CN117678511B - 一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法 - Google Patents
一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于农业领域技术领域，具体涉及一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法。本发明提供了一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，包括如下步骤：美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗；所述美国山核桃无菌苗的须根数量为5个以上，须根长度为7~12cm。本发明在美国山核桃长出须根后，再接种云南硬皮马勃菌液，菌液中存在菌丝，菌丝的形式加大了美国山核桃与云南硬皮马勃菌种的接触面积，增强其感染率，确保云南硬皮马勃的菌根合成率达到90%以上，节省了云南硬皮马勃的菌种成本。本发明首次实现了云南硬皮马勃菌根苗的人工栽培。
Description
技术领域
本发明属于农业领域技术领域，具体涉及一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法。
背景技术
迄今为止，硬皮马勃属在中国发现21种，大多数硬皮马勃属的物种具有毒性，不能食用。云南硬皮马勃（Scleroderma yunnanense），隶属硬皮马勃科，硬皮马勃属，在云南省的热带和亚热带地区均有分布，是我国特有种。云南硬皮马勃具有可食性，也是世界上唯一可食用的硬皮马勃物种，其子实体含有丰富的矿物元素、蛋白质、粗纤维和粗脂肪，同时还含有丰富的氨基酸。在中国云南当地的蘑菇市场上是一种常见的野生菌，味道较为鲜美可口，营养价值较高，深受人们的喜爱。由于野生云南硬皮马勃的产量低、产地较为单一，需要依靠人工栽培来满足日益增长的市场需求，而有效的菌种培养方法及接种方法不仅是云南硬皮马勃菌根化生产的前提，也是栽培成败的关键。现有技术中的云南硬皮马勃菌根化生产时接种成功率还未超过90%。
美国山核桃（Carya illinoinensis）隶属胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya），又名长山核桃、薄壳山核桃，为高大乔木，是世界四大坚果之一，原产地为北美，分布于美国、意大利、以色列、墨西哥、日本、法国、中国等地。该树种是一个极具市场竞争力的高效生态经济型干果油料树种，其壳薄，较易取出果仁，出仁率高达50%~70%，含油率达到70%~80%，不饱和脂肪酸含量较高，为60%左右；与油橄榄相比，不饱和脂肪酸和对人体有益的各种氨基酸较高，且富含维生素B1和B2；同时在园林绿化中应用也较为广泛，其优良的材质，美观的树形，发达的根系，使其具有良好的水土保持和生态功能，因而被广泛用作经济林、用材林、生态林和园林绿化的首选树种。美国山核桃用途较广、收益时间长（50~70年），其经济效益、社会效益和生态效益十分明显。
美国山核桃是核桃品种中一个适合低海拔栽培的树种，在中国的引种历史悠久，引种范围较广。但目前国内的美国山核桃的栽培面积、种植规模与国内的消费需求严重不匹配，供不应求，大部分还是依赖于进口，因此对美国山核桃的开发，提高其结实率非常有必要。
美国山核桃作为一种外来树种，在引入中国云南之后为了使其更好的本土化，增加其结实率，对美国山核桃的研究，除了对其的栽培措施、防治病虫害、品种选育以外，了解美国山核桃林下的本土共生菌，形成美国山核桃苗菌根合成体系，增加其结实率十分必要。现有技术中报道的云南硬皮马勃对美国山核桃的接种成功率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，通过宿主植物幼苗培育和营造菌种生长环境，形成菌根苗，提高云南硬皮马勃接种成功率和美国山核桃结实率，实现林菌共营，同时接种云南硬皮马勃的美国山核桃株高更高，基径更粗，使其更加适应云南的生长环境。
本发明提供了一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，所述方法包括如下步骤：
美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗；所述美国山核桃无菌苗的须根数量为5个以上，须根长度为7~12 cm。
优选的，每棵美国山核桃无菌苗施用云南硬皮马勃菌液10~30 mL；每30~50 mL云南硬皮马勃菌液中含有5~7个菌丝团；每个菌丝团直径为1~1.5 cm。
优选的，所述方法包括如下步骤：
将部分云南硬皮马勃菌液与移栽基质混合，得到接种基质；
将部分云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗根系，得到施用菌液后的美国山核桃无菌苗；
将所述施用菌液后的美国山核桃无菌苗栽种于接种基质中进行培养，得到菌根苗。
优选的，部分云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗根系之前，还包括修剪根系。
优选的，所述美国山核桃无菌苗的培育方法包括：
对美国山核桃种子依次进行春化、清洗、浸种和消毒，得到预处理后的种子；
将所述预处理后的种子与催芽基质混合后进行培育，得到无菌苗；所述催芽基质包括珍珠岩和蛭石。
优选的，所述浸种用的溶液包括添加植物生长调节剂的水溶液；所述植物生长调节剂包括赤霉素和/或乙烯利。
优选的，所述云南硬皮马勃菌液的制备方法包括：云南硬皮马勃接种于MMN液体培养基中进行扩大培养，得到云南硬皮马勃菌液。
优选的，所述扩大培养的温度为21~26℃，扩大培养的时间为28~32 d。
