrederivater betyr:

Ai) O-sulfatert hyaluronsyre, og

A2) O-sulfaterte hyaluronsyrederivater,

begge typer er vist i WO 95/25751, som vi herved inkorporerer ved referanse;

Bi) N-sulfaterte hyaluronsyre, og

B2) N-sulfaterte hyaluronsyrederivater,

begge typer er vist i WO 98/45335, som vi herved inkorporerer ved referanse.

I de O-sulfaterte derivatene av hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivater av klasse Ai og A2, innbefatter antallet av O-sulfaterte grupper generelt mellom 0,5 og 3,5.

I den N-sulfaterte hyaluronsyre Bi eller i de N-sulfaterte hyaluronsyrederivatene B2kan glukosamindelene av repetisjonsenheten være:

a) delvis N-sulfatert,

b) delvis N-sulfatert og delvis O-sulfatert, eller

c) delvis N-sulfatert og totalt O-sulfatert,

hvori

a) betyr et produkt oppnådd ved hjelp av en kontrollert sulfateringsreaksjon av de tidligere deacylerte aminogruppene av glukosamin, b) og c) betyr et produkt oppnådd ved en sulfateringsreaksjon i hvilken, ved siden av de tidligere nevnte deacylerte aminogruppene av glukosamin, også involveres de

primære hydroksyfunksj onene av den samme resten, henholdsvis delvis eller totalt.

Hyaluronsyrederivatene som anvendes for å fremstille de sulfaterte forbindelsene av klassene A2og B2er valgt blant: • partialesterne av hyaluronsyre som inneholder minst en fri karboksylfunksjon og de gjenstående karboksylfunksjoner er forestret med alkoholer av den alifatiske,

aromatiske, arylalifatiske, cykloalifatiske og heterocykliske serien,

• de partielle tverrbundne esterne som innbefatter minst en fri karboksylfunksjon og de gjenstående karboksylfunksjonene som er forestret med den alkoholiske funksjonen av den samme hyaluronsyrekjeden eller av en forskjellig kjede som

ligner de vist i USP nr. 5.676.964, som vi hermed inkorporerer ved referanse,

• de partielle tverrbundne esterne vist i USP nr. 4.957.744 som vi hermed inkorporerer ved referanse, som inneholder minst en fri karboksylfunksjon og de gjenstående karboksylfunksjonene reagert med en polyalkohol av den alifatiske, aromatiske, arylalifatiske, heterocykliske serien og hvori en tverrbinding deretter dannes ved hjelp av spacer-kjeder.

Hvilken som helst biokompatibel polyuretan kan anvendes for fremstilling av polyuretanet som er kovalent bundet til den sulfaterte hyaluronsyren. Foretrukket er polyuretanet som finnes i handelen med varemerket Pellethane ( Sb; spesielt foretrukket er polyuretanet som har en gjennomsnittsmolekylvekt på 180.000 Da, og denne polymeren inneholder repetisjonsenheten 4,4'-metylenbis(fenylisocyanat).

De hemokompatible materialene ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved siden av polyuretanet bundet kovalent til sulfatert hyaluronsyre kan eventuelt ytterligere inneholde naturlige, syntetiske eller semisyntetiske polymerer og/eller farmasøytisk aktive substanser.

De farmasøytisk aktive substansene som kan anvendes er f.eks. antibiotika, infeksjonsbekjempende midler, antimikrobielle-, anivirus-, cytostatiske-, antitumor-, antibetennelses- og sårhelingsmidler, anestetiske midler, kolinerge eller adrenerge agonister og antagonister, antitrombosemidler, antikoaguleringsmidler, hemostatiske midler, fibrinolytiske midler, trombolysemidler, proteiner og deres fragmenter, peptider, polynukleotider, vekstfaktorer, enzymer og vaksiner.

Blant de naturlige polymerene er det f.eks. mulig å anvende kollagen, kopresipitater av kollagen og glykosaminoglykaner, cellulose, polysakkarider i form av geler slik som kitin, kitosan, pektin eller pektinsyre, agar, agarose, xantan, gellan, alginsyre eller alginater, polymannan eller polyglycaner, stivelse og naturgummier.

