KR20220016154A - 메틸로박테리움 종. 노브. 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 내생식물 질소-고정 세균으로서 이의 용도 - Google Patents

메틸로박테리움 종. 노브. 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 내생식물 질소-고정 세균으로서 이의 용도 Download PDF

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펠릭스 페르난데스 마르틴
안토니오 호세 베르나베 가르시아
아나 빌라 마르티네스
프란시스코 호세 카르모나 알바레스
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Abstract

본 발명은 재배 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 수탁 번호 제 CECT 9580 호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.(Methylobacterium sp. nov.) 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 식물에서 내생식물 질소-고정 세균으로서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

메틸로박테리움 종. 노브. 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 내생식물 질소-고정 세균으로서 이의 용도
본 발명은 재배 분야(agronomic field)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 메틸로박테리움 종. 노브.(Methylobacterium sp. nov.) 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 식물에서 내생식물 질소-고정 세균(bacterium)으로서 이의 용도에 관한 것이다.
많은 비료가 농업 분야에서 공지되어 있다. 특히, 질소-계 비료, 예를 들어, 암모니아, 질산암모늄(NH4NO3) 및 요소는 작물 수확량을 가능한 높게 유지하기 위하여 일반적으로 사용된다. 실제로, 식물에서 많은 생물학적 공정은 질소를 포함하는데; 예를 들면, 질소는 아미노산 및, 따라서 단백질의 생산에 포함된다.
그러나, 작물에 적용되는 질소-계 비료의 분획 만이 식물 물질로 전환된다. 식물 물질로 전환되지 않는 비료의 양은 토양 속에 축적될 수 있거나 지표수, 또는 지하수 내로 흘러서 수질 요염을 유발할 수 있다.
화학 비료 사용을 감소시키기 위하여, 질소-고정 세균을 포함하는 접종물을 사용하여 이러한 화학 비료를 부분적으로 대체시킬 수 있다.
메틸올 자화세균(methylotrophic bacteria)의 주요 저장소(reservoir)는 일반적으로 토양 및 물(담수(sweet water) 및 염수(salt water) 둘 다)이지만, 이러한 세균은 또한 광범위한 천연 및 인공 환경, 예를 들면, 먼지, 호수 침전물, 공기, 화장 크림(facial cream), 발효된 생성물, 물 공급 네트워크(water supply network), 욕실 및 냉난방 장치(air conditioning system) 속에 존재한다.
그러나, 공지된 접종물(incoculant)은 식물의 성장 자극에서 만족스러운 결과를 허용하지 않을 뿐 아니라 화학 비료의 대체, 또는 이러한 화학 생성물의 사용에 있어서 유의적인 감소를 허용하지 않는다.
성장 자극인자 및/또는 질소 고정으로 작용하는 많은 공지된 미생물은 유의적인 질소 함량을 생산하여 식물 성장에 필요한 질소 단위를 유의적으로 감소시킬 수 없다. 이러한 공지된 미생물은 인돌아세트산과 같은 일부 유형의 옥신을 생산하며 질소 고정보다는 발근을 촉진시킨다.
US 2015/101373 A1호는 질소 고정 및 식물 성장 촉진 메틸로박테리움(Methylobacterium) NRRL B-50628 및 NRRL B-50629을 개시하고 있다.
KR 2007 0106867 A호는 질소 고정 및 식물 성장 촉진 메틸로박테리움 후지사와엔세(Methylobacterium fujisawaense) CBMB 20를 개시하고 있다.
US 2018/168167 A1호는 식물 성장 촉진 진균 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이파룸(글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸) BCCM 54871을 개시하고 있다.
문헌: SI-WON LEE ET AL: "Methylobacterium dankookense sp. nov., isolated from drinking water", THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 47, no. 6, (2009-12-01), pages 716-720, XP055350364, DOI: 10.1007/s12275-009-0126-6은 메틸로박테리움 단코오켄세(Methylobacterium dankookense)의 효소 활성 및 유전적 유사성을 개시하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주 뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물을 제공하고, 작물에 긍정적인 영향을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 화학 질소-계 비료의 사용을 적어도 감소시키는 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주를 제공하는 것이다.
이러한 및 다른 목적은 제1항에 따른 메틸로박테리움 종. 노브. 균주에 의해 달성된다.
다음의 설명에서, 본 발명의 특징은 예시적인 구현예를 참고로 기술될 것이지만; 본원에 개시된 본 발명의 어떠한 특징도 여기에 개시된 하나 이상의 다른 특징과 조합되어 본 발명의 추가의 구현예를 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 본 출원에 의해 개시된 것으로 고려될 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상은 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주이다.
참고 sb0023/3으로 기탁자에 의해 확인된, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주는 2018년 3월 21일자로 스페인 30100 무르시아, 에디피시오 시임 깜푸스 데 에스피나르도 7에 소재하는 심보르그 에스. 엘.(Symborg S.L.)에 의해 국제 기탁기관 Colecci
Figure pct00001
n Espa
Figure pct00002
ola De Cultivos Tipo (CECT)(에스파니아 46980 파테르나(발렌시아가) 까떼드라띠코 오거스틴 에스카르디노 파크 시엔티픽 유니베르시떼 드 발렌시아가 에디피시오 3 뀌 소재)에 번호 제CECT 9580호로 기탁되었다.
본 발명의 균주는 당해 분야에 공지된 토양 균근균(mycorrhizal fungus) 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸(Glomus iranicum var. tenuihypharum)의 포자의 내부로부터 단리되었다. 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸은 당해 분야에 공지된 수지상체 토양 균근균(arbuscular mycorrhizal fungus)이다. 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸은 2013년 4월 19일자로 BCCM 기탁 번호 제54871호 하에, 벨기에 1348 루베-라-네브 박스 엘7.05.06 크로익 뒤 수드 2, 마이코떼뀌 드 유니버시떼 까톨리크 드 로바인(MUCL), 유니버시떼 카톨리크 드 로바인 소재의 국제 기탁 기관: Belgian Coordinated Collections of Micro-Organisms (BCCM)에 심보르그 에스. 엘.(Symborg, S.L.)에 의해 기탁되었다.
글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸은 제WO2015/000612호 및 제WO2015/000613호에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 균주는 메틸로박테리움 단코오켄세(Methylobacterium dankookense)에 대해 높은 유사성(gen 16S의 서열을 기반으로 98.7%)을 나타낸다.
UBCG를 통한 계통유전체학적 분석은 본 발명의 균주에 대해 가장 가까운 동류로서 메틸로박테리움 단코오켄세를 나타내었다. 수집된 데이타는 본 발명의 균주를 수용하기 위한 신규 종의 생성을 뒷받침하였으며, 이를 위해, 예를 들면, 마이코박테리움 심비오엔세 노브. 명칭이 제안될 수 있었다.
이것이 신규 종으로서 고려될 수 있는지를 입증하기 위하여, 표현형적 및 유전형적 특성화를 검정하였다.
본 발명의 균주는 그람-양성(Gram-negative)이고, 엄격하게 호기성이며, 이는 개별적으로 또는 2개가 쌍으로 나타난, 측면의 편모를 지닌 바실러스의 형태(0.8~1 μm 너비 및 1.2~1.6 μm 길이)이고, 포자를 형성하지 않는다. MMM 아가 또는 MFbM 아가(Agar) 상에서 5 내지 7일 동안 성장시킨 콜로니는 정의된 선명한 경계부를 지닌 환형의, 핑크 색상이며, 이는 다른 유사한 균주에서 기술되지 않았다. 이는 28℃의 최적 온도를 갖는다. NaCl의 존재하에서, 성장 속도는 이것이 성장하지 않는 3% NaCl 또는 그 이상까지 감소한다.
다중유전자(multigene), 게놈-기반 계통발생론적 접근법은 본 발명의 균주, CECT 9580가 가장 가까운 동류를 보다 잘 확인하기 위하여 UBCG 도구를 사용하여 달성하였다. 본 발명에 따른 균주의 위치는 속 내부의 동류의 15개 게놈을 함유하는 UBCG 트리(tree)에서 탐색되었다. 트리(도 13)는 엠. 단코오켄세(M. dankookense)에 대한 특이적인 관계를 나타낸다.
유리하게는, 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 균주는 식물에게 질소를 제공하여, 외부 질소 유입량을 60%까지 감소시키도록 할 수 있는 내생식물 질소-고정 세균이라는 사실에 의해 특성화된다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 균주는 상기 균주의 부재하에서 필수적일 수 있는 외부 질소 유입량과 관련하여 외부 질소 유입량의 60%의 감소를 허용한다.
유리하게는, 본 발명의 균주는 뿌리로부터 잎으로 및 이의 역으로 식물 전체에 이동할 수 있다.
본 발명의 균주의 단리 공정은 다음 단계를 포함한다:
· 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸의 하나 이상의 포자를 제공하는 단계;
· 포자로부터 세포질을 추출하는 단계;
· 추출된 세포질을 메탄올-함유 배지 속에 접종하는 단계; 및
· 접종된 배지를 항온처리하여 본 발명의 베틸로박테리움 종. 노브. 균주를 성장시키는 단계.
구현예에 따라서, 본 발명의 균주의 단리 공정은 다음의 단계를 포함한다:
· 외부 소독 주기(external disinfection cycle)의 과정을 통해 이미 표면 소독된 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸의 포자로부터 단리하여, 포자 용액을 수득하는 단계;
· 상기 공정 후, 포자 용액을 분쇄하고 진균 세포질을 최소 염 메탄올 배지(Minimum salt Methanol Medium)(MMM) 속에서 배양하는 단계;
· 본 발명의 균주의 콜로니를 확인하고, 핑크 색상을 나타낸 이들 중 하나를 집어올려(pick up) 배지로부터 재-단리하는 단계.
구현예에 따라서, 세포질을 추출하기 전에, 포자를 소독제로 처리함으로서, 포자의 외벽을 소독한다.
포자의 외벽의 소독은 당해 분야에 공지된 기술에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 포자의 외벽의 소독은 포자를 차아염소산나트륨(예컨대, 완충액, 예를 들면, Tween® 80 속에서 5% 차아염소산나트륨)으로 처리함으로써 수행할 수 있다.
글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸의 포자로부터 세포질의 추출은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 적합한 완충액, 바람직하게는 링거 액 속에서 포자를 분쇄함으로써 수행할 수 있다.