优选的，所述移栽基质包括腐质土、蛭石和珍珠岩；所述移栽基质和水混合后应用，腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为2：2：（1~1.5）：2.5。
优选的，所述接种基质的pH值为5.5~6.5。
本发明的有益效果：本发明提供了一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，所述方法包括如下步骤：美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗；所述美国山核桃无菌苗的须根数量为5个以上，须根长度为7~12 cm。本发明充分考虑到了美国山核桃幼苗及云南硬皮马勃自身的生长周期及生物活性，在美国山核桃长出须根后，再接种云南硬皮马勃菌液，菌液中存在菌丝，菌丝的形式加大了美国山核桃与云南硬皮马勃菌种的接触面积，使菌丝更好的接触美国山核桃须根，增强其感染率，确保云南硬皮马勃的菌根合成率达到90%以上，节省了云南硬皮马勃的菌种成本。本发明的方法简单、实用、高效，生产成本较低，并且不受季节的影响，经济效益显著，且能够使美国山核桃更加适应云南本土环境，在发展美国山核桃生产的同时，也能生产可食用的野生菌，提高山区土地经营效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1云南硬皮马勃与美国山核桃形成的外生菌根外观形态；
图2为实施例1与美国山核桃共生的云南硬皮马勃菌根横切面图。
具体实施方式
本发明提供了一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，包括如下步骤：
美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗；所述美国山核桃无菌苗的须根数量为5个以上，须根长度为7~12cm。
在本发明中，所述美国山核桃无菌苗的培养方法优选包括如下步骤：对美国山核桃种子依次进行春化、清洗、浸种和消毒，得到预处理后的种子；将所述预处理后的种子与催芽基质混合后进行培育，得到无菌苗。
本发明优选对美国山核桃种子依次进行春化、清洗、浸种和消毒，得到预处理后的种子。本发明所述美国山核桃种子优选为果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的种子；本发明对所述美国山核桃种子的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。在本发明实施例中，所述美国山核桃种子的来源优选为云南楚雄。本发明所述春化的温度优选为4℃；时间优选为55~65d，更优选为60d。本发明对所述清洗的方式没有特殊限定，采用常规的方法即可，清洗到水清澈即可。本发明所述浸种采用的溶液优选包括植物生长调节剂的水溶液；所述植物生长调节剂优选包括赤霉素和/或乙烯利，更优选为赤霉素和乙烯利。本发明浸种用水溶液中的赤霉素质量浓度优选为145~155mg/L，更优选为150mg/L；本发明浸种用水溶液中的乙烯利的质量浓度优选为145~155mg/L，更优选为150mg/L。本发明所述浸种的时间优选为7~8d，本发明所述浸种过程中优选每隔3~4d换一次浸种用的溶液；采用本发明所述浸种能够有效促进美国山核桃种子发芽。本发明对所述赤霉素和乙烯利的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，应用的乙烯利的原始质量浓度为400g/kg。浸种后，本发明优选对所述美国山核桃种子进行筛种和消毒。为了提高美国山核桃的发芽率和出苗后的整齐度，美国山核桃种子在消毒前优选进行清水筛种，去除浮在水面上的空粒，对沉水的种子进行消毒处理。本发明所述消毒用溶液优选包括质量浓度为0.3%的高锰酸钾溶液，所述消毒的时间优选为3~4h，更优选为3.5h。消毒后，本发明优选对所述美国山核桃种子进行冲洗，本发明优选利用无菌水完成消毒，所述冲洗的次数优选为3~4次。
得到预处理后的种子，本发明优选将预处理后的种子与催芽基质混合后进行培育，得到无菌苗。本发明所述培育，在无菌苗长出催芽基质之前优选为暗培养。在本发明中，所述催芽基质优选包括珍珠岩和蛭石。本发明优选于每年2~3月份进行育苗。本发明优选珍珠岩和蛭石按照体积比（1~2）：（1~2）拌匀后应用，更优选为1:1。本发明优选对所述珍珠岩和蛭石分别先进行高温高压蒸汽灭菌后再拌匀。所述高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌1h。选择珍珠岩和蛭石是由于蛭石能够疏松土壤，它还具有良好的透气性、吸水性，温度变化也较小，所以它能够促进植物的生长；此外，蛭石具有一定的保肥性，且可以释放一定的营养元素，长时间提供植物生长所必需的营养，从生长初期促进植物较快生长；珍珠岩具有较好的通透性，易于排水，易于通气。
本发明所述催芽基质的体积是所述预处理后种子的体积的3倍以上。本发明所述预处理后的种子与催芽基质混合的方式优选包括：在育苗盘底部铺设部分催芽基质；将所述预处理后的种子与育苗底盘的催芽基质混合得到混合物；将剩余催芽基质用无菌水淋湿后再与所述混合物混匀，得到培养物。本发明在育苗盘底铺设的催芽基质在育苗盘中的高度优选为5cm。本发明所述混合物与用无菌水淋湿后的剩余催芽基质的体积比优选为（2~4）：1。本发明所述育苗盘的厚度优选为9~15cm。本发明所述培养物的湿度优选为手握成团，松开即散。
