CN110343245A - 一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ε‑聚赖氨酸‑接枝‑疏水氨基酸‑接枝‑海藻糖的糖肽及制备方法，以ε‑聚赖氨酸和疏水氨基酸为原料，通过1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺偶联反应和三氟乙酸脱保护，得到ε‑聚赖氨酸‑接枝‑对甲苯磺酰基‑精氨酸，ε‑聚赖氨酸‑接枝‑苯丙氨酸，ε‑聚赖氨酸‑接枝‑亮氨酸和ε‑聚赖氨酸‑接枝‑缬氨酸；再以ε‑聚赖氨酸‑接枝‑疏水氨基酸与羧基化海藻糖为原料，通过偶联反应，得到产物。该方法操作简便、成本低，反应条件温和，实验原料易得。产品具有良好的生物相容性和细胞膜稳定性，红细胞冻存保护复苏率从49.0％提高到75.6％。适用于生物医用细胞低温冻存保护材料领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽及制备方法，具体涉及ε-聚赖氨酸接枝疏水性氨基酸及羧基化海藻糖的糖肽制备及其增强红细胞低温冻存效果的应用，属于生物医用材料领域。
背景技术
冷冻医学涉及细胞/蛋白的长期贮存，意义重大，直接关系到人类健康，其中血液的长期冻存是急需解决的难题。细胞在冷冻过程中，细胞内、外结冰导致细胞膜破裂是其致命要害，同时会让血红蛋白变性。
目前，细胞长期储存的方法主要是通过添加冻存剂在低温条件下进行冻存。冻存剂主要有两种类型：其一，添加细胞渗透性的冻存剂。例如，添加40％用量的甘油，使细胞内外水低温下变为玻璃态而抑制冰晶形成和生长，在一定程度上使得细胞冻存存活率得以提高(Valeri CR,Ragno G.Use of supernatant osmolality and supernatant refractionto assess the glycerol concentration in glycerolized and deglycerolizedpreviously frozen RBC.Transfusion and Apheresis Scicence,2007,36,133-137)。但这类渗透性保护剂有细胞毒性，且需多次繁琐的洗涤清除,限制了其广泛应用。其二，是添加细胞非渗透性的冻存剂。例如，从南北极生存的鱼类中提取的抗冻肽和仿生抗冻聚合物的聚乙烯醇，可作为细胞冻存保护剂，通过在细胞冻存过程中抑制冰晶的生长实现细胞低温冻存保护的效果(Biggs CI,Bailey TL,Graham B,Stubbs C,Fayter A,GibsonMI.Polymer mimics of biomacromolecular antifreeze.Nature Communications,2017,8,1546；Balcerzak AK,Capicciotti CJ,Briard JG,Ben RN.Designing icerecrystallization inhibitors:from antifreeze(glycol)proteins to smallmolecules.RSC Advances,2014,4,42682-42696)。然而，天然抗冻肽提取过程繁琐，产量小；合成抗冻聚合物大多数为不可降解材料，从而限制了其应用范围。
海藻糖是由两个吡喃葡萄糖基以α,α-1,1-糖苷键连结的非还原性二糖，无毒、化学稳定性好，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜。人们还发现海藻糖可作为细胞和蛋白冻存、冻干保护剂，但它不具有透膜性。有文献报道了聚海藻糖及海藻糖改性聚酯可使得功能蛋白或酶在60℃高温或4℃低温下保持其功能活性的稳定性(Lee J,Lin EW,Lau UY,Hedrick JL,Bat E,Maynard HD.Trehaloseglycopolymers as excipients for protein stabilization.Biomacromolecules,2013,14,2561-2569；Pelegri-O’Day EM,Paluck SJ,Maynard HD.Substituted polyesters bythiol-ene modification:rapid diversification for therapeutic proteinstabilization.Journal of the American Chemistry Society,2017,139,1145-1154)。因此，海藻糖聚合物是一类可作为细胞低温冻存保护剂；ε-聚赖氨酸是一类由25-30个赖氨酸残基组成的水溶性良好、低毒的阳离子均聚物，且在2003年，美国食品和药物管理局(FDA,USA)批准其为食品添加剂，在日本已被广泛使用(Zahi MR,Hattab ME,Liang H,YuanQ.Enhancing the antimicrobial activity of D-limonene nanoemulsion with theinclusion ofε-polylysine.Food Chemistry,2017,221,18-23)。
为了制备生物相容性能良好且能提高细胞冻存效果的生物医用材料，本发明创造性地将ε-聚赖氨酸接枝疏水氨基酸和海藻糖的糖肽聚合物。该糖肽具有良好的生物降解性和生物相容性。同时，该糖肽对细胞膜稳定性和细胞冻存作用皆得到了进一步提高。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽及制备方法，该方法利用ε-聚赖氨酸接枝疏水氨基酸后，进一步接枝海藻糖制备具有细胞膜稳定作用的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽生物材料，可增强小分子海藻糖对红细胞低温冻存保护效果，丰富接枝疏水氨基酸结构种类，且操作简便，反应条件温和，实验原料易得。所述ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽具有良好的生物相容性及细胞膜稳定作用，适用于生物医用细胞低温冻存保护剂材料领域。
本发明的技术方案如下：
一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽，其特征在于结构式为:
式(I)中，R为对甲苯磺酰基-精氨酸或苯丙氨酸或亮氨酸或缬氨酸；n＝25～30；x>0，y>0，z>0；n>x+y+z>0。
本发明的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽的制备方法，具体步骤如下：
1)将疏丁氧羰基-疏水氨基酸和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按照摩尔比1:0.5～1.0溶于二甲基亚砜，搅拌30～60min后，按照羧基和氨基摩尔比1:0.5～1.0加入ε-聚赖氨酸；经室温反应48～72h得到ε-聚赖氨酸接枝叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽产物；
其中，叔丁氧羰基-疏水氨基酸包括叔丁氧羰基-对甲苯磺酰基-精氨酸、叔丁氧羰基-苯丙氨酸、叔丁氧羰基-亮氨酸或叔丁氧羰基-缬氨酸。