추출된 세포질을 메탄올-함유 배지(예컨대, 최소 염 메탄올 배지(MMM)) 속에 접종한 후, 바람직하게는, 메탄올-함유 배지는 다음의 조성을 갖는다: 메탄올, 20,0ml; NaNO3, 0,5g; (NH4)2SO4, 0,5g; MgSO4·7H2O, 0,5g; K2HPO4, 1,0g; FeSO4·7H2O, 0,01g; CaCl2·2H2O, 0,01g; KCl, 0,5g; 비타민 용액, 1,0 ml; 미량영양소 용액, 2,0ml; 아가(Agar), 12g; pH 7,20. 접종된 배지는 바람직하게는 28℃에서 5일 동안 항온처리함으로써, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주가 성장하도록 한다.
구현예에 따라서, 항온처리는 25℃ 내지 30℃(바람직하게는 28℃)에서 수행할 수 있다.
구현예에 따라서, 항온처리는 5 내지 9의 범위(바람직하게는 7)의 pH에서 수행할 수 있다.
본 발명의 균주의 항온처리 및 성장 후, 콜로니는 대표적인 핑크 색상의 생산에 의해 가시적으로 확인된다. 이후에, 하나 이상의 콜로니를 집어서 바람직하게는 적어도 3회 재-단리함으로써 이들이 임의의 가능한 오염물로부터 깨끗해지도록 보증한다.
본 발명의 균주는 조성물 내로 포함시키기에 적합하다.
본 발명의 다른 대상은 기탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된, 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주를 포함하는 조성물이다.
구현예에 따라서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 농업적으로 허용되는 담체 및/또는 하나 이상의 농업적으로 허용되는 공-제형제(co-formulant)를 포함할 수 있다.
농업적으로 허용되는 담체 및 농업적으로 허용되는 공-제형제는 당해 분야에 공지되어 있다.
구현예에 따라서, 담체 및/또는 공-제형제는 활석, 점토, 말토덱스트린, 탈지유, 글루코스, 식물성 무수 추출물, 예를 들면, 차, 카사바(cassava) 및 퀴노아(quinoa), 카올린(caolin), 코이어(coir), 규조토, 키틴, CaCO3, 알기네이트, 카라겐(carragen), 수팩틴(surfactin), 람노피피드(rhamnolipid), 소포로리피드(sophorolipid), 사포닌, 칼륨 올레이트 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
구현예에 따라서, 조성물은 고체형, 수성 액체형, 오일성 액체형, 유액형, 반-고체형 또는 겔형으로 존재할 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 고체형이고, 보다 바람직하게는, 조성물은 분말형으로 존재한다.
또한, 본 발명의 대상은 본 발명의 균주, 즉, 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주를 포함하는 조성물의 생산 방법이다.
구현예에 따라서, 본 발명의 조성물은 이것이 토양 적용에 의해, 예를 들면, 관수 시스템(drip irrigation system) 또는 적심(drench), 또는 엽면 적용(foliar application)에 의해 종자 코팅으로서 적용된다는 사실에 의해 특성화된다.
본 발명의 조성물을 생산하는 공정은 다음의 단계를 포함한다:
· 본 발명에 따라 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 적어도 하나의 메틸로박테리움 종. 노브.를 제공하는 단계,
· 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 메탄올을 포함하는 액체 배양 배지 속에 접종시키는 단계,
· 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 배양하여 메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물을 수득하는 단계; 및
· 상기 액체 배양물을 건조시켜 무수 조성물을 수득하는 단계.
유리하게는, 배양 단계 말기에, 본 발명의 메틸로박테리아의 최종 생산을 배양물 속의 세균의 광학 밀도 및 생물량 생산을 측정함으로써 확인한다.
구현예에 따라서, 본 발명의 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.를 BCCM 기탁 번호 제54871호 하에 기탁된 토양 균근균 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸의 포자의 내부로부터 단리한다.
구현예에 따라서, 메탄올을 포함하는 배지는 MMMM, 즉, 메탄올이 들어있는 최소 광물 배지이다.
구현예에 따라서, 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 배양하여 메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물을 수득하는 단계는 25℃ 내지 30℃ 범위(바람직하게는 28℃)의 온도에서 3 내지 10일 동안 항온처리함으로써 수행할 수 있다.
구현예에 따라서, 본 발명의 적어도 하나의 메틸로박테리움 종. 노브.를 제공하는 상술한 단계는 본 발명의 균주를 질소 유리된 배지, 예를 들면, NFBG(글루코스가 보충된 질소 유리된 세균 배지)를 사용하여 본 발명의 균주를 회수하는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들면, NFBG 배지는 다음의 조성을 가질 수 있다: 글루코스, 말산 5,0 g, 메탄올 20,0ml, (NH4)6Mo7O24 4H2O 0,002g, MgSO4 7H2O 0,2g, K2HPO4 0,1g, KH2PO4 0,4g, FeCl3 0,01g, NaCl 0,1g, KOH 4,8g, 미량영양소 용액 2,0 ml, 비타민 용액 1,0 ml, 브로모티몰 블루 용액(Bromothymol blue sol.), KOH 2N 상의 0,5% 2,0 ml, pH 6,9.
구현예에 따라서, 질소 유리된 배지를 사용하여 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브.를 회수하는 것은 25℃ 내지 30℃ 범위(바람직하게는 28℃)의 온도에서 3 내지 10일 동안, 바람직하게는 5 내지 7일 동안 수행할 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 균주는 적-핑크색의 콜로니를 형성한다. 따라서, 본 발명의 균주의 콜로니는 용이하게 확인할 수 있다.
구현예에 따라서, 본 발명의 적어도 하나의 메틸로박테리움 종. 노브.를 제공하는 상술한 단계는 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브.의 콜로니를 선택하는 단계 및 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 질소-유리된, 메탄올-포함 배지(예컨대, MMMNF, 메탄올 질소가 유리된 광물 최소 배지)를 사용하여 선택적으로 선택시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구현예에 따라서, 질소-유리된, 메탄올-포함 배지를 사용하여 성장시킨 후, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브.의 콜로니를 선택하여 메탄올을 포함하는 액체 배양 배지 속에 접종할 수 있다. 구현예에 따라서, 상기 선택적으로 성장시키는 단계는 25℃ 내지 30℃ 범위(바람직하게는 28℃)의 온도에서 3 내지 10일 동안, 바람직하게는 5 내지 7일 동안 항온처리함으로써 수행할 수 있다.
구현예에 따라서, 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 배양하여 메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물을 수득하는 상술한 단계는 발효에 의해 수행할 수 있다.
구현예에 따라서, 상기 메틸로박테리움 종. 노브를 배양하여 메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물을 수득하는 상술한 단계는 성장시켜 예비-접종물로서 사용될 메틸로박테리움 종. 노브.의 배양물을 수득하는 제1 단계, 및 바람직하게는 발효에 의해 대량 성장시키는 제2 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 대상은 생물-자극제 및/또는 식물 속의 내생식물 질소-고정 세균으로서 본 발명의 수탁 번호 CECT 9580호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주의 뇽도이다.
실제로, 본 발명의 균주 뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물은 식물을 자극하여 식물의 건강 및 수율을 증가시킬 수 있음이 놀랍게도 관찰되었다.
또한, 유리하게는, 본 발명의 균주 뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물을 사용하여 식물에 질소를 제공할 수 있음이 놀랍게도 관찰되었다. 특히, 본 발명의 균주를 식물에게 제공함으로서, 화학 질소 비료의 사용을 실질적으로 감소시킬 수 있음이 관찰되었는데; 예를 들면, 60%까지의 화학 질소 비료의 사용에서의 감소가 본 발명의 균주, 또는 이를 포함하는 조성물을 사용하여 수득될 수 있음이 관찰되었다.
또한, 본 발명의 대상은 따라서, 질소 외부 유입량을 바람직하게는, 60%까지 감소시키기 위한, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 용도이다.
유리하게는, 본 발명의 균주는 식물에게 단독으로, 또는 다른 농업적으로 허용되는 구성성분을 포함하는 조성물의 구성성분으로서 제공될 수 있다.
본 발명의 균주는 대기 질소를 고정시킴으로써 뿌리 및/또는 지상부로부터 식물을 자극시킬 수 있음이 관찰되었다. 특수한 과학적 설명에 얽메이지 않고, 본 발명의 균주는 식물의 조직내로 침투하여 대기 질소를 NH4 +로 환원시키는 니트로게나제 효소 복합체를 포함하는 미생물 효소계를 활성화시키는 것으로 관찰되며, NH4 +는 특수한 생리학적 조건 하에서 미토콘드리아 Glu 데하이드로게나제(NADH-GDH)를 통한 2-옥소글루타레이트의 아민화에 의해 Glu(글루탐산)으로 및, 후속적으로 세포질성 글루타민 신타타제 1(GS1)에 의해 글루타민으로 직접 혼입될 수 있다. 글루타민 옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라제는 흔히 GOGAT로 약칭된 효소이며, 이는 글루타민 신테타제와 함께, 글루타민 및 α-케토글루타레이트로부터 글루타메이트를 생산하고, 식물에 의해 동화된 광합성에서 질소 동화작용의 조절에 있어 중요한 역할을 담당한다.
유리하게는, 본 발명의 균주는 인의 용해도를 증가시키며(이는 특히 파종 단계(seeding stage)에서 유리하다), 옥신 및 카로텐을 생산할 수 있고, 제2 뿌리의 발달을 자극함이 또한 관찰되었다.
유리하게는, 본 발명의 균주는 다양한 작물에게 제공될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 균주는 원예 재배, 목초성 식물(graminaceous plant), 감귤류 재배(citrus cultivation), 핵과(stone fruit)(석과(drupe))의 재배, 포도나무 재배(vine cultivation) 및 산림에 제공되는 경우 특히 유용하다.
본 발명의 균주의 다른 장점은 이것이 숙주 식물에서 광합성을 양호하게 하므로, 식물 생물량을 증가시킨다는 것이다.
· 도 1은 성장 챔버내에서 폐포내에서 성장하는 식물을 나타낸다.
· 도 2는 메틸로박테리아의 성장에 대한 소독 후 특이적인 배양 배지에 노출된 식물 조직 샘플(뿌리(a), 줄기(b) 및 잎(c))을 나타낸다.