本发明优选将所述育苗盘放入培养箱中进行培养得到美国山核桃无菌苗。本发明优选在所述育苗盘中每隔0.7~1cm插入一根消毒后的吸管，保证通气，促进种子发芽。本发明所述培养箱的温度优选为20~25℃；湿度优选为73%~78%，更优选为75%，本发明优选在培养过程中保持基质的湿润和通气，以防止种子霉烂。于所述培养过程中，本发明优选直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。本发明优选当所述美国山核桃无菌苗的须根的数量为5个以上且须根长7~12cm时开始接种云南硬皮马勃菌液，更优选当所述美国山核桃无菌苗的地径为0.2cm~0.5cm，须根的数量为5个以上且须根长7~12cm时开始接种云南硬皮马勃菌液。之所以长出须根后进行接种是为了提高接种成功率，增加菌种感染植物根系的面积，因为菌种一般都只会感染在宿主植物的须根上，这样菌根才能够实现帮助植物吸收土壤中的水分和养分，促进植物的生长和发育。
在本发明中，所述云南硬皮马勃菌液的制备方法优选包括：将云南硬皮马勃接种于MMN液体培养基中进行扩大培养，得到云南硬皮马勃菌液。在本发明中，所述云南硬皮马勃的接种形式优选包括云南硬皮马勃菌落和/或种子液。本发明对所述种子液的制备方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。本发明所述云南硬皮马勃菌落的培养方法优选包括：对云南硬皮马勃的子实体消毒后，取子实体的产孢组织接种于MMN固体培养基平板中进行菌落培养，得到菌落。本发明所述菌落培养的温度优选为21~26℃，更优选为22~24℃；菌落培养的时间优选为7~14d，所述菌落培养的时间优选为菌落面积培养至培养基平板面积的三分之二即可。在本发明实施例中，MMN固体培养基平板的规格为9cm×9cm，待菌落长到5cm×5cm~7cm×7cm的大小可以接种至MMN液体培养基中。本发明所述MMN固体培养基优选包括以下组分：葡萄糖10.0g，氯化钠25mg，麦芽浸粉3.0g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.05g，维生素B1 0.1mg，氯化铁12mg，磷酸氢二铵0.25g，七水硫酸镁0.15g和琼脂7g，加水定容至1000mL，调节pH值为5.7。
得到菌落后，本发明优选将云南硬皮马勃接种于MMN液体培养基中进行扩大培养，得到云南硬皮马勃菌液。本发明所述扩大培养的温度优选为21~26℃，更优选为24~26℃；扩大培养的转速优选为180~220r/min，更优选为200r/min；所述扩大培养的时间优选为28~32d，更优选为30d。本发明优选每30~50mL云南硬皮马勃菌液中含有5~7个菌丝团时进行接种。本发明中每个菌丝团直径优选为1~1.5cm。本发明所述云南硬皮马勃菌液中的菌丝团粉碎之后再取需要接种的云南硬皮马勃菌液量。
本发明所述MMN液体培养基优选包括以下组分：葡萄糖10.0g，氯化钠25mg，麦芽浸粉3.0g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.05g，维生素B1 0.1mg，氯化铁12mg，磷酸氢二铵0.25g，七水硫酸镁0.15g，加水定容至1000mL，调节pH值为5.7。进行扩大培养时，本发明在所述MMN液体培养基中优选加入氨苄青霉素，所述MMN液体培养基中氨苄青霉素的质量浓度优选为0.1mg/L，所述氨苄青霉素的作用为抑制细菌杂菌的生长，对云南硬皮马勃的生长无影响。
得到美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液后，本发明将美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗。
在本发明中，每棵美国山核桃无菌苗施用云南硬皮马勃菌液10~30mL，更优选为20mL。本发明所述云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗的时间优选为早上6:00或者傍晚，中午施用的美国山核桃无菌苗容易失水变蔫。本发明将云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗之前，优选先对美国山核桃无菌苗的根系进行修剪，将所述无菌苗的根尖处剪去1~2cm，使修剪后的根系呈倒圆锥形，修剪根系的作用在于制造创口，利于云南硬皮马勃菌液接种。
本发明将美国山核桃无菌苗和云南硬皮马勃菌液在移栽基质中进行培养，得到菌根苗；更优选为将第一部分云南硬皮马勃菌液与移栽基质混合，得到接种基质；将第二部分云南硬皮马勃菌液施用于修剪后的美国山核桃无菌苗根系，得到施用菌液后的美国山核桃无菌苗；将所述施用菌液后的美国山核桃无菌苗栽种于接种基质中进行培养，得到菌根苗。本发明采用云南硬皮马勃菌液的接种形式，菌液用量更少，成本更低，而且美国山核桃无菌苗感染其他杂菌的感染率也降低。
本发明所述第一部分云南硬皮马勃菌液和第二部分云南硬皮马勃菌液的体积比优选为（4~14）：1，更优选为9:1。本发明所述移栽基质优选包括腐质土、蛭石和珍珠岩；所述移栽基质优选和水混合后应用，所述腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比优选为2：2：（1~1.5）：2.5，更优选为2:2:1.5:2.5。本发明所述基质的含水率优选为10%~20%。本发明优选将所述腐质土、珍珠岩和蛭石分别先进行高温高压蒸汽灭菌后再拌匀。对所述珍珠岩和蛭石进行高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌1h。对所述腐质土进行高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌3~4h，更优选为3h。