2)将ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽按质量体积分数10％～30％加入三氟乙酸溶剂充分溶解，室温搅拌2～6h，ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽脱去保护基团叔丁氧羰基得到ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸产物，用乙醚沉淀后，可经溶于去离子水透析冻干处理得到ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸多肽产物，如式(II)；
其中，ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸多肽包括ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸、ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸、ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸或ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸。
式(II)中k为ε-聚赖氨酸接枝疏水氨基酸多肽的重复单元数，n>k>0；n＝25～30。
3)将羧基化海藻糖的羧基含量和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按摩尔比1:0.6～1.0；溶于水中，并在室温下搅拌30～40min；随后按照氨基和羧基的摩尔比1:0.6～1.0，加ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸水溶液，在室温继续反应48-72h；反应完毕后经去离子水透析并冻干，可得到ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽产物，如式(I)。
其中，ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽包括ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖、ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖、ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖或ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖。
ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸与羧基化海藻糖进行无规偶联反应，反应完成后，海藻糖在ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸侧基位置是无规的。羧基化海藻糖的制备方法参考文献报道方法制备(Debnath K,Pradhan N,Singh BK,Jana NR,Jana NR.Poly(trehalose)nanoparticles prevent amyloid aggregation and suppress polyglutamineaggregation in a huntington’s disease model mouse.ACS Applied Materials&Interfaces,2017,9,24126-24139)。
所述的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖多肽对小鼠成纤维细胞毒性测试结果显示，当ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖多肽浓度小于2mg/mL,小鼠成纤维细胞存活率大于80％，具有良好的生物相容性，适用于生物医用细胞低温冻存保护材料领域。
本发明以ε-聚赖氨酸和疏水氨基酸为原料，通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺偶联反应和三氟乙酸脱保护，得到ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸，ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸，ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸和ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸；再以ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸与羧基化海藻糖为原料，通过偶联反应，得到产物。该方法的优点是操作简便、成本低，反应条件温和，实验原料易得。本发明的疏水氨基酸和海藻糖改性的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的具有良好的生物相容性和细胞膜稳定性，可使得红细胞冻存保护复苏率从49.0％提高到75.6％。这种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖适用于生物医用细胞低温冻存保护材料领域。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明的技术方案进一步的描述，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。
实施例1:
(1)ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖的制备
1)将叔丁氧羰基-对甲苯磺酰基-精氨酸(1.07g，物质的量为0.0025mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.479g,0.0025mol)溶于11mL二甲基亚砜中，得到叔丁氧羰基-对甲苯磺酰基-精氨酸浓度为10wt％的溶液，搅拌30min；
2)按ε-聚赖氨酸的氨基和叔丁氧羰基-对甲苯磺酰基-精氨酸摩尔比1:1，加入ε-聚赖氨酸(0.32g,氨基物质的量为0.0025mol)水溶液在室温反应72h，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸；
3)将得到的ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸产物按质量体积分数10％加入三氟乙酸充分溶解，并室温搅拌6h；
4)采用乙醚沉淀，收集沉淀物后，溶于去离子水，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸，对甲苯磺酰基-精氨酸接枝率为36％，其如结构式如下:
5)在装有磁力搅拌子的100mL单口烧瓶中，加入羧基化海藻糖(1.105g,羧基物质的量0.0025mol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.479g,0.0025mol)，10mL水，得到羧基化海藻糖浓度为10wt％的溶液；室温下活化40min；
