KR20160055795A

KR20160055795A - 단리된 내생생물과 관련된 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20160055795A
Application number: KR1020167005203A
Authority: KR
Inventors: 루쎌 존 로드리게즈; 레지나 순 레드만
Original assignee: 어댑티브 심바이오틱 테크놀로지스 엘엘씨
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2016-05-18
Also published as: US20190075802A1; US9961904B2; CA2919356C; MX2016001103A; US20150033420A1; CN105579573A; AP2016009060A0; AU2018204857A1; PH12016500165A1; CA2919356A1; BR112016001583B1; CN105579573B; EA201690280A1; EP3024925B1; BR112016001583A2; WO2015013558A8; AU2014292990A1; AU2018204857B2; AU2014292990B2; AR097075A1

Abstract

단리된 트리코더마 하르지아눔 및 그의 균주와 관련된 조성물 및 방법이 본원에 개시된다.

Description

단리된 내생생물과 관련된 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO ISOLATED ENDOPHYTES}

본 개시내용은 단리된 내생생물 및 그의 용도, 예컨대 스트레스 내성의 촉진 및/또는 성장 또는 발아의 증가를 위한 식물에의 접종을 위한 용도에 관한 것이다.

2종 이상의 유기체가 밀접한 또는 친밀한 관계로 함께 생활하는 것으로 정의되는 공생은, 종종 2종의 유기체 사이의 상호간 유익한 상호작용이다. 대부분의 식물은 진균과 공생하고 (Petrini, 1986), 이러한 진균은 식물 군락의 구조, 기능, 및 건강 및 적응에서 중요한 역할을 한다 (Bacon and Hill, 1996; Clay and Holah, 1999; Petrini, 1986; Read, 1999; Rodriguez and Redman, 1997).

진균과의 공생 관계는 스트레스 조건 하에 숙주 식물의 성장을 증진시킬 수 있는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 식내서성 진균의 특정 균주는 숙주 식물에 온도, 가뭄 및 염도를 비롯한 극단적 환경 조건에 대한 내성을 부여한다 (Redman et al., 2002b; Rodriguez et al., 2004; Rodriguez and Redman, 2008; Rodriguez et al., 2009; Redman et al., 2011; Rodriguez et al., 2012). 내생생물은 숙주 식물 뿌리, 줄기 및/또는 잎 내에 서식하는 진균 공생체 부류이다. 내생생물은 스트레스 내성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 또한 숙주 식물의 양분 획득 및 성장률 (바이오매스 및 수확량)을 증가시키고, 물 사용 효율을 개선시킨다 (Rodriguez et al., 2008; Rodriguez et al., 2009).

비생물적 스트레스 (예컨대 가뭄, 온도, 염도, pH 및 양분)는 식물의 생리를 변경시켜 적합도, 건강, 발달 및 수확량의 저하를 초래한다. (전형적으로 비생물적 스트레스로 인한) 주변 성장 조건 하에서의 식물의 번식은 작물 및 고유 식물 둘 다에 대하여 농업 생산 및 기후 유발 서식지 변화의 경감을 증가시킬 것이다. 또한, 새로운 식생의 생성은 근대 산업 및 다른 인간 활동에 의해 생성된 오염된 지역의 토양 및 수질 복원에 중요하다.

이전에 공개된 연구 (Redman et al., 2002b & 2011; Rodriguez et al., 2008 & 2012)는 특정 부류의 진균 공생체 (클래스 2)가 간단하게는 식물에 진균 내생생물을 콜로니화함으로써 식물에 생물적 및 비생물적 스트레스 이익을 부여할 수 있음을 입증하였다.

본원에 기재된 바와 같이, 진균 내생생물, 예컨대 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 예를 들어 균주 ThLm1이 이전에 확인된 진균 내생생물과 비교하여 농업 및 고유 식물 둘 다에 우수한 비생물적/생물적 스트레스 내성을 부여하고 이들의 수확량을 증가시키는 것으로 발견되었다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 단리된 진균 내생생물, 예컨대 티. 하르지아눔 종 (균주 ThLm1 포함)과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 미국 농무부 컬쳐 콜렉션(U.S. Department of Agriculture Culture Collection)에 특허 기탁 명칭 번호(Patent Deposit Designation number) NRRL 50846 하에 기탁된 (기탁일 2013년 7월 26일), 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 또는 그의 자손 또는 포자가 제공된다. 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 및/또는 그의 자손 및/또는 포자를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 조성물은 예를 들어 액체 조성물 및 분말 조성물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 스트레스 내성의 촉진 및/또는 식물 성장 또는 종자 발아의 증진을 위한 방법이 제공된다. 방법은 식물 또는 식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균, 또는 그의 포자 또는 자손; 또는 그의 조성물을 접종하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스트레스 내성은 가뭄 내성, 염 내성, 감소된 양분 내성, 진균 내성, 및/또는 온도 내성이다. 일부 실시양태에서, 증진된 식물 성장 또는 종자 발아는 크기, 뿌리 발달의 정도, 종자의 발아율, 클로로필 함량/수준, 광합성 효율, 수확량 또는 질량의 증가를 포함한다.

식물에의 접종은, 일부 실시양태에서, 식물의 뿌리 및/또는 줄기에 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 또는 그의 포자 또는 자손을 콜로니화하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 추가로 포함하며, 고염도, 저수분, 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 토양에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 고염도는 35 mM 초과의 양의 염이다. 일부 실시양태에서, 저수분 함량은 0 - 0.18 in³ 물/in³ 토양이다. 일부 실시양태에서, 저양분 함량은 80 파운드/에이커 미만의 양분이고, 양분은 각각 20%의 질소, 인 및 칼륨, 및 연관된 미량양분을 포함한다.

일부 실시양태에서는, 식물 또는 식물 종자를 고염도 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 물에서 성장시킨다.

일부 실시양태에서는, 식물 또는 식물 종자를 35℃ 이상 또는 15℃ 이하의 평균 온도에서 성장시키거나 또는 발아시킨다.

일부 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 작물 식물 또는 작물 식물 종자, 예컨대 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자이다. 다른 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 관상식물, 예컨대 로사세아에(Rosaceae), 릴리아세아에(Liliaceae), 아잘레아(Azalea), 로도덴드론(Rhododendron), 포아세아에(Poaceae) 또는 크리산테뭄(Chrysanthemum)이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균, 또는 그의 포자 또는 자손; 또는 그의 조성물을 접종한 식물 또는 식물 종자가 제공된다.

일부 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 작물 식물 또는 작물 식물 종자, 예컨대 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자이다. 다른 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 스트레스 내성을 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 식물 또는 식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 식물의 스트레스 내성을 증가시키는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 스트레스는 가뭄, 상승된 염, 감소된 양분 및/또는 온도 스트레스이다. 일부 실시양태에서, 스트레스는 폴리시클릭 방향족 탄화수소, 나프텐산, 또는 높은 pH의 존재가 아니다.

