JPH078769B2 - 土壌線虫駆除方法およびそれに用いる線虫駆除組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、土壌線虫駆除方法およびそれに用いる線虫駆
除組成物に関する。

〔従来の技術〕

近年、従来の化学殺虫剤が環境汚染への影響が大きいと
いう観点から、農業への害虫を生物学的に抑制すること
に対する関心が増大している。

農作物を害する主な害虫の１つは線虫である。かくし
て、環境を汚染せずに、この害虫を有効に駆除する方法
はきわめて望ましいものである。

ルートノット（root-knot）線虫、ルートリージョン（r
oot-lesion）線虫、シフト（cyst）線虫などの線虫を抑
制するのに線虫を喰べるバクテリアを使用することは特
開昭（J-Al）58-024508号公報で開示されている。この
公開公報によれば、線虫を喰べるバクテリアを含む溶液
はバーミキュライト、パーライト、ゼオライトまたはピ
ートモスなどの多孔性物質中に注入され、その注入され
た多孔性物質は植物の周囲に加えられる。

リゾバクテリアのある菌株による、線虫の阻止と植物へ
の菌進入の阻止についてはEP-Al-160089号公報に開示さ
れている。この公開公報によれば、線虫に対する防御は
それらのバクテリアを植物の根域に導入するか、また
は、種子を、土地に播種前にこれらのバクテリアを含む
溶液に浸漬することによってなされうる。これらのバク
テリア株による阻止は、吸収された窒素・炭素源が存在
するばあい、とくに有効である。

カルバミン酸塩またはジチオカルバミン酸塩線虫駆除剤
とパステウリア ペネトランス（Pasteuria penetran
s）菌とを併用した線虫駆除組成はEP-Al-217,378号公報
に開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明にしたがえば、キチンまたはコラーゲンで富養化
した土壌から分離された微生物は、多分線虫の卵殻か卵
サック（egg sacs）を破壊するがゆえに、土壌線虫の抑
制にきわめて有効であることが見出された。さらに本発
明によれば、その中で微生物が生育され、回収される成
長培地上澄み液、ホモジュネートまたはその抽出物は、
それら上澄み液、ホモジュネートまたは抽出物からえら
れる固形物と同様に、土壌線虫の抑制に有効でありうる
ということが以外にも見出された。そのような上澄み
液、ホモジュネート抽出物および固形生成物は、本発明
においては以下、残存培地（residual mediumまたはres
idual media）と称する。

かくして、本発明はCNCM Ｉ−804で寄託されており、
シュードモナス属に属し、線虫駆除活性を有することを
特徴とする20M株の微生物、該微生物の線虫駆除活性を
有する突然変異体および該微生物またはその突然変異体
の残存培地よりなる群から選ばれた線虫駆除活性剤の有
効量を土壌内に入れることからなる線虫駆除の方法を提
供するものである。

本発明はまた、活性成分として前記線虫駆除微生物およ
び（または）ここに定義された残存培地の有効量および
土壌環境とも相互作用のない担体からなる植物防保護用
の線虫駆除の組成物を提供する。

キチンかコラーゲンで富養化した土壌から本発明にした
がって数種類のタイプの線虫駆除微生物がえられた。キ
チンに富んだ土壌から分離されたそのような微生物の例
は、シュードモナス（Pseudomonas）属とアエロモナス
（Aeromonas）属にバクテリアである。コラーゲンに富
んだ土壌から分離されたそのような微生物の例は、クニ
ンガメラ（Cunninghamella）属の菌、とくにエレガンス
（Elegans）種の菌である。

これらの微生物の種類の株は純粋な培養形としてえられ
た。以下のものがとくに記載される。

（ｉ）まだ未同定のシュードモナス（Pseudomonas）の
バクテリアの、“20M"と呼ばれる株。この株は1988年10
月10日にパストール研究所のコレクシオン・ナショナル
・ドゥ・クルトゥール・ドゥ・ミクロオルガニスム（Co
llection Nationale de Cultures de Microganismes
（C.N.C.M））に寄託され、I-804の呼称が与えられた。

（ii）“20M-2"と呼ばれる20Mの突然変異体。

（iii）アエロモナス（Aeromonas）属の、未同定のバク
テリアの“2F"と名づけられた株。

（iv）クニンガメラ（Cunninghamella）属の菌からえら
れる。“30CE"と名づけられたエレガンス（Elegans）種
の株。

本発明はこのようにさらにキチンあるいはコラーゲンで
富養化された土壌から遊離された線虫駆除微生物の純粋
培養株を提供する。とくに、本発明はCNCM Ｉ−804で
寄託されており、シュードモナス属に属し、線虫駆除活
性を有することを特徴とする菌株20Mの純粋培養株を提
供するものである。

さらに本発明によって、前記微生物株の使用による線虫
駆除の方法と組成物が提供される。

そのようにえられた純粋培養株は、キチンからコラーゲ
ンを炭素源として含む培地中で成長され、保存された。
ただし、培地虫にはグルコースのような他の炭素源もま
た存在してもよい。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による純粋培養株は、新しい突然変異株をうるた
めに放射性物質、突然変異誘発性化学物質、γ線または
Ｘ線の照射による制御された突然変異処理を受けてもよ
い。該突然変異株はすぐれた線虫駆除能力、すぐれた生
存力、貯蔵中の改良された感染性、高成長率などのすぐ
れた他の性能をもっている。したがって、以下に使用す
る“線虫駆除微生物の純粋培養株”という語は、純粋な
状態で最初にえられる線虫駆除微生物の親株と、それ
の、線虫駆除に活性な突然変異株とを含んでいる。

本発明にしたがって、線虫駆除微生物かその残存培地
は、線虫による感染を防止するかその発生後そのような
感染の拡散を阻止するために、土壌に適用されるか、ポ
ットの土壌混合物の中に加えられる。これらの微生物か
残存混合物を土壌に適用するのに、それらを液体に調製
することができる。その液体は散布されても潅漑水に混
ぜられても、種子や根の、接種あるいは植えつけ前の浸
漬用に用いられてもよい。それらはまた固体の担体と乾
いた組成物に調製され、この形で土壌に混ぜられてもよ
い。

産業上の目的のためには線虫駆除微生物を含んだ農業用
組成物を作るために多量の線虫駆除微生物が必要であ
る。そのような多量のものは醗酵法でもっともよくえら
れる。その醗酵の過程は、特定した種の微生物培養株の
サンプルを、そのばあいに応じてキチンおよび（また
は）コラーゲンとさらにその他の栄養剤を含む醗酵培地
を入れた醗酵タンク中に接種することからなっている。
醗酵は充分な濃度、たとえばバクテリアのばあいで10¹⁰
細胞/ml、菌のばあいで10⁷細胞/mlの微生物がえられる
まで続けられる。原則として、線虫駆除微生物の工業的
規模での醗酵のばあいには、キチン以外の蛋白質も含ん
でいる純粋でない。それ故に安価なキチン原料が用いら
れてもよい。