本发明优选在移栽基质中加入云南硬皮马勃菌液得到接种基质，本发明所述接种基质的pH值优选为5.5~6.5，更优选为6.0。本发明所述接种基质的pH值为5.5~6.5左右，为弱酸性，在美国山核桃原生种植林发现云南硬皮马勃时，其pH值小于6.5，大于6.5之后并未在种植园地面发现云南硬皮马勃子实体，因此，保持pH值为5.5~6.5左右，以利于云南硬皮马勃液体菌种能够侵染美国山核桃幼苗，利于菌种的生长。本发明无需调节接种基质pH值，接种基质制备好之后可以直接应用。本发明所述接种基质应用的容器优选包括育苗袋。
本发明将所述施用菌液后的美国山核桃无菌苗栽种于接种基质中进行培养，得到菌根苗。本发明将所述施用菌液后的美国山核桃无菌苗栽种于接种基质中进行培养时优选在温室大棚中进行。本发明所述培养的温度优选为18~30℃，更优选为20~28℃；湿度优选为75%~85%，更优选为78%~82%；光照强度优选为30000~35000lux，更优选为32000~33000lux。本发明所述温室优选上方覆盖密度为30%的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据基质湿度控制浇水时间和频度，自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。
本发明使用云南硬皮马勃的液体菌种接种美国山核桃，形成菌根苗，先对美国山核桃种子进行消毒预处理备用，按适当的体积比取蛭石、珍珠岩混匀进行无菌苗培育；同时，利用MMN液体培养基培养云南硬皮马勃的液体菌种备用；待无菌苗和液体菌种备好后，以适当的体积比取蛭石、珍珠岩、腐殖土混匀后，在移栽基质中加入云南硬皮马勃的液体菌种得到接种基质，并调整含水率至适宜范围后，将无菌苗移栽至接种基质中，转入温室大棚培养，期间控制大棚内光照强度、温度和湿度，合理进行苗期浇水、除草管理，直至幼苗长成菌根苗。本发明首次实现了云南硬皮马勃菌根苗的人工栽培，实现了菌根苗的规模化生产，为云南硬皮马勃的栽培奠定了基础。该技术方案具有可靠、接种率高、成本低等优点，适用于菌根大规模生产和应用。本发明适用于菌根合成，尤其是硬皮马勃属真菌与美国山核桃的菌根合成。在云南美国山核桃种植园的野外调查中发现，成年美国山核桃存在云南硬皮马勃菌根，而且林下存在大量云南硬皮马勃时，美国山核桃的生长状态，结实率都更加的高。可见，本发明的技术方案有利于发展美国山核桃生产的同时，能够使美国山核桃更加适应云南本土环境，增加其结实率，还能生产可食用的野生菌，提高山区土地经营效益。
本发明在生产过程中通过高温高压蒸汽有效控制接种基质、宿主植物培育过程中造成的污染，通过拌种法节约了生产成本，且充分考虑到了美国山核桃幼苗及云南硬皮马勃自身的生长周期及生物活性，在美国山核桃大约十一个月（340D）长出须根后，再与云南硬皮马勃合成菌根，并通过调整移栽基质的比例、基质消毒时间、pH值及充分拌种，使其更适合美国山核桃菌根苗的生长，确保云南硬皮马勃的菌根合成率达到90%以上。
本发明并没有直接使用云南硬皮马勃子实体菌悬液进行接种，而是选择了云南硬皮马勃液体菌种，菌丝的形式加大了美国山核桃与云南硬皮马勃菌种的接触面积，使菌丝更好的接触美国山核桃须根，增强其感染率，节省了云南硬皮马勃的菌种成本。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中应用的培养基为：
1.MMN液体培养基组成为：葡萄糖10.0g，氯化钠25mg，麦芽浸粉3.0g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.05g，维生素B1 0.1mg，氯化铁12mg，磷酸氢二铵0.25g，七水硫酸镁0.15g，加水定容至1000mL，调节pH值为5.7。
2.MMN固体培养基组成为：葡萄糖10.0g，氯化钠25mg，麦芽浸粉3.0g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.05g，维生素B1 0.1mg，氯化铁12mg，磷酸氢二铵0.25g，七水硫酸镁0.15g和琼脂7g，加水定容至1000mL，调节pH值为5.7。
上述培养基均121℃灭菌30min后应用。
实施例1
1.美国山核桃种子预处理
选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理7d，每3d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150mg/L，乙烯利的质量浓度为150mg/L；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为3h；之后再用无菌水冲洗3次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。
2.美国山核桃无菌苗培育
分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积和催芽基质的体积比为1:3.5。催芽具体步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤1预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余的催芽基质（记为催芽基质2），用无菌水淋湿，使得混合物与淋湿后的催芽基质2的体积比为2:1，以此混匀，混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜。为保证通气，育苗盘中每隔0.7cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。
3.云南硬皮马勃的液体菌种培养