일부 실시양태에서, 식물에의 접종은 식물의 뿌리, 줄기 및/또는 잎에 트리코더마 하르지아눔 균주 진균 또는 그의 포자 또는 자손을 콜로니화하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 트리코더마 하르지아눔 균주 진균은 균주 TSTh20-1 또는 균주 T-22가 아니다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 종자의 발아를 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자의 발아를 증가시키는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서는, 식물 종자를 살진균제 및/또는 살곤충제로 이전에, 동시에 및/또는 이후에 처리한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 식물에서 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키는 방법이 제공된다. 방법은 식물 종자 또는 묘목에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자 또는 묘목으로부터 성장하는 식물에서 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기 도면과 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터, 또한 첨부 청구범위로부터 명백해질 것이다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 하나 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 ThLm1에 대한 어린 옥수수 식물의 바이오매스 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 비공생 (NS - 각 쌍의 좌측 상의 막대) 및 ThLm1과의 공생 (S - 각 쌍의 우측 상의 막대) 옥수수 식물 (N=24)을 온실에서 스트레스 없이 1개월 동안 성장시켰다. Y-축 상의 값은 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 2는 ThLm1과의 공생을 통한 옥수수 성장 및 수확량 증진을 도시하는 막대 그래프이다. 좌측 = 비공생 (NS), 우측 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 값은 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 3은 ThLm1과의 공생을 통한 옥수수 성장 및 수확량 증진을 보여주는 그래프이다. 좌측 2개 막대 = 비공생 (NS), 우측 2개 막대 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 값은 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 4는 ThLm1과의 공생 (S) 또는 비공생 (NS) 옥수수의 종자 발아를 도시하는 막대 그래프이다. 좌측 = 비공생 (NS), 우측 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 값은 제시된 평균 값을 갖는 종자 발아 퍼센트를 나타낸다 .
도 5는 공생 옥수수 식물에서의 증가된 클로로필 함량을 도시하는 그래프이다. 스트레스의 부재 하의 좌측 = 비공생 (NS), 우측 = 공생 (S) 성숙한 온실 성장 옥수수 식물을 제시된 평균 값을 갖는 클로로필 함량 (Y-축, 숫자는 SPAD 값임)에 대해 측정하였다.
도 6a는 가뭄 스트레스에 노출된 옥수수 식물의 뿌리 및 싹 중량을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 각 그래프의 좌측 막대 = 비공생 (NS), 각 그래프의 우측 막대 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 값은 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 6b는 저양분 스트레스에 노출된 옥수수 식물의 뿌리 및 싹 중량을 보여주는 막대 그래프이다. 각 그래프의 좌측 막대 = 비공생 (NS), 각 그래프의 우측 막대 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 값은 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 7은 염 스트레스에 노출된 옥수수의 중량을 도시하는 막대 그래프이다. 좌측 = 비공생 (NS), 우측 = ThLm1과의 공생 (S). Y-축 상의 숫자는 제시된 평균 중량을 갖는 습윤 중량 (g)이다.
도 8은 벼 묘목에서의 저온 스트레스 내성을 도시하는 그래프이다. 뿌리 바이오매스는 각 막대의 상반부에 도시된다. 뿌리 및 싹 성장을 보여준다 (cm). 싹 성장은 각 막대의 하반부에 도시된다.
도 9는 가뭄 스트레스 하에서의 재배지 평가를 도시하는 그래프이다. 각각 120개 옥수수 식물을 함유하는 5중 반복 플롯에서의 수확량 데이터를 보여준다. ThLm1과의 공생 식물은 수확량이 비공생 (NS) 식물보다 평균 85% 더 높았다.
도 10은 비공생 (NS) 또는 ThLm1과의 공생 (S) 옥수수의 싹 및 뿌리 바이오매스를 보여주는 그래프이다. Y-축 상의 값은 생중량 바이오매스 (g)이다.
도 11은 ThLm1을 접종한 공생 옥수수 식물이 보다 많은 곁뿌리를 갖는 보다 광범위한 뿌리계를 생성하였음을 보여주는 사진이다. 도 11은 도 10의 식물로부터의 비공생 (NS, 좌측) 및 공생 (S, 우측) 뿌리의 대표적 사진이다.
도 12는 비공생 (NS) 또는 ThLm1과의 공생 (S) 대두의 뿌리 및 싹 바이오매스를 보여주는 막대 그래프이다. Y-축 상의 값은 생중량 바이오매스 (g)이다.
도 13은 옥수수 식물의 잎 클로로필 함량을 도시하는 막대 그래프이다. 클로로필의 상대 %를 나타내는 SPAD 측정값을 수득하였다. 3개의 "S" 막대는 각각 ThLm1의 3종의 특유한 제제를 나타낸다.
도 14는 ThLm1과의 공생 (S, 우측 막대) 또는 비공생 (NS, 좌측 막대) 대두 식물의 SPAD 측정값의 막대 그래프이다. SPAD 측정값은 식물에서의 클로로필의 상대 %를 나타낸다.
도 15는 ThLm1의 상이한 제제와의 공생 (S) 또는 비공생 (NS) 옥수수의 열매 수확량을 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 저양분 스트레스 하의 ThLm1과의 공생 (S, 각 그래프에서의 우측 막대) 또는 비공생 (NS, 각 그래프에서의 좌측 막대) 옥수수 식물의 뿌리, 싹, 및 수확량을 도시하는 일련의 막대 그래프이다.
도 17은 가뭄 스트레스 하의 ThLm1과의 공생 (S, 각 그래프에서의 우측 막대) 또는 비공생 (NS, 각 그래프에서의 좌측 막대) 옥수수 식물의 뿌리, 싹, 및 수확량을 도시하는 일련의 막대 그래프이다.
도 18은 염 스트레스 하의 ThLm1과의 공생 (S, 좌측 막대) 또는 비공생 (NS, 우측 막대) 대두 식물에서의 뿌리 및 싹 바이오매스를 도시하는 막대 그래프이다.
도 19는 염 스트레스 하의 ThLm1과의 공생 (S, 좌측 막대) 또는 비공생 (NS, 우측 막대) 옥수수에서의 싹 및 뿌리 바이오매스를 도시하는 막대 그래프이다.
도 20은 고온에 노출된 비공생 (NS) 또는 ThLm1 공생 (S) 옥수수 식물의 성장을 도시하는 막대 그래프이다. 공생 (각 쌍에서의 우측 막대) 및 비공생 (각 쌍에서의 좌측 막대) 옥수수 식물의 성장을 고온 (45-50℃)에의 노출 2주 후에 측정하였다.
도 21은 고온에 노출된 비공생 (NS) 또는 ThLm1 공생 (S) 토마토 식물의 성장을 도시하는 막대 그래프이다. 공생 (각 쌍에서의 우측 막대) 및 비공생 (각 쌍에서의 좌측 막대) 옥수수 식물의 성장을 고온 (45-50℃, 우측 쌍) 또는 정상 온도 (25-30℃, 좌측 쌍)에의 노출 2주 후에 측정하였다.
도 22는 고열 (50-55℃) 하에 ThLm1로 처리되거나 (S) 또는 ThLm1로 처리되지 않은 (NS) 옥수수 종자의 발아 퍼센트의 그래프이다.
도 23은 고열 (50-55℃) 하에 ThLm1로 처리되거나 (S) 또는 ThLm1로 처리되지 않은 (NS) 대두 종자의 발아 퍼센트의 그래프이다.
도 24는 144시간 동안 저온 (5℃)에 노출된, ThLm1로 처리되거나 (S) 또는 ThLm1로 처리되지 않은 (NS) 옥수수 종자의 발아 퍼센트의 그래프이다. 3종의 옥수수 품종이 시험되었다 (A, P & D).
도 25는 72시간 동안 저온 (5℃ 또는 15℃)에 노출된, ThLm1로 처리되거나 (S) 또는 ThLm1로 처리되지 않은 (NS) 대두 종자의 발아 퍼센트의 그래프이다.
도 26은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 가뭄 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 9일 동안 가뭄 스트레스 (급수가 완전하게 결여됨)에 노출시켰다 (표준 편차 5% 미만). 시들음병 없음 = 식물 스트레스없이 성장한 식물과 다르지 않은 완전 팽압을 갖는 식물; 경도 시들음병 = 완전 팽압을 갖고 있으나 잎의 첨단부가 약간 말려 올라간 식물; 영구적 시들음병 지점 = 식물이 재급수시에도 회복되지 않는 중증 시들음병.
도 27은 티. 하르지아눔 분리주에 의해 대두에 부여된 가뭄 내성의 대표적 영상이다. 식물을 6일 동안 가뭄 조건에 노출시켰으며, 모든 NS 식물은 시든 반면 E1 콜로니화된 식물은 완전 팽압을 유지하였다. E1 콜로니화된 식물은 또한 식물 크기에 의해 나타난 바와 같이 가뭄 스트레스 동안에도 계속 성장하였다.
도 28은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 가뭄 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 9일 동안 가뭄 스트레스 (급수가 완전하게 결여됨)에 노출시켰다 (표준 편차 5% 미만). 시들음병 없음 = 식물 스트레스없이 성장한 식물과 다르지 않은 완전 팽압을 갖는 식물; 경도 시들음병 = 완전 팽압을 갖고 있으나 잎의 첨단부가 약간 말려 올라간 식물; 영구적 시들음병 지점 = 식물이 재급수시에도 회복되지 않는 중증 시들음병.
도 29는 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 염 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 14일 동안 염 스트레스 (300 mM NaCl)에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 뿌리 바이오매스를 비공생 대조 식물과 비교하여 유의하게 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 30은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 염 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 14일 동안 염 스트레스 (300 mM NaCl)에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 물 사용량을 비공생 대조 식물과 비교하여 100% 초과만큼 감소시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 31은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 염 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 14일 동안 염 스트레스 (300 mM NaCl)에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 물 사용량을 비공생 대조 식물과 비교하여 300% 초과만큼 감소시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 32는 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 염 스트레스 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 14일 동안 염 스트레스 (300 mM NaCl)에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 뿌리 바이오매스를 비공생 대조 식물과 비교하여 12-32%만큼 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 33은 티. 하르지아눔의 11종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 10일 동안 45℃ 뿌리 온도에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 싹 높이를 비공생 대조 식물과 비교하여 15-46%만큼 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 34는 티. 하르지아눔의 11종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 10일 동안 45℃ 뿌리 온도에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 잎 클로로필 수준을 비공생 대조 식물과 비교하여 16-37%만큼 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 35는 티. 하르지아눔의 6종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 10일 동안 45℃ 뿌리 온도에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 물 사용량을 비공생 대조 식물과 비교하여 26-77%만큼 감소시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 36은 티. 하르지아눔의 6종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물을 10일 동안 45℃ 뿌리 온도에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 뿌리 바이오매스를 비공생 대조 식물과 비교하여 30-100%만큼 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 37은 티. 하르지아눔의 분리주 (ThLm1)에 의해 대두 식물에 부여된 저온 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 종자의 3중 반복물을 나타낸다 (n=27, 표준 편차 < 10%). 종자를 접종시키고, 5℃, 15℃ 및 25℃에서 72시간 동안 정치시켜 발아를 평가하였다. 내생생물은 비공생 대조 식물과 비교하여 모든 온도에서 저온 내성을 부여하고 종자 발아를 증가시켰다.
도 38은 티. 하르지아눔의 분리주 (ThLm1)에 의해 옥수수 식물에 부여된 저온 내성을 보여주는 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9개 종자의 3중 반복물을 나타낸다 (n=27, 표준 편차 < 10%). 3종의 옥수수 품종 (A,P,D)의 종자를 접종시키고, 15℃에서 96시간 동안 정치시켜 발아를 평가하였다. 내생생물은 비공생 대조 식물과 비교하여 저온 내성을 부여하고, 종자 발아를 유의하게 증가시켰다.
도 39a-39c는 발아 2주 후의 비공생 (NS) 및 공생 (TT = ThLM1) 옥수수 묘목에서 시간 경과에 따라 측정된 광합성 효율 (Qmax, Y-축)을 보여주는 일련의 그래프를 제시한다. 식물을 스트레스 없이 (도 39a), 또는 가뭄 스트레스 (도 39b) 또는 열 스트레스 (도 39c)의 존재 하에 성장시켰다. 모든 경우에, 총 효율은 공생 식물에서 유의하게 더 높았다.
도 40은 미국 미시간주의 한 지역에서의 가뭄 스트레스에 따른 평균 옥수수 수확량을 보여주는 막대 그래프이다. 위치는 25 플롯 (각각 20 피트 x 20 피트)으로 무작위적으로 설계하였다. 4종의 옥수수 품종을 2 바이오엔슈어(BioEnsure)® (제제화된 ThLm1) 처리로 시험하였다 (L=적은 수의 포자/종자 & H=많은 수의 포자/종자; 및 N=30/처리로 10중 반복물/처리 존재). 종자에 바이오엔슈어®의 분말 제제를 접종하고, 2시간 내에 심었다. (다른 모든 재배지 연구는 액체 제제를 사용함.) 바이오엔슈어®로의 처리는 옥수수 수확량을 처리하지 않은 식물에 비해 30-85% 증가시켰다.
도 41은 미국 미시간주 및 인디애나주의 여러 에코존에 독립적 협력자에 의해 확정된 위치에서의 낮은 스트레스 하에서의 평균 옥수수 수확량을 보여주는 막대 그래프이다. 위치는 총 215 플롯으로 무작위적으로 설계되었다. 전체적으로 바이오엔슈어® (제제화된 ThLm1)로 처리된 플롯 중 84%에서 옥수수 수확량은 평균 증가율 6.5% 및 증가율 범위 3-20%로 증가하였다. 증가량 (부셸/에이커)은 5-38 범위였다.
도 42는 미국 텍사스주에서 2종의 토양 유형에서 확정된 플롯에서의 낮은 스트레스 하에서의 평균 벼 수확량을 보여주는 막대 그래프이다. 위치는 총 105 플롯 (각각 20 피트 x 20 피트)으로 무작위적으로 설계되었다. 3종의 벼 품종을 2 바이오엔슈어® (제제화된 ThLm1) 처리로 시험하였으며, 80 파운드/에이커에서 파종된 4중 반복물/처리가 존재하였다. 바이오엔슈어®는 191-657 파운드/에이커 범위의 수확량 증가를, 재배지 평균 증가율 6% 및 범위 2.1-18.2%로 유발하였다.
도 43은 낮은 스트레스 하에서의 평균 보리 수확량을 보여주는 막대 그래프이다. 1종의 보리 품종을 18 무작위화된 플롯 (각각 20 피트 x 20 피트)에 심었다. 바이오엔슈어® (제제화된 ThLm1) 처리는 보리 수확량을 7%만큼 증가시켰다.
도 44는 염 스트레스 하에서의 그래스 수확량을 보여주는 막대 그래프이다. 총 18 플롯에서의 그래스를 30-80 mM의 일정한 염 스트레스의 존재 하에 평가하였다. 바이오엔슈어® (제제화된 ThLm1)-처리 식물은 처리하지 않은 (비처리) 식물보다 86% 더 많은 바이오매스를 가졌다.
도 45는 티. 하르지아눔의 15종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 막대 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9종 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물 뿌리를 10일 동안 45℃에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 식물 잎 클로로필 수준을 비공생 대조 식물과 비교하여 16-37%만큼 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 46은 티. 하르지아눔의 15종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 열 내성을 보여주는 막대 그래프이다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 9종 식물의 4중 반복물을 나타낸다 (n=36). 식물 뿌리를 10일 동안 45℃에 노출시켰다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 비공생 대조 식물과 비교하여 식물 바이오매스를 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 황백화되고 시들었다.
도 47은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 양분 내성을 보여주는 막대 그래프이다. 1주령 대두 식물에게 질소, 인, 칼륨 (NPK) 함유 초기 급수를 제공하고, 그 후에 식물을 실험 기간 (대략 90일) 동안 NPK 스트레스 없음 (완전 강도 NPK로 급수) 또는 높은 NPK 스트레스 (¼ 강도 NPK로 급수)에 2일마다 노출시켰다. 이어서, 식물을 바이오매스 (뿌리 및 싹)에 대해 평가하고, 높은 NPK 스트레스 식물에 대한 데이터를 보여주었다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타낸다.
도 48은 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 양분 내성을 보여주는 막대 그래프이다. 1주령 옥수수 식물에게 질소, 인, 칼륨 (NPK) 함유 초기 급수를 제공하고, 그 후에 식물을 실험 기간 (대략 90일) 동안 NPK 스트레스 없음 (완전 강도 NPK로 급수) 또는 높은 NPK 스트레스 (¼ 강도 NPK로 급수)에 2일마다 노출시켰다. 이어서, 식물을 바이오매스 (뿌리 및 싹)에 대해 평가하고, 높은 NPK 스트레스 식물에 대한 데이터를 보여주었다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타낸다.
도 49는 티. 하르지아눔의 19종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 종자 발아 증진을 보여주는 막대 그래프이다. UT (비처리)는 내생생물이 없는 대조 종자를 나타내고, 각 막대는 20개 종자를 나타낸다. 데이터는 비처리 대조 종자보다 증가된 발아 퍼센트를 나타낸다. 모든 내생생물은 종자 발아를 비처리 대조 종자와 비교하여 40-70X 증가시켰다.
도 50은 티. 하르지아눔의 17종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 옥수수 식물에 부여된 저온 내성을 보여주는 막대 그래프이다. 저온 내성은 발아된 종자로부터의 뿌리 길이로 표현된다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 식물을 나타내고, 각 막대는 6일 동안 15℃에 노출된 30개 발아체를 나타낸다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 발아체 성장을 비공생 대조 식물과 비교하여 10-32x 증가시켰다. 모든 공생 식물은 건강한 반면 NS 식물은 성장이 저지되고 건조되었다.
도 51은 티. 하르지아눔의 18종의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 대두 식물에 부여된 저온 내성을 보여주는 막대 그래프이다. 저온 내성은 15℃에서의 종자 발아로서 표현된다. NS (비공생)는 내생생물이 없는 대조 종자를 나타내고, 각 막대는 4일 동안 15℃에 노출된 18개 종자를 나타낸다 (표준 편차 < 10%). 모든 내생생물은 종자 발아를 비공생 대조 식물과 비교하여 85-240%만큼 증가시켰다.