· 도 3은 종자 드레싱(seed dressing)에 의해(a-c), 관주에 의해(d-f) 및 엽면 적용에 의해(g-i) 본 발명의 균주로 처리되고 메틸로박테리아용의 특정 배양 배지에 노출된 식물의 식물 조직 샘플의 영상을 나타낸다.
· 도 4는 본 발명의 균주를 사용한 처리 1 및 처리 2 대조군의 분포 영상을 나타낸다. 필드(Field) 1(a), 필드 2(b), 필드 3(c).
· 도 5는 적용 30일 후 SPAD 측정에 의한 그래프를 나타낸다.
· 도 6은 필드 1(a), 필드 2(b) 및 필드 3(c)에 대한 NDVI 지수를 나타낸다.
· 도 7은 필드 1(a), 필드 2(b) 및 필드 3(c)에 대한 조합된 CIR 지수를 나타낸다.
· 도 8은 볼 발명의 균주를 사용한 처리 1 및 처리 2 대조군을 사용한 시험의 분포 영상을 나타낸다. 필드 1(a), 필드 2(b).
· 도 9는 적용 30일 후 SPAD 측정에 의한 그래프를 나타낸다.
· 도 10은 15일마다 측정한, 처리 45일 후 필드 1에서 NDVI 지수를 나타낸다.
· 도 11은 15일마다 측정된, 처리 45일 후 필드 2에서 NDVI 지수를 나타낸다.
· 도 12a는 처리(들)의 적용 시간에 분무기를 나타내고 도 12b는 처리(들)의 적용 시간에 곡물 크기(grain size)를 나타낸다.
· 도 13은 아미노산 서열을 사용하여 UBCG로 생성시킨 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다. 마디에서 숫자는 유전자 지지체 지수(gene support index)(최대 값은 92이다)를 나타낸다. 게놈 수탁 번호는 괄호 안에 나타낸다. 바아(Bar), 위치당 0.05개 치환.
실험 단락
본 발명의 추가의 양태 및 장점을 다음의 비-제한적 실시예를 참고하여 나타낼 것이다.
본 발명의 균주는 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸의 포자로부터 수득하였다.
이는 0.5% 차아염소산나트륨 및 Tween 80으로 5분 동안 포자를 세척하고, 5회의 소독 주기를 수행함으로써 외부 포자벽의 수개의 소독 공정을 통해, 포자의 내부로부터 단리하였다. 이우헤, 포자 용액을 분쇄하고 진균 세포질을 최소 염 메탄올 배지(Minimum Salt Methanol Medium)(MMM)(메탄올, 20,0ml; NaNO3, 0,5g; (NH4)2SO4, 0,5g; MgSO4·7H2O, 0,5 g; K2HPO4, 1,0g; FeSO4·7H2O, 0,01g; CaCl2·2H2O, 0,01g; KCl, 0,5g; 비타민 용액, 1,0ml; 미량영양소 용액, 2,0ml; 아가, 12g; pH 7,20) 속에서 28℃에서 5일 동안 파종하였다. 배지로부터, 5개의 상이한 콜로니를 확인하고, 핑크 색상을 나타낸 것을 집어서 적어도 3회 재-단리함으로써 이들이 임의의 다른 가능한 오염으로부터 깨끗해지도록 하였다.
실시예 1
시험 1. 본 발명의 균주의 적용 경로.
실험은 본 발명의 균주, 즉, 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 균주인, 메틸로박테리움 종. 노브.를 옆면 적용, 토양 적용 및 종자 코팅, 즉, 종자 드레싱(seed dressing)에 의해 적용시키는 배양 챔버 속에서 수행하였다.
본 발명의 균주의 존재는 잎, 줄기 및 뿌리에서 평가하였다. 식물내에서, 뿌리로부터 잎으로 및 잎에서 뿌리로 균주의 이동 시간, 및 뿌리 기공 및 종자의 침투를 또한 평가하였다.
메틸로박테리아의 식물 내로의 도입 및 상이한 조직의 콜로니화를 확인하기 위하여, 폐포내에 종자를 및 배양 포트 내에 옥수수 식물을 접종하여 시험을 수행하였다. 이러한 경우 3회 처리를 적용하였다: 종자 코팅, 관주를 통한 적용 및 옆면 적용. 본 발명의 균주의 콜로니의 존재를 접종 후 상이한 시간 및 일자(hours and days after inoculation)("h.a.i." 및 "d.a.i.")에 3개의 생물학적 복제물의 뿌리, 줄기 및 앞에서 분석하였다.
· 물질 및 방법
사용된 식물 물질 및 미생물.
옥수수 종자(제아 마이스 엘.(Zea mays L.)를 플루디옥소닐로 코팅하고 메페녹삼 살진균제를 식물 물질로서 사용하였다. 본 발명의 균주 메틸로박테리움 종. 노브. 및 헤르바스피릴룸 세로페디카에(Herbaspirillum seropedicae)에 속하는 균주를 미생물 접종물로서 사용하였다.
옥수수 식물의 성장 조건.
옥수수 식물의 성장을 위해, 도 1에 나타낸 바와 같이, 광의 존재하에서 24℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 성장 챔버 속에 배열된, 2:1의 비의 규사 및 코코넛 섬유를 기반으로 한 멸균 기질의 혼합물이 들어있는 작은 플라스틱 용기를 4주 동안 사용하였다. 식물에게 주당 2회 석회질이 제거된 멸균수를 주었다. 파종 후 15일째에, 식물에게 0.3%의 영양물 용액 N:P:K: 4:1.7:4.5 및 미량영양소 용액을 주었다.
옥수수 식물에서 본 발명의 균주를 사용한 처리
상이한 처리를 옥수수 식물에서 수탁 번호 제CECT 9580호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주를 사용하여, 종자 코팅(즉, 종자 드레싱)에 의해, 관주에 의해 및 옆면 적용, 즉, 잎 경로에 의해 수행하였다. 접종물은 고체형(분말)으로 사용하였다. 분말 속의 세균 농도는 1 x-109 CFU/g의 차수로 존재하였다. 연구된 각각의 처리를 음성 대조군으로서 처리하지 않은 식물과 비교하였다 또한, 질소-고정 세균 헤르바스피릴룸 세로페디카에(Herbaspirillum seropedicae)를 1.2-x 106 CFU/g의 고체 양식 농도으로 시험의 양성 대조군으로서 사용하였다.
a) 종자 코팅.
옥수수 종자를 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 분말 접종물로 코팅하였다.
b) 관주 경로
파종 4일 후에, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주 및 헤르바스필리룸 세로페디카에를 관주를 통해 식물당 1 내지 1.2 x 106 CFU의 농도로 접종하였다. 이러한 목적을 위해, 고체형의 세균 접종물을 추가의 처리를 위해 물 속에 희석시켰다.
c) 잎 경로
식물이 분류 BBCH 12-13와 상응하는, 2 내지 3개의 잎을 나타낸 경우, 실제 잎 사이에 존재하는 경우, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 및 헤르바스피릴룸 세로페디카에를 엽면 경로로 접종하였다. 고체 세균 접종물을 물로 1-x 106 CFU/식물의 농도로 희석시켰다. 앞서, 기질을 플라스틱으로 덮어서 처리로 인한 오염을 방지하였다. 세균 처리는 잎을 분무기로 분무함으로써 수행하였다.
· 뿌리, 줄기 및 잎에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주 콜로니의 검출.
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주를 사용한 처리 후, 상이한 식물 조직 속에서 이의 양성 대조군 헤르바스필리룸 세로페디카에와 함께 이러한 세균의 존재를 분석하였다. 이를 표면적으로 소독하여 거짓 양성을 피하였다. 이를 위해, 이를 30초 동안 에탄올(70 %) 및 차아염소산나트륨(1%)의 용액 속에 2분 동안 침지시키고, 후속적으로 증류수로 2회 세척하였다. 소독(뿌리 및 잎) 후, 메틸로박테리아용의 특정 배양 배지로 후속적인 이전을 위해 줄기 내에서 종 및 횡으로 절단하였다. 도 2는 메틸로박테리아의 성장을 위한해 소독 후 특정 배양 배지에 노출시킨, 이러한 식물 조직 샘플을 나타낸다. 특히, 도 2의 패널 "a"는 뿌리 샘플을 나타내고, 도 2의 패널 "b"는 줄기 샘플을 나타내고 도 2의 패널 "c"는 잎 샘플을 나타낸다. 배양 배지 속에 둔 조직 샘플을 7일 동안 28℃에서 항온처리하였다. 콜로니 성장을 Leica Wetzlar 입체현미경에서 관찰하고, 광을 MC170 HD Leica 카메라로 찍었다. 식물을 첫날 1 내지 24시간 사이에 및 접종(관주 및 엽면) 또는 발아(코팅) 후 2 내지 10일 사이에 분석을 위해 수거하였다. 이러한 생물학적 복제물을 3회 처리 및 분석된 시간에 대해 사용하였다.
· 수득된 결과의 통계적 분석
결과의 통계적 분석을 위해, 사용된 방법은 p<0.05의 유의성 수준으로, 최소의 유의적인 차이의 피셔 시험(Fisher test)과 함께 간단한 ANOVA이었다. 소프트웨어 STATGRAPHICS Centurion 18 뿐만 아니라 데이타 프로세싱 및 그래프 표시를 위한 마이크로소프트 엑셀을 사용하였다.
· 결과
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브.의 적용 효과: 식물의 감염 및 콜로니화.
(a) 종자 드레싱
코팅으로 접종시킨 처리된 식물내 세균 콜로니를 검출하기 위한 제1의 평가를 종자의 발아 시기와 동시에, 48시간째에 수행하였다. 분석은 2일 후 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주가 내부 조직 속에 존재하였고, 4일 후 이들은 줄기 속에 존재하였으며 6일 후 이들은 잎 속에 나타났다. 따라서, 새로운 구조를 향산 세균의 이동은 식물이 발달하면서 일어났다.
b) 관주
관주를 통한 접종의 경우에, 세균은 1시간 째에 뿌리의 내부 조직 속에 존재하였고 4 내지 8일 사이에 줄기로 상승하여, 처리 후 10일째에 잎에 도달하였다. 이러한 경우에 이것이 모든 복제물에서 균질하지 않았음을 강조하는 것이 좋다.
c) 엽면 경로
엽면 경로에 의해, 세균이 접종 후 1시간째에 잎의 내부 조직에서 발견되었고, 처리 후 6시간 째에, 이는 줄기 및 뿌리 속 둘 다에서 검출되었다.