De semisyntetiske polymerene for eksempel, kan velges fra gruppen som består av kollagen tverrbundet med midler som aldehyder eller forløpere av de samme, dikarboksylsyre eller halidene derav, diaminer, derivater av cellulose, hyaluronsyre, kitin eller kitosan, gallan, xantan, pektin eller pektinsyre, polyglykaner, polymannan, agar, agarose, naturgummi og glykosaminoglykaner.

Endelig, blant de syntetiske polymerene er det f.eks. mulig å anvende polymelkesyre, polyglykolsyre eller kopolymerer av den samme eller deres derivater, polydioksaner, polyfosfazener, polysulfonharpikser og PTFE.

De hemokompatible materialene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis i form av svamper, filmer, membraner, fibre, tamponger, ikke-vevde tekstiler, mikrosfærer, nanosfærer, gas, geler og ledekanaler.

De hemokompatible materialene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i det kardiovaskulære området eller i hvilken som helst anvendelse som omfatter kontakt med blodet eller med i stor grad vaskulariserte kroppsvev.

De ovenfor nevnte hemokompatible materialene kan anvendes fordelaktig i forskjellige kirurgiområder, intern, osteoartikulær, neurologisk, anastomotisk, viskoelastisk, oftalmisk, onkologisk, aestetisk, plastisk, otorhinolaryngologisk, abdominal-pelvisk, urogynekologisk og kardiovaskulær kirurgi, for forhindring av post-kirurgiadhesjoner og for forhindring av hypertrofisk arrdannelse.

De hemokompatible materialene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes, ved siden av kirurgiområdet, for hemodialyse, i kardiologi, i dermatologi, i oftalmologi, i otorhinolaryngologi, i tannlegevitenskap, i gynekologi, i urologi og med hensyn til ekstrakorporal blodsirkulering og oksygenering.

De ovenfor nevnte hemokompatible materialene i deres forskjellige former kan også anvendes med fordel som cellekulturstøttemidler, som mesenchymceller eller voksne celler for å oppnå binde-, kjertel- og nervevev.

De hemokompatible materialene kan også anvendes i fremgangsmåtene for fremstilling og overtrekking av gjenstander eller anordninger som anvendes både i det medisinske området og i industrien, som viser, på grunn av denne overtrekkingen, biologiske egenskaper på overflatene.

Gjenstandene som kan overtrekkes er f.eks. katetre, ledekanaler, prøver, hjerteklaffer, mykvevsprotese, proteser av animalsk opprinnelse som hjerteklaffer fra gris, kunstige sener, knokkel og kardiovaskulære erstatninger, kontaktlinser, blodoksygenatorer, kunstige nyrer, hjerter, bukspyttkjertler og lever, blodbeholdere, sprøyter, kirurgiinstrumenter, filtreringssystemer, laboratorieinstrumenter, beholdere for kulturer og for regenereringen av celler og vev, støttemidler for peptider, proteiner og antistoffer.

Spesielt foretrukket polyuretan bundet kovalent til sulfatert hyaluronsyre er de kjennetegnet ved den følgende formelen (I) og formel (II)

hvori PU er en rest av polyuretankjeden og Hsulph er en rest av den sulfaterte hyaluronsyren som i de ovenfor nevnte klassene Ai og Bi eller et sulfatert hyaluronsyrederivat som inneholder minst en fri karboksylfunksjon som i de ovenfor nevnte klassene A2og B2.

Spesielt oppnås fremgangsmåten for fremstilling av polyuretanet bundet kovalent til den sulfaterte hyaluronsyren med formel (I) med en fremgangsmåte som innbefatter de følgende trinn: i) polyuretanet (IV) reageres med bromeddiksyre (VII) i nærvær av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCC) for å oppnå adduktet med formel (III) ifølge det følgende reaksjonsforløpet: ii) adduktet (III) som oppstår i trinn i) reageres med HOOC — Hsulph hvori Hsulph har de ovenfor nevnte betydningene som derved oppnår forbindelsen med formel (I) ifølge det følgende reaksjonsforløpet:

Reaksjonen i trinn i) utføres typisk i en inert atmosfære og i et organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis i dimetylformamid (DMF).