6)将步骤4)的ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸作为原料，按ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸的氨基与羧基化海藻糖摩尔比1:1，加ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸(0.615g,氨基物质的量为0.0025mol)水溶液，在室温继续反应72h；经透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖，海藻糖接枝率约为24％，结构式如下：
其中，x+y＝6；x+z＝9。
(2)性能测试
制备的ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖，采用Alamar Blue试剂盒进行细胞毒性实验，聚合物浓度小于2mg/mL时，对小鼠成纤维细胞的存活率皆在80％以上，对绵羊红细胞溶血测试，ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖的溶血率小于1％，表明ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖具有良好的细胞相容性。利用ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖和小分子海藻糖共同对绵羊红细胞进行冻存保护实验，红细胞复苏率为约75.6％，而纯小分子海藻糖对绵羊红细胞低温冻存保护实验，红细胞存活率仅约为49％。
实施例2：
(1)ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖的制备
1)将叔丁氧羰基-苯丙氨酸(1.33g，物质的量为0.005mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.958g,0.005mol)溶于13mL二甲基亚砜中，得到叔丁氧羰基-苯丙氨酸浓度为10wt％的溶液，搅拌60min；
2)按ε-聚赖氨酸的氨基和叔丁氧羰基-苯丙氨酸摩尔比1:0.5，加入ε-聚赖氨酸(0.32g,氨基物质的量为0.0025mol)水溶液在室温反应48h，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-精氨酸；
3)将得到的ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-精氨酸产物按质量体积分数15％加入三氟乙酸充分溶解，并室温搅拌2h；
4)采用乙醚沉淀，收集沉淀物后，溶于去离子水，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸，苯丙氨酸接枝率为48％，其如结构式如下:
5)在装有磁力搅拌子的100mL单口烧瓶中，加入羧基化海藻糖(0.663g,羧基物质的量0.0015mol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.287g,0.0015mol)，13mL水，得到羧基化海藻糖浓度为20wt％的溶液；室温下活化30min；
6)将步骤4)的ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸作为原料，按ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸与羧基化海藻糖摩尔比1:0.6，加ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸(0.518g,氨基物质的量为0.0025mol)水溶液，在室温继续反应48h；经透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖，海藻糖接枝率约为28％，结构式如下：
其中，x+y＝7；x+z＝12。
(2)性能测试
制备的ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖，采用Alamar Blue试剂盒进行细胞毒性实验，聚合物浓度小于2mg/mL时，对小鼠成纤维细胞的存活率皆在80％以上，对绵羊红细胞溶血测试表面，溶血率小于4％，表明ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖具有良好的细胞相容性。利用ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖和小分子海藻糖对绵羊红细胞进行冻存保护实验，红细胞复苏率为约68.7％，而纯小分子海藻糖对绵羊红细胞低温冻存保护实验，红细胞存活率仅约为49％。
实施例3：
(1)ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖的制备
1)将叔丁氧羰基-亮氨酸(1.16g，物质的量为0.005mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.479g,0.0025mol)溶于6mL二甲基亚砜中，得到叔丁氧羰基-亮氨酸浓度为20wt％的溶液，搅拌45min；
2)按ε-聚赖氨酸的氨基和叔丁氧羰基-亮氨酸摩尔比1:0.75，加入ε-聚赖氨酸(0.48g,氨基物质的量为0.00375mol)水溶液在室温反应56h，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-亮氨酸；
3)将得到的ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-亮氨酸产物按质量体积分数20％加入三氟乙酸充分溶解，并室温搅拌4h；
4)采用乙醚沉淀，收集沉淀物后，溶于去离子水，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸，亮氨酸接枝率为47％，其如结构式如下:
5)在装有磁力搅拌子的100mL单口烧瓶中，加入羧基化海藻糖(1.326g,羧基物质的量0.003mol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.0.516g,0.0027mol)，9mL水，得到羧基化海藻糖浓度为20wt％的溶液；室温下活化35min；
6)将步骤4)的ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸作为原料，按ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸与羧基化海藻糖摩尔比1:0.8，加ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸(0.71g,氨基物质的量为0.00375mol)水溶液，在室温继续反应60h；经透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖，海藻糖接枝率约为30％，结构式如下：
其中，x+y＝9；x+z＝14。
(2)性能测试
制备的ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖，采用Alamar Blue试剂盒进行细胞毒性实验，聚合物浓度小于2mg/mL时，对小鼠成纤维细胞的存活率皆在80％以上，对绵羊红细胞溶血测试表面，溶血率小于3％，表明ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖具有良好的细胞相容性。利用ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖和小分子海藻糖对绵羊红细胞进行冻存保护实验，红细胞复苏率为约59.3％，而纯小分子海藻糖对绵羊红细胞低温冻存保护实验，红细胞存活率仅约为49％。