もし線虫駆除微生物の培養株が、たとえば他のバクテリ
アで汚染されると、その結果生じた発酵物は線虫駆除活
性のない多量の、あるばあいにはきわめて多量にさえな
るバクテリアを含むであろう。このことはこの発酵物か
らつくられる組成物の効果の低減をもたらす。したがっ
て醗酵に純粋な培養株を使うことは好ましいことであ
る。

このようにしてえられた醗酵上澄み液は植物の防護に用
いられる線虫駆除微生物の液状線虫駆除組成物としてそ
のまま使用されうる。あるいはまた、液状組成物は微生
物または微生物と土壌環境と両方を他の培地に移すこと
によってつくられうる。

線虫駆除微生物の乾燥組成物はたとえば、そのようにし
てえられた醗酵上澄み液を多孔性固体担体の中に注入
し、乾燥してつくられる。しかしながら、長い間の貯蔵
後や地中での長期間ののちにさえこの微生物に活性が残
るためには、種々の適当な添加剤によって達成されると
いうことを注意しておくことが必要である。そのうえさ
らに、前記担体は、そこで他のタイプの微生物が増殖す
ることを避けるために、好ましくは栄養の乏しいもので
あるべきである。

〔実施例〕

以下の記述と実施例において下記の用語が用いられる。
すなわち、 “キチノリチックバクテリア（chitinolytic bacteri
a）” キチンで富様化した土壌から分離したバクテリアを示
す。

“コラーゲンノリチックバクテリア（collagenolytic b
acteria）” コラーゲンで富養化した土壌から分離したバクテリアを
示す。

“キチノリチック菌（chitinolytic fungi）” キチンで富養化した土壌から分離した菌を示す。

“コラーゲンノリチック菌（collagenolytic fungi）” コラーゲンで富養化した土壌から分離した菌を示す。

しかしながら、これらの語は、上に定義されたキチノリ
チックバクテリアが、ただキチノリチック活性だけをも
ち、たとえばコラーゲノリチック活性を持たないという
意味を指し示しているのではないということを記憶され
るべきである。反対に、ここで定義されたあるキチノリ
チックバクテリアは、ときとしてはそのキチノリチック
活性より強くさえあるコラーゲノリチック活性をもちう
る。同じことはキチノリチック菌そして反対にコラーゲ
ノリチックバクテリアや菌にも適用される。加えて、本
発明にしたがって分離されたすべての微生物は、実質的
な一般の蛋白質加水分解活性を示すことが見出された。

下記において引用は折々とりわけキチノリチックバクテ
リアについてなされるであろう。同じことはキチノリチ
ックおよびコラーゲノリチック菌と同様にコラーゲノリ
チックバクテリア、ムタティス ムタンディス（mutati
s mutandis）にも適用されうることは理解されるべきで
ある。

Ｉ線虫駆除微生物の調製 線虫駆除微生物は乾燥あるいは液状の組成物に調製され
うる。乾燥組成物は、原則として微生物量や土壌環境と
折り合いのよい固体担体からなる。担体は微生物の生存
力の保持と、かつ土壌に適用した際の微生物の増殖に寄
与する。担体はさらにバクテリアとその標的（すなわち
根域にある線虫の卵および卵サックとの相互作用を妨害
してはならない。好ましい担体は、多孔性の材料でつく
られていて、付着剤としてはたらく添加物が共存しても
よい。

線虫駆除微生物の乾燥組成物は、一般に固体担体の粒子
を微生物の液状懸濁液と充分な時間、すなわち粒子に微
生物懸濁液が充分注入するようになるまで接触させるこ
とでつくられる。そののち、担体は液から分離、乾燥さ
れる。種々の添加物、たとえば付着剤のようなものは注
入された担体の乾燥前に加えられる。

本発明による線虫駆除微生物の乾燥組成物は、通常の方
法で土壌内に適用されうる。たとえば、組成物は農場
（その全域または一部）に播種機や乾燥肥料の散布に用
いられる通常の装置を用いて散布されうる。乾燥組成物
は同様にポット内の土壌混合物にも含ませうる。

線虫駆除微生物の土壌内への導入はまた液状の組成物の
形で、たとえばそれらの組成物を直接処理すべき地域に
散布するとか、あるいはあらかじめ乾燥または液状の組
成物を潅漑用水に混合させて、肥料を施すときに普通に
行なわれるのと同様の方法で適用されうる。散布用の線
虫駆除微生物の水溶液組成物は、醗酵によってえられた
微生物の懸濁液あるいはその希釈物であってもよいし、
または乾燥した純粋培養株か固体組成物に水または水溶
液を加えてつくってもよい。

線虫駆除微生物がその中で育てられ、そこから回収され
る培地は、また線虫駆除活性を持つ。したがって、その
ような培地はそのままで線虫駆除の組成物として使用し
うるし、または、線虫駆除活性をもった水溶液か乾燥生
成物の形に、それ自体知られている方法で処理されても
よい。前述のとおりこのような残存培地は有効な線虫駆
除剤であって、バクテリアそのものと同様の方法で適用
される。

線虫駆除微生物の液状組成物および（または）残存培地
はまた播種や植つけ前の種子や植物の浸漬にも用いられ
る。

この組成物は土壌中への導入に際し、微生物の増殖を惹
き起すことができるので好ましい。その目的のため、た
とえば綿の実のあらびき粉、そのばあいに応じてコラー
ゲンおよび（または）キチン、および同様のものなどを
栄養源として加えることは有用なことである。一方、原
則として組成物への栄養分の添加は前もって行なわれる
が、以下のことは記憶されるべきである。すなわち早期
の導入は乾燥組成物のばあいにのみ実際的であって、そ
のときすですら好ましくない汚染微生物の増殖を避ける
ための注意がなされねばならない。

II線虫駆除微生物の純粋な培養株の生成 本発明による純粋な培養株はキチンかコラーゲンで人工
的に富養化した土壌からえられた。これらの富養化した
土壌はキチノリチックまたはコラーゲノリチックバクテ
リアと菌の増殖を推進する。それらのバクテリアや菌の
多くは土壌線虫の抑制に有効である。

富養化した土壌は戸外の場所にあるいは温室・各種のコ
ンテナー・容器などの閉鎖系の中に置かれうる。この目
的のためのある好ましいキチン源は甲殻類（ground cru
stacean）の殻や類似のものからえられるような種々の
キチンに富んだ廃棄物である。コラーゲンの１つの好ま
しいソースはたとえば食肉産業に用いられる種類のもの
である。キチンかコラーゲン源が土壌の上に散かれた場
所での好ましいその量は約15〜20g/m²である。一方、キ
チンかコラーゲン源が土壌、たとえばポット用混合物
（pot mixture）に混ぜられると、好ましい量は、約0.0
1〜0.05％（重量基準）である。

