CN110951619B - 抗幽门螺旋杆菌活性的蒽醌类化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)菌株Shsl21，它的保藏编号为CGMCC No.18550。本发明还提供了用菌株Shsl21制备的化合物，该化合物具有较好的抗幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)活性，适宜于抗幽门螺旋杆菌先导化合物研究或制备抗幽门螺旋杆菌药物。
Description
技术领域
本发明涉及抗幽门螺旋杆菌活性的化合物。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是从慢性胃炎患者胃黏膜组织中培养出的一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。有研究表明幽门螺旋杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、特发性血小板减少性紫癜、不明原因贫血、甚至某些心血管疾病息息相关。全世界平均感染率约50％，发展中国家普遍高于发达国家。中国也是一个感染率较高的国家，据统计感染率为40-90％。1994年，世界卫生组织将幽门螺旋杆菌列为Ⅰ类致癌因子，随着人群中检出率的升高，幽门螺旋杆菌的治疗已成关注焦点，因此研发高效、低毒的幽门螺旋杆菌药物是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种抗幽门螺旋杆菌活性的化合物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中R1＝-H、-OH，R2＝-CH(OH)CH3、-H。
本发明的第二目的是提供一株木贼镰刀菌属(Fusarium equiseti)菌株Shsl21，其已于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.18550。
本发明的第三目的是提供一种化合物的制备方法，包括如下步骤：
活化菌株Shsl21；
固体发酵菌株Shsl21；
用乙酸乙酯浸提固体发酵物得粗提物；
用减压硅胶柱层析得到洗脱液；
用色谱分离得反向洗脱液；
用反相HPLC分离得HPLC洗脱液。
本发明提供的菌株和化合物，都具有较好的抗幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)活性，适宜于抗幽门螺旋杆菌先导化合物研究或制备抗幽门螺旋杆菌药物。
附图说明
图1为式(I)所示化合物A的1H核磁共振图谱。
图2为式(I)所示化合物A的13C核磁共振图谱。
图3为式(I)所示化合物B的1H核磁共振图谱。
图4为式(I)所示化合物B的13C核磁共振图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。
实施例1
菌株Shsl21的分离和鉴定
一、菌株Shsl21的分离
2015年从广西防城港市北仑河口桐花树的花上分离到一株菌，命名为菌株Shsl21。
菌株Shsl21为一株红树林内生真菌。
二、菌株Shsl21的鉴定
1、分子鉴定
菌株Shsl21的18S ribosomal RNA部分序列与GENBANK ACCESSION NO.MN443741的序列相似性最高，相似性为99％。
根据以上鉴定结果，菌株Shsl21属于木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。
三、菌株Shsl21的保藏
菌株Shsl21，属于木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)，已于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.18550。
实施例2
化合物的制备
PDA培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000mL混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min。
种子培养基：将葡萄糖4.0g、麦芽汁10.0g、酵母提取物4.0g和水1000mL混匀，将pH调节到6.5，每个250mL三角瓶中加入50mL并121℃灭菌30min。
大米培养基：将80g大米和120mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。
1菌株Shsl21的固体发酵
1.1菌株Shsl21的活化
将菌株在PDA平板上培养5d，待菌落长满平板后，将5个1cm2大小的菌块连同培养基接种到含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上培养(25℃、200rpm)7d后作为种子培养液。
1.2菌株Shsl21的固体发酵
将5mL种子培养液接种于装有大米培养基的三角瓶中，25℃无菌培养30d。
2化合物的提取
2.1在步骤1.2得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24h，收集上清液。
2.2在步骤2.1的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24h，收集上清液。
2.3在步骤2.2的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24h，收集上清液。
2.4在步骤2.3的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24h，收集上清液。
2.5将步骤2.1的上清液、步骤2.2的上清液、步骤2.3的上清液和步骤2.4的上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到14.0g粗提物。
3、化合物的分离纯化
3.1减压硅胶柱层析得到洗脱液
将步骤2.5得到的粗提物进行减压硅胶柱层析。
