CN111876361A

CN111876361A - 分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌及其用途

Info

Publication number: CN111876361A
Application number: CN202010804748.2A
Authority: CN
Inventors: 张传清; 仇智灵; 刘亚慧; 毛程鑫
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-08-12
Also published as: CN111876361B

Abstract

本发明公开了一种分离自健康山核桃林地土壤的生防芽孢杆菌PHLA101，为Paenibacillus polymyxa PHLA101，保藏编号为CCTCC NO:M2019161。本发明还同时提供了上述生防芽孢杆菌PHLA101的用途：抑制烟草赤星病菌、山核桃干腐病菌、桑果菌核病菌的菌丝生长。

Description

分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明属于作物病害防控技术领域，尤其涉及一种分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101及其在山核桃干腐病等病害防治中的应用。

背景技术

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一种非病原性的细菌，经常分布在植物根围土壤等环境中发现，属于革兰氏阳性细菌，具有周鞭鞭毛，可以运动。多粘类芽孢杆菌过去是作为多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)，属于芽孢杆菌属(Bacillius)的成员。后来基于16S rRNA基因序列的系统发育分析发现其与芽孢杆菌属存在显著的差异，于1993年划归类芽孢杆新属(Paenibacilluas)。多粘类芽孢杆菌的芽孢对辐射、热、干燥、pH值和有毒化学物等极端环境有很强的抵抗能力。据报道，在休眠状态下，多粘类芽孢杆菌的芽孢可以保持活力数年甚至数十年。且其芽孢有繁殖速度快、营养要求简单等特点，很适合作为生防资源予以开发。研究表明多粘类芽孢杆菌对植物病原菌的作用机制主要与脂肽化合物等次级代谢产物相关，而不同来源的株系对病原菌的抑菌谱经常不同，甚至对相同病原菌会显示不同的颉颃活性。例如M-1防治火疫病(Erwinia amylovora)和软腐病(E.carotovor)，IAM5可有效防治茄子青枯病(Ralstonia solanacearum)，近年来一些新的多粘类芽孢杆菌专利株系则登记用于灰霉病、稻瘟病等不同的真菌病害防治。如在已经报道的多粘类芽孢杆菌产生的众多的抗菌物质中，多粘菌素M由Paenibacillus kobensis产生，而多粘菌素F是由P.circulans产生。然而，不同多粘类芽孢杆菌株系产生的杀镰孢菌素是不同的。

山核桃(Carya cathayensis)为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属落叶乔木，是中国特有的经济树种和干果，具有很高的营养价值和经济价值。我国现有山核桃栽培面积约1.3×10⁶hm²，年平均一产产值17.5亿元，加工产值34.2亿元。近年来，由葡萄座腔菌引起的山核桃干腐病，在安徽省、浙江省临安、淳安、桐庐等山核桃主栽培区普遍发生，并且不断蔓延，对山核桃的生长、产量及未来产业的可持续发展构成了严重威胁。据杭州市林水局2015年的专题调查：全市现有山核桃林约6.0万hm²，其中罹病面积达到惊人的3.9万hm²，占64％；而临安区为发病最严重的区域，发病率高达86.5％，干腐病造成的减产幅度达15％以上，年产量损失1400余吨，直接经济损失就达1.0244亿元以上，而间接损失更是难以估量。研究者认为山核桃干腐病发生的日益严重与林地土壤的退化可能有比较密切的关系。

部分现有的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的作用如下：

1、2019114048189的发明《一株多粘类芽孢杆菌及其应用》提供了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)HY31，其保藏编号为CCTCC No:M20191102。对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖镰孢菌番茄专化型、尖镰孢菌辣椒专化型和尖镰孢萎蔫专化型等植物枯萎病病原菌均有很强的抑制效果，可以预防枯萎病的发生同时促进蔬菜的生长。

2、2019112812633的发明《一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用》提供了一种多粘类芽孢杆菌Lla-02(Paenibacillus polymyxa)，保藏号CGMCC NO.18753；从百合鳞片中分离得到，其对尖孢镰刀菌、灰霉葡孢、百合枯萎病菌、葡萄座腔菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有抑菌活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101及其应用，PHLA101对葡萄座腔菌的菌丝生长具有较好的抑制作用，对山核桃干腐病具有较好的防治效果，同时对烟草赤星病菌和桑果菌核病菌也具有较强的颉颃作用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种分离自健康山核桃林地土壤的生防芽孢杆菌PHLA101，为Paenibacillus polymyxa PHLA101，保藏编号为CCTCC NO:M2019161。