Før utførelsen av trinn ii) filtreres reaksjonsblandingen som oppstår i trinn i) fortrinnsvis for å separere oppløsningen som inneholder det ønskede produktet (III) fra presipitatet av dicykloheksylurea som dannes simultant.

Trinn ii) utføres fortrinnsvis i nærvær av natriumbikarbonat.

Reaksjonen i trinn ii) utføres typisk i løpet av 24 timer ved en temperatur som varierer fra 25 til 45°C og fortrinnsvis ved 25°C.

Polyuretanderivatet med formel (II) kan oppnås ved en fremgangsmåte som innbefatter de følgende trinn:

i') en sulfatert hyaluronsyre eller et sulfatert hyaluronsyrederivat, hvori deler eller alle karboksygruppene fra glukuronresten er i deres syreform HOOC - Hsulph reageres med heksametylendiisocyanat (HMDI) (V), for å oppnå adduktet med formel (VI) ii') adduktet (VI) som oppstår fra trinn i') reageres med polyuretanet (IV) for å oppnå det ønskede produktet (II) ifølge de følgende reaksjonsforløpet:

Begge reaksjonene i trinnene i') og ii') utføres typisk i en inert atmosfære ved å anvende DMF som oppløsningsmiddel.

Temperaturen i trinn ii') holdes i området fra 45 til 55°C i en tidsperiode fra 48 til 72 timer mens blandingen overlates til reaksjonen.

De følgende eksemplene gis for å tilveiebringe ikke-begrensende illustrasjoner av den foreliggende oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Polyuretan som er kovalent bundet til O-sulfatert hyaluronsyre med formel (I)

(PUBRAC-1)

30 ml av en 10% (vekt/volum) oppløsning i DMF av Pellethane<®>suppleres med 1,5 g DCC under omrøring.

Med en gang DCC er oppløst, tilsettes 1,8 g bromeddiksyre oppløst i en minimal mengde DMF dråpevis.

Etter omtrent 30 minutter filtreres oppløsningen for å separere den fra det kvite dicykloheksylurea-presipitatet.

lg O-sulfatert hyaluronsyre natriumsalt (molekylvekt 200 kDa og sulfateringsgrad 3,5) oppløses i 60 ml vann og denne oppløsningen perkuleres langs lengden av en ionebyttekolonne, pakket med 75 ml av en sulfonharpiks i form av tetrabutylammoniumsalt.

Denne harpiksen har blitt fremstilt ved fremgangsmåtene av aktivering av en protonert sulfonharpiks med en tetrabutylammoniumhydroksid (40% vekt/volum) oppløsning.

Oppløsningen som inneholder det O-sulfaterte hyaluronsyre-tetrabutylammoniumsaltet som stammer fra kolonnen, ble oppsamlet og deretter frysetørket.

200 mg av det således oppnådde O-sulfaterte hyaluronsyre-tetrabutylammoniumsaltet og 2 g natriumbikarbonat tilsettes til den ovenfor nevnte polyuretan-oppløsningen i

DMF.

Blandingen reageres124 timer mens den omrøres ved en temperatur på 25°C.

Hvis noe som helst presipitat dannes, filtreres reaksjonsblandingen på nytt og overføres deretter i Petri-skåler.

Vi viser senere i figur 1 infrarød-spekteret av den sulfaterte hyaluronsyren med en sulfateringsgrad på 3,5 og av dets polyuretanderivat i de tørre og våte formene, oppnådd som ovenfor illustrert.

Polyuretanderivatet i dets tørre tilstand viser det typiske spekteret av polyuretan som er ikke-modifisert med sulfatert hyaluronsyre mens derimot i dets våte tilstand, kan topper på mellom 3600 og 2800 cm"<1>og ved 1654 cm"<1>oppdages som relativ til funksjonelle grupper av den sulfaterte hyaluronsyren.

