CN103146608A

CN103146608A - 一种amf+pgpr组合菌剂及其制备方法和在分解残留有机磷农药中的用途

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Publication number: CN103146608A
Application number: CN2013100713428A
Authority: CN
Inventors: 刘润进; 李敏
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-03-06
Also published as: CN103146608B

Abstract

本发明提供了一种AMF+PGPR组合菌剂及其制备方法和在分解残留有机磷农药中的用途，主要步骤是分别将丛枝菌根真菌（AMF）摩西球囊霉和根围促生细菌（PGPR）荧光假单胞菌培养繁殖后，将AMF和PGPR混匀制备成组合菌剂。将该组合菌剂以每平方米土地50mL的用量施入受有机磷农药污染的土壤中、播种三叶草，以建立AMF+三叶草+PGPR三联修复体系。经接种处理的土壤不施肥，适当控水，其他常规管理，令该联合修复体系正常培育、生长与分解。经过两年的分解，即可显著降低土壤中甲胺磷残留量，土壤理化性状、肥力和健康状况得到修复。可以解决现有技术存在的降解率低和降解过程中所产生的有毒中间产物等问题。

Description

一种AMF+PGPR组合菌剂及其制备方法和在分解残留有机磷农药中的用途

技术领域

本发明涉及生物修复污染环境的领域，具体涉及一种AMF+PGPR组合菌剂及其制备方法和在分解残留有机磷农药中的用途。

背景技术

我国每年施用化学农药约80万吨，其中，20万吨有机磷农药中剧毒的甲胺磷高达6万吨。可见国内有机磷农药仍占主导地位，土壤、农产品和河流沉积物中都检测到了该类农药的残留，对土壤和农产品的污染已达到不能容容忍的程度，一直是个难以解决的大问题。目前利用植物、动物、真菌、细菌等生物降解的途径受到国内外广泛重视。如外生菌根真菌（Suillus variegates）体外培养降解多氯联苯（PCBs）和含氯的芳香族除草剂时，与细菌共培养降解效率高；当缺乏土壤细菌和其他微生物时，S.variegates与松树形成的菌根对2,4-二氯酚的降解率只有3%。丛枝菌根真菌（AMF）也具有降解有毒有机物的能力。AMF摩西球囊霉（Glomus mosseae）与植物及其他真菌协同作用能在一定程度上降解石油污染物、修复被污染的土壤。苜蓿接种AMF幼套球囊霉（Glomus etunicatum）促进了根围土壤中菲类物质的降解。而根围促生细菌（PGPR）是土壤中的重要生物成员，近年来其修复有毒有机物污染土壤的效应也倍受关注。然而，单一或两种生物虽有一定的分解有毒有机物的作用，但降解率很低，难以奏效。虽然AMF+植物+PGPR协同促进植物营养吸收、提高植物抗病性等方面的效应已有研究，而AMF+植物+PGPR协同分解土壤中残留农药的研究尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种AMF+PGPR组合菌剂及其制备方法和在分解残留有机磷农药中的用途，本发明具体利用真菌、细菌与植物三种生物联合修复受有毒有机物污染的土壤，可显著降低土壤中甲胺磷残留量、改善土壤理化性状、修复土壤肥力和健康状况，解决了现有技术存在的土壤中残留的有机磷农药分解率低的问题。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种AMF+PGPR组合菌剂，所述AMF+PGPR组合菌剂由体积比为AMF:活性炭：PGPR=10：1：1混匀制备而成，所述AMF含菌量为12000～15000IPUmL^-1，所述PGPR含菌量为10⁶～10⁷CFU mL^-1。

对上述技术方案的进一步改进：所述AMF为摩西球囊霉和/或幼套球囊霉，所述PGPR为荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌或芽孢杆菌中的一种或几种。

对上述技术方案的进一步改进：AMF+PGPR组合菌剂为摩西球囊霉+荧光假单胞菌组合。

本发明还提供了所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，它包括以下步骤：

（1）制备AMF菌剂：精选无杂质细河砂、粘土、珍珠岩，按体积比为细河砂：粘土：珍珠岩=7～5：3～2：1混匀、经湿热灭菌后作为AMF菌剂培养基质，将AMF孢子加入上述培养基质中并播种烟草和/或三叶草，于温室内培养；培养3～4个月后收获基质和根系，调整AMF接种物IPU数量为12000～15000IPUmL^-1备用；