도 3은 종자 드레싱(a-c), 관주(d-f) 및 엽면 적용(g-i)에 의해 본 발명의 균주로 처리하고, 메틸로박테리아용 특정 영양 배지에 노출시킨 심물의 식물 조직 샘플의 영상을 나타낸다.
여기서 하기 보고한 표 1은 10일 동안 식물의 상이한 부분에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 콜로니의 검출과 관련된 데이타를 나타낸다. 범례: H: 시간, d: 일, 20-40%(+), 50-80%(++) 및 90-100%(+++)에서 세균의 존재. 줄기 A: 정점 줄기(Apical Stem); 줄기 B: 기저 줄기.
Figure pct00003
· 결론
본 시험에서, 미생물의 도입이 뿌리 층(root zone) 전체 및 지상부에 의해 둘 다에서 효과적이었음이 측정되었다. 따라서, 임의의 방법으로 처리된 식물에서, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 콜로니가 존재하였고, 이는 이러한 내생식물 미생물이 뿌리로부터 잎으로 및 다시 역으로 이동하였음을 나타낸다.
실시예 2 시험 2. 잔기 주기 옥수수의 재배에서 40%의 질소 비료의 감소에 대한 본 발명의 균주의 사용 효능.
· 목적.
잎의 녹색(green color of the leaf)(SPAD)의 발현, 식물 지수(vegetation index), 식물내 질소 수준, 잎 속의 미생물의 농도 및 생산 수율의 평가를 통해, 통상의 성장 조건에서 질소 도포 비료의 40%의 감소에 대한, 콘(corn)(옥수수)의 발달에 있어 본 발명의 균주의 효능을 알기 위함이다.
· 물질 및 방법.
시험 필드 및 시비(fertilization)
시험은 스페인에서, 휴스카(Huesca)의 3개 농장에서 수행하였다. 제1 농장은 좌표가 휴스카의 몬테수신(Montesusin)내 41° 52'12.7"N 0° 23'11.1" W이고; 제2 농장은 좌표가 휴스카의 에 벨베르 드 신카의 41° 40'47.6"N 0° 17'09.5"이고; 제3 농장은 좌표가 휴스카의 에 타마리테 드 리테라의 41° 47'58.1"N 0° 23'56.0"이다.
시비 권장량은 통상의 시비이고 질소 감소 처리에서는 40% 감소이었다. 당해 목적을 위해, 비료를 비료 살포기를 사용하여 여기 하기에 보고된, 표 2에 명시된 양으로 분배하였다.
표 2는 각각의 구획에서 각각의 비료 속에 사용된 양, 비료의 유형 및 질소 비료 단위(nitrogen fertiliser unit)(NFU)를 나타낸다.
Figure pct00004
· 필드내 처리의 분배
필드는 다음의 표면을 가졌다: 필드 1(5.43 ha), 필드 2(3.28 ha) 및 필드 3(2.34 ha). 16 미터 너비의 2개의 연이은 지역을 매개변수의 평가를 위해 구하였다. "1"로 표시된 지역은 처리된 지역이고 "2"로 표시된 지역은 대조군 지역이다.
도 4는 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주를 사용한 처리 1(지역 1) 및 처리 2 대조군(지역 2)을 사용한 시험의 분배를 나타낸다. 특히, 도 4의 패널 "a"는 필드 1을 나타내고, 도 4의 패널 "b"는 필드 2를 나타내고 도 4의 패널 "c"는 필드 3을 나타낸다.
· 긴 주기의 옥수수에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브 균주의 배양 및 시비의 특성.
콘 종자(제아 마이스(Zea mays))를 품종 "40F"의 곡물에 대해 300 kg/ha의 재배 비율로 선택하고, 3 cm의 깊이와 75 cm의 열 간격 및 동일한 열 내 15 cm의 간격으로 파종하였다. 각각의 파종 레인의 너비는 스프링클러(sprinkler) 사이가 16 m이었다. 파종일은 2018년 5월 1일부터 5일이었고, 줄기가 나온지 5일 후 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용일은 파종 후 40일째인, 2018년 6월 12일이고 스페인에서 콘 재배의 대표적인 지역에 농부들이 나타낸 필드에 파종기를 사용하여 파종하였다. 무작위 설계가 각각의 처리에 대한 필드의 플롯을 선택하는데 있어 이루어졌다.
본 발명의 메탈로박테리움 종. 노브 균주는 잎 적용으로 333 g/ha (3 x 107 CFU/g)의 용량에서 질소 시비를 40% 감소시켜 적용하였다. 결과를 통상의 시비 처리와 비교하였다.
식물이 BBCH 규모의 13 내지 14 단계로 된 경우, 엽 적용을 헥타르당 300 내지 400 리터의 브로쓰로 스프레이를 사용하여, 17℃의 공기 온도 및 52%의 상대 습도로, 2.3 mps의 북쪽 방항 바람 속도로, 잎 상에 이슬 및 60%의 흐림(cloudiness)의 존재없이 수행하였다.
· 매개변수 및 평가 방법
잎의 그램당 콜로니-형성 단위(CFU/g)의 계수
본 매개변수는 미생물이 전체 배양 주기 속에 및 잎 위에 어떠한 양이 존재하는지를 확인하기 위해 측정하였다. 이는 20개 이하의 식물로부터의 4번째 잎에의 잎의 그램을 취하고 이를 탄소원으로서 메탄올이 들어있는 질소-유리된 선택 배양 배지 속에 파종함으로써 일련 희석하여 측정한다.
SPAD(잎 속의 클로로필 수준)
본 매개변수는 식물의 양호한 영양 상태의 지표이며 질소 및 철 수준과 밀접하게 관련되어 있다. 이를 위해, SPAD(토양 식물 분석 개발(Soil Plant Analisys Development))로 알려진 측정기를 사용하였고 각각의 처리의 100개 이하의 식물의 4번째 잎에서 100회 측정하였다.
잎, 줄기 및 속대 곡물 속의 질소
본 매개변수는 수확 시기에 누적된 각각의 식물 조직내 질소의 양의 지표이다. 잎, 줄기 및 속대 곡물을 100개의 식물로부터 취하여 킬달 방법(Kjeldahl's method)으로 총 질소를 분석하였다.
드론 사진(상이한 지수를 수득하기 위한 드론의 비행)
NDVI(정규 식생 지수(Normalized Difference Vegetation Index)). 식물의 잎에서 반사된 적색광 및 근적외선의 밴드를 대조한다. 이는 캐노피 밀도(canopy density)의 일반적인 지표이고 이것이 가진 엽록소가 많을 수록 보이는 토양으로부터 살아있는 녹색 식생(vegetation)을 구별하는데 사용된다.
조합된 CIR(색상 적외선). VIR(근적외선), 적색 및 녹색 밴드를 조합시킨 적외선 합성 색상. 건강한 식생은 높은 수준의 NIR(근적외선)을 반사하여 적색으로 보인다. 잠복성 식생(latent vegetation)은 흔히 녹색 또는 청동색이나, 모래 토양은 연갈색이고 점토 토양은 암갈색 또는 청록색이다.
수율
수확 수율을 평가하기 위해, 6개의 무작위 블록을 취하고 30 평방 미터의 표면적을 수확하였다. 수득된 곡물을 각각의 구역에서 습도에 의한 손실을 빼고 칭량한다.
통계적 분석
요인(SPAD 및 성능) 및 이의 상호작용을 Windows 5.1(미국 Manugistics, Inc.)용 Statgraphics Plus 소프트웨어를 사용하여 ANOVA에 의해 각각의 매개변수에 대해 분석하였다.
· 결과
콜로니 형성 단위(Colony forming unit)(cfu)의 계수
여기서 하기 보고한 표 3은 처리 후(2018년 6월 4일) 및 처리(2018년 6월 4일) 1개월 후 잎 및 잎 그램 당 및 적용 탱크에서 콜로니-형성 단위(CFU)와 관련된 데이타를 나타낸다.
2018년 6월 4일 2018년 7월 4일
CFU/ml 적용 탱크 CFU/gr의 잎 CFU/gr 잎
필드 1 2.50E+04 4.40E+02 7.00E+02
필드 2 2.50E+04 3.30E+03 4.20E+03
필드 3 2.50E+05 8.00E+02 1.20E+03
적용 탱크 속에는 생성물의 균질한 혼합물이 존재하였고 식물에 정확한 적용은, 콘 잎에 적용 1개월 후, 유지되고 모든 플롯에서 관찰될 수 있는 바와 같이 이의 성장을 증가시켰다.
SPAD
도 5는 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용 후 30일째에 SPAD 측정을 나타낸다.
적용으로부터 1개월 후 식물은 모든 필드에서 유의적인 차이없이, 대조군과 동일한 SPAD 수준을 유지하였고, 이는 세균에 의해 기여되었으므로 화학 질소의 감소가 식물에서 부정적인 효과를 가지지 않았음을 입증한다.
잎, 줄기 및 속대 속의 질소
여기서 하기 보고된 표 4는 수확 시기에 옥수수 식물의 상이한 조직 속에서 발견된 질소 농도(g/식물)에 관한 데이타를 나타낸다.
필드 1 필드 2 필드 3
대조군 처리군 대조군 처리군 대조군 처리군
잎 0,39 0,37 0,58 0,37 0,35 0,36
줄기 0,71 0,76 1,80 0,51 0,72 0,76
곡물 1,63 2,08 1,81 3,16 1,70 1,71
합계 2,73 3,22 4,19 4,05 2,76 2,84
드론 사진(45 dat)
도 6은 필드 1(패널 "a"), 필드 2(패널 "b") 및 필드 3(패널 "c")에 대한 NDVI 지수 측정에 사용된 드론 사진을 나타낸다.
도 7은 필드 1(패널 "a"), 필드 2(패널 "b") 및 필드 3(패널 "c")에 대한 조합된 CIR 지수 측정에 사용된 드론 사진을 나타낸다.
지수 NDVI 및 조합된 CIR을 고려하여, 관개수 압력 및 색상 차이가 스프링클러가 물을 적절하게 제공하지 않는 지역에서의 작물에서 관찰되는 문제가 있던 필드 3을 제외하고는, 대조군과 비교하여, 임의의 필드에서 식물 캐노피, 클로로필 및 식물 건강(청색 및 적색의 강도)에 있어서 차이가 관찰되지 않았다.