EKSEMPEL 2

Polyuretan som er kovalent bundet til N-sulfatert hyaluronsyre med formel (I)

(PUBRAC-2)

Med en gang DCC er oppløst tilsettes 1,8 g bromeddiksyre oppløst i en minimal mengde DMF dråpevis. 30 til 40 minutter senere filtreres oppløsningen for å separere den fra det hvite presipitatet av dicykloheksylurea.

Denne oppløsningen suppleres med 2 g natriumbikarbonat og 200 mg N-sulfatert hyaluronsyre-tetrabutylammoniumsalt som oppnås med utgang fra N-sulfatert hyaluronsyrenatriumsalt (molekylvekt 200 Kda og 30% sulfatering) som beskrevet i Eksempel 1 for den tilsvarende O-sulfaterte forbindelsen.

Reaksjonsblandingen reageres deretter i 24 timer under omrøring ved en temperatur på 25°C.

Den filtreres igjen og overføres deretter i Petri-skåler.

EKSEMPEL 3

Polyuretan som er kovalent bundet til O-sulfatert hyaluronsyre ifølge formel (I)

(PUBRAC-3)

2g DCC tilsettes i en inert atmosfære til 25 ml av en 10% (vekt/volum) oppløsning i DMF av Pellethane ( Sb under omrøring.

Med en gang DCC er oppløst, tilsettes 1,8 g bromeddiksyre oppløst i en minimal mengde av DMF dråpevis.

Etter omtrent 30 minutter filtreres oppløsningen for å separere denne fra det hvite presipitatet av dicykloheksylurea.

Til den således oppnådde oppløsningen tilsettes 250 mg av O-sulfatert hyaluronsyre-tetrabutylammoniumsalt, fremstilt med begynnelse fra det tilsvarende natriumsaltet (molekylvekt 200 Kda og sulfateringsgrad 3,5) som beskrevet ovenfor i Eksempel 1, og 2 g natriumbikarbonat og deretter reageres blandingen i 24 timer mens den omrøres ved en temperatur på 45°C.

Hvis noe som helst presipitat dannes, filtreres reaksjonsblandingen på nytt og overføres deretter til Petri-skåler.

EKSEMPEL 4

Rensing av polyuretan som er kovalent bundet til sulfatert hyaluronsyre med formel (I) oppnådd ifølge Eksempel 3 (PUBRAC Ris THF)

Fremstillingsprosedyren som beskrevet i Eksempel 3 utføres en gang til, men reaksjonsproduktet oppløses i THF før man overfører det i Petri-skåler.

EKSEMPEL 5

Rensing av polyuretan som er kovalent bundet til sulfatert hyaluronsyre med formel (I) som oppnås ifølge Eksemplene 1-4 (PUBRAC)

Før overføring i Petri-skåler vaskes reaksjonsproduktet som oppnådd i Eksempel 1-4 først med aceton og deretter utføres 2-3 vasketrinn med en 10% oppløsning av NaCl.

EKSEMPEL 6

Polyuretan kovalent bundet til O-sulfatert hyaluronsyre med formel (II)

(PUHMDI-6)

O-sulfatert hyaluronsyre oppnås med begynnelse fra det tilsvarende natriumsaltet (molekylvekt 200 kDa og sulfateringsgrad 3,5) som beskrevet ovenfor i Eksempel 1 og en fullstendig protonering av dens karboksygruppe utføres for å bringe tetrabutylammoniumsalt-oppløsningen, som stammer fra kolonnen, til pH = 3 - 4 før man frysetørker.

300 mg av den således oppnådde O-sulfaterte hyaluronsyren oppløses i den minimale mengden av DMF (ca. 10 ml).

Med en gang oppløsningen er ferdig, overføres oppløsningen i en flaske som inneholder 200 ul HMDI under omrøring og i en inert atmosfære.

30 minutter senere tilsettes 10 ml av en 10% (vekt/volum) Pellethane oppløsni*ng i

DMF.

Oppløsningen røres om i en inert atmosfære ved en temperatur på 45 - 50°C i 3 dager. Deretter overføres den i Petri-skåler.

