CN105724210A - 一种植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法，包括以下步骤：（1）培养基的制备；（2）接种剂的制备；（3）植物种子的催芽；（4）种植；（5）接菌；（6）收获及指标的测定。本发明可用于测定已知菌株的促生效能及促生机理和筛选促生效能优良的未知菌株，操作简单方便、结果较为准确。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法。
背景技术
植物根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，简称促生菌或PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根际、茎叶，可促进植物生长及对矿质营养吸收和利用，产生促进植物生长代谢物，抑制有害微生物繁殖的一类细菌的总称。在农业生产中引入植物根际促生菌，对创造良好的根际生态环境、降低化肥与农药的使用、抑制病虫害的发生有重要的作用，在保证现代农业可持续发展的同时又达到增产的目的。因此，筛选出促生效能好的菌株对提高植物产量有着重要意义。
近年来，国内外很多学者对植物根围促生菌的生理效应、作用机制、制剂产品和应用进行了多方面的研究。目前，应用方面最普遍的做法是从植物根际分离筛选大量高效优良的植物根际促生菌菌株，并测定其促生效能，再筛选促生效能好的菌株研制微生物肥料，将植物根际促生菌真正运用到大田中。在筛选菌株测定促生效能时，本发明提供的方法操作简单方便、能较为准确的测定菌株对植物生长特性及品质的影响。
发明内容
本发明的目的为提供一种操作简单方便、测定结果较为准确的植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
一种植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法，包括以下步骤：
（1）培养基的制备
在Hoagland营养液的基础上添加一定量的琼脂，制备Hoagland半固体培养基；制备LB培养基；
（2）接种剂的制备
接种PGPR菌株于LB液体培养基中，于28℃，125r/min培养48h，用无菌水调节菌株菌悬液浓度为1×108cfu/mL；在三角瓶内装入150mLLB液体培养基，灭菌后置于室温下1-2d，经检查无污染后接种20mL上述菌悬液，于28℃，125r/min培养2-3d，用灭菌量筒将菌液注入灭菌玻璃瓶中常温密封保存备用；
（3）植物种子的催芽
选择籽粒饱满的植物种子，经0.1%HgCl2表面消毒2-3min，再用无菌水冲洗3-5次后，置于盛有水琼脂培养基的培养皿中，放入25℃的培养箱中培养，待种子萌发至1-2cm后备用；
（4）种植
将步骤（3）中萌发至1-2cm的幼苗移至盛有40ml灭菌的Hoagland半固体培养基的长玻璃试管中，每个试管种植1株幼苗，放入智能人工气候培养箱中（28℃，16h光照，20000lx，8h黑暗，相对湿度40%-50%）2d后选择成功生长，长势一致的幼苗；
（5）接菌
取步骤（2）中制备的接种剂1ml在无菌条件下分别接种于步骤（4）中选择的幼苗，设不接菌对照处理，每个处理均重复3次，幼苗试管置于智能人工气候培养箱中继续培养。
（6）收获及指标的测定
接种菌株的幼苗培养数天（可按试验需要设定）后收获，测定植物的生物量、根系生长的特征、植物的品质等内容，分析判断菌株的促生效能。
其中，步骤（1）中所述Hoagland半固体培养基可以为Hoagland半固体难溶磷培养基或者Hoagland半固体无氮培养基。
采用本发明的测定方法，测定的PGPR菌株可为已知菌株，也可为未知菌株。若为已知菌株，可测定这种菌株的促生效能及促生机理；若为未知菌株，可通过此方法筛选促生效能优良的菌株资源，然后再进一步鉴定。所以无论采用哪种PGPR菌种均可达到本发明的目的和效果。
具体实施方式
以下实施例用以对本发明进行详细说明，并不用于限定本发明。
实施例1
供试溶磷菌株为PYXP1、PYXP13、PWXP8、PYXZ1、PYXZ7、PYXZ19、PYXZ23、PWXZ6、PWXZ10、NXY18、NXZ4、NXZ8、NXZ17、NXZ18、003PWXZ6、003NXZ4、003NXZ9。
供试植物为披碱草（Elymusdahuricus），发芽率为95%。
一种植物根际促生菌（PGPR）对植物促生效能的测定方法，包括以下步骤：
（1）培养基的制备
Hoagland半固体难溶磷培养基，配方（1000mL）如下：1mol/LMgSO4·7H2O4mL，1mol/LCa3(PO4)22mL，1mol/LCaCl2·2H2O10mL，1mol/LKCl10mL，Fe·EDTA2mL,微量元素营养液2mL，Agar2g。
