一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法及培
养容器
技术领域
本发明属于食用菌生产技术领域,尤其是涉及一种寄主植物-菌根食用菌共生苗培育技术。
背景技术
松茸、块菌、牛肝菌等菌根性食用菌与双孢蘑菇、香菇、平菇等腐生菌不同,菌根性食用菌是食用菌中重要的一类,它着生于活体植物的根系上,通过活体植物根系接受植物的光合成产物,同时将它本身从土壤中吸收的养分供给活体植物利用,即形成植物-食用菌共生关系。目前人工栽培是非常困难的。通常的做法一般是先培养寄主植物苗,以表面灭菌的种子在灭菌的培养基质中培养,将培养好的寄主植物苗,接种上菌根食用菌菌种,然后将接种后的寄主植物-菌根食用菌共生苗,在一定的温室或灭菌温室中培养,待菌根苗成长到一定程度大小,将其移植到生产场地,生成食用菌子实体。整个过程主要包括寄主植物无菌苗的培育,在寄主植物根系接种食用菌菌种,接种后的菌根苗的培养,以及养成的菌根苗移植到生产场地进行出菇培养。2013年第34卷第1期四川林业科技报道林强的研究事例,其寄主植物-菌根食用菌合成苗的制作方法是,收集云南松种子用水选法去除空壳种子,用0.1%的高锰酸钾液浸泡处理30min,然后再用清水浸泡1d~2d,灭菌处理后的云南松种子播入混合基质的培育箱中,培养基质在121℃~126℃的高压灭菌器下灭菌2.5h~3h放置一周后使用,播种后,用清水将基质浇透后放置于室内催芽,待80%以上的种子发芽后再移入炼苗室内进行无菌苗培育。将培育好的云南松无菌苗浸泡在自来水里至根部基质松解,在适宜的容器内装入上述灭菌基质,至2/3深度,然后用小勺舀一勺约3g接菌剂(菌根食用菌接种菌液),在容器基质表面,将云南松无菌苗栽入,使根部与菌剂接触,然后覆盖基质压紧,用水浇透,将接种苗放置在炼苗室培育半月,期间适当浇水,然后移到温室大棚育苗架上培养6个月。然而,现有技术存在的问题有:(1)寄主植物种子只能表面灭菌,以及寄主植物苗在培育过程中环境,尽管可以事先灭菌处理,但整个生长过程中难以做到真正的无菌培养,如空调的空气流动,人员的操作传染,以及温室角落的均无繁衍等等,因此容易造成杂菌污染。(2)寄主植物苗培养成功后,需要在寄主植物苗的根系上接种菌根食用菌的菌种,其接种方法一般是将植物根系在接种液中浸染,或者在植物根系造成创伤,如剪短一部分根系、剥皮、刺伤等,在创伤的部位接种菌种。然而这些方法难以确保在植物苗根系上确切接种成功,即接种成功率较低.(3)将接种后的植物苗栽植于培养基质中,这时容易造成接种的菌种流失乃至死亡,致使植物苗根系接种菌种浓度降低,从而减少寄主植物-菌根食用菌共生苗的成活率。(4)接种后的寄主植物-菌根食用菌共生苗,一般放在温、湿、光等可控条件下的温室中培养,这种温室事先是可以进行灭菌处理的,但是这种温室难以保证在寄主植物-菌根食用菌共生苗整个生育期间是无菌条件的。(5)菌根性食用菌其特点之一就是菌丝生长速度很慢,整个培育期将是长期的,在这个长期的培育过程中,培养基质的水分管理是十分困难的和难以准确掌握的,常常造成接种成功的寄主植物-菌根食用菌共生苗衰败和死亡。
发明内容
针对目前现行的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养方法存在的缺陷,本发明的目的是提供一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法,该方法使寄主植物-菌根食用菌共生苗在全生长过程处于无菌可控条件下生长发育,可以达到在离体无菌条件培育出寄主植物系统,接种菌根食用菌菌种,形成离体无菌条件下的寄主植物-菌根食用菌共生苗系统。
为实现上述目的,本发明采用了下列技术方案。
一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法,包括如下步骤:
(1)准备离体无菌培养寄主植物系选择具有寄主植物-菌根食用菌共生关系的植物,在无菌条件下摘取植物茎尖生长点进行离体培养,继而诱导植物发根,形成完整的寄主植物苗系统;
(2)无菌精准接种 用无菌微型接种注射器吸取特定寄主植物-菌根食用菌关系的菌种菌源液,精准地将菌种接入步骤(1)培养的植物根系的表皮皮层组织中,然后将接种口用凝胶剂包埋好,形成离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗系统;