EKSEMPEL 7

Polyuretan kovalent bundet til O-sulfatert hyaluronsyre med formel (II)

(PUHMDI-7)

O-sulfatert hyaluronsyre oppnås med utgangspunkt i det tilsvarende natriumsaltet (molekylvekt 200 kDa og sulfateringsgrad 3,5) som beskrevet ovenfor i Eksempel 1 og en fullstendig protonering av dens karboksygruppe utføres for å bringe tetrabutylamoniumsalt-oppløsningen, som stammer fra kolonnen, til pH = 3 - 4 før frysetørking.

250 mg av den således oppnådde O-sulfaterte hyaluronsyren oppløses i den minimale mengden av DMF (ca. 10 ml) og deretter helles oppløsningen under omrøring og i en inert atmosfære inn i en flaske som inneholder 200 (il HMDI. 30 minutter senere tilsettes 25 ml av en 10% (vekt/volum) oppløsning i DMF av Pellethane<®>til reaksjonsblandingen som bevarer en inert atmosfære.

Oppløsningen røres i en inert atmosfære ved en temperatur på 55°C i 48 timer. Deretter overføres den i Petri-skåler.

EKSEMPEL 8

Rensing av polyuretan kovalent bundet til O-sulfatert hyaluronsyre med formel (II) som oppnås ifølge Eksemplene 6 og 7 (PUHMDI)

Før overføring i Petri-skåler vaskes reaksjonsproduktet som oppnådd i Eksempler 6 og 7 med en 10% oppløsning av NaCl i 2 - 3 timer.

EKSEMPEL 9

Undersøkelse av blodplateadhesjon på materialet som oppnås ifølge Eksempel 1

(PUBRAC-1).

Blod ble tatt fra en sunn, ikke-røykende donor som ikke har tatt noen legemidler i en tidsperiode på 14 dager. Blodplate-rikt plasma (PRP) ble oppnådd ved sentrifugering av alt blodet ved 250 omdreininger pr. minutt i 25 minutter ved romtemperatur. 1 ml PRP ble brakt i kontakt med hver prøve (0,5 cm x 0,5 cm) av testpolymeren og disse ble deretter latt stå i 3 timer ved romtemperatur for å begunstige blodplateadhesjon. Prøvene ble deretter vasket i PBS (fosfatbufferoppløsning) for å fjerne hvilke enhver blodplate som ikke har sluttet seg til overflaten og deretter inkubert i en oppløsning av glutaraldehyd ved 2,5% (volum/volum) i 100 mM natriumkakodylat i 30 sekunder.

Deretter ble filmene vasket i kakodylat av natrium, 100 mM, i 30 sekunder, skylt i destillert vann og overført til den første dehydreringsoppløsningen (70% volum/volum etanol i destillert vann) i en tidsperiode på 15 minutter. Prøvene ble deretter overført til den andre dehydreringsoppløsningen (90% volum/volum etanol i destillert vann) i 15 minutter og til slutt i absolutt etanol i ytterligere 15 minutter.

Alle prøvene ble deretter dehydrert i et vakuum i 12 timer, metallisert med gull og analysert med et scanning-elektromikroskop (SEM) (Figurene 2, 3 og 4).

Som vist på figurene 2, 3 og 4, er overflaten av materialet morfologisk uregelmessig og kjennetegnet ved nærværet av utallige sprekker med varierende størrelse. Tross disse uregelmessighetene viser 90% av materialet ingen tegn på blodplateadhesjon.

Kun på de gjenstående 10% av overflatene kan nærværet av blodplater observeres som, i noen tilfeller, danner små grupper, mens i andre tilfeller ser de ut til å opprettholde sine individuelle egenskaper til og med når de har tapt den skiveformede formen som er typisk for ikke-aktiverte blodplater, og de har ekstruderte pseudopoder med hvilke de holder seg fast på overflaten.

EKSEMPEL 10

Undersøkelse av hel-blod-koagulering på materialet oppnådd ifølge Eksempel 3 (PUBRAC-3) og 4 (PUBRAC Ris THF).