（1）制备MMN固体培养基平板：取14g MMN粉末（MMN粉末组成为：葡萄糖10.0g，氯化钠25mg，麦芽浸粉3.0g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.05g，维生素B1 0.1mg，氯化铁12mg，磷酸氢二铵0.25g和七水硫酸镁0.15g，混匀后应用）加入锥形瓶中，再加入7g琼脂粉，加水定容至1000mL，调节pH值5.7。120℃高压蒸汽灭菌20min加热煮沸至完全溶解，分装。待灭菌结束温度降至50℃左右后加入氨苄青霉素，每500 mL培养基加入500 μL的氨苄青霉素，之后再分装至90mm直径无菌培养皿，得到MMN固体培养基平板。
（2）选取云南硬皮马勃的子实体备用，取生长状况良好的子实体用体积浓度75%的酒精进行表面消毒5s，取其产孢组织接种于步骤（1）的MMN固体培养基平板中，于适宜的温度（21℃）在培养箱中进行培养。培养14d后观察恒温培养下的MMN固体培养基平板，待菌落长到计数范围内（即待菌落长到平板面积的三分之二），配制MMN液体培养基（MMN液体培养基的作用为分离纯培养）。在超净工作台中将氨苄青霉素加入高压灭菌后的MMN液体培养基中，培养基中氨苄青霉素的浓度为0.1mg/L；之后将MMN液体培养基转移到容量为50mL的锥形瓶中，每个锥形瓶中35mL液体培养基。待MMN固体培养基中菌落长到5cm×5cm之后，将平板中培养好的菌落用灭菌的牙签挑到锥形瓶中培养，在锥形瓶上标上编号，然后在摇床上26℃，200r/min条件下扩大培养一个月得到云南硬皮马勃液体菌种（即菌丝菌悬液）备用，每30~50mL云南硬皮马勃菌液中含有5~7个菌丝团时进行接种，每个菌丝团直径为1~1.5cm（下同），一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种10mL。设置3个平行实验。
4.制备移栽基质
分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌3h，冷却备用。
将腐质土、蛭石、珍珠岩和水按照2:2:1:2.5的体积比混合均匀，得到移栽基质，备用。
5.美国山核桃无菌苗接种云南硬皮马勃液体菌种
实验组：步骤3得到的云南硬皮马勃液体菌种接种于美国山核桃幼苗，一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种10mL。具体操作为：
（1）液体菌种8mL和适量无菌水混入步骤4的移栽基质中得到接种基质，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质松手坠落至地面后可以松散开。接种基质的pH值为5.5，该pH值适宜云南硬皮马勃的生长，应用时无需调整基质的pH值水平。
（2）育苗袋内先装入步骤（1）部分接种基质，装入量为育苗袋体积的1/3。
（3）步骤2得到的美国山核桃无菌苗，修剪其苗根系，将幼苗根尖处剪去1~2cm，使修剪后的根系呈倒圆锥形，将修剪好根系的美国山核桃幼苗种植在步骤（2）育苗袋内。具体为：
左手拇指与食指拿好修剪后的美国山核桃苗，小指放在育苗袋的边缘，固定美国山核桃苗使其悬空于育苗袋中，在根部追加2mL左右的液体菌种，右手放入育苗袋的接种基质中，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下核桃苗，再用步骤（1）的接种基质填满育苗袋，最后浇入定根水50~70mL/每棵苗；之后放入温室，保持光照，温度控制在18~28℃，湿度保持70%~85%。
对照组：同实验组，唯一的区别在于：将液体菌种10mL替换为无菌水10mL。
6.接种苗的管理
将步骤5得到的接种云南硬皮马勃后的美国山核桃苗和对照组的美国山核桃苗，移栽到温室条件下培养，温度为18℃~28℃之间，温室上方覆盖30%密度的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据基质湿度控制浇水时间和频度，自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。
7.苗期菌根检查
步骤5美国山核桃苗于接种两个月后开始抽查是否有菌根形成，每次随机抽两株苗，每两周抽查一次直至观察到有菌根形成，观察菌根形态和外延菌丝，切片观察横切面；使用CTAB法提取DNA，进行PCR扩增目标片段，后进行测序比对，确认接种的云南硬皮马勃是否感染菌根，PCR结果在NCBI进行比对，比对结果为653/657（相似度为99%），则确认云南硬皮马勃成功感染美国山核桃幼苗。
其中，实施例1的云南硬皮马勃与美国山核桃形成的外生菌根外观形态见图1，根据图1可知，云南硬皮马勃的液体菌种与美国山核桃形成的菌根在幼嫩阶段呈根尖到基部从浅黄色偏透明-浅褐色-褐色渐变，菌根顶端略凸起，淡黄色、附有白毛，呈单轴状和羽状（图1中A）。菌根顶端直，表面有白毛。外延菌丝较多（图1中B和图1中C），呈棉絮状，透明，菌丝基本不分支，长度为0.11~1.83cm，在Leica S8AP0解剖镜下测量单根菌根长0.6~5.1cm，直径为0.056~0.28mm。
利用光学显微镜（Leica DMI6000 B）观察实施例1的菌根横切面切片，观察结果见图2，其中A~B代表外菌套；C~D代表外延菌丝；E~H代表菌根横切面及哈氏网。根据图2可知，与美国山核桃共生的云南硬皮马勃菌根的外延菌丝较短，有隔，未见锁状联合，菌丝在皮层细胞间隙之间生长，菌丝在营养根表面繁殖，交织成网状，层层交织形成菌套，外菌套式样为表皮状拟薄壁组织。菌套横切面厚7.27~40.00μm，由球形、不规则球形、椭圆形和不规则椭圆形的菌丝细胞组成，3~5层，细胞壁薄或稍厚，浅褐色或棕黄色，分层不明显，菌套外部有多层透明菌丝包裹，接种美国山核桃的菌根横切面上能观察到发达的哈蒂氏网结构。图2中的A~H的显微镜比例尺为100 μm。
实施例2