本发明还提供了上述生防芽孢杆菌PHLA101的用途：抑制烟草赤星病菌、山核桃干腐病菌、桑果菌核病菌的菌丝生长。

作为本发明的生防芽孢杆菌PHLA101的用途的改进：用于防治山核桃的干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病。

作为本发明的生防芽孢杆菌PHLA101的用途的进一步改进，包括以下步骤：

1)制备生防芽孢杆菌PHLA101发酵液(发酵液中含有抑菌物质)；

2)将发酵液或稀释后的发酵液施在经济作物(例如山核桃)上。

作为本发明的生防芽孢杆菌PHLA101的用途的进一步改进，所述步骤1)为：

①防芽孢杆菌在NA培养基上活化(培养至对数生长期)；

②步骤①所得的菌液接种于NB液体培养基中，在转速150～250rpm，温度28～30℃恒温摇床中培养2～5天，过滤，得发酵液。

作为本发明的生防芽孢杆菌PHLA101的用途的进一步改进，步骤②中，取处于对数生长期的菌液20～25μL接种于100mL NB液体培养基中进行培养。

由于不同来源的株系对病原菌的抑菌谱经常不同，甚至对相同病原菌会显示不同的颉颃活性。因此，本发明尝试从健康的山核桃林地土壤分离并筛选多粘类芽孢杆菌的不同株系，以获得对葡萄座腔菌有较好颉颃效果的株系，用于山核桃干腐病的生物防治。

本发明提供的生防类芽孢杆菌PHLA101分离自健康山核桃林地土壤，并是从1237株生防类芽孢杆菌中筛选获得。

本发明的生防类芽孢杆菌PHLA101，保藏信息如下：保藏名称为Paenibacilluspolymyxa PHLA101，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2019161，保藏时间2019年3月15日。

本发明的生防菌剂是含有芽孢的活菌。

本发明实际喷施时：将PHLA101发酵液进行适当稀释(稀释100～300倍)，选择山核桃等植物发生干腐病等病害前进行喷施，喷施至树干或植株表面有水滴流下即可。

本发明具有如下技术优势：

(1)本发明的生防类芽孢杆菌PHLA101为健康山核桃林地分离获得的生防类芽孢杆菌，与其他生防菌株相比定植性能更高，对干腐病的生防潜力更大。

(2)本发明的分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101为Paenibacilluspolymyxa，在平板拮抗实验中显示对山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌菌丝生长均有较好的抑制作用，可将其应用于山核桃干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病的生物防治。

(3)本发明的分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液，对山核桃干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病的防治效果好，可应用于山核桃干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病中的生物防治。

(4)本发明分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101应用于山核桃干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病的防治，可克服因化学农药的使用带来的一系列问题，因而有利于农产品的无公害生产，农民可以不用或是减少其他化学农药的用量，不仅可以为农民减少开支，而且有利于提高产品质量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101平板颉颃病菌生长的示意图；

a:代表分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101；b:病原菌。

图2为分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101等对病菌(山核桃干腐病菌)生长的平板颉颃作用；

从左至右分别代表：只接种病菌未接种生防类芽孢杆菌、接种生防类芽孢杆菌PHLA101和病菌、接种分离的其它类芽孢杆菌、接种分离的其它类芽孢杆菌、接种生防类芽孢杆菌PHLA101和病菌；

说明：接种生防类芽孢杆菌PHLA101和病菌，设置了2个重复；2个接种分离的其它类芽孢杆菌，是随机从1237株选择的除PHLA101以外的2株类芽孢杆菌。

图3为分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101等的发酵滤液对病菌(山核桃干腐病菌)生长的抑制作用：含毒介质法；

从左至右分别代表：只接种病菌未混入生防类芽孢杆菌发酵滤液、混入生防类芽孢杆菌PHLA101发酵滤液并接种病菌、混入生防类芽孢杆菌PHLA101发酵滤液并接种病菌、混入其它生防类芽孢杆菌(PHLA657)的发酵滤液并接种病菌、混入生防类芽孢杆菌PHLA101发酵滤液并接种病菌。