수율
여기서 하기 보고된 표 5는 각각의 필드의 수율에 관한 데이타를 나타낸다.
수율 (kg/ha) 증가 % (kg/ha)
대조군 처리군 처리군
필드 1 16881 a 17511 b 3.96
필드 2 14346 a 18335 b 27.8
필드 3 14312 a 17539 b 22.5
표 5에서, 라인 상의 상이한 문자를 수반하는 평균은 서로 유의적으로 상이하다.
필드 1에서, 대조군은 16881 kg/ha의 수율을 가졌다. 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용으로, 17511 kg/ha의 수율이 수득되었고; 이는 4% 이상의 생산을 의미한다.
필드 2에서 대조군은 14346 kg/ha의 수율을 가졌다. 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 18335 kg/ha의 수율, 즉, 28%의 생산 증가를 생성하였다.
필드 3에서 대조군은 14312 kg/ha의 수율을 가졌다. 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 17539 kg/ha의 수율, 즉, 22.5%의 생산 증가를 생성하였다.
여기서 하기 보고한 표 6은 질소 균형-시비를 통해 제공된(투입된) 질소, 추출 후 식물에 의해 동화된 질소, 투입량과 식물내 추출량 사이의 동화의 균형에 관한 데이타를 나타낸다. 곡물 톤 당 질소 요구량(즉, 필요한 투입량) 및 곡물의 톤 당 질소 추출.
Figure pct00005
· 결론
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주는 콘의 재배시 효율적인 적용 및 식물에서 미생물의 지속성을 갖는다.
본 발명의 균주는 보다 많은 양의 질소 비료가 사용된 통상의 시비와 동일한 SPAD(클로로필)의 수준, 식물 건강 및 식물 캐노피 밀도(NDVI 지수 및 조합된 CIR 지수)를 유지하였다.
본 발명의 균주는 도포 시비에서 감소된 총 질소성 비료 단위의 40%를 제공하며 또한 4 내지 27%의 생산에 있어서의 증가를 제공한다. 식물이 단지 식물 당 하나의 속대(cob)를 가졌으므로, 이러한 증가는 곡물의 특정 비중(specific weight) 및/또는 실행 수와 관련될 수 있다.
시비를 통해 기여된 질소성 비료 단위와 수행된 식물 내 질소의 추출량의 균형을 관찰한 경우, 헥타르당 66 내지 111 kg의 질소의 질소 증가가 있다. 이는 이러한 질소의 킬로그램이 배양 주기 동안 본 발명의 균주에 의해 고정되었음을 의미한다. 이러한 결과는, 곡물 1톤을 생산하기 위한 요건이 대조군보다 적으므로, 처리된 식물에서 생산된 곡물의 톤 당 질소 요구량에서 간접적으로 관찰된다. 처리된 곡물 1톤을 생산하기 위한 요구량은 곡물 1톤을 생산하기 위해 이루어졌던 질소의 추출량보다 더 낮음을 염두하여야 한다. 동일한 양의 곡물을 생산하는데 보다 많은 질소가 요구되므로, 이는 대조군에서와는 반대이다.
실시예 3
시험 3. 옥수수의 짧은 주기 재배에서 질소 비료의 30%의 감소에 대한 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 사용의 효능.
· 목적.
잎의 녹색의 발현(SPAD), 식생 지수, 식물 내 질소 수준, 잎 속의 미생물의 농도 및 생산 수율을 통한 통상의 성장 조건 하에서 질소 도포 시비의 30%의 감소에 대한, 콘(옥수수)의 발달에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효능을 알기 위함이다.
· 물질 및 방법
시험 필드 및 시비.
시험은 스페인의 2개의 필드에서 수행하였다: 좌표가 41° 50'13.8 "N 0° 05'38.0" E인 휴스카내 포마 드 신카의 필드 및 좌표가 38° 49'55.3" N 1° 50'27.1" W인 알바세테 핀카 오란 내의 다른 곳.
시비 권장사항은 통상의 시비 및 질소 감소 처리에서는 30% 감소이었다. 이를 위해, 비료를 여기서 하기 보고된 표 7에 명시된 양을 사용하여 비료 살포기로 분배하였다.
표 7은 각각의 플롯에서 각각의 비료에 사용된 비료의 양, 유형 및 질소 비료 단위(NFU)를 나타낸다.
Figure pct00006
· 필드에서 처리의 분배
필드는 다음의 표면을 가졌다: 필드 1(74 ha), 필드 2(3.67 ha) 및 16 미터 너비의 2개의 연속된 지역을 매개변수의 평가를 위해 취하였다. "1"로 표시된 지역은 처리된 지역이고 "2"로 표시된 지역은 대조군 지역이다.
도 8은 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 종을 사용한 처리 1(지역 1) 및 처리 2 대조군(지역 2)의 시험 분포를 나타낸다. 특히, 도 8의 패널 "a"는 필드 1을 나타내고 도 8의 패널 "b"는 필드 2를 나타낸다.
· 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 배양 및 적용의 특성화
품종 "구아시(Guasi)"의 콘 종자를 필드 1에서 및 품종 DKC 5032 YG를 필드 2에서, 300 kg/ha의 재배 비율로 선택하고, 3 cm의 깊이와 75 cm의 열 간격 및 동일한 열 내 15 cm의 간격으로 파종하였다. 각각의 파종 레인의 너비는 16 m이었다. 파종일은 필드 1에서 6월 20일 및 필드 2에서 6월 30일이었고, 줄기가 나온지 10일 후 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용일은 파종 후 각각 22 및 20일째인, 2018년 7월 12일(필드 1) 및 2018년 7월 20일(필드 2)이었다.
본 발명의 메탈로박테리움 종. 노브 균주는 잎 적용으로 333 g/ha (3 x 107 CFU/g)의 용량에서 적용하였다.
식물이 BBCH 규모의 13 내지 14 단계로 된 경우, 엽 적용을 헥타르당 300 내지 400 리터의 브로쓰로 스프레이 기기를 사용하여, 22 및 20℃의 공기 온도 및 72 및 58%의 상대 습도로, 2.3 및 12 mps의 북쪽 및 북서쪽 방항 바람 속도로, 잎 상에 이슬 및 각각 0 및 15%의 흐림의 존재없이 수행하였다.
· 매개변수 및 평가 방법
잎의 그램당 콜로니-형성 단위(CFU/g)의 계수
본 매개변수는 미생물이 전체 배양 주기 속에 및 잎 위에 어떠한 양이 존재하는지를 확인하기 위해 측정하였다. 이는 20개 이하의 식물로부터의 4번째 잎에의 잎의 그램을 취하고 이를 탄소원으로서 메탄올이 들어있는 질소-유리된 선택 배양 배지 속에 파종함으로써 일련 희석하여 측정한다.
SPAD(잎 속의 클로로필 수준)
본 매개변수는 식물의 양호한 영양 상태의 지표이며 질소 및 철 수준과 밀접하게 관련되어 있다. 이를 위해, SPAD(토양 식물 분석 개발로 알려진 측정기를 사용하였고 각각의 처리의 100개 이하의 식물의 4번째 잎에서 100회 측정하였다.
잎, 줄기 및 속대 곡물 속의 질소
본 매개변수는 수확 시기에 누적된 각각의 식물 조직내 질소의 양의 지표이다. 잎, 줄기 및 속대 곡물을 100개의 식물로부터 취하여 킬달 방법으로 총 질소를 분석하였다.
위성 사진
ESA Copernicus 위성으로부터의 사진을 다운로딩하고 Qgis 프로그램으로 가공하여 NDVI 지수를 수득하였다.
NDVI(정규 식생 지수). 식물의 잎에서 반사된 적색광 및 근적외선의 밴드를 대조한다. 이는 캐노피 밀도의 일반적인 지표이고 이것이 가진 엽록소가 많을 수록 보이는 토양으로부터 살아있는 녹색 식생(vegetation)을 구별하는데 흔히 사용된다.
수율
수확 수율을 평가하기 위해, 6개의 무작위 블록을 취하고 30 평방 미터의 표면적을 수확하였다. 수득된 곡물을 각각의 구역에서 습도에 의한 손실을 빼고 칭량한다.
통계적 분석
요인(SPAD 및 수율) 및 이의 상호작용을 Windows 5.1(미국 Manugistics, Inc.)용 Statgraphics Plus 소프트웨어를 사용하여 ANOVA에 의해 각각의 매개변수에 대해 분석하였다.
· 결과
콜로니 형성 단위(Colony forming unit)(CFU)의 계수
여기서 하기 보고한 표 8은 처리 후(2018년 7월 12 내지 20일) 및 처리한지 1개월 후(2018년 8월 15일) 잎 그램 당 및 적용 탱크에서 콜로니-형성 단위(CFU)와 관련된 데이타를 나타낸다.
2018년 7월 12-20일 2018년 8월 15일
CFU/ml 적용 탱크 CFU/gr의 잎 CFU/gr Hoja
필드 1 2.70E+02 5.40E+03 1.00E+04
필드 2 2 1.20E+03 3.00E+03 8.10E+03
적용 탱크 속에는 생성물 및 탱크 내 정확한 적용의 균질한 혼합물이 존재하였고 콘 잎에 적용 1개월 후, 집단은 유지되고 모든 필드에서 관찰될 수 있는 바와 같이 이의 성장을 증가시켰다.
SPAD
도 9는 적용 후 30일째에 SPAD 측정을 나타낸다.
적용으로부터 1개월 후 식물은 모든 필드에서 유의적인 차이없이, 대조군과 동일한 SPAD 수준을 유지하였고, 이는 세균에 의해 기여되었으므로 화학 질소의 감소가 식물에서 부정적인 효과를 가지지 않았음을 입증한다.
잎, 줄기 및 속대 속의 질소
여기서 하기 보고된 표 9는 옥수수 식물의 각각의 조직의 질소(그램)의 양에 관한 데이타를 나타낸다.
필드 1 필드 2
대조군 처리군 대조군 처리군
잎 0,35 0,49 0,49 0,58
줄기 0,46 0,58 0,58 0,86
곡물 1,09 1,38 1,30 1,14
합계 1,90 2,45 2,37 2,58
위성 사진
도 10은 15일마다 측정된 처리 45일 후 필드 1에 대한 NDVI 지수 측정에 사용된 위성 사진을 나타낸다.
도 11은 15일마다 측정된 처리 45일 후 필드 2에 대한 NDVI 지수 측정에 사용된 위성 사진을 나타낸다.