（2）制备PGPR菌剂：将PGPR接种于液体培养基培养，稀释至10⁶～10⁷CFUmL^-1备用；

（3）制备AMF+PGPR组合菌剂：将体积比为AMF:活性炭：PGPR=10：1：1混匀成组合菌剂，所述AMF的含菌量为120000～15000IPUmL^-1，所述PGPR含菌量为10⁶～10⁷CFU mL^-1，低温晾干、包装制备成组合菌剂。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中将AMF孢子加入培养基质至500～1000个孢子/2～3L基质。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）的温室培养条件为自然光照条件；昼夜温度分别为25～30℃，12～18℃；每两周施加30%的Hoagland营养液。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中液体培养基配方为:以水为溶剂，蛋白胨20g/L，甘油10mL/L，K₂HPO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g g/L。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中将PGPR接种量以2～3mL10⁶CFU mL^-1/L接种于液体培养基中，于27～29℃下摇瓶培养。

本发明还提供了所述组合菌剂在分解土壤中残留有机磷农药甲胺磷中的用途。

对上述技术方案的进一步改进：当年将所述组合菌剂以每平方米土地40～60mL的用量施入受有机磷农药污染土壤中，然后播种三叶草或苜蓿，建立AMF+三叶草或苜蓿+PGPR三联修复体系。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1．本发明以AMF+PGPR组合菌剂为主导，以每平方米土地40～60mL的施用量，并在施用组合菌剂的土壤中播种植物，形成AMF+植物+PGPR三联修复体系。经本发明试验表明，通过连续两年的修复，有机磷农药降解率达到90%以上，而且，三叶草生长量、土壤理化性状和健康状况也得到显著改善。

2．本发明以细河砂、粘土和活性炭等作为组合菌剂的培养基质，材料来源广泛、简单易得、成本低，且不受季节限制；而且接种技术简单易行。

具体实施方式

实施例1

利用本发明所述AMF+PGPR组合菌剂分解土壤中残留的有机磷农药甲胺磷的方法具体包括以下步骤：

1．制备AMF+PGPR组合菌剂

精选细河砂、粘土、珍珠岩（细河砂、粘土需剔除杂质和过2mm筛；珍珠岩为市售商品）按5：2：1（体积比）混匀，经湿热灭菌后装入新陶盆（20×30cm），将丛枝菌根真菌（AMF）摩西球囊霉（Glomus mosseae）（青岛农业大学分离保藏，保藏编号:Gm32）500～1000个孢子加入陶盆（2～3L）中并播种烟草+三叶草，于温室内培养：自然光照条件；昼夜温度分别为25～30℃和15～18℃；根据需要进行浇水、灭虫和防病措施；每两周可施加30%的Hoagland营养液。培养4个月后收获基质和根系，调整接种物IPU数量为12000～15000IPUmL^-1备用。

本实施例中将根围促生细菌（PGPR）荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）（青岛农业大学分离保藏，保藏编号:K2011）接种于液体培养基（g/l:蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O1.5g，水1000mL）中，于28℃下摇瓶培养32h，将菌液稀释至10⁷CFU mL^-1备用。将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或芽孢杆菌sp（Bacillus sp.）B697分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基(蛋白胨15g,牛肉膏5g,NaCl5g,葡萄糖10g,pH7.2,水1000mL）置于28℃于摇瓶(200r/min)培养48h，稀释至10⁷CFU mL^-1备用。

将上述制备好的AMF与PGPR菌剂，按AMF（15000IPUmL^-1）:活性炭：PGPR（10⁷CFU mL^-1）=10：1：1(体积比)混匀成组合菌剂，供接种处理用。

2．接种与播种处理

以甲胺磷含量为85～130mg/kg的蔬菜大棚作为试验样地，设立接种AMF+PGPR组合菌剂与不接种对照（CK）各3个小区（即重复3次），每个小区面积20m²。将上述制备好的组合菌剂以每平方米土地40mL的用量施入小区内，对照小区则加入等量的经过灭菌的菌剂，然后播种三叶草。整个试验区土壤不施用速效化肥；比常规减少两次灌溉；其他如灭虫、防病、中耕、除草等均按采用常规管理措施，令其正常生长。