금세기에, 농업 생산성에 대한 예측가능한 제한은 비생물적 스트레스 예컨대 가뭄, 극온 및 염도를 포함한다. 현재, 어떠한 스트레스 내성 작물 식물 또는 스트레스 내성 작물을 생성할 수 있는 상업적 제품도 존재하지 않는다. 비생물적 스트레스 내성 작물은 육종, 돌연변이 선택 또는 유전자 변형 (GM) 접근법에 의해 생성된 바 없었고, 농업의 "성배"로 남아 있다.

옥수수, 대두, 밀 및 벼는 전세계에서 대량으로 재배되며, 인간 집단의 존속을 위해 가장 중요한 작물 가운데 있는 것으로 간주된다. 그러나, 재배자는 농업 지속성에 요구되는 높은 작물 수확량을 유지하는데 있어서 수많은 과제에 직면해 있다. 최근 수년간, 세계 기후 변화는 많은 농업 장소에서 증가된 빈도의 극심한 가뭄에 기여해 왔다. 관개를 통해 가뭄의 영향을 완화시키는 것이 가능하지만, 이는 고가의 해결책이며 수질/물 이용가능성이 또한 감소하고 있다.

성장을 증진시키거나 식물의 양분 상태를 변경하거나 또는 미생물 또는 곤충 병원체에 대해 식물을 보호하는, 이용가능한 여러 미생물 제품이 존재한다 (표 1; 문헌 [Berg, 2009]).

<표 1> 농업에 사용하기 위한 미생물 제품

트리코더마 하르지아눔 (티. 하르지아눔)은 매우 다양한 생리학적으로 특수화된 균주를 포괄하는 진균 종이며, 그 중 일부는 토양-매개 식물 병원체에 대한 생물살충제로서 또는 효소의 산업적 생산을 위해 사용된다 (Naseby et al., 2000). 티. 하르지아눔은 식물에서 매우 다양한 식물-병원성 미생물 및 바이러스에 대한 그의 저항성을 증가시키는 대사 변화를 유도하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Harman et al., 2004). 티. 하르지아눔 균주 T-22는 일부 조건 하에 식물의 성장 및 뿌리 발달을 증가시킬 수 있는 것으로 이전에 밝혀진 바 있다. T-22는 또한 특정 토양에서 식물이 달리 이용불가능했던, 식물 섭취를 위한 식물 양분을 가용성화시킬 수 있다 (Altomare et al., 1999; Harman et al., 2004). 추가로, 오일-샌드 테일링 상에서 성장하는 것으로 확인된 식물로부터의 식내서성 진균으로서 단리된 티. 하르지아눔 TSTh20-1 (특허 기탁 명칭 번호 PTA10317)의 또 다른 균주가, 특히 물, 유기 탄소, 질소 및 미네랄 함량, 온도, 및 폴리시클릭 방향족 탄화수소 또는 나프텐계 산으로의 오염에 관한 준최적 또는 스트레스성 조건 하에 식물 성장을 촉진하는 것으로 확인되었다 (PCT 공개 번호 WO2011/032281).

본원에 기재된 바와 같이, 본원에서 ThLm1로 지칭되는 신규 식내서성 진균 공생체 트리코더마 하르지아눔 균주는 워싱턴 주의 해변에서 자라는 그래스 (포아세아(Poacea)) 종으로부터 단리되었다. 이 균주는 식물 또는 동물의 공지된 병원체가 아니다.

다른 식물, 예컨대 작물 식물 및 고유 식물에 티. 하르지아눔 균주 ThLm1을 접종한 경우에, 상기 접종이 식물 종자 발아율, 성장 및 수확량의 증가; 물 소비 및 NPK (질소, 인 및 칼륨) 보충의 감소; 가뭄, 온도, 염도를 비롯한 비생물적 스트레스에 대한 내성의 부여; 및 전반적 식물 건강의 증진을 비롯한 여러 이익을 유발하는 것으로 확인되었다. ThLm1은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 다를 포함하는 광범위한 식물에 콜로니화할 수 있으며 이에 따라 교차 식물/작물 유용성을 갖는 것으로 확인되었다. 추가로, 티. 하르지아눔 균주 ThLm1은 전적으로 식물 영양 조직 내에 존재하며 접종된 식물의 종자 또는 열매 내로 성장하지 않았던 것으로 확인되었다. 결과적으로, ThLm1은 교차-작물 유용성을 가지며, 내생생물이 없는 소비자 제품을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 비생물적 스트레스 내성 (염, 온도, 낮은 NPK, 가뭄), 바이오매스 및 수확량 증진을 부여하고, 전반적 식물 건강 및 강건성을 증가시킨다.

티. 하르지아눔의 다른 균주는 생물살충제, 식물 성장 증진제로서 및 산업적 효소의 생산을 위해 상업적으로 사용된다. 어떠한 균주도 ThLm1에 대해 확인된 바와 같이 종자 발아를 증진시키거나 또는 염도 또는 온도 스트레스 내성을 부여하는 것으로 보고된 바가 없다. 다른 균주가 물 소비를 감소시키는 것으로 보고된 바 있지만, ThLm1은 농업 작물에서 우월한 결과를 일으키고, 재배지 조건 하에 이익을 부여하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 참조).