以下の論及は、とくにキチノリティックバクテリアの純
粋培養株の生成について行なう。

一旦キチノリチックバクテリアがキチンに富んだ土壌中
で増殖すると、この土壌のサンプルは集められ、唯一の
炭素源としてキチンを含む選択培地に接種される。この
目的のためには、非キチノリティックバクテリアの生長
を避けるため純粋なキチンを使うことが必要である。キ
チンの好ましい純粋な源は、たとえば、Sigma,MO.,米国
で製造されるコロイドキチンである。このものは知られ
た方法で作られうる。キチンに加えて、選択培地（sele
ction medium）は、また、KNO₃のような窒素源、Na⁺、M
g²⁺、PO₄ ^-3 SO₄ ^-2のようなある種のイオンおよびpHを
６〜８、好ましくは6.5〜7.5に保つための緩衝剤を含む
必要がある。

バクテリアが増殖するに充分な期間の培養ののち、培地
のサンプルは選択段階を加えるために、本質的に同じ組
成からなる他の選択培地に移される。このようにしてた
とえば、選択培地が寒天培地のばあいでは、バクテリア
の一つのコロニーが液状の溶液に懸濁され充分に希釈の
のち寒天に接種される。

この選択段階は純粋な培養株がえられるまで数回くり返
されうる。

コラーゲノリティックバクテリアの純粋培養株の分離方
法は、各段階でキチンがコラーゲンに置きかえられる
が、全く同様である。

菌の分離の方法も全く同様である。本質的な違いは菌の
成長に用いられる菌の成長に適当であるべき培地の違い
である。たとえば、適当な培地は“マーチン−ローズ・
ベンガル・培地（Martin-Rose Bengal Medium）”であ
る。それは炭素源としてキチンかコラーゲンを含んでい
るが、バクテリアの分離のために用いられた培地との違
いは、この培地はそのほかの炭素源としてグルコースの
ようなものを含んでいることである。

III培養株の保存 本発明に従ってえられたキチノリティックバクテリアの
純粋培養株は、すくなくともバクテリアの生存と成長の
ための最小限の要求物を供給する培地の入った培養容器
の中で保存されうる。この培地は原則としては当該分野
で知られているどんなバクテリア成長培地でもよいが、
汚染微生物の成長を抑制するために、主要炭素源として
キチンを含む成長培地を用いることが望ましい。この培
地は、それ故選択培地と同じでありうるが、キチン源は
純粋である必要はない。微生物を常に成長フェーズに保
つために、培養株のサンプルはときどき、たとえば２週
間に１回、新しい培地に移されるべきである。

培養株のこのような保存は、ただ比較的短期間、すなわ
ち数週間から数か月が適当であるということは記憶され
るべきである。培養株のより長い期間、すなわち何か月
から何年という保存は２、３日ごとに繰り返し移し変え
が必要なので骨のおれることである。加えて、たとえ最
高の注意が払われたとしても他の微生物による汚染の可
能性は常に存在する。さらに、時がたつにつれて、制御
できない形で培養株の性質を変えるであろう自然の突然
変異が起りうるのである。

コラーゲノリチックバクテリアの純粋な培養株は同様な
方法で、しかしキチンをコラーゲンに変えることで保存
できる。

本発明による、菌の培養株は菌の成長と増殖に適当な培
地中で一時保存されうる。このような培地の例は、その
ばあいによって小麦ぬかの抽出物やキチンかコラーゲン
のような炭素源を含む寒天培地である。

菌の細胞による栄養の消費と老廃物の分泌によって細胞
か、それにより生成された分生子を含むサンプルはそれ
故定期的に新しく、新鮮な培地に移されるべきである。
たとえば、もし培養株が寒天培地で成長されたばあい
は、菌細胞で生成された分生子は収集され、新しい寒天
培地上に接種される。分生子の収集は寒天培地上に蒸溜
水を加えることによって、うまく行なわれる。寒天培地
の上では浸透圧のために熟成した（ripe）分生子は、上
澄み液中に排出され、そこから容易に回収される。

バクテリアに関する前記の記載と同様の理由から、その
ような保存は比較的短期間のばあいにのみ適当である。
６か月までの保存期間については、たとえばぬか抽出物
の寒天培地のような、固体マトリックス上の菌細胞の単
層膜が、約４℃で保存される。

他方、分生子懸濁液は長期間、すなわち約12カ月まで４
℃で貯蔵されうる。

IV菌株の長期貯蔵 長期の貯蔵は、前記のとおり、微生物懸濁液を凍らせる
かそれの凍結乾燥でおこなわれる。キチノリティックバ
クテリアのばあい、培養株はある時間、対数増殖期に到
達するまで成長させられる。そのような成長に適した培
地は液状のコロイド状キチン培地である。凍結の前に、
たとえばグリセロール80％とコロイド状キチンを含む液
状培地20％からなる凍結混合物がバクテリア懸濁液中に
混ぜられる。こうしてえられた混合懸濁液は、しばらく
の間、たとえば約30分間、室温に保たれ、それから−70
℃にまで凍らされる。

凍結乾燥のためには、キチノリティックバクテリアは液
状のコロイド状キチン培地中で対数増殖期に達するまで
成長させられる。そのバクテリア懸濁液は、そののち、
たとえば12000gで10分間遠心分離にかけられる。上澄液
を除いたあとにえられるバクテリアのペレット（pelle
t）は10％の脱脂粉乳の液に懸濁され、その懸濁液はゆ
っくりと、たとえば渦巻によって混合される。このよう
にして混ぜられた懸濁液はドライアイス−アセトン中で
凍らされ、そののち凍結乾燥にされる。

バクテリアの解凍または水和化は、それ自体知られてい
る方法で行なわれる。

本発明の他の微生物の長期貯蔵は、当業者にとって明ら
かな種々の変法と共に同様の方法で行なわれる。

Ｖ醗酵 これらの微生物の農業用線虫駆除組成物を作るための大
量の微生物をうるためには醗酵が必要である。醗酵の培
地は一般に炭素源と微生物の成長と増殖に必要な他の成
分を含んでいる。しかしながら、汚染した、線虫駆除能
力のない微生物の成長を防ぐために、炭素源には、すく
なくとも主要なものとして特定の微生物に従ってキチン
かコラーゲンを用いることが好ましい。以下、醗酵につ
いてはキチノリティックバクテリアについて記載する。

大量のキチノリチックバクテリアをうるための醗酵培地
は好ましくは炭素源としてキチン、たとえば未精製の甲
穀類（ground crustaceam）の穀（以下“粗キチン”と
呼ぶ）を含み、さらにグルコースのような付加的な炭素
源を含んでもよい。好ましくは醗酵培地は、また緩衝塩
類、酵母エキス、グルコースおよびKNO₃のような窒素源
を含んでいる。

そのような醗酵培地ではどのファクターも限界にならな
いように注意されねばならない。そして多くのパラメー
ターすなわち、pH、ミネラル濃度（mineral strengt
h）、温度などはバクテリアの許容範囲内に、好ましく
は最高レベルに保たれるべきである。