비료를 감소시키면서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주를 사용한 치료로 NDVI(녹색의 강도)에서의 균일성은 대조군과 비교하여 재배 주기 전체에서 관찰된다.
수율
여기서 하기 보고된 표 10은 각각의 필드의 수율에 관한 데이타를 나타낸다.
수율
(kg/ha)		 증가%
(kg/ha)
대조군 처리군 처리군
필드 1 10515 a 11828 b 12.48
필드 2 12525 a 12863 b 2.7
필드 1에서, 대조군은 10515 kg/ha의 수율을 가졌지만, 본 발명의 균주의 적용으로 12.5%의 생산 증가와 함께, 11823 kg/ha의 수율이 수득되었다.
필드 2에서 대조군은 12525 kg/ha의 수율을 가졌고, 본 발명의 균주로 2.7%의 증가인, 12863 kg/ha의 수율이 수득되었다.
표 11은 질소 균형: 시비를 통해 제공된 질소, 추출 후 식물에 의해 동화된 질소, 투입량과 식물내 추출량 사이의 동화의 균형에 관한 데이타를 나타낸다. 곡물 톤 당 질소 요구량 및 곡물의 통 당 질소 추출.
Figure pct00007
· 결론
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주는 콘의 재배시 효율적인 적용 및 식물에서 미생물의 지속성을 갖는다.
본 발명의 메틸로박테리운 종. 노브. 균주는 보다 많은 양의 질소 비료가 사용된, 통상의 통상의 시비와 동일한 SPAD(클로로필)의 수준, 식물 건강 및 식물 캐노피 밀도(NDVI 지수)의 수준을 유지하였다.
수율과 관련하여, 본 발명의 균주는 도포 시비에서 감소된 총 질소성 비료 단위의 30%를 제공하며 또한 2.7 내지 12.5%의 생산에 있어서의 증가를 제공한다. 식물이 단지 식물 당 하나의 속대를 가졌으므로, 이러한 증가는 곡물의 특정 비중 및/또는 실행 수와 관련될 수 있다.
시비를 통해 제공된 질소성 비료의 단위와 수행된 식물 내 질소의 추출량의 균형을 관찰한 경우, 헥타르당 43 내지 57 kg의 질소의 질소 증가가 있다. 이는 이러한 질소의 킬로그램이 성장 주기 동안 본 발명의 균주에 의해 고정되었음을 의미한다. 이러한 결과는, 곡물 1톤을 생산하기 위한 요건이 대조군보다 더 적으므로, 본 발명의 균주로 처리된 식물에서 생산된 곡물의 톤 당 질소 요구량에서 간접적으로 관찰된다. 처리된 곡물 1톤을 생산하기 위한 요구량은 곡물 1톤을 생산하기 위해 이루어졌던 질소의 추출량보다 더 낮음을 염두하여야 하며, 대조군에서는 동일한 양의 곡물을 생산하는데 보다 많은 질소가 요구되므로, 이는 반대이다.
실시예 4
시험 4. 상이한 용량의 질소 시비에 대한 딸기 재배에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 평가
· 목적.
식물에서 잎의 녹색의 발현(SPAD), 식물 내 질소 수준, 잎 속의 미생물의 농도 및 생산 수율을 통한, 통상의 시비의 0, 25, 50, 75 및 100%의 상이한 용량의 질소 시비에 적용된 딸기 작물의 발달에 있어서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효능을 알기 위함이다.
· 물질 및 방법
시험 필드 및 시비.
시험은 무르시아 로스 마르티네츠 델 푸에르토내 좌표가 37°48'59.6 "N 1° 05'43.6" E인 심보르그의 시험 농장에 위치한 필드에서 수행되었다. 필드는 192m2으로 이루어지고 8m 너비 및 24m 길이이었다.
관주 및 시비의 관리는 모든 처리에 대해 상이하다. 공물 시비 프로그램은 상이한 질소 함량의 5개 용액으로 이루어진다.
표 12는 UFN에서 측정된, 상이한 시비 처리를 나타낸다.
UFN
100% 질소 시비 670
75% 질소 시비 502.5
50% 질소 시비 335
25% 질소 시비 167.5
0% 질소 시비 0
· 처리
표 13은 궁극적으로 본 발명의 메틸로박테리움 균주를 사용한 처리군 및 비처리군으로 나누어진 5개의 시비 수준을 기반으로 한 10회 처리를 참고한다.
T1. 0 % 질소 시비
T2. 25 % 질소 시비
T3. 50 % 질소 시비
T4. 75 % 질소 시비
T5. 100 % 질소 시비
T6. 0 % 질소 시비 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
T7. 25 % 질소 시비 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
T8. 50 % 질소 시비 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
T9. 75 % 질소 시비 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
T10. 100% 질소 시비 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
· 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 배양 및 적용의 특성화
식물 물질
묘목사에서 제공한 뿌리가 없는, Fortuna 품종의 딸기 식물을 심었다.
식재 프레임 및 밀도
식재 프레임은 재배 열 사이가 2m, 식물 사이가 0.1m이고, 오점형(quincunx)으로 1m x 0.18m x 0.15m의 코코넛 섬유 주머니에 식재하여, 헥타르당 100,000개의 식물 밀도로, m2 당 10개이 식물의 밀도를 제공하였고, 필드는 192m2로 이루어짐으로써 전체 시험 당 1920개의 식물이 존재한다.
식재일 및 작물의 제거일.
딸기의 이식은 2017년 11월 2일이었고, 2018년 6월 1일에 작물을 제거하였다.
수력학적 설계
3 l/h의 자가-보충 외부 드립퍼(dripper)가 있는 16mm 호스와 연결되어 있는, 32mm의 2차 파이프로 가는 3.5 kv 전기 펌프를 사용하였다.
관주 수(irrigation water)
시험을 수행하는데 사용된 관주 수는 담수화 공장에서 가져왔으며 전체 시험에서 식물 당 130 리터의 물을 질산염의 리터 당 0.1 그램의 농도(식물 당 13 그램)로 적용하였다. 상기 물의 특성은 다음 표(표 14)에 요약되어 있다. 여기 하기에 보고된 표 14는 관주 수의 특성화에 관한 데이타를 나타낸다.
매개변수 결과
pH 7.86
EC (dSm-1) 0.96
총 용해된 고체 (g/l) 0.507
클로라이드 음이온 (g/l) 0.245
설페이트 음이온 (g/l) 0.0157
하이드록사이드 음이온 (g/l) 0.0001
카보네이트 음이온 (g/l) 0.074
니트레이트 음이온 (g/l) 0.101
가용성 인 음이온 (g/l) 0.0005
칼슘 양이온 (g/l) 0.0202
마그네슘 양이온 (g/l) 0.0084
나트륨 양이온 (g/l) 0.134
칼륨 양이온 (g/l) 0.01
암모늄 양이온 (g/l) 0.00077
붕소 미량영양소 (g/l) 0.99
철 미량영양소 (g/l) 0.05
망간 미량영양소 (g/l) 0.01
구리 미량영양소 (g/l) 0.01
아연 미량영양소 (g/l) 0.01
본 발명의 균주는 엽면 적용에 의해 333g/ha(3 x 107 CFU/g)에서 적용되었다.
엽면 적용은 식물이 13 내지 14 단계의 BBCH 규모인 경우에 헥타르당 200 리터의 비율로 분무 배낭을 사용하여, 20℃의 공기 온도 및 50%의 상대 습도로, 잎에서 이슬의 부재하에, 및 15%의 흐림으로 수행하였다.
· 매개변수 및 평가 방법.
잎의 그램 당 콜로니-형성 단위(CFU/g)의 계수
본 매개변수를 측정하여 미생물이 전체 배양 주기 내 및 잎 상에 어떤 양이 존재하는지를 확인하였다. 이는 50개의 식물로부터의 잎 1 그램을 취하여 이를 탄소원으로서 메탄올이 들어있는 질소-유리된 선택 배지 속에 파종함으로써 측정한다.
잎 속의 질소.
본 매개변수는 분석 시기에 누적된 각각의 식물 조직내 질소의 양의 지표이다. 100개의 식물을 잎, 줄기 및 과일로부터취하여 킬달 방법으로 총 질소를 분석하였다.
수율
작물 수율을 평가하기 위하여, 30개의 식물을 각각의 처리로부터 무작위로 선택하여 작물 주기 전체에서 수거하였다.
통계적 분석
요인(수율) 및 이의 상호작용을 Windows 5.1(미국 Manugistics, Inc.)용 Statgraphics Plus 소프트웨어를 사용하여 ANOVA에 의해 각각의 매개변수에 대해 분석하였다.
· 결과
잎의 그램 당 콜로니 형성 단위(CFU/g)의 계수
여기서 하기 보고한 표 15는 적용으로부터 매달 측정한 잎 그램 당 콜로니-형성 단위에 관한 결과를 나타낸다.
처리/샘플링 날짜 2018년 1월 18일 2018년 2월 15일 2018년 3월 15일 2018년 4월 15일
T 6 9.00E+03 2.00E+03 2.00E+03 2.50E+03
T 7 2.00E+03 1.00E+03 8.00E+03 8.00E+03
T 8 2.00E+03 1.00E+03 6.40E+03 5.00E+03
T 9 1.80E+04 3.00E+03 1.00E+03 3.00E+03
T 10 2.60E+03 1.00E+03 1.00E+03 1.00E+03
콜로니 샘플링에 의해, 본 발명의메탈로박테리움 종. 노브. 균주의 영속성이 식물에서의 배양 주기 전체에서 관찰된다.
총 질소
여기에 하기 보고된 표 16은 딸기 작물에서 질소의 농도(g/100g의 식물), 총 질소(g/식물) 및 식물의 신선한 중량과 관련된 데이타를 나타낸다.
처리 질소(그램/100 그램의 식물) 평균 식물 중량(그램) 총 질소(그램/식물)
T 1 1.86 7.5 0.14
T 2 2.52 41.4 1.04
T 3 3.20 92.1 2.94
T 4 3.23 96.6 3.12
T 5 3.31 94.7 3.13
T 6 1.69 8.4 0.14
T 7 2.87 65.5 1.87
T 8 3.24 90.1 2.91
T 9 3.28 98.8 3.24
T 10 3.24 90.2 2.92
표 16은 대조군 및 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주로 처리한 것 둘 다에서, 질소 시비가 증가함에 따라 질소 농도에서의 증가가 존재함을 나타낸다.