따라서, 본 개시내용의 측면은 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1, 및 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

본 개시내용의 추가의 측면은 균주 ThLm1에 대해 본원에 기재된 바와 같은 트리코더마 하르지아눔의 사용 방법에 관한 것이다. 식물 또는 식물 종자에 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 식물의 스트레스 내성을 증가시킴으로써, 스트레스 내성을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 스트레스는 가뭄, 상승된 염, 감소된 양분 및/또는 온도 스트레스이고/거나 폴리시클릭 방향족 탄화수소, 나프텐산 또는 높은 pH의 존재가 아니다. 식물 종자에 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자의 발아를 증가시키는, 종자의 발아를 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 식물 종자 또는 묘목에 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 티. 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자 또는 묘목으로부터 성장하는 식물에서 티. 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시킴으로써, 식물에서 티. 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 이들 측면의 일부 실시양태에서, 티. 하르지아눔 진균은 균주 TSTh20-1 또는 균주 T-22가 아니다.

정의:

본원에 사용된 용어 "비생물적 스트레스"는 특정 환경에서 살아있는 유기체에 대한 물리적 및 화학적 요소의 부정적 영향을 지칭한다. 물리적 및 화학적 요소는 물, 유기 양분 수준, 무기 양분 수준, 화학적 오염, 화학적 처리 (예를 들어, 살충제 예컨대 살진균제 및 살곤충제), 온도, 강우량, pH, 산화환원, 산소 함량, 탄화수소 잔기, 알칼리, 금속, 염도, 대기 가스, 광, 토양 조성을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "내생생물"은 숙주 식물 뿌리, 줄기 및/또는 잎 내에 존재하는 진균 공생체의 부류를 지칭한다.

본원에 사용된 용어, 예를 들어 진균을 "식물에 접종하는"은 식물에 진균 또는 임의의 진균 발생기를 적용 또는 감염시키는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "식물"은 진균에 의해 콜로니화될 수 있는 식물계의 임의의 구성원을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물은 비제한적으로 옥수수, 대두, 벼, 밀, 목화, 보리, 소르굼, 토마토, 조롱박, 녹색 잎채소, 목화, 장과류, 목본 식물 및 잔디를 포함하는 농업 작물이다. 이들 식물 종이 시험되었고, 티. 하르지아눔 균주 예컨대 ThLm1은 이들에게 성장 이익을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 다른 실시양태에서, 식물은 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄이다.

본원에 사용된 용어 "ThLm1의 자손"은 ThLm1 세포로부터 유래된 모든 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "식물 성장을 촉진하는" 또는 "증가된 식물 바이오매스 및 수확량"은 진균을 접종하지 않은 대조 비공생 식물 또는 그의 부분과 비교하거나 또는 미리 결정된 표준과 비교하여 식물 또는 그의 부분 (예컨대 뿌리 및 싹, 및 종자/열매 수확물)이 크기, 질량 또는 수량에 있어서 증가된 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "ThLm1의 포자"는 ThLm1 진균, 또는 그의 유성 단계인 히포크레아(Hypocrea)에 의해 형성된 무성 생식 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "공생" 및/또는 "공생 관계"는 대부분의 식물이 진균 예컨대 근균과 상호작용하는 것을 포함하여 2종의 유기체 사이의 유익한 상호작용을 지칭한다. 유사하게, 본원에 사용된 용어 "공생체"는 공생 상호작용에 있는 유기체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "물 사용 효율"은 규정된 기간에 걸쳐 식물에 의해 소비된 물 또는 유체의 양을 의미한다. 이는 또한 식물 바이오매스의 그램당 물 또는 유체 사용 또는 물 포텐셜에 의해 정의될 수 있다.

단리된 트리코더마 하르지아눔 ThLm1

한 측면에서, 본 개시내용은 2013년 7월 25일에 미국 농무부 컬쳐 콜렉션에 제출되고 특허 기탁 명칭 번호 NRRL 50846 (기탁일, 2013년 7월 26일) 하에 기탁된, 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 또는 그의 자손 또는 포자에 관한 것이다.

ThLm1의 자손은 ThLm1 세포로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. ThLm1의 포자는 ThLm1 진균에 의해, 또는 그의 유성 단계인 히포크레아에 의해 형성된 무성 생식 세포를 포함한다. 본원에 사용된 "단리된"은 그의 천연 공생 숙주로부터 제거된 세포 또는 진균을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1은 포아세아 그래스 종으로부터 제거될 수 있다. 진균은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있거나 본원에 기재된 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 단리된 진균 또는 세포는 단리 후에 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 암피실린, 테트라시클린 및 스트렙토마이신이 보충된 0.1X 감자 덱스트로스 한천 배지 상에서 배양함으로써 유지될 수 있고, 22℃에서 12시간 광 체제로 성장시킬 수 있다. 성장 5-14일 후, 분생포자는 멸균수 10 ml를 첨가하고 멸균 유리 슬라이드로 포자를 부드럽게 긁어냄으로써 플레이트로부터 수확될 수 있다.

ThLm1의 돌연변이체 및 변이체는 모 균주와 동일한 (또는 더 우수한) 이익을 제공할 수 있다. 돌연변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 다양한 화학물질에 대한 노출, 조사, 물리적 조건, 분자 조작, 바이러스 기반 DNA 변형 및/또는 플라스미드 기반 DNA 변형에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 돌연변이체는 모 균주와 동일하거나 더 우수한 이익을 제공하는 돌연변이체를 확인하기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 선택될 수 있다. 변이체는 또한 콜로니화된 식물을 물리적 또는 화학적 조건에 노출시키고 공생 이익에 대해 선택함으로써 생성될 수 있다.

조성물

본 개시내용의 다른 측면은 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 및/또는 그의 자손 및/또는 포자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 종자 및/또는 식물에 유해하지 않은 담체인 생리학상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO96/039844 및 미국 특허 번호 5,586,411; 5,697,186; 5,484,464; 5,906,929; 5,288,296; 4,875,921; 4,828,600; 5,951,978; 5,183,759; 5,041,383; 6,077,505; 5,916,029; 5,360,606; 5,292,507; 5,229,114; 4,421,544; 및 4,367,609를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨).

추가로, 살진균제, 살곤충제, 살선충제, 살박테리아제, 양분, 생물살충제, 다른 미생물 접종물, 착색제, 수화 매트릭스 및 중합체를 비롯한 다양한 물질이 종자의 처리 동안 첨가될 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 종자 처리에 통상적으로 사용되는 대부분의 물질은 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1과 식물 종 사이의 공생의 확립을 방해하지 않는다.

일부 실시양태에서, 조성물은 분무 적용 또는 침지 적용에 적합한 유체 형태이다. 조성물은 희석 또는 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 접종 전에 물로 희석된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 페이스트 형태이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 살분을 위한 건조 및 분말 형태이다. 조성물은 뿌리, 잎, 줄기 또는 종자를 비롯한 식물의 임의의 부분에 적용될 수 있다. 조성물은 바람직하게는 건조 종자에, 예컨대 종자 코팅 형태로 적용된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 바람직한 결과, 예컨대 스트레스 내성의 유도 및/또는 식물 성장의 증진을 달성하기 위해 식물 또는 식물 종자에 적용할 수 있는 조성물의 양 또는 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 종자당 약 5 내지 약 100,000개의 티. 하르지아눔 균주 예컨대 ThLm1의 생존 포자, 바람직하게는 종자당 약 50 내지 1000개의 생존 포자가 사용될 수 있다.

식물 및 식물 종자

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 또는 그의 포자 또는 자손을 접종한 식물 및 식물 종자에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "식물"은 진균에 의해 콜로니화될 수 있는 식물계의 임의의 구성원을 포함한다. 식물이 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1에 의해 콜로니화되는지 여부의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여, 예컨대 식물로부터 진균을 단리하고 (관련 기술분야에 공지된, 예컨대 본원에 기재된 방법에 의해) 이를 확인함으로써, 식물로부터의 직접적 DNA 추출에 이어서 (예를 들어, PCR 또는 프로브를 사용한) 검출 분석에 의해 수행될 수 있다. 식물의 건강 및 스트레스 내성의 단순한 관찰 또는 비공생 식물과 비교한 생리학적 메트릭스에서의 변동에 의해 식물이 콜로니화된 것이 결정될 수 있다.

식물 또는 식물 종자는 예를 들어 단자엽식물 또는 쌍자엽식물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 비제한적으로 옥수수, 대두, 벼, 밀, 수박, 토마토, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경 및 목본 식물을 포함하는 작물 식물 또는 그의 종자이다.

일부 실시양태에서, 식물은 고유 식물이다. 본원에 사용된 고유 식물은 서식지 또는 기후대에 토착적이거나 또는 그에 귀화된 식물이다. 고유 식물의 예는 그래스, 나무, 현화 식물, 관목 및 허브, 예컨대 스파이크 벤트그래스, 애뉴얼 헤어그래스, 캘리포니아 브롬, 슬렌더 헤어그래스, 블루 와일드 라이, 메도우 발리, 아메리칸 던그래스, 아메리칸 포크위드 및 아라비돕시스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 공지된 분류 체계 및 데이터베이스를 사용하여 특정한 서식지 또는 기후대에 대한 고유 식물을 용이하게 확인할 수 있다 (예를 들어, wildflower.org의 고유 식물 데이터베이스; nativeplantnework.org의 고유 식물 네트워크; 미국 농무부를 통한 식물 데이터베이스; 문헌 [Kenrick, Paul & Crane, Peter R. (1997). The Origin and Early Diversification of Land Plants: A Cladistic Study. Washington, D. C.: Smithsonian Institution Press. ISBN 1-56098-730-8; Raven, Peter H., Evert, Ray F., & Eichhorn, Susan E. (2005). Biology of Plants (7th ed.). New York: W. H. Freeman and Company; 및 Prance G. T. (2001). "Discovering the Plant World". Taxon (International Association for Plant Taxonomy) 50 (2, Golden Jubilee Part 4): 345-359.] 참조).

일부 실시양태에서, 식물은 비-고유 식물이다. 본원에 사용된 비-고유 식물은 서식지 또는 기후대에 토착적이지 않으며 귀화될 수 있거나 침입성일 수 있는 식물이다. 비-고유 식물의 예는 그래스, 나무, 현화 식물, 관목 및 허브, 다육식물 등을 포함하나, 제한되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 공지된 분류 체계 및 데이터베이스를 사용하여 특정한 서식지 또는 기후대에 대한 고유 식물을 용이하게 확인할 수 있다 (예를 들어 미국 농무부를 통한 식물 데이터베이스 참조).