Denne undersøkelsen ble utført på PUBRAC-3 og PUBRAC Ris THF ved å anvende blod fra en enkelt donor. 5 ml blod ble brakt i kontakt med en prøve (0,5 cm x 0,5 cm) av de følgende materialene:

kontrollprøve polystyren

PU Pellethane

PUBRAC-3 polyuretanderivat ifølge Eksempel 3

PUBRAC Ris THF polyuretanderivat ifølge Eksempel 4

Prøvene ble lagret ved romtemperatur og tiden som er nødvendig for å oppnå blodkoagulering måles deretter.

Resultatene vises i den følgende tabellen:

Tabell 1 viser at polyuretanderivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen har en antikoaguleringsaktivitet som er minst lik den av polyuretan og til og med mye høyere enn den av polyuretanderivatet som oppnås ifølge Eksempel 3 som viser en koaguleringstid over 2 timer.

EKSEMPEL 11

Trombintid målt ved å anvende materialet som oppnås ifølge Eksempel 3 (PUBRAC-3) og 7 (PUHMDI-7).

Evnen til derivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å øke blodkoaguleringstiden måles ved trombintidsundersøkelsen som utføres med et koagulumeter.

En bedømmelse gjøres på grunnlag av tiden det tas å transformere fibrinogen til fibrin etter tilsetningen av et overskudd av trombin i en blodprøve i nærværet av polymeren. Et resultat på over 120 sekunder er ikke lenger viktig.

Resultatene vises i den følgende tabellen:

Tabellen viser at anikoaguleringsaktiviteten skjer på siden av filmen som er i kontakt med glasset på grunn av det polare miljøet som fører til at den sulfaterte hyaluronsyregruppen utsettes på overflaten mens forskjellige resultater observeres på siden som er i kontakt med luften.

EKSEMPEL 12

Reptilasetid målt ved å anvende materialet som oppnås ifølge Eksempler 3 (PUBRAC-3) og 4 (PUBRAC Ris THF).

Reptilase, en fraksjon ekstrahert fra giften av den søramerikanske slangen BoHrox atrox, er et enzym som koagulerer fibrinogen ved å spalte dets flbrinopeptid A.

Reptilasetiden bestemmes ved inkubering av 0,3 ml av menneskelig plasma på runde

prøver (diameter 0,8 cm) av PUBRAC-3 og PUBRAC Ris THF ved 37°C i 2 minutter og deretter tilsetning av Reptilase Reactive (funksjon av trombinekstrakter fra Bothrox Atrox gift, Haemodiagnostica Diagnostica Stago, Boehringer Mannheim) og måling av koaguleringstiden som skjer automatisk (Elvi Digiclot 2 Coagulometer, Logos S.p.A., Milano, Italia). Tabell 3 viser effektene av materialene som oppnås ifølge Eksempel 3 og 4 med hensyn til reptilasetiden.

Data i Tabell 3 viser at materialene som oppnås ifølge Eksempel 3 og 4 har moderate og ikke meget betydningsfulle virkninger på reptilasetiden.

EKSEMPEL 13

Trombin-inhibering målt ved å anvende materialet som oppnås ifølge Eksempel 3

(PUBRAC-3)

Trombin-inhibering i plasma og i nærvær av rensede molekyler, dvs. antitrombin III (AT III) og heparin kofaktor (HC II) ble undersøkt for materialet som oppnås i Eksempel 3 (PUBRAC-3) for å undersøke måten på hvilken derivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen utøver deres antikoaguleringsaktivitet.

Utvalgte donorer var normale, sunne individer som har fastet i mer enn 8 timer og som ikke hadde tatt noen som helst medisinering i en tidsperiode på minst 14 dager. Blodprøver ble tatt i 3,8% (vekt/volum) tri-natriumcitrat som antikoaguleringsmiddel ved et forhold på 9 deler blod til 1 del citrat. Prøvene ble sentrifugert ved 3.500 rpm i 15 minutter for å oppnå blodplate-fattig-plasma (PPP). Samlet citrert plasma ble fremstilt fra 10 -12 normale medikament-frie frivillige og lagret i alikvoter ved -80°C. AT III (1 U.I./ml) og HC II (Heparin Cofactor II innkjøpt av Calbiochem, USA) ble rekonstituert fra lyofilisert pulver med sterilt vann og anvendt med det samme. 32,4 mg menneskelig fibrinogen (molekylvekt« 341.000, Calbiochem, USA) ble oppløst i 6 ml av en fysiologisk oppløsning (0,9% NaCl, pH = 7,4), deretter ble 0,2 ml av denne oppløsningen brakt i kontakt med en prøve av PUBRAC-3 (0 0,7 cm).