1.美国山核桃种子预处理：选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理7d，每4d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150 mg/L，乙烯利的质量浓度为150 mg/L；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为3.5 h；之后再用无菌水冲洗4次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。
2.美国山核桃无菌苗培育：分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积的三倍以上催芽基质进行贮藏催芽。步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤1预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余的催芽基质（记为催芽基质2）撒在混合物之上，用无菌水淋湿；使得混合物与淋湿后的催芽基质2的体积比为2:1，以此混匀，混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜。为保证通气，育苗盘中每隔0.7~1cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。
3.云南硬皮马勃的液体菌种培养
（1）制备MMN固体培养基平板制备同实施例1。
（2）选取云南硬皮马勃的子实体备用，取生长状况良好的子实体用体积浓度为75%的酒精进行表面消毒5s，取其产孢组织接种于步骤（1）的MMN固体培养基平板中，于适宜的温度（21℃）在培养箱中进行培养。培养10d后观察恒温培养下的MMN固体培养基平板，待菌落长到计数范围内（即待菌落长到平板面积的三分之二），配制MMN液体培养基（MMN液体培养基的作用为分离纯培养）。在超净工作台中中将氨苄青霉素加入高压灭菌后的MMN液体培养基中，培养基中氨苄青霉素的浓度为0.1mg/L；之后将MMN液体培养基转移到容量为50mL的锥形瓶中，每个锥形瓶中35mL液体培养基。MMN固体培养基平板在超净台计数后，将平板中培养好的菌落用灭菌的牙签挑到锥形瓶中培养，在锥形瓶上标上编号，然后在摇床上26℃，200r/min条件下扩大培养一个月得到云南硬皮马勃液体菌种备用，一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种20 mL。设置3个平行实验。
4.制备移栽基质
分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌4h，冷却备用。
将腐质土、蛭石、珍珠岩和水按照2:2:1.3:2.5的体积比混合均匀，得到移栽基质后，备用。
5.美国山核桃无菌苗接种云南硬皮马勃液体菌种
实验组：步骤3得到的云南硬皮马勃液体菌种接种于美国山核桃幼苗，一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种20mL。具体操作为：
（1）液体菌种18mL和适量无菌水混入步骤4的移栽基质中，得到接种基质，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质松手坠落至地面后可以松散开。接种基质的pH值为6.0，该pH值适宜云南硬皮马勃的生长，应用时无需调整基质的pH值水平。
（2）育苗袋内先装入步骤（1）部分接种基质，装入量为育苗袋体积的1/3。
（3）步骤2得到的美国山核桃无菌苗，修剪其苗根系，将幼苗根尖处剪去1~2cm，使修剪后的根系呈倒圆锥形，将修剪好根系的美国山核桃幼苗种植在步骤（2）育苗袋内。具体为：
左手拇指与食指拿好修剪后的美国山核桃苗，小指放在育苗袋的边缘，固定住美国山核桃苗使其悬空于育苗袋中，在根部追加2mL左右的液体菌种，右手放入育苗袋的接种基质中，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下核桃苗，再用步骤（1）的接种基质填满育苗袋，最后浇入定根水50~70mL/每棵苗；之后放入温室，保持光照，温度控制在18~26℃，湿度保持75~85%。
对照组：同实验组，唯一的区别在于：将液体菌种10mL替换为无菌水10mL。
6.接种苗的管理
将步骤5得到的接种云南硬皮马勃后的美国山核桃苗和对照组的美国山核桃苗，移栽到温室条件下培养，温度为18~26℃之间，温室上方覆盖30%密度的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据基质湿度控制浇水时间和频度，自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。
7.苗期菌根检查：同实施例1。
实施例3
1.美国山核桃种子预处理：选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理8d，每3d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150mg/L，乙烯利的质量浓度为150mg/L；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为4h；之后再用无菌水冲洗4次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。