식물 또는 식물 종자는 관련 기술분야에 공지된 또는 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 접종될 수 있다. 식물은, 예를 들어 표준 절차를 사용하여 식물로부터 진균을 단리하고 본원에 기재된 방법에 의해 진균을 확인함으로써, 식물로부터의 직접적 DNA 추출에 이어서 검출 분석에 의해, 또는 식물 건강 및 스트레스 내성의 관찰 또는 비공생 식물과 비교한 생리학적 메트릭스의 변동에 의해 티. 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 또는 그의 포자 또는 자손을 사용한 접종에 대해 시험될 수 있다.

방법

본 개시내용의 또 다른 측면은 스트레스 내성을 촉진하고/거나 식물 성장 또는 종자 발아를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 식물 또는 식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 또는 그의 포자 또는 자손을 접종하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "스트레스"는 종자 발아, 식물 성장 또는 발생 및/또는 식물 (예를 들어, 열매) 수확량에 대한 영향을 비롯하여, 특정 환경에서 살아있는 유기체, 예컨대 식물에 대한 물리적, 유기 및 화학적 요소의 부정적 영향을 지칭한다. 물리적 및 화학적 요소는 물 (토양 수분 및 강우량 포함), 양분 수준 (유기 및 무기 양분 수준, 특히 낮은 양분 수준 포함), 온도 (특정한 식물에 의해 허용되거나 특정한 식물에 최적인 온도 범위 밖에 있는 고온 또는 저온 포함), pH (특정한 식물에 의해 허용되거나 특정한 식물에 최적인 pH 범위 밖에 있는 높은 또는 낮은 pH 포함), 산화환원, 산소 함량, 염도, 대기 가스, 광 및 토양 조성을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 유기 인자는 병원성일 수 있는 진균, 박테리아, 바이러스, 선충류 또는 곤충, 또는 초식동물일 수 있는 다른 동물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "스트레스 내성"은 스트레스 조건에 대한 살아있는 유기체, 예컨대 식물의 저항성을 지칭한다. 저항성은, 예를 들어 식물의 사멸 또는 식물에서의 성장 감소 및/또는 수확량 감소를 달리 유발하는 스트레스 조건 하에 성장하거나 존속하는 능력일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스트레스 내성은 가뭄 내성, 염 내성, 감소된 양분 내성, 진균 내성 및/또는 온도 내성이다. 일부 실시양태에서, 티. 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1로 접종된 식물은 상기 균주로 접종되지 않은 식물에 비해 보다 스트레스 내성이다.

스트레스 내성의 증가 또는 촉진은 티. 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 또는 그의 자손 또는 포자로 접종된 식물에서의 스트레스 내성의 수준을 접종되지 않은 대조 식물에서의 스트레스 내성의 수준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 성장 속도, 발아율, 수확량, 질량, 생리학적 메트릭스 및 다른 이러한 인자는 스트레스 조건 하에 접종된 식물에서, 유사한 스트레스 조건 하에 대조 비-접종된 식물에서의 동일 인자와 비교하여 측정될 수 있다. 접종된 식물에서의 1종 이상의 이러한 인자의 증가는 스트레스 내성의 증가 또는 촉진을 나타낼 것이다. 스트레스 내성의 증가 또는 촉진은 또한 티. 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1 또는 그의 포자 또는 자손으로 접종된 식물에서의 스트레스 내성의 수준을 미리 결정된 표준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 미리 결정된 표준은 예를 들어 식물의 집단, 예컨대 비-접종된 식물의 집단의 평균 성장 속도, 발아율, 광합성 효율, 수확량 또는 질량일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스트레스 내성의 촉진은 대조 또는 미리 결정된 표준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 초과의 스트레스 내성에서의 증가를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "성장을 증진시키는"은 진균으로 접종되지 않은 대조 식물 또는 그의 부분과 비교하거나 또는 미리 결정된 표준과 비교하여 크기, 뿌리 발달의 정도 (예를 들면, 뿌리계가 얼마나 광범위한지), 종자의 발아율, 클로로필 함량/수준, 수확량 (예를 들어, 종자 또는 열매 생산의 수) 또는 질량에서의 증가를 갖는 식물 또는 그의 부분 (예컨대 뿌리 및 싹)을 지칭한다. 미리 결정된 표준은 예를 들어 식물의 집단, 예컨대 비-접종된 식물의 집단의 식물 또는 식물 부분의 평균 크기, 뿌리 발달의 정도, 발아율, 클로로필 함량/수준, 광합성 효율, 수확량 또는 질량일 수 있다. 식물 성장에서의 증진의 결정은 다수의 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 전체 식물 또는 그의 부분 (예컨대 종자, 열매, 싹 및 뿌리)의 크기, 뿌리 발달의 정도, 발아율, 클로로필 함량/수준, 광합성 효율, 수확량 또는 질량이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 성장의 증진은 식물 또는 그의 부분의 크기, 뿌리 발달의 정도, 발아율, 클로로필 함량/수준, 광합성 효율, 수확량 또는 질량이 대조 또는 미리 결정된 표준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 초과만큼 증가한 것을 포함한다.

본원에 사용된, 예를 들어 진균을 "식물 또는 식물 종자에 접종하는"은 식물 또는 식물 종자에 임의의 진균 발생기로부터의 진균 또는 진균 세포, 예컨대 포자를 적용 또는 콜로니화하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 식물에 접종하는 것은 식물의 뿌리 및/또는 줄기에 트리코더마 하르지아눔 균주, 예컨대 ThLm1을 콜로니화하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 추가로 포함한다. 식물 또는 식물 종자는 하나 이상의 스트레스 조건, 예컨대 가뭄 조건, 고염 조건, 감소된 양분 조건, 저광 조건, 기생 진균 조건 및/또는 고온 조건 하에 성잘할 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 고염도, 저수분 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 토양에서 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 포함한다. 고염도를 특징으로 하는 토양은 토양에 존재하는 염, 예컨대 Na, Mg, Ca 또는 K 클로라이드, 술페이트 또는 카르보네이트의 양이 35 mM을 초과하는, 예컨대 35 mM, 40mM, 45mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 120mM, 140mM, 160mM, 180mM, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM, 400mM, 450mM, 500mM 또는 그 초과량의 염을 초과하는 토양을 포함한다. 저수분을 특징으로 하는 토양은 토양 유형에 따라 0 내지 0.18 in³ 물/in³ 토양, 예컨대 0.18, 0.17, 0.16, 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.10, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 또는 0.01 in³ 물/in³ 토양 미만을 갖는 토양을 포함한다. 저양분 함량을 특징으로 하는 토양은 80 파운드/에이커 미만의 양분 (각각 20%의 질소, 인 및 칼륨 (NPK), 및 연관된 미량양분 포함), 예컨대 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5 파운드/에이커 미만의 양분을 갖는 토양을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 36℃ 이상, 예컨대 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50℃ 또는 그 초과의 평균 온도에서 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 36℃ 이상, 예컨대 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50℃ 또는 그 초과의 평균 온도에서 식물 종자를 발아시키는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 15℃ 이하, 예컨대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5℃ 또는 그 미만의 평균 온도에서 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 15℃ 이하, 예컨대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5℃ 또는 그 미만의 평균 온도에서 식물 종자를 발아시키는 것을 포함한다.

본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 작물 식물 또는 작물 식물 종자이다. 일부 실시양태에서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자는 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 목본 식물, 장과류 또는 벼, 또는 그의 종자가다. 다른 실시양태에서, 식물 또는 식물 종자는 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함한다.

본 명세서에 인용된 모든 공개 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 경우와 같이 본원에 참조로 포함된다.

추가의 상술 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 나머지의 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 간주되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개는 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위해 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1. 유익한 공생체로서의 ThLm1의 단리 및 확인

ThLm1의 단리 및 접종

트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1은 워싱턴주의 해변에서 자라는 그래스 (포아세아) 종으로부터 단리되었다. 이러한 식물의 서식지-스트레스는 가뭄, 낮은 토양 양분, 및 고염도로 확인되었다. 레이무스 몰리스(Leymus mollis) (던그래스) 식물은 워싱턴주 산 호안(San Juan) 아일랜드 군도의 여러 연안 해변 서식지에서 수집되었다. 식물은 토양 부스러기가 제거될 때까지 세척하고, 플라스틱 집-록(Zip-loc) 백에 넣고, 이전에 기재된 바대로 표면 멸균처리하였다 (Redman et al., 2001, 2002a). 무균 기술을 이용하여, 식물은 뿌리, 근경 및 줄기를 나타내는 부분들로 절단하고, 진균 성장 배지 [0.1X PDA (감자 덱스트로스 한천)] 상에 플레이팅하고, 실온에서 5-7일 동안 냉 형광등 아래에서 인큐베이션하여 진균이 출아하도록 하였다. 출아 시에, 나타난 주요 진균 내생생물의 30종의 대표 분리주 (X95%)를 계대배양하고, 이 중 10종의 대표 분리주의 단일 포자 단리를 이전에 기재된 바대로 수행하였다 (Redman et al., 1999). 대표 분리주 10종 모두를 멸균 1.5 ml 스크류-캡 튜브 내에 50-100 mg/ml의 암피실린으로 보충된 멸균수 하에 배치하고 장기 저장을 위해 4℃에 두었다.

ThLm1에 의한 종자 및 식물의 콜로니화

여러 시험 식물에 ThLm1을 접종하였다. 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)) 및 대두 (글리신 맥스(Glycine max)) 종자를 중등도 교반 하에 15-20분 동안 0.5-1.0% (v/v) 차아염소산나트륨 용액 중에서 표면-멸균처리하고 멸균 증류수 10-20 부피로 헹구었다. 이러한 식물 종은 두 주요 식물 계통 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 나타낸다. 그러나, ThLm1은 또한 ThLm1로 콜로니화하기 위해 옥수수 및 대두에 대해 설명된 대로 처리되는, 채소 (예를 들면, 토마토, 조롱박, 페퍼, 완두, 콩, 잔디, 녹색 잎채소 등), 주요 작물 (예를 들면, 밀, 벼, 보리, 괴경), 그래스 및 목본 식물을 비롯한 많은 다른 식물과도 공생을 확립한다. 식물은 종자, 발아부, 묘목 또는 더 오래된 단계 식물을 포자의 액체 또는 분말 제제 (10 - 10,000개 포자/종자)로 직접 처리 (분사, 침지, 혼합 또는 급수)함으로써 ThLm1과의 공생을 확립할 수 있다. 포자는 식물의 어느 부분에도 적용될 수 있으며 더 낮은 줄기 및 뿌리를 접종함으로써 최상의 결과가 얻어진다.