3．AMF+三叶草+PGPR联合修复体系的分解实验

（1）经过第一年和第二年生长后，即通过连续两个生长季的培养生长，分别采集各小区三叶草和土壤样品，进行分析测定。

用酸度计测定土壤pH；用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量；按常规法测定株高、地上部和地下部干重；甲胺磷含量以GB/T17331-1998为依据，采用二氯甲烷萃取，液液分配纯化，用丙酮定容进样，色谱仪：VarianGC3800(American)，色谱条件：进口样温度：230℃；柱箱温度80℃保持1min以升温速率15℃/min到170℃，保持1min，以升温速率10℃/min到235℃，保持5.5min，共运行20min；检测器：色谱柱：SE-54，30m；甲胺磷降解率（%)=（甲胺磷初始量-自然消解量-甲胺磷残留量)/（甲胺磷初始量-自然消解量）×100%

（2）从第一个生长季即可看出，三叶草植株叶色浓绿、生长健壮，而对照区的则叶黄、植株弱小。试验结果表明，无论是第一个还是第二个生长季接种处理的三叶草生物量显著大于不接种对照（表1）。

表1接种AMF+PGPR对三叶草生长的影响

注：表中CK=不接种对照；Gm=Glomus mosseae；Pf=Pseudomonas fluorescens K2011;

Bs=Bacillus subtilis;Bsp=Bacillus sp.B697

接种处理的土壤理化性状优于对照，甲胺磷降解率显著低于对照（表2）。当年生长季结束时有机磷农药（以甲胺磷计）降解率可达37.9%以上。而第二个生长季后即经过连续两年的培养生长与分解，各处理的效果更显著，第二年三叶草继续生长，经过两年的分解，土壤中残留的有机磷农药降解率比上一年增加1倍,达到75.2%以上，其中摩西球囊霉+荧光假单胞菌组合处理的最高，为91.7%。表明该AMF+PGPR组合菌剂效果最好。

表2AMF+三叶草+PGPR对土壤理化性状和甲胺磷农药降解率的影响

Bs=Bacillus subtilis;Bsp=Bacillus sp.B697

实施例2

一种AMF+PGPR组合菌剂分解土壤中残留的有机磷农药甲胺磷的方法，包括如下步骤：

1．制备AMF+PGPR组合菌剂

精选如实施例1所述的细河砂、粘土、珍珠岩，按5：2：1（体积比）混匀、湿热灭菌后装入新陶盆（20×30cm），将幼套球囊霉（Glomus etunicatum）(青岛农业大学分离保藏，保藏编号：Age95)接种物加入盆中并播种烟草+三叶草，于温室内培养，常规管理，每两周可施加30%的Hoagland营养液。培养3个月后收获基质和根系，备用。

将Pseudomonas fluorescens K2011接种于液体培养基（g/L:蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O1.5g，水1000mL）28℃干摇瓶培养32h。稀释至10⁶FU mL^-1备用；将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或芽孢杆菌sp（Bacillus sp.）B697分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基(g/L:蛋白胨15g,牛肉膏5g,NaCl5g,葡萄糖10g,pH7.2,水1000mL）置于28℃于摇瓶(200r/min)培养48h。稀释至10⁶CFU mL^-1备用。

将上述制备好的AMF与PGPR菌剂，按AMF（12000IPU mL^-1）:活性炭：PGPR（10⁶CFU mL^-1）=10：1：1(体积比)混匀成组合菌剂，供接种处理用。

2．接种与播种处理

选择甲胺磷含量为105～150mg/kg的黄瓜大棚，设立接种与对照（CK）各3个小区（即重复3次），每个小区面积20m²。将上述制备好的组合菌剂以每平方米土地60mL的用量施入小区内，对照小区则加入等量的经过灭菌的菌剂，然后播种苜蓿。试验区土壤不施肥，适当控水，其他常规管理，令其正常生长。

3．AMF+苜蓿+PGPR联合修复体系的分解实验

（1）于第一个生长季和第二个生长季后，分别采集各小区苜蓿和土壤样品，进行分析测定。用酸度计测定土壤pH；用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量；按常规法测定株高、地上部和地下部干重；甲胺磷含量以GB/T17331-1998为依据，采用二氯甲烷萃取，液液分配纯化，用丙酮定容进样，色谱仪：Varian GC3800(American)，色谱条件：进口样温度：230℃；柱箱温度80℃保持1min以升温速率15℃/min到170℃，保持1min，以升温速率10℃/min到235℃，保持5.5min，共运行20min；检测器：色谱柱：SE-54，30m；甲胺磷降解率（%)=（甲胺磷初始量-自然消解量-甲胺磷残留量)/（甲胺磷初始量-自然消解量）×100%