其中，微量元素营养液配方(500mL)为：HBO30.310g，MnSO41.115g，ZnSO4·7H2O0.430g，NaMoO4·2H2O0.0125g，CuSO4·5H2O0.00125g，CoCl20.00125g，KI0.0375g。
LB(Luria-Bertani)培养基组成及配方为：NaCl10g，Bacto-trypton10g，Bactoyeastextract5g，琼脂20.0g，pH值为7.5。
（2）接种剂的制备
接种PGPR菌株于LB液体培养基中，于28℃，125r/min培养48h，用无菌水调节菌株菌悬液浓度为1×108cfu/mL；在三角瓶内装入150mLLB液体培养基，灭菌后置于室温下1-2d，经检查无污染后接种20mL上述菌悬液，于28℃，125r/min培养2-3d，用灭菌量筒将菌液注入灭菌玻璃瓶中常温密封保存备用；
（3）植物种子的催芽
选择籽粒饱满的披碱草种子，经0.1%HgCl2表面消毒2-3min，再用无菌水冲洗3-5次后，置于盛有水琼脂培养基的培养皿中，放入25℃的培养箱中培养，待种子萌发至1-2cm后备用；
（4）种植
将步骤（3）中萌发至1-2cm的幼苗移至盛有40ml灭菌的Hoagland半固体培养基的长玻璃试管中，每个试管种植1株幼苗，放入智能人工气候培养箱中（28℃，16h光照，20000lx，8h黑暗，相对湿度40%-50%）2d后选择成功生长，长势一致的幼苗；
（5）接菌
取步骤（2）中制备的接种剂1ml在无菌条件下分别接种于步骤（4）中选择的幼苗，设不接菌对照处理，每个处理均重复3次，幼苗试管置于智能人工气候培养箱中继续培养。
（6）收获及指标的测定
接种溶磷菌的幼苗培养35d后收获，用无菌蒸馏水洗净根表附着的培养基，测量株高，将植株的地上和地下部分分开，用扫描仪（DeskscanSystem-RootLawProgram，美国）对根系进行扫描并计算根长、根直径、根体积、根表面积等生长指标；之后，将植株地上部分和地下部分于105℃杀青1h，70℃烘干至恒重，分别称取干重（南京农业大学，1988）。
溶磷菌株接菌处理后对披碱草地上、地下植物干重和株高的影响如表1，披碱草的株高、地上和地下植物干重显著高于对照，达到了显著水平（P<0.05），各菌株处理间差异各异。其中，菌株PYXZ1、PWXZ6和003PWXZ6处理后对植株株高的促进作用最为明显显著高于其他处理（P<0.05），分别为39.79cm、40.51cm和41.99cm，超过对照74.48%、77.91%和84.46%；对植株的地上、地下植物干重及总干重增加最显著的为PYXP1和003PWXZ6菌株，植株总干重分别为0.0898g/株和0.848g/株，显著高于对照（0.0194g/株）（P<0.05）；各处理中菌株PWXZ10处理的根冠比最高（0.21）。
表1不同溶磷菌株处理对披碱草地上、地下植物干重和株高的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。
溶磷菌株接菌处理后对披碱草根系性状的影响如表2，结果表明，各菌株接菌处理后对披碱草根系性状的影响差异显著（P<0.05），其中，菌株PWXZ7、NXZ8、PYXP1、003NXZ9接菌处理对根系平均直径的影响最大，分别为0.4294mm、0.3069mm、0.3006mm、0.4034mm，显著高于对照（0.1404）（P<0.05）；菌株PWXZ10接菌处理后，植株的根总长最大（245.7025cm），显著高于其他处理及对照（57.1185cm）（P<0.05），菌株NXZ4处理后，菌株的根总长次之（171.2165cm），也显著高于显著高于其他处理及对照（57.1185cm）（P<0.05）；菌株PWXZ10、NXZ4接菌后对根表面积的影响最大，分别为16.8455cm2/株和14.3299cm2/株，显著高于其他处理和对照（5.6376cm2/株），菌株PYXZ23、PYXP1、PYXP13处理根表面积次之，分别为12.3230cm2/株、12.6273cm2/株、12.3904cm2/株；菌株PYXZ23、NXZ8、NXZ4、PYXP13处理对根体积的影响最大，分别为0.0890cm3/株、0.0790cm3/株、0.0920cm3/株、0.0980cm3/株，显著高于其他处理和对照（0.0380cm3/株）。
表2不同溶磷菌株处理对披碱草根长和根系性状的影响
各菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根总长及其分布的影响如表3，菌株PWXZ10处理的根总长最大，但根系直径均分布在0.05~0.25mm之间；菌株NXZ4处理根系直径在0.05~0.25mm之间的根长为170.2584cm，占根总长的99.58%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根长为0.7120cm，占总根长的0.42%；菌株PYXZ19处理根系直径在0.05~0.25mm之间的根长为98.2359cm，占根总长的99.65%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根长为0.2359cm，占根总长的0.24%，根系直径大于0.45mm的根长为0.1051cm，占根总长的0.11%。
表3不同溶磷菌株处理对披碱草根系不同直径下根长及其比例的影响
各菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根表面积及其分布的影响如表6-5，菌株PWXZ10处理的根表面积最大，但根系直径均分布在0.05~0.25mm之间；菌株NXZ4处理根系直径在0.05~0.25mm之间的根表面积为11.2544cm2，占根总表面积的94.27%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根表面积为0.6845cm2，占根总表面积的5.73%；菌株PYXZ19处理根系直径在0.05~0.25mm之间的根表面积为6.4909cm2，占根总表面积的94.46%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根表面积长为0.2301cm2，占根总表面积的3.35%，根系直径大于0.45mm的根表面积为0.1507cm2，占根总表面积的2.19%。
表4不同溶磷菌株处理对披碱草根系不同直径下根表面积及其比例的影响
各菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根体积及其分布的影响如表6-6，菌株PYXP1处理的根体积最大，但根系直径均分布在0.05~0.25mm之间；菌株NXZ4处理的根体积次之，根系直径在0.05~0.25mm之间的根体积为0.1466cm3，占根总体积的73.26%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根体积为0.0535cm3，占根总体积的26.74%；菌株PYXZ19处理根系直径在0.05~0.25mm之间的根体积为0.0760cm3，占根总体积的68.35%，根系直径在0.25~0.45mm之间的根体积长为0.0180cm3，占根总体积的16.18%，根系直径大于0.45mm的根体积为0.0172cm3，占根总体积的15.47%。
表5不同溶磷菌株处理对披碱草根系不同直径下根体积及其比例的影响
实施例2
供试固氮菌株为NXP3、NXP17、NXP19、NXZ3、NXZ9、NXZ15、NXZ16、003NXZ1、003NXZ5。
供试植物披碱草（Elymusdahuricus），发芽率为95%。
一种植物根际促生菌（PGPR）对植物促生效能的测定方法，包括以下步骤：
（1）培养基的制备
Hoagland半固体无氮培养基（MalikK.A.etal，1989的基础上做了修改），配方（1000mL）如下：1mol/LMgSO4·7H2O4mL，1mol/LKH2PO42mL，1mol/LCaCl2·2H2O10mL，1mol/LKCl10mL，Fe·EDTA2mL，微量元素营养液2mL，Agar2g。
其中，微量元素营养液配方(500mL)为：HBO30.310g，MnSO41.115g，ZnSO4·7H2O0.430g，NaMoO4·2H2O0.0125g，CuSO4·5H2O0.00125g，CoCl20.00125g，KI0.0375g。
LB(Luria-Bertani)培养基组成及配方为：NaCl10g，Bacto-trypton10g，Bactoyeastextract5g，琼脂20.0g，pH值为7.5。
（2）接种剂的制备
接种PGPR菌株于LB液体培养基中，于28℃，125r/min培养48h，用无菌水调节菌株菌悬液浓度为1×108cfu/mL；在三角瓶内装入150mLLB液体培养基，灭菌后置于室温下1-2d，经检查无污染后接种20mL上述菌悬液，于28℃，125r/min培养2-3d，用灭菌量筒将菌液注入灭菌玻璃瓶中常温密封保存备用；
（3）植物种子的催芽
选择籽粒饱满的披碱草种子，经0.1%HgCl2表面消毒2-3min，再用无菌水冲洗3-5次后，置于盛有水琼脂培养基的培养皿中，放入25℃的培养箱中培养，待种子萌发至1-2cm后备用；