発酵の最適pHは約6.5〜7.5であることが見出された。酵
母エキスの最適濃度は約0.1％から0.4％（重量／体積
比）であることが見出された。その好ましい濃度は約0.
3％である。

チッ素源としてKNO₃が用いられたときは、前記のような
培地におけるその最高濃度は約0.5％から約0.2％であっ
て、0.1％が好ましいことが見出された。グルコースは
必然的な構成物ではないが、バクテリアの成長にポジテ
ィブの効果をもつことが分った。グルコースの最適濃度
範囲は約0.1％ないし0.4％、そして0.2％が好まいしこ
とが分った。キチン源として粗キチンが用いられたとき
は、その好ましい濃度範囲は約0.1％から0.4％で約0.2
％がより好ましい。これらのバクテリアの成長は緩衝塩
の濃度に敏感であることが分った。緩衝塩の濃度は約0.
01M以下に保たれるべきである。好ましい濃度は約0.008
Mである。

最高条件が保たれると、最終的な細胞数は10¹⁰細胞/ml
の数に到達する。

コラーゲノリチックバクテリアの発酵は同様な方法で、
ただしキチンをコラーゲンに変え、他のすべての条件は
同じままで行なった。好ましいコラーゲン源は、たとえ
ば食肉産業に用いられるものである。

線虫駆除菌の発酵は菌をたとえば種々の産業廃棄物中で
成長させて行なわれる。好ましい発酵培地はたとえばじ
ゃが芋の煮汁（煮たじゃが芋の可溶性抽出物である）、
トウモロコシのひたし汁（corn-steep liquor）（澱粉
工業におけるトウモロコシの種子を煮込んだのちに残る
シロップ）、コットンミール（cotton meal）の抽出物
（綿の実を煮込んだのちの抽出組成物）、乳ショウ、麦
ぬかまたはこれらの混合物であって、それらにはコラー
ゲンおよび（または）キチンが添加されてもよい。菌は
半固体メデューム、すなわち湿った粒子固体培地すなわ
ちバーミキュライト、ピートモスのような粉状担体、ま
たはさとうもろこし、小麦または大麦の粒のような湿っ
た粉状化されたマトリックス内でも発酵しうる。

液体発酵は菌のサンプルを成長培地に接種し、かつ培地
を充分な時間好気培養することにより行われる。発酵の
ための最適な温度は約25℃であり、そして最適なpHは6.
5〜約8.0である。発酵は攪拌のもと、たとえばフラスコ
を振りながら行なわれるのが好ましい。

前記の培地の中で、菌の培養株の発酵を行なうための好
ましい液状培地は、約20％のじゃが芋煮汁、0.1％のコ
ラーゲンおよび（または）キチンを含むものである。こ
の培地内では、７〜９日間の培養後の細胞の生産量は上
にあげられた他の培地のそれの約10倍である。加うる
に、乳しょうととうもろこしひたし汁の相対体積割合が
2:1になるまでとうもろこしひたし汁を追加された乳し
ょう培地においても同様の生産量が達成されることが見
出された。

半固体発酵は前記の特定された多数の担体上において行
なってもよい。そのような発酵後に収集されることがで
きる菌細胞の最終的数量は、液体発酵によりえられる量
よりも多いが、発酵時間は、担体の形式にもよるが、通
常はより長い。

以下の記述の中に、いくつかの例やテストが記載されて
いて本発明を説明しているが、本発明はこれらの例に限
定されるものではなく、また請求の範囲の記載に定義さ
れた発明の範囲内に限られるものでもなく、当該分野に
通じた者によって直ちに理解されるであろうような修飾
が可能であると理解されている。

さらに、以下の例はとくにすぐれた生産物であり、本発
明の姿であるバクテリアCNCM Ｉ−804で寄託されてお
り、シュードモナス属に属し、線虫駆除活性を有するこ
とを特徴とする菌株20Mの純粋培養株を引用している。
しかしながら請求の範囲のおよび範囲内の他のバクテリ
ア株によっても同様の結果がえられるということは了解
されるべきである。

以下の記載においては、つぎに示す添付図面が折々参照
されている。

第１図および第２図はそれぞれ異なる培地が20M細胞増
殖に与える影響を調べた実験結果を示すグラフ、第３図
はpHが20M細胞増殖に与える影響を調べた実験結果を示
すグラフ、第４図は異なる２つの培地において酵母エキ
スが20M細胞増殖に与える影響を調べた実験結果の一例
を示すグラフ、第５図はキチン、20Mおよび2Fがトマト
苗木の根におけるゴール指数に与える影響を調べた実験
結果の一例を示すグラフ、第６図はキチン、20Mおよび2
Fがトマト苗木の根あたりの線虫の幼虫の数に与える影
響を調べた実験結果の一例を示すグラフ、第７図は30C
E、そのホモジェネート、コラーゲンおよびキチン・プ
ラス・コラーゲンがゴール指数に与える影響を調べた実
験結果の一例を示すグラフ、第８図はコラーゲンを伴な
った30CEおよび伴なわない30CEがゴール指数に与える影
響を調べた実験結果の一例を示すグラフである。

実施例１〔20Mおよび2Fの分離〕 50ml容のポットは、0.2％（重量基準）のクランドサン
（Clandosan）が混合された天然砂質土壌で満たされ温
度が27〜29℃に制御された温室中で45日間培養された。
土壌は全培養期間中湿り気をもたせられた。

毎日４つのポットをとり、それぞれのポットから土壌試
料20gを、キチノリティックバクテリアの分離の処理を
それらに施すまで５℃で貯蔵した。

キチノリティックバクテリアを分離するため、土壌のサ
ンプル10gを、250ml容のフラスコ中で無菌水90mlに懸濁
させ、ついでこのフラスコを回転振とう機で30分間振盪
した。デシマル希釈液（decimal dilutions）を調整
し、唯一の炭素源として0.2％（重量基準）のキチン
（シグマ（Sigma）MO.,USA）を含むソルト培地（salt m
edium）をもった寒天プレートに0.1ml散布された。

バクテリアのキチン活性はキチンの分解によって生じた
バクテリア・コロニーの周囲の環によって明示された。
キチン活性を示すコロニーは分離され、さらに処理され
た。最も強いキチン活性（すなわち、コロニーの周囲の
もっともはっきりした環）を示したコロニーはさらに線
虫駆除活性のふるいにかけられた。

線虫駆除活性を有する多くの培養株がえられた。そのな
かでも、20日後に取った土壌サンプルから分離された20
Mおよび2Fは、最も強いキチン活性と最高の線虫駆除活
性を示した。

実施例２〔20Mおよび2Fの成長培地〕 20Mおよび2Fの培養株を成長させるために適した培地
は、つぎのような組成である： 粗キチン0.2％、グルコース0.2％、KNO₃ 0.1％、（N
H₄）₂SO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.03％、KH₂PO₄ 0.1
％、K₂HPO₄ 0.15％および酵母エキス0.05％。