ThLm1이 작물 식물 및 자생 식물을 비롯하여 ThLm1로 접종된 많은 식물 종과 공생을 확립하는 것이 관측되었다. ThLm1 접종은 스트레스 내성을 부여하는 것으로 관측되었다. ThLm1로 접종되고 개선된 스트레스 내성을 갖는 식물의 개요는 표 2에 제시된다.

<표 2> ThLm1로 접종된 식물

ThLm1은 스트레스 부재 하에 식물 성장 및 건강을 증가시켰다

옥수수 식물을 ThLm1로 접종하거나 또는 접종하지 않았고, 1개월 동안 온실에서 스트레스 조건의 부재 하에 성장하였다. 이어서 옥수수 식물을 뿌리 및 싹 부분으로 분리하여 습윤 중량 측정을 하였다. 중량 측정의 통계적 분석은 ThLm1로 접종된 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 크다는 것을 보여주었다 (ANOVA, P<0.05, 도 1).

옥수수 성장 및 수확량을 또한 ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물에서 측정하였다. 성숙한 온실 식물은 스트레스의 부재 하에 옥수수 이삭 (수확물)을 생산하도록 더 성장시켜 습윤 중량 측정을 하였다. 통계적 분석은 ThLm1로 접종된 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 많은 수확량을 생산하였다는 것을 보여주었다 (N=48; P>0.05, 도 2).

스트레스의 부재 하에 성장된 ThLm1 접종된 옥수수에서 옥수수 성장 및 수확량 증진을 추가로 측정하였다. 스트레스의 부재 하에 성장된 성숙한 온실 식물을 전체 식물 중량 (바이오매스) 또는 옥수수 이삭 (수확물)으로 분리하여 습윤 중량 측정을 하였다. 통계적 분석은 ThLm1로 접종된 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 크다는 것을 보여주었다 (N=48; P>0.05, 도 3).

ThLm1 접종 식물에서의 종자 발아 증진을 또한 측정하였다. 옥수수 종자의 발아는 식물 성장 인큐베이터 및 온실에서 스트레스의 존재 및 부재 하에 측정하였다. 통계적 분석은 ThLm1로 접종된 종자 (ThLm1과의 공생)가 비-접종된 (NS) 종자보다 유의하게 더 높은 발아율을 가졌다는 것을 보여주었다 (N=100; SD<5; P<0.05, 도 4, 22-25).

또한 클로로필 함량을 ThLm1 접종 식물에서 측정하였다. 스트레스의 부재 하에 성장된 성숙한 온실 옥수수 식물을 % 클로로필 함량에 대해 측정하였다. 통계적 분석은 ThLm1 접종 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 더 높은 클로로필 함량을 가졌다는 것을 보여주었다 (N=9; P>0.05, 도 5, 13, 14). 전반적 관찰로서, ThLm1 접종 식물은 비-접종된 식물보다 더 푸르고 더 견실하게 보였다.

이들 데이터는 식물의 ThLm1 접종이 일반적으로 스트레스의 부재 하에 식물 성장, 수확량, 발아율 및 클로로필 함량을 비롯한 식물 건강을 증가시켰다는 것을 보여준다.

ThLm1은 스트레스의 존재 하에 식물 성장 및 건강을 증가시켰다

또한, ThLm1로 접종된 식물이 ThLm1로 접종되지 않은 식물보다 더 건강한지 결정하기 위해 스트레스 조건이 시험되었다. 뿌리 및 싹 중량을 ThLm1로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 가뭄 스트레스에 노출된 옥수수 식물에서 측정하였다. 60일령 옥수수 식물을 스트레스 없음 (2일마다 완전 급수), 중간 정도 가뭄 스트레스 (4일마다 급수) 또는 높은 가뭄 스트레스 (7일마다 급수)에 노출시켰다. 이어서 식물을 높은 가뭄 노출된 식물 (뿌리 및 싹)로부터의 바이오매스에 대해 평가하였다. 식물을 뿌리 및 싹 부분으로 분리하여 습윤 중량 측정을 하였다. 통계적 분석은 ThLm1 접종 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 크다는 것을 보여주었다 (N=36; P>0.05, 도 6a).

뿌리 및 싹 측정을 또한 ThLm1로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 저양분 스트레스에 노출된 옥수수 식물에서 수행하였다. 1주령 옥수수 식물에게 양분 (질소, 인 & 칼륨계 식물 비료, NPK) 함유 초기 급수를 제공하고, 그 후에 식물을 실험 기간 (대략 90일) 동안 양분 스트레스 없음 (완전 강도 NPK로 급수) 또는 저양분 스트레스 (¼ 강도 NPK로 급수)에 2일마다 노출시켰다. 이어서 식물을 바이오매스 (뿌리 및 싹)에 대해 평가하였다. 식물을 뿌리 및 싹 부분으로 분리하여 습윤 중량 측정을 하였다. 통계적 분석은 ThLm1 접종 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 크다는 것으로 보여주었다 (N=36; P>0.05, 도 6b).

중량 측정을 ThLm1로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 염 스트레스 하의 옥수수 식물에서 수행하였다. 60일령 식물을 30일 동안 염 스트레스 없음 (NPK의 표준 수준 함유 물) 또는 염 스트레스 (표준 NPK 용액 중 200mM NaCl)에 2일마다 노출시켰다. 식물 습윤 중량을 측정하였다. 통계적 분석은 ThLm1 접종 식물 (ThLm1과의 공생)이 비-접종된 식물보다 유의하게 더 크다는 것을 보여주었다 (N=36; P≥0.05, 도 7).

저온 스트레스 내성은 ThLm1로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 벼 묘목에서 측정하였다. 벼 묘목을 냉수 스트레스에 노출시켰다. 2주 후에, 벼 묘목을 뿌리 및 싹 바이오매스에 대해 평가하였다 (습윤 g). ThLm1로 접종된 벼는 통계적으로 더 큰 뿌리 및 싹을 가졌다 (N=10; P<0.05, 도 8).

가뭄 스트레스 하에서의 재배지 평가를 또한 수행하였다. 식물을 미국 미시간주에서 건조지역 경작 하에 성장시키고 50년 중 최악의 가뭄에 노출시켰다. 수확량 데이터는 각각 120개 옥수수 식물을 포함하는 4중 반복 플롯에 대해 입수하였다. ThLm1로 접종된 식물 (ThLm1과의 공생)은 비-접종된 식물보다 평균 85% 더 많은 수확량을 생산하였다, 도 9.

이들 데이터는 ThLm1로의 접종이 가뭄, 저양분, 온도 및 염 스트레스를 비롯한 스트레스 조건 하에, 식물 건강, 예컨대 성장 및 수확량을 개선하였다는 것을 보여준다.

<개요>

종합하면, 데이터는 ThLm1로의 접종으로 종자 발아율 및 묘목 성장이 증가하였고, 다양한 스트레스 (염, 온도, 가뭄, 양분)에 대한 내성을 부여하였고, 전반적 견실성 및 건강 (예컨대 % 클로로필의 증가)이 증진되었고, 수확량이 증가되었다는 것을 보여준다. 또한, ThLm1이 다른 미생물에 의한 식물 콜로니화를 경쟁적으로 경쟁하여 배제할 수 있고, 그렇게 하여 넓은 범위 또는 농업 식물 예컨대 대두, 벼 및 옥수수에서 병원성 유기체의 유입을 차단할 수 있었다는 것이 (따라서 질환의 발생이 감소됨) 발견되었다 (데이터는 제시되지 않음). ThLm1이 접종 시에 식물에 제공한 이익의 목록은 표 3에 요약된다.

<표 3> Th-Lm1 접종 식물 이익

실시예 2. ThLm1 단리 및 그로의 식물 접종

ThLm1의 단리

ThLm1을 단리하기 위해, 식물은 토양 부스러기가 제거될 때까지 세척하고, 플라스틱 집-록 백에 넣고 이전에 기재된 바대로 표면 멸균처리하였다 (Redman et al., 2001, 2002a). 무균 기술을 이용하여, 식물은 뿌리, 근경 및 줄기를 나타내는 부분들로 절단하고, 진균 성장 배지 [0.1X PDA (감자 덱스트로스 한천, 디프코(Difco)] 상에 플레이팅하고, 실온에서 5-7일 동안 냉 형광등 아래에서 인큐베이션하여 진균이 출아하도록 하였다. 출아 시에, 나타난 주요 진균 내생생물의 30종의 대표 분리주를 계대배양하고, 이 중 10종의 대표 분리주의 단일 포자 단리를 이전에 기재된 바대로 수행하였다 (Redman et al., 1999). 대표 분리주 10종 모두를 멸균 1.5 ml 스크류-캡 튜브에서 50-100 mg/ml의 암피실린으로 보충된 멸균수 하에 배치하고 장기 저장을 위해 4℃에 두었다.

ThLm1 배양:

ThLm1은 0.1X 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 배지(디프코) 상에서 배양하였다. 배지는 50-100 ug/ml의 암피실린, 테트라시클린 및 스트렙토마이신을 보충하고 12시간 광체계로 22℃에서 진균 배양물을 성장시켰다. 성장 5-14일 후에, 분생포자는 10 ml의 멸균수를 첨가하고 온화하게 멸균 유리 슬라이드로 포자를 벗겨냄으로써 플레이트로부터 수확하였다. 포자의 최종 부피는 멸균수로 100 ml로 조정하고, 멸균 목화 치즈클로스 거즈 4층을 통해 여과하고 포자 농도를 10⁴-10⁵개 포자/ml로 조정하였다.