说明：混入生防类芽孢杆菌PHLA101发酵滤液并接种病菌，设置了3个重复。

图4为PHLA101对9种植物病原菌的抑制活性对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、样品的采集及分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌的分离、筛选。

1.样品的采集

2015-2018年，从临安山核桃种植基地，采集长势良好、健壮、无病症的山核桃植株根围土壤，用于生防类芽孢杆菌的分离。每点选取1～2株健壮无病植株，在山核桃植株根围侧去掉3～7cm的表土，挖出根系，再将距根系5mm以上的土壤剥离，剩余土壤作为根际土壤样品。将采集的山核桃植株土壤样品风干、去除杂物、研磨过筛，四分法收集、保存备用。

2.分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌的分离

称取土壤样品1.5克放入含100毫升无菌水的锥形瓶中，250r/min的摇床上震荡30min，取下静置，再取上清液梯度稀释。取每一浓度梯度的稀释液均匀涂抹于NA平板上，于30℃倒置培养。3d后观察长出的菌落，将菌落形态与颜色与类芽孢杆菌相似的单菌落转接至LB液体培养基中，30℃振荡培养12h后，将菌液稀释涂布于NA平板上，30℃培养72h。重复振荡稀释培养至平板上所有菌落一致后，转接至NA平板上，30℃培养72h后，4℃保存。

3.植物生防类芽孢杆菌对山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌的平板拮抗活性的筛选

(1)试验方法

采用对峙培养法，将保存于4℃中的植物生防类芽孢杆菌与病原菌(山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌)在PDA平板上进行活化。将芽孢杆菌菌液接种在9cm培养皿a处，同时将病原菌的菌饼接种在b处(见图1)。以无生防内生菌平板作为对照。放于25℃恒温培养箱中黑暗培养4d后，测量数据，计算径向生长抑制率。

计算公式：径向生长抑制率＝[100×(病原菌最长半径-病原菌中心轴半径)/病原菌最长半径]。

(2)结果分析

如图2所示，平板拮抗试验表明：无效菌株无法抑制病菌菌丝的生长，而生防生防类芽孢杆菌PHLA101对山核桃干腐病菌的菌丝生长具有较强的抑制效果，产生明显的抑菌圈。径向生长抑制率超过50％。对照组生长正常。

PHLA101对烟草赤星病菌和桑果菌核病菌向生长抑制率分别为超过45.2％和43.7％。

本发明从1237株生防类芽孢杆菌中筛选获得生防类芽孢杆菌PHLA101。

实施例2、分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101的鉴定

(1)试验方法

将分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101在NA上活化，综合通过形态学鉴定(菌落的大小、形态、颜色、透明度和芽孢的形态等)、常规细菌学生理生化鉴定和16Sr DNA序列分析进行。

(2)结果分析

分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101菌落呈乳白色、圆形、不透明，菌体杆状，芽孢卵圆形。耐盐性为1％，与报道的多粘类芽孢杆菌模式菌株的反应基本相同。根据生理生化特征鉴定菌株PHLA101为多粘类芽孢杆菌。16S r DNA系统发育分析表明PHLA101与多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa亲缘关系最近。

实施例3、分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液对病菌的抑制活性测定

1.分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌发酵液的制备：

将分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101在NA培养基上进行振荡培养，至对数生长期，得菌液；振荡培养条件为30℃，250rpm。

取20微升菌液放入装有100mL的NB液体培养基的三角瓶中，在恒温摇床中振荡培养(30℃；250rpm)2d。对培养完成的发酵液使用两层擦镜纸进行过滤，获得分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液。

2.分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液对山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌菌丝活性测定：

将发酵液加入熔化的PDA培养基中，浓度为1％(v/v)，将山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌接种至平板中心放置于25℃的恒温培养箱中培养，以无菌蒸馏水作为空白对照，即以只接种病菌未混入生防类芽孢杆菌发酵滤液作为对照。

3d后测量菌落直径。公式为：抑制率＝100％×(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径。

3.结果分析

如图3所示，分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液能抑制山核桃干腐病菌病菌菌丝生长，抑制率超过60.12％。