총 질소의 증가는 본 발명의 균주로 처리한 식물에서 질소 비료의 75%에 이를때까지 관찰되며, 최고 값은, 본 발명의 균주로 처리된 식물내 질소 농도의 최고 값인, 3.28에서 발견되었다. 100%의 시비로 처리된 식물내 N 함량은 감소한다.
생산
생산을 시작하는 순간으로부터, 30개의 식물을 매주 수확하며, 전체 재배 주기 동안 각각의 처리로부터 무작위로 선택하였다.
여기서 하기 보고한 표 17은 각각의 처리에 대해 식물당 킬로그램의 수율을 나타낸다.
처리 생산 (Kg / 식물)
T 1 0.24 a
T 2 0.8 b
T 3 1.07 c
T 4 1.05 c
T 5 1.15 c
T 6 0.17 a
T 7 1.04 c
T 8 1.12 c
T 9 1.4 d
T 10 1.02 c
최고 생산된 처리는 식물당 1.4 킬로를 생산한 9(본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용으로 질소의 75%)이었고, 이는 다른 처리군과 유의적으로 상이하였다.
0 UFN인 처리군은 식물 당 kg의 최저 딸기를 생산한 것이며, 이는 유의적으로 상이하다.
하기 보고한 표 18은 질소 균형: 시비를 통해 제공된 질소, 추출 후 식물에 동화된 질소, 투입량(즉, 제공된 질소)와 식물내 추출량 사이의 동화 균형을 나타낸다.
Figure pct00008
· 결론
잎의 그램 당 콜로니-형성 단위(CFU/g의 잎)
잎 속에서 미생물의 지속성은 딸기 성장 주기 전체에서 관찰된다.
총 질소
처리군 9에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주로 처리한 식물은 모든 대조군 처리군과 비교하여 잎 속에서 최고의 질소 농도를 갖는다.
생산
처리군 9(503 UFN)에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 대조 처리군(671 UFN)과 관련하여 21%의 생산 증가 및 시비된 처리군 4(503 UFN)와 관련하여 33%의 증가를 촉진하였다.
실시예 5
시험 5 - 포도 배양에서 필드 입증 시험
· 목적
잎의 녹색의 발현(SPAD), 잎 속의 미생물의 농도 및 생산 수율의 평가를 통한, 통상의 용량의 질소 시비에 적용된, 포도의 배양물의 발달에 있어서 본 발명의 균주의 효능을 알기 위함이다.
· 물질 및 방법
시험 필드 및 시비.
시험은 좌표가 38°33'13.9"N 1°21'16.5"W인 주밀라, 및 좌표가 39°11'22.4"N 2°59'15.8"W인 토멜로소에 위치한 2개의 필드에서 수행하였다.
시비 추천은 전체 배양 주기에 대해 105 UFN에 상응하는, 700 kg NPK (15-15-15)를 지닌 기본 시비를 지닌 통상의 시비이었다.
· 필드에서 처리의 배치
필드는 다음의 표면을 가졌다: 필드 1(1 ha), 필드 2(2.20 ha) 및 2개의 인접한 16 미터 너비 블록(즉, 지역)을 매개변수의 평가를 위해 취하였다.
· 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 배양 및 적용의 특성화
필드 1에서 포도 품종은 petit verdot이고 필드 2에서 품종은 Grenache이며, 본 발명의 균주의 적용일은2018년 5월 10일(필드 1) 및 2018년 5월 15일(필드 2)이었다.
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주를 엽면 적용에 의해 333 g/ha(3 x 107 CFU/g)의 용량으로 적용하였다.
엽면 적용은 식물이 각각 17 및 20℃의 공기 온도 및 20 및 38%의 상대 습도와, 5.4 및 9 mps의 남쪽 및 북서쪽 방향의 바람 속도로, 잎에서의 이슬 및 각각 10 및 25% 흐림의 부재하에서 페퍼콘 단계(peppercorn stage)일때 헥타르당 350 리터의 브로쓰를 사용하여 분무기로 수행하였다.
도 12a는 처리(들)의 적용 시간에서 분무기를 나타내고 도 12b는 처리(들)의 적용 시간에 곡물 크기를 나타낸다.
· 매개변수 및 평가 방법
수율
작물의 수율을 평가하기 위하여, 6개의 블록을 무작위로 취하고 30 평방미터의 표면을 수거하여, 식물에서 수득한 포도를 칭량하였다.
통계적 분석.
요인(수율) 및 이의 상호작용을 Windows 5.1(미국 Manugistics, Inc.)용 Statgraphics Plus 소프트웨어를 사용하여 ANOVA에 의해 각각의 매개변수에 대해 분석하였다.
· 결과
수율
여기서 하기 보고된 표 19A 및 표 19B는 각각의 처리에 대해 식물당 킬로그램의 수율에 관한 결과를 나타낸다.
Figure pct00009
결론
필드 1에서, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 미처리 대조군과 관련하여 수율을 18% 증가시킬 수 있다.
필드 2에서, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 미처리 대조군과 관련하여 수율을 41% 증가시킬 수 있다.
실시예 6
시험 6 - 에스카롤(escarole) 작물(시초리움 엔디비아 라티폴리아( Cichorium endivia latifolia), Lempika 품종)에서 수율에 있어 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효과의 평가
다음의 시험을 GET 시도의 실현화를 위해 독립적인 공인 기관에 의해 수행되었다.
본 연구의 설계, 결과의 분석 및 보고는 가능한 경우 다음의 EPPO-가이드라인 PP 1/152(4), PP 135(4) 및 PP 1/181(4)에 따라 수행하였다.
시험의 일반적인 정보
시험은 2018년 8월 17일에, 스페인의 게로나주 빌라-사크라에서 시작되어, 동년 11월 12일에 종료되었다. 이식일은 2018년 8월 21일이었다. 통상의 시비는 8월 28일에 수행하였고 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 배양물이 적합한 발달 단계(BBCH 17-19)에 도달한, 9월 28일이었다.
시험 설계
시험은 4회 처리 및 5회의 반복의 무작위 블록 시스템으로 이루어졌다. 각각의 기본 필드(플롯)는 2.5 미터 너비이고 7 미터 길이이며, 면적은 17.5m2이다. 식물의 열은 0.56 미터 이격되어 있고 열의 공간은 0.35m이어서 4개의 열 내에 총 80개의 식물이 제공된다.
배양
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효과를 꽃상추 작물(endive crop)(시초리움 인디바 라티폴리아(Cichorium endivia latifolia), Lempika 품종)에서 연구하였다. 이러한 지역에서 기존 작물은 2018년에 양파이고 2017년에는 해바라기 및 상추이었다.
토양
토양은 우수한 수준의 시비를 나타내었다:
MO %: 2.02
질감(texture): 점질 양토
pH: 7.70
CEC: 0.22
토양 배수: 불량
유지
배양 주기 전체에서, 식물 건강을 유지하는데 필수적인 식물위생 처리를 적용하였다.
통계적 설명
통계적 분석 및 보고를 농업 연구 관리(Manager of Agricultural Investigation)(ARM)의 소프트웨어(Gylling Dates Management Inc.에 의해 개발됨)에 의해 실현되었다. 평가된 데이타를 비교 수단을 위해 α = 5%에서 스튜던츠-뉴만 케울스(Student-Newman-Keuls)와 조합된 일원 변량 분석(ANOVA)을 사용하여 분석하였다. 동일한 문자 뒤에 오는 의미는 유의적으로 상이하지 않다.
시험 목적
1.- 정상 비율의 시비 또는 감소된 시비가 적용된, 에스카롤 작물에서 작물 거동 및 수율에 있어 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효과를 평가하기 위함이다.
2.- 표준의 통상적인 시비와 비교하여 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 효과를 비교하기 위함이다.
3.- 표적 작물에 대한 본 발며으이 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 임의의 의도하지 않은 효과를 평가하기 위함이다.
시험 요약
본 시험의 목적은 에스카롤 작물의 수율에 있어서 질소의 용량(시비)가 감소된 경우, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주(3 x 107 CFU/g)의 효과를 평가하기 위한 것이었다. 시험은 스페인의 북동부의, 빌라-사크라 지방자치제(Girona)에, 개방 필드의, 채소 재배를 위한 전형적인 작은 지역에 위치하였다. 연구는 유럽 연합의 규정 1107/2009에 의해 정의된, 우수 실험 관행(Good Experimental Practices)의 원칙에 부합하여 수행되었다.
본 발명의 균주는 질소 시비 비율이 상이한(100%(일반적), 60% 및 40%) 3개의 지역에서 동일한 비율(300g f.p./ha)로 시험되었고, 이를 "비처리" 대조군(100%의 N 시비, 그러나, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 부재)과 비교하였다.
시비는 이식 전(2018년 8월 23일)에 이루어졌다. 생성물은 눈금이 매겨진 배낭 분무기 HONDA WRJ2525를 사용하여 BBCH 단계 17-19(2018년 9월 28일)에서 적용하였다.
3회의 평가를 작물 발달 동안 작물 활력에 대해 퍼센트로 이루어졌다. 수확 또는 수확 직전에 각각 20개의 식물이 있는 플롯의 2개의 중앙 열(central row)을 평가하는 수확 매개변수를 기록하였고, 2개의 가장자리 열은 평가에 고려하지 않았다. 식물 직경(cm), 존재하는 식물의 수(시장성있음, 시장성없음, 죽음 및 백화된 식물로 구별), 식물 중량 및 수확량(2개이 중앙 열(7.84 m2)에서의 수 및 kg)을 평가하였다. 헥타르당 시장성있는 식물의 수확량 및 수 및 표준 시비가 없는 처리(처리 1)에 대한 증가%를 ARM 소프트웨어를 사용하여 자동적으로 계산하였다. 식물독성 및 활력 평가는 시험 전체에서 수행되었다.
여기서 하기에 보고된 표 20은 처리 목록을 나타낸다.