この培地において、最適pHは6.5から7.0であり、最適温
度は約25℃であることがわかった。

この培地はそのままで、発酵培地としても、グルコース
なしで保存培地としても好適なものである。

実施例３〔20Mの特性〕 （ａ）抗生物質感度 20Mの懸濁液を、実施例１の成長培地を含んでいる寒天
プレートに散布した。様々な抗生物質が含浸されたディ
スクが寒天プレート上に置かれ、ついでこれは30℃で24
時間培養された。抗生物質の結果を、成長阻止区域に直
径を測定することにより検定した。

その結果を以下の第１表に示す。

（ｂ）いろいろな発酵の段階における20Mのキチン活性
および蛋白質分解活性 20Mは以下のように３段階で発酵させられた。

第１段階:10⁶細胞/mlを含有している20Mの懸濁液は、実
施例２のグルコースを除いた成長培地80ml中に混合さ
れ、24時間培養された。

第２段階：第１段階でえられた20Mの懸濁液100mlは、酵
母エキスを0.3％に上げた以外は実施例２の組成をもつ
成長培地900ml中に移され、さらに24時間培養された。

第３段階：第２段階でえられた20Mの懸濁液１は、第
２段階のものと同じ組成の成長培地４に移された。

試料は第２段階および第３段階の終りに回収され、キチ
ン活性および蛋白質分解活性を検出するために比色試験
が施された。

その結果を以下の第２表に要約して示す。

第２表からわかるように、キチナーゼ活性を別として、
20Mは比較的強い蛋白質分解活性を有している。

実施例４〔20Mの突然変異体〕 リファンピイシン（rifampiicin）に対する耐性を示す2
0Mの突然変異株が分離された。その耐性は、この抗生物
質200μg/mlの存在下で阻止されずに成長する菌株の能
力によって明らかである。そうでなければ、その特性は
20Mの特性と同一である。

20M-2と称せられるこの菌株は、抗生物質をその成長培
地または発酵培地に加えてもよいという利点があり、こ
の微生物が阻止されることなく成長する間に、それだけ
で困難で高価な専門技術である厳しい滅菌条件を守ると
いう必要なしに他の種類の汚染微生物の成長が除かれる
かまたは少なくとも最小にされる。

実施例５〔20Mおよび2Fの発酵〕 （Ｉ）20M （ａ）初期発酵 実施例２にしたがってえられた成長培地５を入れた５
容のベンチ・トップ（bench top）発酵槽に、20M懸濁
液50mlが最終濃度が10⁴細胞/mlとなるように接種され、
バクテリアが24時間好気的に（aerobically）成長させ
られた。

（ｂ）主発酵 初期発酵でそのように培養された培地は実施例１の培地
をさらに200入れた200容のバッチ（batch）発酵槽
に移され、その混合物はさらに20〜24時間培養された。
培養後、細胞を数えたが、いずれのばあいにも収量は約
10¹⁰細胞/mlであった。

（II）2F 2Fの発酵は、20Mのばあいと同様の方法で行なわれ、ほ
ぼ同じ収量の細胞がえられた。

実施例６〔寒天における成長〕 （Ｉ）20M 20Mの培養株の試料は、寒天培地を含んでいるプレート
上で成長させられた。その寒天はコロイド状キチンとさ
らには実施例２のばあいと同様の成分（粗キチンおよび
グルコースを除く）を含んでいる。約24時間後、バクテ
リアの細胞を数えたところ、細胞の収量は約10¹⁰細胞/m
lであることがわかった。

細胞のキチン活性はバクテリアのコロニーの周りの環に
よって明らかであった。

（II）2F 2Fは、20Mと同様の方法で寒天上で成長させられ、同様
のキチン活性が観察された。

実施例７〔様々な成長培地における20Mの成長〕 （ａ）キチン源、ミネラルの組合せおよびグルコースの
効果 ２つの異なったミネラル溶液を用いた。ひとつは、すな
わち硫酸塩を含んでいる。“C"と名づけたものであり、
もうひとつは硫酸塩およびリン酸塩を含んでいる“S"と
名づけたものである。

それぞれの溶液に、３種類のキチンのいずれかを加え
た。これらの３種類とは粉末キチン（CT）、コロイド状
キチン（COLO）および粗キチン（CL）である。試験され
た培地の半分にグルコースを補充した。

このようにして、以下のような培地が試験された。

S-CT:バッファＳ＋グラウンドキチン S-CT＋G:バッファＳ＋グラウンドキチン＋グルコース S-COLO:バッファＳ＋コロイド状キチン S-COLO＋G:バッファＳ＋コロイド状キチン＋グルコース S-CL:バッファＳ＋粗キチン S-CL＋G:バッファＳ＋粗チキン＋グルコース C-CT:バッファＣ＋グラウンドキチン C-CT＋G:バッファＳ＋グラウンドキチン＋グルコース C-COLO:バッファＣ＋コロイド状キチン C-COLO＋G:バッファＣ＋コロイド状キチン＋グルコース 10⁷細胞/mlの細胞を含んでいる20Mの培養株から取り出
された懸濁液0.1mlは、試験されたそれぞれの培地20ml
に接種された。このようにして、試験された培地におけ
る初期の細胞の濃度は約10⁵細胞/mlであった。培養株が
その対数増殖期であった６時間後および培養株が定常期
であった24時間後に、細胞数を数えた。その結果を添付
した図面である第１図および第２図にグラフで示す。第
１図の縦軸は細胞数の初濃度に対する倍率を表わし、第
２図の縦軸は1ml当たりの細胞数を表わす。

結果から明らかなように、６時間後および24時間後両方
の接種において、Ｓミネラル培地はＣミネラル培地より
もすぐれていることがわかる。また、試験された３つの
キチン源のうち、CTはCOLOと同じくらいかまたはそれよ
りもすぐれ、またCLはその両者よりもすぐれていること
がはっきりわかる。

粗キチンは、廃棄物から調製され、そのため３つのキチ
ン源のうち最も安価なキチン源であるが、20M培養株を
成長させるのに好ましいキチン源である。粗キチンがす
ぐれているのは、他の２つのキチン源がキチン以外の有
機物をほとんど含まないのに対して、粗キチンは蛋白質
残留物をはじめ、おそらくビタミン類や他の栄養成分も
含んでいるという事実によるのである。

より純粋なキチン源が要求されるばあいには、CTを使用
することが好ましい。その理由としては、よりよい成長
を生じさせることに加え、調製に労力を要し時間がかか
るCOLOよりも安価なキチン源でもあるからである。

Ｃミネラル溶液のばあいには、グルコースの補充は害が
あった。これは、Ｓミネラル培地が一塩基性リン酸カリ
ウムと二塩基性リン酸カリウムとのバランスにより、よ
りすぐれた緩衝能を有するのに対してＣ溶液培地はたい
へん小さい緩衝能しか有さないことによるのであろう。
グルコースは発酵培地中でpHを低下させるので、おそら
く、Ｃ培地の限られた緩衝能によって、培地はバクテリ
アが成長するには酸性になりすぎたのであろう。その一
方でＳ培地では、pHの低下が小さかったので好適な成長
の条件が供されるのであろう。