2.美国山核桃无菌苗培育：分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积的三倍以上的催芽基质进行贮藏催芽。具体步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤（1）预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余的催芽基质（记为催芽基质2）撒在混合物之上，用无菌水淋湿；使得混合物与淋湿后的催芽基质2的体积比为3：1，以此混匀。混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜。为保证通气，育苗盘中每隔0.7~1cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。
3.云南硬皮马勃的液体菌种培养
（1）制备MMN固体培养基平板制备方法同实施例1。
（2）选取云南硬皮马勃的子实体备用，取生长状况良好的子实体用体积浓度为75%的酒精进行表面消毒5s，取其产孢组织接种于步骤（1）的MMN固体培养基平板中，于26℃在培养箱中进行培养。培养14d后观察恒温培养下的MMN固体培养基平板，待菌落长到计数范围内（即菌落面积为培养基平板面积的三分之二），在超净工作台中将氨苄青霉素加入高压灭菌后的MMN液体培养基中，培养基中氨苄青霉素的浓度为0.1mg/L；之后将MMN液体培养基转移到容量为50 mL锥形瓶中，每个锥形瓶中35 mL液体培养基。MMN固体培养基平板在超净台计数后，将平板中培养好的菌落用灭菌的牙签挑到锥形瓶中培养，在锥形瓶上标上编号，然后在摇床上26℃，200 r/min条件下扩大培养一个月得到云南硬皮马勃液体菌种备用，一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种30mL。设置3个平行实验。
4.制备移栽基质
分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌3~4h，冷却备用。
将腐质土、蛭石、珍珠岩和水按照2:2:1.5:2.5的体积比混合均匀，得到移栽基质，备用。
5.美国山核桃无菌苗接种云南硬皮马勃液体菌种
步骤3得到的云南硬皮马勃液体菌种接种于美国山核桃幼苗，一棵美国山核桃无菌苗接种液体菌种30mL。具体操作为：
（1）液体菌种28mL和适量无菌水混入步骤4的移栽基质中，得到接种基质，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质松手坠落至地面后可以松散开。接种基质的pH值为6.5，该pH值适宜云南硬皮马勃的生长，应用时无需调整基质的pH值水平。
（2）育苗袋内先装入步骤（1）部分接种基质，装入量为育苗袋体积的1/3。
（3）步骤2得到的美国山核桃无菌苗，修剪其苗根系，将幼苗根尖处剪去1~2cm，使修剪后的根系呈倒圆锥形，将修剪好根系的美国山核桃幼苗种植在步骤（2）育苗袋内。具体为：
左手拇指与食指拿好修剪后的美国山核桃苗，小指放在育苗袋的边缘，固定住美国山核桃苗使其悬空于育苗袋中，在根部追加2mL左右的液体菌种，右手放入育苗袋的接种基质中，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下核桃苗；再用步骤（1）的接种基质填满育苗袋，最后浇入定根水50~70mL/每棵苗；之后放入温室，保持光照，温度控制在18~26℃，湿度保持75%~85%。
6.接种苗的管理
将步骤5得到的接种云南硬皮马勃后的美国山核桃苗，移栽到温室条件下培养，温度为18~26℃之间，温室上方覆盖30%密度的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据基质湿度控制浇水时间和频度，自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。
7.苗期菌根检查
同实施例1。
在接种第340d时，实施例1~3的美国山核桃都有菌根形成，统计实施例1~3感染云南硬皮马勃的菌根合成率，测量实验组与对照组的美国山核桃幼苗的株高及基径，见表1~表3。
1菌根合成率
在接种第340d时，实施例1~3的美国山核桃都有菌根形成，见表1，菌根合成率高。菌根合成率的计算公式为：菌根合成率（%）=菌根感染的根段数/检查的根段总数×100%。
表1实施例1~3的云南硬皮马勃后的菌根
2接种云南硬皮马勃后对美国山核桃植株的影响
实施例1~3的实验组和对照组的美国山核桃的株高与基径测量数据使用SPSS进行分析，析结果见表2和表3。根据表2可知，实施例1~3接种云南硬皮马勃之后，美国山核桃的基径更粗；采用了莱文方差等同性检验，实施例2故接种云南硬皮马勃之后对美国山核桃植株基径影响较显著。
表2美国山核桃实验组与对照组的基径数据统计
根据表3可知，故接种云南硬皮马勃之后，美国山核桃的株高更高；采用了莱文方差等同性检验，得到显著性分别为0.015、0.102和0.922，显著性（p）=0.102>0.05，显著性（p）=0.922>0.05，故接种云南硬皮马勃之后实施例2和实施例3的株高影响不显著，对实施例1的株高影响显著。
表3美国山核桃实验组与对照组的株高数据统计
对比例1
同实施例1，唯一的区别在于：接种基质的pH值为7.0。美国山核桃无菌苗接种云南硬皮马勃液体菌种后并不能形成菌根。
对比例2
同实施例1，唯一的区别在于：云南硬皮马勃采用子实体菌悬液接种法，云南硬皮马勃的子实体菌悬液培养的方案具体如下：
（2）选取云南硬皮马勃的子实体备用，取生长状况良好的子实体用体积浓度为75%的酒精进行表面消毒5s，对每一个云南硬皮马勃子实体进行编号并测序确认，放入-20℃冰箱中长期保存备用。
云南硬皮马勃子实体制备菌悬液：接种前，云南硬皮马勃的子实体取出，室温自然解冻后称重，用刀将子实体切成小块，再放入粉碎机充分粉碎呈均匀的浆液，粉碎使云南硬皮马勃的孢子游离出来，得到孢子悬浮液。粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高。一棵美国山核桃无菌幼苗大约接种0.3~1g云南硬皮马勃子实体，子实体孢子悬浮液的浓度为3×107~1×108个孢子/mL。