0,2 ml av AT III eller 0,2 ml av HC II eller 0,2 ml av PBS ble deretter tilsatt til den ovenfor nevnte prøven.

Trombintiden med eller uten AT III og HC II ble bestemt manuelt ved å tilsette 0,2 ml trombin (Human Thrombin kjøpt av Boheringer Mannheim, Tyskland) til 0,2 ml av de ovenfor nevnte prøvene.

Resultatene sammenfattes i den følgende tabellen:

Det ovenfor nevnte eksperimentet ble utført både med og uten AT III og resultatene som ble oppnådd var omtrent de samme i begge tilfeller, noe som viser at antakelig inaktiveringen av trombin ved polyuretanderivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen med deres ikke av AT III.

Dessuten viser de ovenfor nevnte resultatene evnen til de foreliggende derivatene til å akselerere trombininhiberingen mediert ved HC II.

Sammenfattende ble trombin inhibert av de foreliggende polyuretanderivatene både via HC II og via direkte akselvirkning.

Claims

1. Polyuretan,karakterisert vedat det er bundet kovalent til sulfatert hyaluronsyre eller til et sulfatert hyaluronsyrederivat.

2. Polyuretan ifølge krav 1,karakterisert vedatstart-polyuretanet innbefatter repetisjonsenheten 4,4'-metylenbis(fenylisocyanat).

3. Polyuretan ifølge et hvilket som helst av kravene log2,karakterisert vedat den sulfaterte start-hyaluronsyren er valgt fra gruppen som består av: Ai) O-sulfatert hyaluronsyre, og Bi) N-sulfaterte hyaluronsyre.

4. Polyuretan ifølge et hvilket som helst av kravene log2,karakterisert vedat det sulfaterte-start-hyaluronsyrederi våtet er valgt fra gruppen som består av: A2) O-sulfatert hyaluronsyrederivat, og B2) N-sulfatert hyaluronsyrederivate.

5. Polyuretan ifølge krav 4,karakterisert vedat hyaluronsyrederivatene som anvendes for å fremstille den sulfaterte start-hyaluronsyre A2og B2er valgt fra gruppen som består av: • partialesterne av hyaluronsyre som inneholder minst en fri karboksylfunksjon og den gjenstående karboksylfunksjonen forestret med alkoholer av den alifatiske, aromatiske, arylalifatiske, cykloalifatiske og heterocykliske serien, • de partial-tverrbundne esterne som innbefatter minst en fri karboksylfunksjon og de gjenstående karboksylfunksjonene er forestret med den alkoholiske funksjonen av den samme hyaluronsyren eller av en forskjellig kjede, • de partial-tverrbundne esterne som inneholder minst en fri karboksylfunksjon reagert med polyalkohol av den alifatiske, aromatiske, arylalifatiske, heterocykliske serien og hvori tverrbinding deretter dannes ved hjelp av spacer-kjeder.

6. Polyuretan ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat den er gitt ved formel (I) eller formel (II)

hvori PU er en rest av polyuretankjeden og Hsulph er en rest av den sulfaterte hyaluronsyren eller et sulfatert hyaluronsyrederivat som inneholder minst en fri karboksylfunksj on.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av polyuretanet med formel (I),karakterisert vedat den innbefatter de følgende trinn: i) polyuretanet (IV) reageres med bromeddiksyre (VII) i nærvær av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCC) for å oppnå adduktet med formel (III); ii) adduktet (III) som strammer fra trinn i) reageres med HOOC—Hsulph og dermed oppnås forbindelsen med formel (I).