しかしながら、６時間後にはグルコースは、S-CTおよび
S-CL培地において成長を遅らせたが、この効果は24時間
後に逆になり、グルコースの補充をうけた培地はグルコ
ースのない培地よりもこの時間までに相当高い細胞数と
なったことは注目すべきである。１つの可能な説明はこ
れらの２つの培養株に対する遅れ時間が異なるというこ
とである。

（ｂ）pHの効果： 培養株はコロイド状キチンを含むＳ培地中で成長され、
pHは一塩基性リン酸カリウムと二酸基リン酸カリウムの
比率を変えることにより操作された。pHを5.2と7.2間で
変化させた。その結果を添付した図面の第３図にクラフ
で示す。第３図の縦軸は細胞の最高濃度を1ml当りの細
胞数で表わし、横軸はpH値を表わす。この結果から、こ
の培地中で20Mバクテリアが成長するための最適pHは6.4
〜7.2であることがわかる。

このpHに対する感度によって、（ａ）において試験され
たいろいろな培地に対する成長のちがいが説明される。
pHの変化が許容限界をこえて起こる培地では、pHが許容
レベルにある培地よりも成長が小さいだろう。

キチン源としての粗キチンにより達成されたすぐれた成
長の結果は、キチンは蛋白質を含有し、グルコースを伴
なう発酵はpHを下げる傾向があるけれども蛋白質を含む
培地での発酵はpHを上げる傾向があることによって説明
されうるかもしれない。明らかに、粗キチンやグルコー
スはpHのバランスを破るが、一方同時にグルコースはす
ぐれた成長培地を構成するのである。

（ｃ）緩衝剤のモル濃度の20Mの成長への影響： 培地中の最適pHレベルの維持は、原則として緩衝能を強
めることにより達せられうる。20Mバクテリアが、緩衝
能を増加させるために必要であるより高い塩濃度に耐え
うるかを試験するために、残りの成長培地の構成はその
まま変えずに異なった緩衝剤濃度で細胞の成長を測定し
た。24時間の好気性の成長ののち、成長したバクテリア
の細胞の濃度がそれぞれのばあいに数えられた。

バクテリアは高い緩衝剤レベルにおいてもまた成長した
が、最大のバクテリア細胞濃度は、緩衝剤レベルが0.01
M以下の培地においてみられることがわかった。これら
の結果からこの微生物は高い塩濃度に敏感であり、それ
ゆえに本発明によれば発酵培地における緩衝剤濃度は約
0.01M以下に保たれることが好ましい。

（ｄ）酵母エキス濃度の20Mの成長への影響： 酵母エキス濃度の20Mの成長への影響をS-CL＋Ｇ培地お
よびS-COLO培地について試験した。その結果を第４図に
グラフで示す。第４図の縦軸は細胞の最高濃度を1ml当
りの細胞数で表わし、横軸は１中のグラム数で表わし
た酵母エキス濃度を表わす。

S-COLO培地において、酵母の補充によって2g/をピー
クとして、成長が改善された。しかしながら、3g/を
こえたばあいには成長は減少した。この減少は、酵母エ
キスの補充が培地のpHを許容限界以上に高くする傾向が
あることに起因しているかもしれない。

要求される酵母エキスの最適量は、培地に加えられる炭
素源によって異なるかもしれない。

（ｅ）様々な培地成分の比率の20Mの成長への影響 成長培地を調整するには、どんな１つの要因も限界に達
しないように、しかもpHおよびミネラルの強さはバクテ
リアの成長の許容制限内に保たれるように栄養素をバラ
ンスよく供給しなければならない。前記に示されたよう
に、酵母エキスは確実に成長に影響があるが、酵母エキ
スの供給が高いレベルにおよぶとpHに影響があるため、
その供給は制限内に保たれるべきである。加えて、下記
に示すようにグルコースは極端に高い量のチッ素源が培
地中にないばあいのみ、成長を高めることがわかった。
しかしながら、もし様々な補充のつりあいがうまく保た
れれば、たとえば、より多くの粗キチンとグルコースを
その２つのバランスを維持しながら同時に供給すること
により、よりすぐれた成長が達成されるだろう。以下の
実験は、異なった補充の比率を変えることにより成長速
度を改善しうるかどうかを試験するために行なわれた。

（e1）キチン：グルコール比が20Mの生長に与える影響 結果をまとめて第３表に示す。第３表中CLは粗キチンＧ
はグルコースを示す。

粗キチンとグルコースとを各々0.4％含有する培地を除
き、すべてのテストにおいて最高細胞密度はほぼ同程度
であった。粗キチンとグルコースを各々0.4％含有する
培地のばあい、最高細胞密度が他よりあきらかに高く、
成長率も他より高いものであった。

これらの結果は、粗キチンとグルコースとの相対比が維
持されているならばそれらを増量しうることを示してい
る。

（e2）粗キチン、グルコース、酵母エキス、KNO₃ 栄養源が20M成長率に与える影響 残りの成分は実施例２と同じままで、粗キチン、グルコ
ース、酵母エキスおよびKNO₃の濃度が変更された。20M
培養株の成長率が、各ケースにおいて測定された。結果
をまとめて第４表に示す。

第４表中CLは粗キチン、Ｇはグルコース、Yeはイースト
抽出物を示す。

各々のケースにおいて、KNO₃を1g/とすることにより
成長は低下せしめられ、最大細胞密度はKNO₃が0.51g/
のばあいに匹敵する程度に低下せしめられた。また、グ
ルコースを0.4％とすることにより酸性状態となり、そ
の結果、最終的な細胞密度はグルコースが0.2％のばあ
いに匹敵する程度に一貫して低下せしめられた。また、
酵母エキスの添加により、pHがわずかに上昇せしめら
れ、成長が促進される傾向があった。

前記結果によれば、本発明に用いる好ましい培地とし
て、0.1g/のKNO₃と、0.3％のイースト抽出物と、キチ
ン源として0.2〜0.4％の粗キチンと、0.2％のグルコー
スとが添加されたＳミネラル培地があげられる。

実施例８〔20Mの線虫駆除活性〕 20Mパックド・セル〔packed cells）の一定量が、線虫
を接種した土壌を含有したポット（各ポットあたりエム
・ジャバニカ（M.javanica）が500卵）に添加された。
トマトの苗が植えられるのに先だって、10⁸細胞/gの土
壌が添加された。