처리 번호 처리명 비율 비율 단위 성장 단계 적용 코드 적용 설명
1 UTC
UF 1000 kg/ha BEFTRA A 이식 전
2 M.s. 300 g/ha BBCH 16-19 B 작물 BBCH 16-19
UF 1000 kg/ha BEFTRA A 이식 전
3 M.s. 300 g/ha BBCH 16-19 B 작물 BBCH 16-19
F (용량 N=60%) 600 kg/ha BEFTRA A 이식 전
4 M.s. 300 g/ha BBCH 16-19 B 작물 BBCH 16-19
F (용량 N=40%) 400 kg/ha BEFTRA A 이식 전
표 20에서, 다음의 참고를 사용한다:
UTC: 비처리된 대조군
UF: 일반적인 시비
F: 시비
M.s.: 메틸로박테리움 종. 노브. 균주, 즉, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주
결론
생성물의 효과
시험 조건에 따라서, 감소된 용량의 질소와 함께 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 적용은 통상의 비료(본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주가 없는)의 단지 1회 적용과 비교하여 평균 식물 중량(kg) 및 상업적 수확량(헥타르당 식물의 수)의 수치적 증가를 수득하였고, 이는 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주가 식물의 적확한 발달을 위해 필수적인 질소를 제공하였음을 의미한다.
처리 3 및 4는 처리 1과 비교하는 경우 각각 3.8 및 13.89%의 작물 수확 증가를 달성하였고, 유의적인 통계적 차이를 수득하였다. 수득된 결과가 보다 높은 질소 감소에서 가장 우수한 결과를 제시하였음에도 불구하고, 평가된 매개변수에서 상이한 용량의 질소를 사용한 처리에서 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주 중에는 유의적인 차이가 수득되지 않았다.
본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주는 작물이 7 내지 9개의 잎을 가진 경우(BBCH 17-19) 300 g/ha(3 x 107 cfu/g)에서 적용되었다.
통상의 시비(N=40%)를 사용하여 300 g/ha(3 x 107 cfu/g)에서 적용된 본 발명의 균주는 통계적으로 유의적인 차이로, 13.89%의 수확량이 증가된 가장 우수한 시험 결과를 나타내었다.
평가된 다른 매개변수와 관련하여, 시험 사이에 유의적인 통계적 차이가 존재하지 않았고, 이는 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주가 식물의 정확한 발달을 위해 필수적인 질소를 제공할 수 있음을 나타낸다.
평가된 매개변수의 결과는 통상의 시비로 수득된 것과 유사하거나 심지어 이보다 더 우수하였으므로, 본 발명의 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 사용은 작물에서 요구된 질소 시비의 양을 감소시킨다.
실시예 7 - 본 발명에 따른 예시적인 조성물의 생산 공정
· NFBG 배지(글루코스가 보충된 질소 유리된 세균 배지)로부터 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 회수.
성장 매개변수:
o 성장 온도 20 내지 35℃.
o 항온처리 시간 5 내지 7일.
· 단리된 핑크-적색 콜로니를 선택하고 이를 선택 배지 MMMNF(메탄올 질소가 유리된 최소 배지)에 재씨딩(reseeding)한다.
MMMNF (메탄올 질소가 부재인 최소 배지)
성장 매개변수:
o 성장 온도 20 내지 35℃.
o 항온처리 시간 5 내지 7일.
· 단리된 콜로니(핑크-적색)을 선택하고 이를 MMM(메탄올이 들어있는 최소 광물 배지)에 재-씨딩(reseeding)하여, 예비-접종물로서 사용될 액체 배양물을 성장시킨다.
발효 매개변수:
o 성장 온도 20 내지 35℃.
o 교반(r.p.m.) 50 내지 250.
o 발효 시간 5 내지 7일.
· 미생물의 예비-접종물이 들어있는 전체 용적의 생물반응기의 접종.
발효 매개변수:
o 성장 온도 20 내지 35℃.
o 통기(r.p.m.) 50 내지 250.
o 통기 0.3-3.2 N*m3/h.
o 발효 시간 80 내지 130 시간.
· 담체와 혼합 및 분무 건조로 건조
· 미생물이 들어있는 발효된 브로쓰의 각각의 리터를 농업적으로 허용되는 담체와 혼합한다.
· 혼합물이 분무 건조된 후에, 다음의 건조 매개변수에 따라 건조시킨다:
o 공급 속도 7 내지 11 ml/l.
o 압축 공기 유동 225 내지 375 l/h.
o 건조 공기 유동 35 내지 50 m3/h.
o 유입 온도 100 내지 180℃.
o 사이클론 성능 25 내지 40%.
· 최종 생성물 제형용 생성물의 혼합
각각 1g의 무수 생성물(분말 + 미생물)을 1 헥타르당 시비에 사용될, 최종 생성물 101 내지 550g이 수득될 때까지. 다음의 보조-제형화제와 혼합한다.
o 1 내지 50g의 농업적으로 허용되는 보조-제형제.
o 100 내지 500g의 농업적으로 허용되는 담체.
여기서 하기 보고된 표 21은 제조 공정 전체에서 사용된 배양 배지 g/L의 조성을 나타낸다.
NFM MMM MMMNF
말산(Malic acid) 5,0 g
메탄올(0.22 μm 여과로 멸균시킴) 20 ml 20 ml 20 ml
NaNO 3 0,5 g
(NH4) 2 SO 4 0,5 g
(NH4) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 0,002 g 0,002 g
MgSO 4 7H 2 O 0,2 g 0,5 g 0,5 g
K 2 HPO 4 0,1 g 1,0 g 1,0 g
KH 2 PO 4 0,4 g
FeCl 3 0,01 g
FeSO 4 7H 2 O 0,01 g 0,01 g
KCl 0,5 g 0,5 g
NaCl 0,1 g
CaCl 2 2H 2 O 0,01 g 0,01 g
KOH 4,8 g
미량영양소 용액 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml
비타민 용액(0.22 μm 여과로 멸균시킴) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
브로모티몰 블루(2N KOH 중 0.5% 용액) 2,0 ml
pH 6,9 7,2 7,2
아가-아가(Agar-Agar) 12,0 g 12,0 g
여과로 멸균시킨 구성성분을 오토클레이빙(autoclaving) 후 배양 배지가 < 60℃의 온도로 냉각되면 가한다.
여기서 하기 보고된 표 22는 미량영양소 및 비타민의 그램의 양을 지칭한다.
미량영양소 비타민
H 3 BO 3 1,85 g
MnSO 4 4H 2 O 2,45 g
ZnSO 4 7H 2 O 0,28 g
Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,034 g
CoCl 2 6H 2 O 0,005 g
CuSO 4 5H 2 O 0,005 g
니코틴산(Nicotinic acid) 0,2 g
바이오틴(Biotin) 0,0018 g
판토텐산칼슘(Calcium pantotheate) 0,18 g
피리독신(Pyridoxine) 0,18 g
시아노코발라민(Cyanocobalamin) 0,08 g
티아민(Thiamin) 0,2 g

Claims (20)

  1. 수탁 번호 제 CECT 9580 호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.(Methylobacterium sp. nov.)의 균주.
  2. 기탁 번호 제 CECT 9580 호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.의 균주를 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    하나 이상의 농업적으로 허용되는 담체 및/또는 하나 이상의 농업적으로 허용되는 공-제형제(co-formulant)를 더 포함하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 담체 및/또는 공-제형제는, 활석, 점토, 말토덱스트린, 탈지유, 글루코스, 및 차, 카사바(cassava) 및 퀴노아(quinoa), 카올린(caolin), 코이어(coir), 규조토, 키틴, CaCO3, 알기네이트, 카라겐(carragen), 수팩틴(surfactin), 람노피피드(rhamnolipid), 소포로리피드(sophorolipid), 사포닌, 칼륨 올레이트의 추출물과 같은 식물성 무수(dry) 추출물, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 고체형, 수성 액체형, 오일성 액체형, 유액형, 반-고체형 또는 겔형으로부터 선택된 형태인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 고체형인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 분말형인, 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은, 토양 적용에 의해, 바람직하게는 관수 시스템(drip irrigation system) 또는 적심(drench), 또는 엽면 적용(foliar application)에 의해, 종자 코팅으로서 적용는, 조성물
  9. 제2항에 따른 조성물의 생산 공정으로서,
    · 본 발명에 따라 수탁 번호 제 CECT 9580 호 하에 기탁된 적어도 하나의 메틸로박테리움 종. 노브.를 제공하는 단계,
    · 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 메탄올을 포함하는 액체 배양 배지 속에 접종시키는 단계,
    · 상기 메틸로박테리움 종. 노브.를 배양하여 메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물을 수득하는 단계, 및
    · 상기 액체 배양물을 건조시켜 무수(dry) 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 공정.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 수탁 번호 제 CECT 9580 호 하에 기탁된 메틸로박테리움 종. 노브.는 BCCM 기탁 번호 제 54871 호 하에 기탁된 토양 균근균 글로무스 이라니쿰 바르. 테누이하이이파룸(Glomus iranicum var. tenuihypharum)의 포자의 내부로부터 단리되는, 공정.
  11. 제9항에 있어서,
    메틸로박테리아를 포함하는 액체 배양물의 건조 전에 하나 이상의 농업적으로 허용되는 담체를 추가하는 단계를 더 포함하는, 공정.
  12. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 농업적으로 허용되는 공-제형제(co-formulant)를 추가하는 단계를 더 포함하는, 공정.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 하나 이상의 농업적으로 허용되는 공-제형제(co-formulant)는 건조 조성물에 추가되는, 공정.
  14. 식물에서 생물-자극인자(bio-stimulant)로서 제1항에 따른 메틸로박테리움 종. 노브.(Methylobacterium sp. nov.) 균주의 용도.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 식물은, 포도 덩굴(grapevine), 베리(berries), 및 콩과식물(legumes)과 같은 농업 작물(horicultural crop), 광범위한 초본(extensive herbaceous) 및 곡물(gramineous) 작물, 나무 작물(wood crops)인, 용도.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 식물의 수확을 증가시키기 위한, 용도.
  17. 질소 외부 유입량을 60%까지 감소시키기 위한, 제1항에 따른 메틸로박테리움 종. 노브. 균주의 용도.
  18. 식물에서 생물-자극인자(bio-stimulant)로서 제2항에 따른 조성물의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 식물은, 포도 덩굴, 베리, 및 콩과식물과 같은 농업 작물, 광범위한 초본 및 곡물 작물, 나무 작물인, 용도.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 식물의 수확을 증가시키기 위한, 용도.
KR1020217042673A 2019-06-03 2020-05-07 메틸로박테리움 종. 노브. 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 생물-자극제 및 내생식물 질소-고정 세균으로서 이의 용도 KR20220016154A (ko)

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