(3)寄主植物-菌根食用菌共生苗培养 将步骤(2)接种后的共生苗放在离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器中,固定共生苗于培养容器中的三脚架中,共生苗的根尖部放在培养基上,要使接种口与培养基面保持一定的距离,避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散,并且不使其倒伏,也不使其下坠,在特定的寄主植物-菌根食用菌共生适宜的培养基种类及培养条件下,培养形成可用于生产的寄主植物-菌根食用菌共生苗。
一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器,包括透明的容器、容器盖和三角形固定架,容器盖设有过滤通气窗,容器底部设有一个三角形固定架,三角形固定架顶部设置一个带有缺口圆形环,缺口圆形环上设有若干向外、固定弹性胶圈的小钩。
使用离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器时,在容器中倒入培养基后灭菌、灭菌后冷却,无菌条件下将寄主植物-菌根食用菌共生苗移入容器中,将共生苗的茎部从圆形环的缺口处移入圆形环中,用无菌的弹性胶圈在缺口圆形环上的小钩与共生苗茎部间循环绕,固定共生苗不倒伏、不下坠,盖上容器盖即可。
本发明的有益效果:
(1)采用本发明的培养方法,可以在无菌、温度湿度和光照可控的环境条件下培育出寄主植物系统,使快速大量繁育共生苗成为现实,本发明较现有技术的繁育速度提高了3-12倍。
(2)采用本发明无菌微型接种注射器接种,可以精确地在寄主植物根系的表皮皮层组织内部注入接种菌源,较现有技术的接种成功率提高了1.6-2.5倍,接种后寄主植物-菌根食用菌共生苗的生成率较现有技术提高了30%-50%。
附图说明
图1为本发明的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养容器示意图。
图2为本发明的接种方法示意图。
图中:1、容器,2、容器盖,3、三角形固定架,4、缺口圆形环,5、小钩,6、弹性胶圈,7、过滤通气窗,8、共生苗, 9、培养基,10、寄主植物根系,11、微型接种注射器。
具体实施方式
本发明适用于如块菌、牛肝菌、松茸、茯苓等菌根食用菌种类的共生苗培养,。其主要的技术环节是:(1)根据菌根食用菌的种类选择适当的寄主植物种类,如块菌的共生寄主植物是栎树、榛子树、云南松等;(2)对应寄主植物种类采用适当的茎尖组织培养方法,包括茎尖培养基种类、生根培养基种类以及培养条件等,如适合于木本植物的培养基有WPM、MS、B5、White、Heller等;(3)使用无菌微型接种注射器,严格实行精准的接种方法;(4)使用本发明的培养容器,正确使用接种后的培养方法和操作步骤;(5)整个培养过程要在完全无菌条件下完成。
实施例1
一种离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器,包括透明的容器1、容器盖2和三角形固定架3。所述的三角形固定架3设置在容器1的底部,三角形固定架3顶部设有一个带有缺口的圆形环4,缺口的圆形环4上设有若干向外、固定弹性胶圈6的小钩5。所述的容器盖2的中央设有过滤通气窗7。
实施例2
一种栎树与块菌的离体无菌共生苗的培养方法,包括如下步骤:
(1)寄主材料的准备 将栎树(辽东栎或栓皮栎)枝条截成1寸长的小段,每段枝条含有一个腋芽,去除叶片叶柄,用清水洗净,再用70%酒精进行表面灭菌30秒,然后用灭菌水清洗3遍,再用0.1%次氯酸钠灭菌3-5分钟,倒掉次氯酸钠,用灭菌水冲洗3次,备用。
(2)培养基配制 选择适合于栎树茎尖培养的WPM培养基作为基本培养基,添加0.2-0.5%的6-BA、3%蔗糖和15g/L琼脂粉,用NaOH或HCl调整pH值为6.5-7.0。培养基分装于150-180mm×180mm试管中,每只试管分装培养基10ml,在高压灭菌锅中121℃,20分钟高压灭菌。灭菌后将培养基取出,摆成斜面,备用。