20Mが植物に与える影響は、いくつかのパラメータを用
いて評価された。すなわち、全地上部生体重、根におけ
るこぶ形成度および卵の数が用いられた。

その結果を第５表に示す。

この結果より、20Mがエム・ジャバニカの増殖に対して
驚くべき阻止効果を生じ、計数において90％の減少をも
たらすことがわかる。

同様の結果が、別な９つの実験においてもえられた。

実施例９〔20M菌株の特性描写〕 この菌株の特性を容認された実施方法にしたがって測定
したところ、以下のような結果がえられた。

細胞の形 棒状（rods） 幅（μｍ） 0.6〜1.0 長さ（μｍ） 1.5〜5.0 自動性 ＋ 鞭毛突出 ポーラー（polar）＞１ グラム（gram）反応 − ３％KOHにる溶菌 − アミノペプチダーゼ（セルニー（Cerny）） ＋
胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 成長： 嫌気性 − 37/41℃ ＋／− pH5.6 − マック・コンキー（Mac-Conkey）寒天 − SS寒天 − セトリミド（Cetrimid）−寒天 − NaCl ３％ − 色素 黄色 非拡散性 ＋ 拡散性 − けい光Ｘ線 − ピオシアニン − 酸性化（Acid from）（OF-Test）： グルコース好気性 − グルコース嫌気性 − グルコースからのガス − 酸性化（Acid from）（ASS）： アラビノース ＋ セロビオース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ フルクトース ＋ ラクトース − マルトース ＋ サッカロース − キシロース ＋ エタノール − OPNG − 抗利尿ホルモン（ADH） − VP − インドール − NO₃からのNO₂ − 脱チッ素反応 − フェニルアラニンデアミナーゼ − ショ糖からのレバン − レシチナーゼ − ウレアーゼ − ポリ−β−ヒドロキシブチレード ＋ 細胞壁タイプ:A1γ、メソ−DAP direct 少量のメソ−DAPが見つかった。それはグラム陰性のバ
クテリアに対して特有なものである。

加水分解： デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン ＋ DNA no gr トゥイーン 80 ＋ エスクリン ＋ チロシン分解 − 成長要因必要物 − 使用した物質： − アセトン − アジペート（adipate） − ベンゾエート − ブチレート − カパレート（caparate） − シトレート − シトラコネート − フマレート ＋ グリコレート − ラクテート − レブリネート − マレート − マロネート − フェニルアセテート − プロピオネート − ピルベート ＋ サッカレート ＋ スクシネート − L-アラビノース ＋ フルクトース ＋ グルコース ＋ マンノース ＋ マルトース ＋ L-ラムノース ＋ リボース ＋ サッカロース − トリハロース（trihalose） ＋ キシロース ＋ m-イノシトール − マンニトール − グルコネート ＋ 2-ケトグルコネート − N-アセチルグルコサミン − L-グルタメート ＋ L-ヒスチジン ＋ L-セリン − L-スレオニン − n-ブタノール − 前記の結果に基づき、菌株20Mはシュードモナス属に属
することが決定された。この菌株の種はまだ同定されな
かったが、新しい種であるかもしれない。

参考例１〔菌株2Fの特性描写〕 I:AP;20E試験 以下に示す結果がえられた： 形 棒状（rods） 自動性 ＋ 成長反応 − 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ − 成長： 嫌気性 ＋ 好気性 ＋ NaCl ０％ ＋ ３％ ＋ 7.5％ − 色素（op.100〜200nm） − 加水分解： デンプン ＋ トゥイーン80 ＋ カゼイン ＋ ビブリオスタティック（vibriotatic） 化合物2,4-ジアミノ‐6,7-ジイソプロピルプテリジンへ
の耐性 ＋ 酸性化（Acid from）： グルコース ＋ マンニトール ＋ イノシトール − ソルビトール − ラムノース − スルロース ＋ メリビオース − アニグダリン ＋ アラビナーゼ − β−ガラクトシダーゼ ＋ アルギニン−デヒドロラーゼ ＋ リシン−デカルボキシラーゼ ＋ オルニチン−デカルボキシラーゼ − クエン酸ナトリウム利用能 − H₂S生成 − ウレアーゼ − トリプトファン−デアミナーゼ − インドール生成 ＋ アセトン生成（ピルビン酸から） ＋／− セラチナーゼ ＋ NO₃からのNO₂生成 ＋ N₂ガスへの還元 − グルコース発酵 ＋ グルコース酸化 ＋ マッコンキー培地成長 ＋ （グルコースからのガス −） 前記の結果に基づき、99.9％の確率で、2Fはアエロモナ
ス・ビドロフィラ（Aeromonas hydrophyla）種であると
同定された。

II:APi 20NE試験 以下のような結果がえられた： NO₃のNO₂への還元 ＋ TPPインドール生成 − グルコール酸処理 ＋ 抗利尿ホルモン（ADH） ＋ ウレアーゼ − エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ） ＋ セラチン（celatin）加水分解（プロテアーゼ） ＋ OPNG（β−ガラクトシダーゼ） ＋ 同化： グルコース ＋ アラビノース − マンノース ＋ マンニトール ＋ N-アセチル‐グルコースアミン ＋ マルトース ＋ グルコネート（gluconate） ＋ コプレート（coprate） ＋ アジペート（adipate） − マレート ＋ シトレート ＋ フェニルアセテート − オキシダーゼ ＋ これらの結果に基づき、2Fは種のはっきりした同定なし
にアエロモナス（Aeromonas）属に属していると同定さ
れる。

III:AP:50CH試験 えられた結果を以下の第６表に示す。

この試験に基づき、2Fは種のはっきりした同定はない
が、アエロモナス属に属していると同定される。

参考例２〔2Fの線虫駆除効果〕 線虫を接種した土壌を含有したポットまたはスチロフォ
ームのコーン型カップ（ポットあたりエム・ジャバニカ
500卵およびカップあたり同100卵）にトマトの苗が植え
られた。植付に先だって、前記土壌はさらに、つぎの処
理のうちの１つを受けた。

（ａ）無処理； （ｂ）キチン0.05％の添加； （ｃ）キチンおよび20Mパックド・セルの添加； （ｄ）キチンおよび2Fパックド・セルの添加； （ｅ）キチンおよび20Mプラス2Fパックド・セルの添
加。

スチロフォームのカップからの植物は、植付後７日で収
穫され、ポットの植物は植付後35日で収穫された。ポッ
ト中のゴール指数（GI）およびスチロフォームのカップ
中の植物の根あたりの幼虫の数量が測定された。その結
果をそれぞれ第５図および第６図に示す。第５図の縦軸
はゴール指数を、第６図の縦軸は植物の根あたりの幼虫
数を表わす。

これにより、キチン自体が線虫の汚染の防御に有効であ
り、それがおそらくは、土壌中に存在するキチンノリチ
ック微生物の増殖を開始することによるものであろうこ
とがわかる。

前記結果はまた、2Fと20Mとがともに線虫駆除活性を有
しており、同様な有効性を有していることも示してい
る。

参考例３〔30CEの分離〕 クニンガメラ エレガンス（Cunninghamella Elegans）
（ムコラレス（Mucorales）となる種の30CEなる菌株
が、コラーゲンで改質された砂質土壌から分離され、マ
ーチン−ロゼ・ベンガル（Martin-Rose Bengal）培地中
で純粋化された。