对比例2并不能使美国山核桃形成菌根，无法获得菌根苗。
对比例3
同实施例1，唯一的区别在于制备接种基质时，接种基质的灭菌方法不同，灭菌方法为：将珍珠岩、蛭石在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌30 min，冷却备用；腐质土在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌2.5h，冷却备用。接种20棵美国山核桃幼苗，设置2组平行实验。结果表明：其中一组平行实验中有8棵侵染云南硬皮马勃，形成云南硬皮马勃菌根苗；其他的12棵侵染上外源竞争菌；另一组平行实验中有9棵侵染云南硬皮马勃，形成云南硬皮马勃菌根苗；其他的11棵侵染上外源竞争菌，目标菌种云南硬皮马勃生长相对较少。
对比例3获得的美国山核桃菌根苗的外源竞争菌侵染较多，外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、思茅乳菇（Lactariuskesiyae）、会东块菌（Tuber huidongense）等杂菌。
对比例4
同实施例1，唯一的区别在于制备接种基质时，接种基质的灭菌方法不同，灭菌方法为：将珍珠岩、蛭石不灭菌；腐质土在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌3h，冷却备用。接种20棵美国山核桃幼苗，设置2组平行实验。结果表明：其中一组平行实验中有7棵侵染云南硬皮马勃，形成云南硬皮马勃菌根苗；其他的13棵侵染上外源竞争菌；另一组平行实验中有8棵侵染云南硬皮马勃，形成云南硬皮马勃菌根苗；其他的12棵侵染上外源竞争菌，目标菌种云南硬皮马勃生长相对较少，目标菌种云南硬皮马勃生长相对较少。
对比例4获得的美国山核桃菌根苗的外源竞争菌侵染较多，外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、思茅乳菇（Lactariuskesiyae）、会东块菌（Tuber huidongense）等杂菌。
综上，接种云南硬皮马勃之后对实施例2的美国山核桃的基径影响较显著，对实施例1的美国山核桃的株高影响显著。
本发明在人工条件下，接种云南硬皮马勃液体菌种十一个月后，能够成功侵染美国山核桃，形成菌根，菌根合成率达到90%~96%，为云南硬皮马勃后期的人工培育奠定基础；且与对照组相比，接种云南硬皮马勃的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，同时美国山核桃又有效地促进了云南硬皮马勃的生长发育。美国山核桃引入云南之后，接种云南硬皮马勃此类本土菌种之后，增强美国山核桃在云南的适应性；有利于美国山核桃生长的同时，为美国山核桃林下可种植可食用的野生菌奠定基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.一种美国山核桃接种云南硬皮马勃液体菌株制备菌根苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将部分云南硬皮马勃菌液与移栽基质混合，得到接种基质；
将部分云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗根系，得到施用菌液后的美国山核桃无菌苗；
将所述施用菌液后的美国山核桃无菌苗栽种于接种基质中进行培养，得到菌根苗；
所述美国山核桃无菌苗的须根数量为5个以上，须根长度为7~12 cm；每棵美国山核桃无菌苗施用云南硬皮马勃菌液10~30mL；每30~50mL云南硬皮马勃菌液中含有5~7个菌丝团，每个菌丝团直径为1~1.5cm；所述云南硬皮马勃菌液的制备方法包括：云南硬皮马勃接种于MMN液体培养基中进行扩大培养，得到云南硬皮马勃菌液；所述接种基质的pH值为5.5~6.5；所述移栽基质包括腐质土、蛭石和珍珠岩；所述移栽基质和水混合后应用，腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为2：2：（1~1.5）：2.5；珍珠岩、蛭石在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h；腐质土在121℃、1 atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌3~4h。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，部分云南硬皮马勃菌液施用于美国山核桃无菌苗根系之前，还包括修剪根系。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述美国山核桃无菌苗的培育方法包括：
对美国山核桃种子依次进行春化、清洗、浸种和消毒，得到预处理后的种子；
将所述预处理后的种子与催芽基质混合后进行培育，得到无菌苗；所述催芽基质包括珍珠岩和蛭石。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述浸种用的溶液包括添加植物生长调节剂的水溶液；所述植物生长调节剂包括赤霉素和/或乙烯利。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述扩大培养的温度为21~26℃，扩大培养的时间为28~32d。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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