柱子型号为：8×30cm；填充物为：薄层层析硅胶H和柱层层析硅胶(精制型)；化合物A洗脱过程为：依次用1000mL洗脱液A(由1体积份石油醚和9体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱、1000mL洗脱液B(由0体积份石油醚和10体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，收集洗脱液A-B的过柱后洗脱液。化合物B洗脱过程为：依次用1000mL洗脱液A(由6体积份石油醚和4体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱、1000mL洗脱液B(由5体积份石油醚和5体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱、1000mL洗脱液C(由4体积份石油醚和6体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱、1000mL洗脱液D(由3体积份石油醚和7体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱、1000mL洗脱液E(由2体积份石油醚和8体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，流速为50mL/min，收集洗脱液A-E的过柱后洗脱液。
3.2化合物A所述凝胶色谱分离的参数具体如下：
柱子型号为：3×60cm；填充物为：Sephadex LH-20；流动相为MeOH：CH2Cl2＝1:1有机溶剂，流速为0.5mL/min；收集保留体积为40-60mL的过柱后反向洗脱液。
化合物B所述反向硅胶色谱分离的参数具体如下：
柱子型号为：3×60cm；填充物为：C18；流动相为500mL洗脱液由6体积份甲醇和4体积份水组成，流速为0.5mL/min；收集过柱后洗脱液。
所述凝胶色谱分离的参数具体如下：
柱子型号为：3×60cm；填充物为：Sephadex LH-20；流动相为百分含量为100％甲醇有机溶剂，流速为0.5mL/min；收集保留体积为10-30mL的过柱后反向洗脱液。
3.3所述反相HPLC分离的参数具体如下：
柱子型号为：Kramosil C18柱(10μm；10×250mm)；化合物A洗脱过程为：用体积百分含量为65-90％的甲醇水溶液洗脱20min，流速为2mL/min。收集保留时间为24.8-25.1min(峰值的保留时间tR为25.0min)的过柱后洗脱液。
化合物B洗脱过程为：用体积百分含量为63-68％的甲醇水溶液洗脱30min，流速为2mL/min。收集保留时间为23.8-24.1min(峰值的保留时间tR为23.9min)的过柱后洗脱液。
3.4将步骤3.3收集的HPLC洗脱液减压蒸馏至干燥，分别得到化合物A 3.1mg产物，化合物B10mg产物。
4.化合物的表征
将步骤3.4的产物进行有机质谱和核磁共振谱分析。
产物的表征数据如下：
化合物A：
黄色固体状；分子式：C16H12O6；分子量：300；1H核磁共振图谱见图1，13C核磁共振图谱见图2
化合物B：
黄色针状；分子式：C14H8O6；分子量：272；1H核磁共振图谱见图3，13C核磁共振图谱见图4；
依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，步骤3的产物为式(I)所示的化合物。
其中A：R1＝H,R2＝CH(OH)CH3；B：R1＝OH,R2＝H。
实施例3
式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的抑制作用
采用微量稀释法检测式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)。
将甲硝唑(Aladdin公司)作为化合物的阳性对照，进行平行实验。
本实施例所用细菌为:幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)。
实验具体步骤如下：
1.制备MIC板
第1孔先加脑心浸出液培养基(BHI)(具体成分包括：蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠，pH＝7.4)173.6μL，再加6.4μL式(I)所示化合物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加，保留90μL培养基，作为加菌不加式(I)所示化合物对照。
2.制备菌液
取固体平板上对数期生长的幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)，用BHI培养基制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，为1×107CFU/mL，备用。
3.接种菌液
取10μL加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106CFU/mL)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔化合物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1μg/mL。
4.结果判断
以在小孔内完全抑制细菌生长的式(I)所示化合物最低浓度为MIC。
当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。
当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高化合物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的抑菌作用需重复3次试验。
式(I)所示化合物A和B对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的MIC值为16μg/mL。
甲硝唑对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的MIC值为大于16μg/mL。
Claims (2)
1.一株木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)菌株Shs121 CGMCC No.18550。
2.用权利要求1所述菌株生产抗幽门螺杆菌化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
活化菌株Shsl21；
固体发酵菌株Shsl21；
用乙酸乙酯浸提固体发酵物得粗提物；
用减压硅胶柱层析得到洗脱液；
用色谱分离得反向洗脱液；
用反相HPLC分离得包含化合物A或B的HPLC洗脱液；
所述化合物A和B的结构式如下式所示：
其中A：R1＝H,R2＝CH(OH)CH3；B：R1＝OH,R2＝H。
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