ThLm1의 확인:

진균은 분생자병 및 분생자 형태학을 이용하여 확인되었다 (Arx, 1981; Barnett 및 Hunter, 1998; Leslie 및 Summerell, 2005). 엘. 몰리스로부터의 분리주들이 현미경적으로 동일 진균 종으로 확인되고 나면, 분리주 중 3종을 무작위로 분자 종 확인을 위해 선택하였다. 종 명칭은 rDNA의 가변 ITS1 및 ITS2 서열 [ITS4 (5'-tcctccgcttattgatatgc-3'; 서열 1)/ITS5 (5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'; 서열 2) 프라이머] 및 번역 신장 인자 [EF1T (5'-atgggtaaggaggacaagac-3'; 서열 3)/EF2T (5'-ggaagtaccagtgatcatgtt-3'; 서열 4) 및 EF11 (5'-gtggggcatttaccccgcc-3'; 서열 5)/EF22 (5'-aggaacccttaccgagctc-3'; 서열 6) 프라이머 (O'Donnell et al., 2000; White et al., 1990)]의 서열 분석을 기반으로 하였다. DNA는 균사체로부터 추출하였고 이전에 기재된 바대로 PCR 증폭하였다 (Rodriguez, 1993; Rodriguez and Yoder, 1991). PCR 산물을 서열분석하고 BLAST를 진뱅크 데이터베이스에 대해서 검색하였다. 형태학 및 진뱅크 분석은 3개 분리주/종을 동일한 종 (트리코더마 하르지아눔)으로서 확인하였고 모든 분리주를 식물 이익에 관련하여 시험하였다.

트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1의 이익

트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1의 단자엽식물 (옥수수) 및 쌍자엽식물 (대두 및/또는 토마토)에 대한 이익을 평가하는 일련의 연구를, 진균이 양쪽 계통의 식물과 유익한 공생을 확립하다는 것을 증명하기 위해 수행하였다.

ThLm1은 스트레스의 부재 하에 식물 성장과 건강을 증가시켰다

첫째로, 스트레스 부재 하에 ThLm1 접종 식물의 전반적 식물 건강, 예컨대 식물 성장 및 발육을 결정하기 위해 스트레스 조건 없이 실험을 수행하였다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 묘목을 성장 12주 후에 싹 및 뿌리 바이오매스에 대해 평가하였다. 성장 증진이 ThLm1로 접종된 식물에서 관찰되었다 (N=48; SD<6.8; P<0.050, 도 10). 추가로, ThLm1로 접종된 옥수수는 더 많은 곁뿌리를 갖는 더 광범위한 뿌리계를 생성하는 것으로 관측되었다 (도 11).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 묘목을 또한 성장 13일 후에 싹 및 뿌리 바이오매스에 대해 평가하였다. 대두 묘목의 성장 증진이 ThLm1로 접종된 식물에서 관찰되었다 (N=10; SD<10%; P<0.050, 도 12).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 클로로필 함량에 대해 평가하였다. SPAD 측정을 수행하였고 이는 % 클로로필을 나타낸다. ThLm1 접종 옥수수 식물은 비-접종된 식물보다 더 높은 클로로필 함량을 갖는 것으로 관측되었다 (N=60, P<0.05, 도 13). 일반적으로, ThLm1로 접종된 옥수수 식물은 비-접종된 식물보다 진한 녹색이었다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 식물을 또한 클로로필 함량에 대해 평가하였다. ThLm1로 접종된 대두 식물은 비-접종된 식물보다 유의하게 더 많은 클로로필을 가졌다 (N=10, SD<5%, P<0.05, 도 14).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 종자를 발아에 대해 평가하였다. ThLm1로 접종된 옥수수 종자는 더 높은 발아 %를 가졌다 (N=100; SD<5; P<0.05, 도 4).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 열매 수확량에 대해 평가하였다. 옥수수 수확량 평가를 위해, 6개 옥수수 식물을 모아 이삭의 수확 중량을 결정하였다. ThLm1 접종 식물은 비-접종된 식물보다 더 많은 열매를 생산하였다 (N=6, P<0.05, 도 15).

종합하면, 상기 데이터들은 스트레스의 부재 하에 ThLm1 접종이 성장 증진, 보다 광범위한 뿌리계, 상승된 클로로필 수준, 더 높은 발아율 및 더 높은 열매 수확량을 부여하였다는 것을 보여준다.

다음, 스트레스의 존재하에 ThLm1 접종된 식물의 전반적 식물 건강을 결정하기 위한 조건 하에 실험을 수행하였다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 저양분 스트레스 하에 뿌리 질량, 싹 질량, 묘목 중량 및 수확량에 대해 평가하였다. 1주령 옥수수 식물에게 질소, 인, 칼륨 (NPK) 함유 초기 급수를 제공하고, 그 후에 식물을 실험 기간 (대략 90일) 동안 NPK 스트레스 없음 (완전 강도 NPK로 급수), 낮은 NPK 스트레스 (½ 강도 NPK로 급수) 또는 높은 NPK 스트레스 (¼ 강도 NPK로 급수)에 2일마다 노출시켰다. 이어서 식물은 수확량 및 바이오매스 (뿌리 및 싹)에 대해 평가하였다. ThLm1 접종 식물은 저양분 스트레스 하에 비-접종된 식물보다 더 높은 뿌리 질량, 싹 질량, 묘목 중량 및 수확량을 가졌다 (N=12-60; SD<10%, P<0.05, 도 16).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 가뭄 스트레스 하에 뿌리 질량, 싹 질량 및 수확량에 대해 평가하였다. 60일령 옥수수 식물은 스트레스 없음 (2일마다 완전 급수) 또는 높은 가뭄 스트레스 (7일마다 급수)에 노출시켰다. 이어서 식물은 수확량 및 바이오매스 (뿌리 및 싹)에 대해 평가하였다. ThLm1 공생 식물은 가뭄 스트레스 하에 NS 식물보다 더 높은 뿌리 질량, 싹 질량 및 수확량을 가졌다 (N=12-60; SD< 10%, P≤0.05, 도 17).

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 식물을 염 스트레스 하에 뿌리 및 싹 바이오매스에 대해 평가하였다. 8개 접종된 묘목 및 8개 비-접종된 묘목은 2주 동안 염 (300mM)에 노출시켰다. 접종된 식물은 유의하게 더 많은 싹 및 뿌리 바이오매스를 생산하였다 (도 18). 비-접종된 식물 잎은 연구의 말기에 시든 반면, 접종된 식물은 건강하게 유지되었다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 염 스트레스 하에 뿌리 및 싹 바이오매스에 대해 평가하였다. 8개 접종된 묘목 및 8개 비-접종된 묘목은 2주 동안 염 (300mM)에 노출시켰다. 접종된 식물은 유의하게 더 많은 싹 및 뿌리 바이오매스를 생산하였다 (도 19). 비-접종된 식물 잎은 연구의 말기에 시든 반면, 접종된 식물은 건강하게 유지되었다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 식물을 고온 스트레스 하의 성장에 대해 평가하였다. 성장은 고온 (45-50℃)에의 노출 2주 후에 측정하였다. ThLm1 접종 식물은 열 스트레스 하에 비-접종된 식물보다 더 많이 성장하였다 (도 20). 비-접종된 식물은 시든 반면, 접종된 식물은 건강하게 유지되었다.

ThLm1로 접종되거나 또는 접종되지 않은 토마토 식물을 고온 스트레스 하의 성장에 대해 평가하였다. 성장은 고온 (45-50℃)에의 노출 2주 후에 측정하였다. ThLm1 접종 식물은 열 스트레스 하에 비-접종된 식물보다 더 많이 성장하였다 (도 21). 비-접종된 식물은 시든 반면, 접종된 식물은 건강하게 유지되었다.

ThLm1로 처리 또는 처리되지 않은 옥수수 종자를 고온 스트레스 (50-55℃) 하의 발아에 대해 평가하였다. ThLm1로 처리된 종자 (N=15)는 처리되지 않은 대조군 종자보다 유의하게 더 우수하게 발아하였다 (도 22).

ThLm1로 처리 또는 처리되지 않은 대두 종자를 고온 스트레스 (50-55℃) 하의 발아에 대해 평가하였다. ThLm1로 처리된 종자 (N=15)는 처리되지 않은 대조군 종자보다 유의하게 더 우수하게 발아하였다 (도 23).

ThLm1로 처리되거나 또는 처리되지 않은 옥수수 종자를 저온 스트레스 하의 발아에 대해 평가하였다. 옥수수 종자를 144시간 동안 저온 온도 (5℃)에 노출시켰다. ThLm1로 처리된 종자 (N=30)는 처리되지 않은 대조군 종자보다 유의하게 더 우수하게 발아하였다 (도 24).

ThLm1로 처리되거나 또는 처리되지 않은 대두 종자를 저온 스트레스 하에 발아에 대해 평가하였다. 대두 종자를 72시간 동안 저온 온도 (5℃ 또는 15℃)에 노출시켰다. ThLm1로 처리된 종자 (N=30)는 처리되지 않은 대조군 종자보다 유의하게 더 우수하게 발아하였다 (도 25).

종합하면, 상기 데이터들은 ThLm1로의 접종으로 뿌리 및 싹 질량, 수확량 및 발아를 비롯한 식물 건강 및 성장이 스트레스 조건 예컨대 가뭄, 염, 고온 및 저온 하에 개선되었다는 것을 제안한다.

ThLm1은 스트레스의 존재 및 부재 하에 광합성 효율을 증가시킨다

광합성 효율 (Qmax)은 광합성 동안 화학적 에너지로 변환된 광 에너지의 분율이다. 옥수수에 대해 도 39a-39c에 예를 들어 나타낸 바와 같이, ThLm1로의 여러 연구는 스트레스의 존재 또는 부재 둘 다에서 ThLm1로의 식물 처리가 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 다에서 Qmax의 증가를 결과하였다는 것을 보여주었다.

ThLm1은 스트레스의 존재 및 부재 하에 작물 수확량을 증가시킨다

2년 재배지 시험을 바이오엔슈어® (제제화된 ThLm1) 접종 및 비-접종된 옥수수, 벼, 곡실류 및 그래스 종자로 8개 주에서 수행하였다 (도 40-44). 재배지 시험은 높은 가뭄 및 염 스트레스 또는 매우 낮은 스트레스 수준 (정상 성장 시기)의 조건하에 수행하였다. 바이오엔슈어®는 모든 조건하에 작물 수확량을 증가시켰고 보다 큰 수확량 상승이 스트레스의 높은 수준하에 관찰되었다. 토양 유형 및 기후 구역에 상관없이 수확량 상승이 발생하였다.