(3)寄主植物离体培养 将(1)准备好的栎树枝条小段,在无菌超净工作台中显微镜下,摘取0.5mm左右的茎尖,放入试管培养基,在无菌培养室中,25℃、16小时光照条件下进行离体培养,6周后,移植到新的同成份的瓶装培养基(250ml瓶,每瓶装40ml培养基中,进行继续培养,培养条件为25℃、16小时光照,每6周转移一次新培养基继续培养,直至将离体培养组织培育成栎树小苗(无根)形态。然后将栎树小苗移植到发根培养基(250ml瓶,每瓶装40ml培养基)中进行诱导发根。发根培养基为WPM培养基作为基本培养基,添加0.2-0.5%的IBA和0.1%的NAA,3%蔗糖,15g/1L琼脂粉,调整PH值为6.5-7.0。培养条件为25℃、16小时光照。
(4)块菌接种液配制 将储存于冷冻冰箱的洗净过的块菌子囊果取出,室温下自然解冻,超净工作台中用无菌水洗过,用0.1%次氯酸钠表面灭菌3-5分钟,再用无菌水冲洗干净。然后进行组织分离,将菌块切开,取中间部分的子实体果肉分离到事先准备好的液体PDA培养基(300ml三角瓶,培养基量100ml)中,在摇床上进行振动培养,制成块菌接种液,备用。
(5)接种无菌条件下将(3)培养好的栎树无菌苗从培养基中取出,洗净根系培养基残渣,用无菌微型接种注射器吸入(4)准备好的块菌接种液,刺入栎树无菌苗根系的表皮,将接种菌液注入植物根系表皮组织中,再将接种口用凝胶剂包埋好。
(6)共生苗培养将(5)接种后的栎树-块菌共生苗,放入本发明的离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养容器中,用弹性胶圈固定共生苗于培养容器中的三脚架中,共生苗的根尖部放在培养基上,以使其可以吸收培养基的营养。要使共生苗的根系接种口与培养基面保持一定的距离,避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散,并且不使共生苗倒伏,也不使其下坠。培养基为WPM培养基作为基本培养基,添加3%蔗糖,15g/1L琼脂粉,调整PH值为6.5-7.0。在温度25℃,5000Lx,16小时光照,无菌条件下,培养形成离体无菌的寄主植物-菌根食用菌共生苗。
实施例3
一种山杨树与美味牛肝菌的离体无菌共生苗的的培养方法,包括如下步骤:
(1)寄主植物材料的准备 山杨树是美味牛肝菌的寄主植物之一,选择山杨树带叶芽枝条,将其枝条按实施例1步骤(1)方法,进行枝条整理,并进行洗净,表面灭菌,备用。
(2)培养基配制 适合于寄主植物的培养基是关键,山杨树的适宜培养基是MS+0.3-0.5%6-BA+3%蔗糖+15g/L琼脂粉,pH值为6左右。按实施例1步骤(2)配制方法制作,灭菌后备用。
(3)寄主植物离体培养 将上述(1)的山杨树枝条小段,在无菌超净工作台中显微镜下,摘取0.5mm左右的茎尖,放入(2)培养基,在无菌培养室中,25℃,16小时光照条件下离体培养。6周后,移植到新的同成份的瓶装培养基(250ml瓶,每瓶装40ml培养基)中,进行继续培养,培养条件不变。每6周转移一次至新培养基中进行培养,直至将离体培养枝条培育成稳定的小苗(无根)形态。将培养好的山杨树苗在发根培养基中诱导发根。发根培养基为MS+0.5-1.0%的IBA+3%蔗糖+15g/1L琼脂粉,pH值为6,发根培养条件为25℃、16小时光照。
(4)美味牛肝菌接种液配制在超净工作台中,选用300ml三角瓶,放入无菌水100ml左右,将美味牛肝菌菌丝取出,放入无菌水三角瓶中稀释,在摇床上进行振动摇匀,制成接种液,备用。
(5)接种将培养好的山杨树的离体无菌培养苗从培养基中取出,洗净根系培养基残渣。用无菌微型接种注射器进行接种,方法同实施例1步骤(5),接种后将接种口用凝胶剂包埋好。
6. 共生苗培养将完成接种的山杨树-美味牛肝菌共生苗,放入本发明的寄主植物-菌根食用菌共生苗培养容器中,用弹性胶圈固定共生苗于培养容器中的三脚架中,共生苗的根尖部放在培养基上,以使其可以吸收培养基的营养。要使共生苗的根系接种口与培养基面保持一定的距离,避免接种口接触培养基质而造成接种菌种扩散,并且不使共生苗倒伏,也不使其下坠。培养基为MS+3%蔗糖+15g/1L琼脂粉,PH值为6-6.5,培养条件温度25℃,光照5000 Lx,16小时,无菌。