10gの土壌のサンプルが、250ml容のフラスコ内で90mlの
無菌水中に懸濁せしめられたのち、30分間振盪された。
ついで前記懸濁液をデシマル希釈後（decimal dilution
s）に調製され、各希釈液のサンプルは、そののち、培
養プレート中に0.1％のコラーゲを含有する塩培地で調
製された寒天培地上に散布された。

該プレートが菌細胞の実質的な成長が生ずるまである時
間培養されたのち、サンプルが新たな寒天培地に移入さ
れ、この培養−移入サイクルは均一な培養株が選択され
るまで数回繰返された。

参考例４〔30CEの成長培地〕 30CEなる培養株を成長させるための好適な培地として
は、つぎの組成を有するものがあげられる。

コラーゲン:0.2％ K₂HPO₄:0.08％ CaCl₄:0.019％ MgSO₄・7H₂O:0.039％ グルコース:0.2％ このような培地においては、最適pHは約6.5〜7.0で、最
適温度は約30℃であることがわかった。

参考例５〔30CEの発酵培地〕 30CEの発酵のための培地としては、約20％のじゃが芋の
煮汁と約0.1％のコラーゲンとを含むものがあげられ
る。

参考例６〔30CEまたはその残留培地の線虫駆除活性〕 30CEの菌株が参考例４の成長培地中に添加され、エルレ
ンマイヤー・フラスコ内で振盪しながら30℃で３日間培
養された。菌細胞自体を伴なった培地（以下、培地とい
う）または均一化された培地（以下、ホモジェネートと
いう）のいずれかが、そののちテストされた。

ポットあたり650個の卵を接種された500gの土壌を入れ
た複数のポットの各々に、前記培地、ろ液またはホモジ
ェネートのいずれかが添加された。ばあいによっては、
前述の添加に加えてコラーゲンが、それ自体、またはキ
チンとの組合わせとして土壌に添加された。

５週間後、該植物は引抜かれ、根のこぶおよびコール指
数を調べるために観察された。ばあいによっては、線虫
の計数が行なわれた。線虫で汚染されてはいるが無処理
のポットが対照の基準とされた。

（ａ）30CEの培地およびホモジェネートの線虫駆除効果 種々の処理がゴール指数（GI）に与える影響が第７図に
示されている。第７図の縦軸はゴール指数を表わす。第
７図よりわかるように、30CEのホモジェネートはGIを減
少させる最強の効果を有していた。また、前述のものと
統計的に有意差のない同様の強い効果が、土壌を培地
（生きた30CE細胞を含有するもの）およびキチンとコラ
ーゲンとの混合物で処理したばあいにも観察された。
（後者の効果は、おそらくは土壌中のコラーゲノリティ
ックおよびキチノリティック微生物の増殖を開始するこ
とに起因している。）ある効果については、コラーゲン
で処理されたものについても観察された。

（ｂ）コラーゲンの添加が30CEの線虫駆除活性に与える
影響 第８図にはコラーゲンの添加が30CEの線虫駆除活性に与
える影響を示す。第８図の縦軸はゴール指数を表わす。
第８図よりわかるように土壌中への30CEの添加はゴール
指数の減少にある効果を有し、30CEの培養株にコラーゲ
ンが添加されたばあいにはそれによりはるかに強い効果
が観察された。このようなコラーゲンの添加は菌細胞の
増殖の促進を可能にする。

なお、前記実施例では30CEが調製されない形態で土壌に
添加されたが、適切に調整された30CEを添加したばあい
には、はるかに強い効果、すなわち、コラーゲンを伴な
うばあいにえられる効果に匹敵する効果またはそれをこ
える効果が期待されうる。

〔発明の効果〕

本発明の方法によってえられた微生物および該微生物を
含む組成物は、線虫駆除活性を有し、化学物質からなる
農薬にみられるような環境汚染の危険なしに植物の線虫
からの防御に有効であることが分る。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ異なる培地が20M細胞増
殖に与える影響を調べた実験結果を示すグラフ、第３図
はpHが20M細胞増殖に与える影響を調べた実験結果の一
例を示すグラフ、第４図は異なる２つの培地において酵
母エキスが20M細胞増殖に与える影響を調べた実験結果
の一例を示すグラフ、第５図はキチン、20Mおよび2Fが
トマト苗木の根におけるゴール指数に与える影響を調べ
た実験結果の一例を示すグラフ、第６図はキチン、20M
および2Fがトマト苗木の根あたりの線虫の幼虫の数に与
える影響を調べた実験結果の一例を示すグラフ、第７図
は30CE、そのホモジュネート、コラーゲンおよびキチン
・プラス・コラーゲンがゴール指数に与える影響を調べ
た実験結果の一例を示すグラフ、第８図はコラーゲンを
伴なった30CEおよび伴なわない30CEがゴール指数に与え
る影響を調べた実験結果の一例を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エリ・コーン イスラエル国、テル‐アビブ、テル‐バル ク、 モスバン ストリート 29／エー (72)発明者 セルジオ・ガルペル イスラエル国、レホボト 76 484、 ヘ ルスヘンゾン ストリート 47

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】CNCM Ｉ−804で寄託されており、シュー
   ドモナス属に属し、線虫駆除活性を有することを特徴と
   する20M株の微生物、該微生物の線虫駆除活性を有する
   突然変異体および該微生物またはその突然変異体の残存
   培地からなる群より選ばれた線虫駆除活性剤の有効量を
   土壌中に導入することからなる土壌線虫駆除方法。
2. 【請求項２】CNCM Ｉ−804で寄託されており、シュー
   ドモナス属に属し、線虫駆除活性を有することを特徴と
   する20M株の微生物、該微生物の線虫駆除活性を有する
   突然変異体および該微生物またはその突然変異体の残存
   培地からなる群より選ばれた線虫駆除活性成分の有効
   量、ならびに該活性成分および該土壌環境と親和性のあ
   る担体からなる植物防護用線虫駆除組成物。
3. 【請求項３】水性液状担体と、該担体中に懸濁された前
   記微生物からなる請求項２記載の組成物。
4. 【請求項４】担体が固体多孔性物質であり、前記微生物
   が該固体多孔性物質に充填されてなる請求項２記載の組
   成物。
5. 【請求項５】前記組成物が付着剤として作用する添加剤
   をさらに含む請求項４記載の組成物。
6. 【請求項６】さらに栄養源を含んでなる請求項２、３、
   ４または５記載の組成物。
7. 【請求項７】前記栄養源がコットンミール、キチンおよ
   びコラーゲンからなる群よりえらばれたものである請求
   項６記載の組成物。
8. 【請求項８】CNCM Ｉ−804で寄託されており、シュー
   ドモナス属に属し、線虫駆除活性を有することを特徴と
   する20M株の微生物または該微生物の線虫駆除活性を有
   する突然変異体の純粋培養株。