另：PHLA101发酵液对烟草赤星病菌和桑果菌核病菌的抑制率超过53.1％和47.7％。

实施例4、分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101对病菌的颉颃活性测定

采用如图2所述的对峙培养法。取直径5mm的病菌菌菌饼置于PDA平板距中央20mm处的左侧，再在距离中央20mm的右侧接入多粘类芽孢杆菌PHLA101或另一个多粘类芽孢杆菌对照株系PHLA37(本发明中分离自山核桃植株根围土壤的另一菌株)的菌液。每天12h光照、12h黑暗置于28℃恒溫培养，每隔24h测量病菌靠近细菌一侧的菌丝生长量(Ra)和径向生长量(Rc)。和只接种病菌的作对照。每个处理3次重复。最后测定细菌对9种病原菌的径向生长抑制率。

结果发现本发明的多粘类芽孢杆菌PHLA101对图4所述的9种病害的病原菌都有拮抗效果，其中PHLA101对烟草赤星病菌、山核桃干腐病菌和桑果菌核病菌的颉颃作用较强，抑菌率达到52.3％以上，对水稻纹枯病菌的颉颃效果最弱，抑菌率仅为9.5％。随机选择的对照株系多粘类芽孢杆菌PHLA37对9种供试的重要植物病原真菌的颉颃作用均较弱，抑菌率在2.1-16.8％之间。

实施例5、分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101发酵液有效物质防治山核桃干腐病效果评价

(1)试验方法

在山核桃林地，随机划分为9个病情情况基本类似的小区进行防效试验，设PHLA101，PHLA657(随机选择的类芽孢杆菌株系，为本发明中分离自山核桃植株根围土壤的另一菌株)其它和清水3个处理，每个处理3个小区。

PHLA101组：利用上述实施例3制备的发酵液稀释200倍喷施在山核桃植株表面，水滴流下即可(用量约为150L/亩)，常规管理。

PHLA657：为类芽孢杆菌，参照实施例3所述方法制得PHLA657发酵液，稀释200倍，喷施方式和用量同上。

清水：以清水直接进行喷施，喷施方式和用量同上。

(2)结果分析

喷施后的10天进行调查，所得效果如下表1所述。

表1、PHLA101田间防治山核桃干腐病效果

如表1所示，在常规管理条件下，通过喷施分离自健康山核桃林地的生防类芽孢杆菌PHLA101，可显著抑制山核桃干腐病的发生，平均防效达到75.1％，而对照PHLA657仅为-3.3％。

综上，本发明的菌株对山核桃干腐病菌、烟草赤星病菌和桑果菌核病菌的菌丝生长具有显著的抑制作用，可有效防治相应病害的发生。

对比试验1、将多粘类芽孢杆菌Lla-02、以及本发明的发明过程中筛选到的以下几个芽孢杆菌(如表2所述)，按照按照实施例4所述方法进行检测，其对烟草赤星病菌、山核桃干腐病菌和桑果菌核病菌的抑菌率的对比如下表2所述。

表2

多粘类芽孢杆菌HY31对上述3种病原菌的抑制效果尚不如Lla-02。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.分离自健康山核桃林地土壤的生防芽孢杆菌PHLA101，其特征是：为Paenibacilluspolymyxa PHLA101，保藏编号为CCTCC NO:M2019161。

2.如权利要求1所述的生防芽孢杆菌PHLA101的用途，其特征是：抑制烟草赤星病菌、山核桃干腐病菌、桑果菌核病菌的菌丝生长。

3.根据权利要求2所述的生防芽孢杆菌PHLA101的用途，其特征是：用于防治山核桃的干腐病、烟草赤星病和桑果菌核病。

4.根据权利要求2或3所述的生防芽孢杆菌PHLA101的用途，其特征是包括以下步骤：

1)制备生防芽孢杆菌PHLA101发酵液；

2)将发酵液或稀释后的发酵液施在经济作物上。

5.根据权利要求4所述的生防芽孢杆菌PHLA101的用途，其特征是：

所述步骤1)为：

①防芽孢杆菌在NA培养基上活化；

②将步骤①所得的菌液接种于NB液体培养基中，在转速150～250rpm，温度28～30℃恒温摇床中培养2～5天，过滤，得发酵液。

6.根据权利要求5所述的生防芽孢杆菌PHLA101的用途，其特征是：所述步骤②中，取处于对数生长期的菌液20～25μL接种于100mL NB液体培养基中进行培养。