요약

종합하면 데이터는 ThLm1로의 접종이 종자 발아율 및 식물 성장을 증가시켰고, 다양한 스트레스 (염, 온도, 가뭄, 양분)에 대해 내성을 부여하였고, 전반적 견실성 및 건강 (예컨대 % 클로로필의 증가)을 증진시켰고, 수확량을 증가시켰다는 것을 보여준다.

실시예 3. 티. 하르지아눔 분리주의 스트레스 내성 증가, 발아 증가 및 다른 진균 배제에 대한 효과

다양한 지리적 위치로부터 단리된 티. 하르지아눔의 균주 (균주 중 16종의 근원이 표 4에 언급됨)가, 상기 실시예에 기재된 바의 방법을 사용하여 ThLm1에 추가하여 티. 하르지아눔 균주의 이익을 평가하기 위해 사용되었다.

<표 4> 사용된 티. 하르지아눔 균주의 지리적 다양성

결과는 도 26-38, 45-48, 50 및 51에 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주에 의해 식물에 부여된 가뭄 스트레스 내성, 염 스트레스 내성, 온도 내성 (열 및 저온 내성) 및 저양분 내성에 대해 나타내어진다. 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주 모두가 각각의 실험 또는 조건에 사용되지는 않았지만, 결과는 일반적으로 다양한 스트레스에 내성을 증가시키기 위한 티. 하르지아눔의 용도를 분명히 뒷받침한다.

티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 식물을 고온 스트레스 하의 성장에 대해 평가하였다. 성장은 고온 (45-50℃)에의 노출 2주 후에 측정하였다. 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 접종된 식물은 열 스트레스 하에 비-접종된 식물보다 증가된 잎 클로로필 수준 및 더 높은 식물 바이오매스를 가졌다 (도 45 및 46).

티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 또는 옥수수 식물은 저양분 스트레스 하에 묘목 중량에 대해 평가하였다. 1주령 대두 또는 옥수수 식물에게 질소, 인, 칼륨 (NPK) 함유 초기 급수를 제공하고, 그 후에 식물을 실험 기간 (대략 90일) 동안 NPK 스트레스 없음 (완전 강도 NPK로 급수), 낮은 NPK 스트레스 (½ 강도 NPK로 급수) 또는 높은 NPK 스트레스(¼ 강도 NPK로 급수)에 2일마다 노출시켰다. 이어서 식물을 묘목 중량에 대해 평가하였다. 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 접종된 식물은 저양분 스트레스 하에 비-접종된 식물보다 더 높은 묘목 중량을 가졌다 (도 47, 대두; 도 48, 옥수수).

또한, 저온 스트레스 내성을 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 옥수수 묘목에서 측정하였다. 이어서 옥수수 묘목을 저온 스트레스에 노출시키고 발아 뿌리 길이에 대해 평가하였다. 티. 하르지아눔으로 접종된 옥수수는 통계적으로 보다 긴 발아부를 가졌다 (도 50).

저온 스트레스 내성을 또한 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 사전 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 묘목에서 측정하였다. 대두 묘목을 저온 스트레스에 노출시키고 이어서, 발아 뿌리 길이에 대해 평가하였다. 티. 하르지아눔으로 접종된 대두 묘목은 통계적으로 보다 긴 발아부를 가졌다 (도 51).

다른 실험에서, 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주를, 도 49에 나타난 바와 같이 본원에 기재된 방법론을 이용하여 종자의 발아에 대한 그의 효과에 대해 시험하였다. 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 접종되거나 또는 접종되지 않은 대두 종자를 발아에 대해 평가하였다. 티. 하르지아눔의 지리적으로 다양한 분리주로 접종된 대두 종자는 미처리된 대두 종자와 비교하여 유의하게 더 높은 발아 %를 가졌다 (도 49). 결과는 일반적으로 종자의 발아를 증가시키기 위한 티. 하르지아눔의 용도를 뒷받침한다.

다른 실험에서, 티. 하르지아눔의 16종의 지리적으로 다양한 분리주를 식물에서 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착에 대한 그의 효과에 대해 시험한다. 종자 또는 묘목을 단리된 티. 하르지아눔 분리주 또는 그의 포자로 접종하고 종자 또는 묘목을 성장시킨다. 접종된 티. 하르지아눔 분리주 이외의 진균의 성장을 평가한다. 결과는 접종된 종자 또는 묘목으로부터 성장하는 식물에서 일반적으로 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키기 위한 티. 하르지아눔의 용도를 뒷받침한다.

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다른 실시양태

본 명세서에 개시된 모든 특성은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특성은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특성은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 또는 유사한 특성의 예이다.

상기 기재로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 파악할 수 있을 것이며, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 발명에 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태들도 청구범위 내에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Adaptive Symbiotic Technologies LLC <120> Compositions and Methods Related to Isolated Endophytes <130> A1045.70000WO00 <150> US 61/858,819 <151> 2013-07-26 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 1 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 2 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 3 atgggtaagg aggacaagac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 4 ggaagtacca gtgatcatgt t 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 gtggggcatt taccccgcc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 6 aggaaccctt accgagctc 19

Claims

미국 농무부 컬쳐 콜렉션(U.S. Department of Agriculture Culture Collection)에 특허 기탁 명칭 번호(Patent Deposit Designation number) NRRL 50846 하에 기탁된, 단리된 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) 균주 ThLm1 진균, 또는 그의 자손 또는 포자.
제1항의 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 및/또는 그의 자손 및/또는 포자를 포함하는 조성물.
제2항에 있어서, 액체 또는 분말인 조성물.
식물 또는 식물 종자에 제1항의 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균, 또는 그의 자손 또는 포자; 또는 제2항의 조성물을 접종하는 것을 포함하는, 스트레스 내성의 촉진 및/또는 식물 성장 또는 종자 발아의 증진을 위한 방법.
제4항에 있어서, 스트레스 내성이 가뭄 내성, 염 내성, 감소된 양분 내성, 진균 내성, 및/또는 온도 내성인 방법.
제4항에 있어서, 증진된 식물 성장 또는 종자 발아가 크기, 뿌리 발달의 정도, 종자의 발아율, 클로로필 함량/수준, 광합성 효율, 수확량 또는 질량의 증가를 포함하는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식물에의 접종이 식물의 뿌리 및/또는 줄기에 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균 또는 그의 포자 또는 자손을 콜로니화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 고염도, 저수분 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 토양에서 성장시키는 것인 방법.
제8항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 고염도 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 물에서 성장시키는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 35℃ 이상 또는 15℃ 이하의 평균 온도에서 성장시키거나 또는 발아시키는 것인 방법.
제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 작물 식물 또는 작물 식물 종자인 방법.
제12항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자가 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자인 방법.
제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 관상식물, 예컨대 로사세아에(Rosaceae), 릴리아세아에(Liliaceae), 아잘레아(Azalea), 로도덴드론(Rhododendron), 포아세아에(Poaceae) 또는 크리산테뭄(Chrysanthemum)인 방법.
제1항의 단리된 트리코더마 하르지아눔 균주 ThLm1 진균, 또는 그의 포자 또는 자손; 또는 제2항의 조성물을 접종한 식물 또는 식물 종자.
제15항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자인 식물 또는 식물 종자.
제16항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자가 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자인 식물 또는 식물 종자.
제15항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄인 방법.
식물 또는 식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 식물의 스트레스 내성을 증가시키는 것을 포함하는, 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
제19항에 있어서, 스트레스가 가뭄, 상승된 염, 감소된 양분 및/또는 온도 스트레스인 방법.
제19항에 있어서, 스트레스가 폴리시클릭 방향족 탄화수소, 나프텐산 또는 높은 pH의 존재가 아닌 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 식물에의 접종이 식물의 뿌리, 줄기 및/또는 잎에 트리코더마 하르지아눔 균주 진균 또는 그의 포자 또는 자손을 콜로니화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 성장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 고염도, 저수분 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 토양에서 성장시키는 것인 방법.
제24항에 있어서, 고염도가 35 mM 초과의 양의 염인 방법.
제24항에 있어서, 저수분 함량이 0 - 0.18 in³ 물/in³ 토양인 방법.
제24항에 있어서, 저양분 함량이 80 파운드/에이커 미만의 양분이고, 여기서 양분은 각각 20%의 질소, 인 및 칼륨, 및 연관된 미량양분을 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 고염도 및/또는 저양분 함량을 특징으로 하는 물에서 성장시키는 것인 방법.
제24항에 있어서, 식물 또는 식물 종자를 35℃ 이상 또는 15℃ 이하의 평균 온도에서 성장시키거나 또는 발아시키는 것인 방법.
제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 작물 식물 또는 작물 식물 종자인 방법.
제30항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자가 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자인 방법.
제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄인 방법.
제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코더마 하르지아눔 균주 진균이 균주 TSTh20-1 또는 균주 T-22가 아닌 방법.
식물 종자에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자의 발아를 증가시키는 것을 포함하는, 종자의 발아를 증가시키는 방법.
제34항에 있어서, 식물 종자를 살진균제 및/또는 살곤충제로 이전에, 동시에 및/또는 이후에 처리하는 것인 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 작물 식물 또는 작물 식물 종자인 방법.
제36항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자가 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자인 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄인 방법.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코더마 하르지아눔 균주 진균이 균주 TSTh20-1 또는 균주 T-22가 아닌 방법.
식물 종자 또는 묘목에 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자; 또는 단리된 트리코더마 하르지아눔 진균 또는 그의 포자를 포함하는 조성물을 접종하여, 접종된 종자 또는 묘목으로부터 성장하는 식물에서 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키는 것을 포함하는, 식물에서 트리코더마 하르지아눔 이외의 진균의 정착을 감소시키는 방법.
제40항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 작물 식물 또는 작물 식물 종자인 방법.
제41항에 있어서, 작물 식물 또는 작물 식물 종자가 수박, 토마토, 옥수수, 밀, 대두, 조롱박, 페퍼, 녹색 잎채소, 보리, 목화, 콩, 완두, 괴경, 장과류, 목본 식물 또는 벼, 또는 그의 종자인 방법.
제40항에 있어서, 식물 또는 식물 종자가 관상식물, 예컨대 로사세아에, 릴리아세아에, 아잘레아, 로도덴드론, 포아세아에 또는 크리산테뭄인 방법.
제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코더마 하르지아눔 균주 진균이 균주 TSTh20-1 또는 균주 T-22가 아닌 방법.