8. Fremgangsmåte for fremstilling av polyuretanet med formel (II),karakterisert vedat den innbefatter de følgende trinn: i') HOOC - Hsulph reageres med heksametylendiisocyanat (HMDI) (V), for å oppnå adduktet med formel (VI); ii') adduktet (VI) som stammer fra trinn i') reageres med polyuretanet (IV) for å oppnå det ønskede produktet (II).

9. Hemokompatibelt materiale,karakterisert vedat det innbefatter minst ett polyuretan ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6.

10. Hemokompatibelt materiale,karakterisert vedat det består av minst ett polyuretan ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6.

11. Hemokompatibelt materiale ifølge krav 9,karakterisertved at det ytterligere innbefatter en farmasøytisk aktiv substans.

12. Hemokompatibelt materiale ifølge krav 11,karakterisertv e d at nevnte farmasøytisk aktive substans er valgt fra gruppen som består av antibiotika, infeksjonshemmende midler, antimikrobielle midler, antivirale, cytostatiske, antitome-, antiinflammatoriske, sårhelingsmidler, anestetiske, kolinerge eller adrenerge agonister eller antagonister, antitrombosemidler, antikoaguleirngsmidler, hemostatiske, fibrinolytiske, trombolytiske midler, proteiner eller deres fragmenter, peptider, polynukleotider, vekstfaktorer, enzymer og vaksiner.

13. Hemokompatibelt materiale ifølge et hvilket som helst av kravene 9,11 og 12,karakterisert vedat det ytterligere innbefatter minst en naturlig, syntetisk eller semisyntetisk polymer.

14. Hemokompatibelt materiale ifølge krav 13,karakterisertved at nevnte naturlige polymer er valgt fra gruppen som består av kollagen, kollagen-kopresipitater og glykosaminoglykaner, cellulose, polysakkarider i form av geler som kitin, kitosan, pektin eller pektinsyre, agar, agarose, xantan, gellan, algjninsyre eller alginatene, polymannan eller polyglykan, stivelse og naturlige gummier.

15. Hemokompatibelt materiale ifølge krav 13,karakterisertv e d at nevnte semisyntetiske polymer er valgt fra gruppen som består av kollagen tverrbundet med midler som aldehyder eller forløpere av det samme, dikarboksylsyrer eller deres halider, diaminer, derivater av cellulose, hyaluronsyre, kitin eller kitosan, gelan, xantan, pektin eller pektinsyre, polyglykaner, polymannan, agar, agarose, naturlig gummi og glykosaminoglykaner.

16. Hemokompatibelt materiale ifølge krav 13,karakterisertv e d at nevnte syntetiske polymer er valgt fra gruppen som består av polymelkesyre, polyglykolsyre eller kopolymerer eller det samme av deres derivater, polydioksaner, polyfosfazener, polysulfonharpikser og PTFE.

17. Hemokompatibelt materiale ifølge et hvilket som helst av kravene 9-16,karakterisert vedat de er i form av svamper, filmer, membraner, fibre, ikke-vevde tekstiler, mikrosfærer, nonosfærer, gaser, geler og ledekanaler.

18. Industrielle eller medisinske artikler eller anordninger,karakterisert vedat de er fremstilt med eller overtrukket med det hemokompatible materialet ifølge hvilket som helst av kravene 9-16.

19. Industrielle eller medisinske artikler eller anordninger ifølge krav 18,karakterisert vedat nevnte anordninger er valgt fra gruppen som består av katetre, ledekanaler, prøver, hjerteklaffer, mykvevsprotese, proteser av animalsk opprinnelse som hjerteklaffer fra gris, kunstige sener, knokkelerstatninger eller kadiovskulære proteser, kontaktlinser, blodoksygenatorer, kunstige nyrer, hjerter, bukspyttkjertler og lever, blodbeholdere, sprøyter, kirurgiinstrumenter, filtreringssystemer, laboratorieinstrumenter, beholdere for kulturer og for celle- og vevs-regenerasjon, støttemidler for peptider, proteiner og antistoffer.