（4）种植
将步骤（3）中萌发至1-2cm的幼苗移至盛有40ml灭菌的Hoagland半固体培养基的长玻璃试管中，每个试管种植1株幼苗，放入智能人工气候培养箱中（28℃，16h光照，20000lx，8h黑暗，相对湿度40%-50%）2d后选择成功生长，长势一致的幼苗；
（5）接菌
取步骤（2）中制备的接种剂1ml在无菌条件下分别接种于步骤（4）中选择的幼苗，设不接菌对照处理，每个处理均重复3次，幼苗试管置于智能人工气候培养箱中继续培养。
（6）收获及指标的测定
接种固氮菌的幼苗培养23d后收获，用无菌蒸馏水洗净根表附着的培养基，测量株高，将植株的地上和地下部分分开，用扫描仪（DeskscanSystem-RootLawProgram，美国）对根系进行扫描并计算根长、根直径、根体积、根表面积等生长指标；之后，将植株地上部分和地下部分于105℃杀青1h，70℃烘干至恒重，分别称取干重（南京农业大学，1988）。
固氮菌株接菌处理后对披碱草地上、地下植物干重和株高的影响如表6，结果表明，除菌株003NXZ5之外其他各菌株接菌处理后披碱草的株高显著高于对照，达到了显著水平（P<0.05），其中NXP17处理的株高最高（18.3333cm），高于对照65.16%；菌株NXP处理后菌株NXZ15、003NXZ5处理后披碱草的地下植物干重最高（0.0032g/株），也显著高于对照（P<0.05）；菌株NXP17处理后对植株总干重增加最显著，为0.0122g/株，显著高于对照（0.0037g/株）（P<0.05）；各处理中菌株003NXZ5处理的根冠比最高（0.52），菌株NXZ3（0.41）次之。
表6不同固氮菌株处理对披碱草地上、地下植物干重及株高的影响
固氮菌株接菌处理后对披碱草根系性状的影响如表7，结果表明，各菌株接菌处理后对披碱草根系性状的影响差异显著（P<0.05），菌株NXP3、NXP17、NXZ9、NXZ16、003NXZ1、003NXZ5接菌处理对根系平均直径的影响与菌株NXP19、NXZ3、NXZ15和对照差异显著（P<0.05），而菌株NXP19、NXZ3、NXZ15和对照间差异不显著，其中菌株NXZ9处理披碱草根系的平均直径最大（0.3971mm），显著高于对照（0.2741）（P<0.05）；菌株003NXZ5接菌处理后，植株的根总长最大（94.5405cm），显著高于其他处理及对照（17.2896cm）（P<0.05），菌株NXZ15处理后，菌株的根总长次之（51.4505cm），也显著高于其他处理及对照（17.2896cm）（P<0.05）；菌株003NXZ5接菌后对根表面积的影响最大，为6.7908cm2/株，显著高于其他处理和对照（1.4744cm2/株）（P<0.05），菌株NXZ15处理根表面积次之，分别为4.7259cm2/株；菌株003NXZ5处理对根体积的影响最大，为0.0405cm3/株，菌株NXZ15处理次之（0.0345cm3/株），两者间差异不显著，但显著高于其他处理和对照（0.0100cm3/株）（P<0.05）。
表7不同固氮菌株处理对披碱草根系性状的影响
固氮菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根总长及其分布的影响如表8，菌株003NXZ5处理根系直径在0.00~0.05mm之间的根长为92.8297cm，占根总长的98.21%，显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径在0.05~0.15mm之间的根长为1.7009cm，占总根长的1.79%；菌株NXZ9处理根系直径在0.00~0.05mm之间的根长为17.8662cm，占根总长的79.09%，根系直径在0.05~0.15mm之间的根长为4.6347cm，占根总长的20.51%，显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径大于0.15mm的根长为0.0861cm，占根总长的0.40%；菌株NXZ16处理根系直径大于0.15mm的根长为0.1577cm，占根总长的0.48%，显著高于其他处理和对照（P<0.05）。
表8不同固氮菌株处理对披碱草根系不同直径下根长及其比例的影响
各菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根表面积及其分布的影响如表9，菌株003NXZ5处理根系直径在0.00~0.05mm之间的根表面积为0.5201cm2，占根总表面积的94.14%，显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径在0.05~0.15mm之间的根表面积为0.3434cm2，占根总表面积的5.86%；菌株NXZ9处理根系直径在0.00~0.15mm之间的根表面积为1.5234cm2，占根总表面积的61.08%，根系直径在0.05~0.15mm之间的根表面积长为0.9267cm2，占根总表面积的37.16%，显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径大于0.15mm之间的根表面积为0.0439cm2，占根总表面积的1.76%；菌株NXZ16处理根系直径在0.00~0.15mm之间的根表面积为2.4655cm2，占根总表面积的81.97%，根系直径在0.05~0.15mm之间的根表面积长为0.4672cm2，占根总表面积的15.49%，根系直径大于0.15mm的根表面积为0.0816cm2，占根总表面积的2.72%，显著高于其他处理和对照（P<0.05）。
表9不同固氮菌株处理对披碱草根系不同直径下根表面积及其比例的影响
各菌株处理对披碱草根系不同直径段植株根体积及其分布的影响如表10，菌株003NXZ5处理根系直径在0.00~0.05mm之间的根体积为0.0332cm3，占根总体积的85.13%，显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径在0.05~0.15mm之间的根体积为0.0058cm3，占根总体积的14.87%；菌株NXZ9、NXZ15、NXZ16处理根系直径在0.00~0.05mm之间的根体积分别为0.0121cm3、0.0263cm3、0.0185cm3，占根总体积的40.33%、69.03%、59.29%，根系直径在0.05~0.15mm之间的根体积长为0.0161cm3、0.0108cm3、0.0093cm3，占根总体积的53.66%、28.35%、29.82%，其中菌株NXZ9处理显著高于其他处理和对照（P<0.05），根系直径大于0.15mm的根体积为0.0018cm3、0.0010cm3、0.0034cm3，占根总体积的6.01%、2.62%、10.89%，其中菌株NXZ16处理显著高于其他处理和对照（P<0.05）。
表10不同固氮菌株处理对披碱草根系不同直径下根体积及其比例的影响
实施例中采用的供试植物是披碱草（Elymusdahuricus），但本发明的测定方法适用于不同的植物，可依据研究的目的、要求采用不同种类的植物种子。
Claims (3)
1.一种植物根际促生菌对植物促生效能的测定方法，包括以下步骤：
（1）培养基的制备
在Hoagland营养液的基础上添加一定量的琼脂，制备Hoagland半固体培养基；制备LB培养基；
（2）接种剂的制备
接种PGPR菌株于LB液体培养基中，于28℃，125r/min培养48h，用无菌水调节菌株菌悬液浓度为1×108cfu/mL；在三角瓶内装入150mLLB液体培养基，灭菌后置于室温下1-2d，经检查无污染后接种20mL上述菌悬液，于28℃，125r/min培养2-3d，用灭菌量筒将菌液注入灭菌玻璃瓶中常温密封保存备用；
（3）植物种子的催芽
选择籽粒饱满的植物种子，经0.1%HgCl2表面消毒2-3min，再用无菌水冲洗3-5次后，置于盛有水琼脂培养基的培养皿中，放入25℃的培养箱中培养，待种子萌发至1-2cm后备用；
（4）种植
将步骤（3）中萌发至1-2cm的幼苗移至盛有40ml灭菌的Hoagland半固体培养基的长玻璃试管中，每个试管种植1株幼苗，放入智能人工气候培养箱中（28℃，16h光照，20000lx，8h黑暗，相对湿度40%-50%）2d后选择成功生长，长势一致的幼苗；
（5）接菌
取步骤（2）中制备的接种剂1ml在无菌条件下分别接种于步骤（4）中选择的幼苗，设不接菌对照处理，每个处理均重复3次，幼苗试管置于智能人工气候培养箱中继续培养；
（6）收获及指标的测定
接种菌株的幼苗培养数天（可按试验需要设定）后收获，测定植物的生物量、根系生长的特征、植物的品质等内容，分析判断菌株的促生效能。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（1）中所述Hoagland半固体培养基可以为Hoagland半固体难溶磷培养基或者Hoagland半固体无氮培养基。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于：步骤（6）中所述接种菌株的幼苗培养天数，接种溶磷菌时为35d，接种固氮菌时为23d。
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