（2）接种处理的苜蓿生物量显著大于对照（表3），苜蓿植株叶色浓绿、生长健壮，而对照区的则叶黄、植株弱小。

表3接种AMF+PGPR对苜蓿生长的影响

注：表中CK=不接种对照；Ge=Glomus etunicatum；Pf=Pseudomonas fluorescensK2011;Bs=Bacillus subtilis;Bsp=Bacillus sp.B697

接种处理的土壤理化性状优于对照，甲胺磷降解率原显著低于对照。第二个生长季后，处理的效果更显著（表4）。与Gm+PGPR各组合相比，Ge+PGPR组合对甲胺磷的分解效果则较差，其中只有Ge+Bsp与Gm+Bsp的效果相似。

表4MF+苜蓿+PGPR对土壤理化性状和甲胺磷农药降解率的影响

本发明通过上述实验证明了甲胺磷污染土壤中接种AMF和PGPR能促进三叶草或苜蓿的生长发育，使植株更健壮，且双接种效果要优于单接种处理。AMF对甲胺磷农药有较的耐受性，显著改善了植物的磷素营养状况。菌根侵染的根围效应，增加了具有降解农药作用的PGPR定殖数量和降解效率，促进了土壤中甲胺磷农药的矿化，解除了甲胺磷对植物的毒害，降低了甲胺磷农药对土壤的污染程度。这与AMF和PGPR的相互促进、协同发挥作用是密切相关的。

本发明证明很多生物如植物、真菌和细菌（包括AMF和PGPR）可以将一些残留于土壤中的有机磷农药作为碳源和部分养分来源。当AMF与植物根系形成超级共生体，其菌根围效应(mycorrhizosphere effects)，尤其是AMF与PGPR相互促进、协同发挥生理生态作用，而具有独特的降解途径（如诱导合成和分泌可降解农药的酶类、提高其活性、增加土壤酶活性等），可以加速许多农药的降解和矿化，从而降低农药对土壤的污染程度，同时可以提高植物的抗逆性和生长量。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种AMF+PGPR组合菌剂，其特征在于所述AMF+PGPR组合菌剂由体积比为AMF: 活性炭：PGPR=10：1：1混匀制备而成，所述AMF含菌量为12000~15000 IPUmL^-1，所述PGPR含菌量为10⁶~10⁷ CFU mL^-1。

2.根据权利要求1所述的AMF+PGPR组合菌剂，其特征在于：所述AMF为摩西球囊霉和/或幼套球囊霉，所述PGPR为荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌或芽孢杆菌中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的AMF+PGPR组合菌剂，其特征在于：AMF+PGPR组合菌剂为摩西球囊霉+荧光假单胞菌组合。

4.根据权利要求1或2所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）制备AMF菌剂：精选无杂质细河砂、粘土、珍珠岩，按体积比为细河砂：粘土：珍珠岩=7~5：3~2：1混匀、经湿热灭菌后作为AMF菌剂培养基质，将AMF孢子加入上述培养基质中并播种烟草和/或三叶草，于温室内培养；培养3~4个月后收获基质和根系，调整AMF接种物IPU数量为12000~15000 IPUmL^-1备用；

（2）制备PGPR菌剂：将PGPR接种于液体培养基培养，稀释至10⁶~10⁷CFU mL^-1备用；

（3）制备AMF+PGPR组合菌剂：将体积比为AMF: 活性炭：PGPR=10：1：1混匀成组合菌剂，所述AMF的含菌量为120000~15000 IPUmL^-1，所述PGPR含菌量为10⁶~10⁷ CFU mL^-1，低温晾干、包装制备成组合菌剂。

5.根据权利要求4所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中将AMF孢子加入培养基质至500~1000个孢子/2~3L基质。

6.根据权利要求4所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的温室培养条件为自然光照条件；昼夜温度分别为25~30℃和12~18℃；每两周施加30%的Hoagland 营养液。

7.根据权利要求4所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中液体培养基配方为: 以水为溶剂，蛋白胨20 g/L，甘油10 mL/L，K₂HPO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g g/L。

8.根据权利要求4所述的AMF+PGPR组合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中将PGPR 接种量以2~3mL 10⁶CFU mL^-1/L接种于液体培养基中，于27~29℃下摇瓶培养。

9.根据权利要求1、2或3所述的组合菌剂在分解土壤中残留有机磷农药甲胺磷中的用途。

10.根据权利要求9所述的组合菌剂在分解残留有机磷农药中的用途，其特征在于：当年将所述组合菌剂以每平方米土地40~60mL的用量施入受有机磷农药污染土壤中，然后播种三叶草或苜蓿，建立AMF+三叶草或苜蓿+PGPR三联修复体系。