实施例4：
(1)ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖的制备
1)将叔丁氧羰基-缬氨酸(1.89g，物质的量为0.01mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺1.528g,0.008mol)溶于15mL二甲基亚砜中，得到叔丁氧羰基-亮氨酸浓度为13wt％的溶液，搅拌30min；
2)按ε-聚赖氨酸的氨基和叔丁氧羰基-缬氨酸摩尔比1:0.8，加入ε-聚赖氨酸(1.66g,氨基物质的量为0.013mol)水溶液在室温反应68h，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-缬氨酸；
3)将得到的ε-聚赖氨酸-接枝-叔丁氧羰基-缬氨酸产物按质量体积分数30％加入三氟乙酸充分溶解，并室温搅拌5h；
4)采用乙醚沉淀，收集沉淀物后，溶于去离子水，经过透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸，亮氨酸接枝率为43％，其如结构式如下:
5)在装有磁力搅拌子的50mL单口烧瓶中，加入羧基化海藻糖(1.326g,羧基物质的量0.003mol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.0.618g,0.0032mol)，9mL水，得到羧基化海藻糖浓度为15wt％的溶液；室温下活化30min；
6)将步骤4)的ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸作为原料，按ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸与羧基化海藻糖摩尔比1:0.65，加ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸(0.78g,氨基物质的量为0.00462mol)水溶液，在室温继续反应56h；经透析冻干处理后，得到产物ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖，海藻糖接枝率约为36％，结构式如下：
其中，x+y＝10；x+z＝13。
(2)性能测试
制备的ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖，采用Alamar Blue试剂盒进行细胞毒性实验，聚合物浓度小于2mg/mL时，对小鼠成纤维细胞的存活率皆在80％以上，对绵羊红细胞溶血测试表面，溶血率小于2％，表明ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖具有良好的细胞相容性。利用ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖和小分子海藻糖对绵羊红细胞进行冻存保护实验，红细胞复苏率为约51.3％，而纯小分子海藻糖对绵羊红细胞低温冻存保护实验，红细胞存活率仅约为49％。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换，均落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽，其特征在于结构式为:
式(I)中，R为对甲苯磺酰基-精氨酸或苯丙氨酸或亮氨酸或缬氨酸；n＝25～30；x≥0，y≥0，z≥0且x、y和z不能同时为0；n>x+y+z>0。
2.权利要求1的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽的制备方法，其特征包括如下步骤：
1)将疏丁氧羰基-疏水氨基酸和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按照摩尔比1:0.5～1.0溶于二甲基亚砜，搅拌30～60min后，按照羧基和氨基摩尔比1:0.5～1.0加入ε-聚赖氨酸；经室温反应48～72h得到ε-聚赖氨酸接枝叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽产物；
2)将ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽按质量体积分数10％～30％加入三氟乙酸溶剂充分溶解，室温搅拌2～6h，ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸多肽脱去保护基团叔丁氧羰基得到ε-聚赖氨酸接枝-叔丁氧羰基-疏水氨基酸产物，用乙醚沉淀后，可经溶于去离子水透析冻干处理得到ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸多肽产物，如式(II)；
式(II)中k为ε-聚赖氨酸接枝疏水氨基酸多肽的重复单元数，n>k>0；n＝25～30；
3)将羧基化海藻糖的羧基含量和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺按摩尔比1:0.6～1.0；溶于水中，并在室温下搅拌30～40min；随后按照氨基和羧基的摩尔比1:0.6～1.0，加ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸水溶液，在室温继续反应48-72h；反应完毕后经去离子水透析并冻干，可得到ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽产物，如式(I)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤1)中，叔丁氧羰基-疏水氨基酸包括叔丁氧羰基-对甲苯磺酰基-精氨酸、叔丁氧羰基-苯丙氨酸、叔丁氧羰基-亮氨酸或叔丁氧羰基-缬氨酸。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤2)中，ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸多肽包括ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸、ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸、ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸或ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤3)中，ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽包括ε-聚赖氨酸-接枝-对甲苯磺酰基-精氨酸-接枝-海藻糖、ε-聚赖氨酸-接枝-苯丙氨酸-接枝-海藻糖、ε-聚赖氨酸-接枝-亮氨酸-接枝-海藻糖或ε-聚赖氨酸-接枝-缬氨酸-接枝-海藻糖。
6.权利要求1的ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽作为细胞冻存保护剂应用。
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