JP2016111954A - 耐熱性β―キシロシダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1] (A)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。
[2] α−L−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−L−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される1種以上を有する、前記[1]の耐熱性β−キシロシダーゼ。
[3] (a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号3又は4で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
[4] 前記ポリペプチドが、α−L−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−L−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される1種以上も有する、前記[3]のポリヌクレオチド。
[5] 前記[3]又は[4]のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
[6] 前記[5]の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
[7] 真核微生物である、前記[6]の形質転換体。
[8] 前記[6]又は[7]の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
[9] 前記[1]若しくは[2]の耐熱性β−キシロシダーゼ、前記[3]若しくは[4]のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記[8]の耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
[10] セルロースを含む材料を、前記[1]若しくは[2]の耐熱性β−キシロシダーゼ、前記[3]若しくは[4]のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、前記[6]若しくは前記[7]に記載の形質転換体、前記[8]の耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記[9]のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造に好適に用いられる。
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の99%が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の0.1%以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
また、本発明及び本願明細書において、α−L−アラビノフラノシダーゼ活性とは、PNPAFを基質とする加水分解活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、α−L−アラビノピラノシダーゼ活性とは、PNPAPを基質とする加水分解活性を意味する。
(A)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(すなわち、オープンリーディングフレームOJ1M−273、又は遺伝子クローンOJ1M−273−1)、
(B)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼをコードする。当該耐熱性β−キシロシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号3又は4で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも105℃、pH5.0の条件下でPNPXを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するDNA、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するDNAからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性β−キシロシダーゼを生産し得る。
本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性β−キシロシダーゼを発現させる。
前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼにより、キシラナーゼによりへミセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖、若しくはセロビオハイドロラーゼによりセルロースが加水分解して生じたオリゴ糖を単糖に加水分解する、リグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
<1> 温泉土壌からのDNA抽出と全ゲノムシーケンス(Whole Genome Sequence、WGS)
70〜110℃で活性を示す新規耐熱性β−キシロシダーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌DNAを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムDNAの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の3ヶ所、5地点(メタゲノムDNAサンプルN2、AR19、AR15、OJ1、及びH1)から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度58〜78℃、pH7.2〜8のレンジにあった。
温泉土壌サンプルOJ1について、メタゲノムDNAの配列解読を行い、454シーケンサーにおいては平均リード長390bp、総リード数6,301,450個、総ゲノム解読量2,456,206,434bpを得、GA2xシーケンサーにおいては平均リード長114bpのペアエンドで、総リード数545,185,016個、総ゲノム解読量62,151,091,824bpを得、合計して64.6Gbpの全ゲノムシーケンス(WGS)データセットを得た。
454シーケンサー及びGA2xシーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、CLCbio社製のCLC Genomics Workbench(ver5.4.8)を用いてクオリティーフィルタリング及びde novoアセンブリングを行った。クオリティーフィルタリング後には、454シーケンサーで得られたリードの総リード長は2,446,280,452bpとなり、GA2xシーケンサーで得られた塩基配列データの総リード長は54,066,191,005bpとなった。アセンブリング後には、500bp以上の長さを持つコンティグの数は2,080,555個、総全長は1,083,520,858bpとなり、このうち最大コンティグ長は1,063,869bpであった。
UniProtデータベース(http://www.uniprot.org/)からEC番号が3.2.1.4(セルラーゼ)、3.2.1.21(β−グルコシダーゼ)、3.2.1.37(β−キシロシダーゼ) 、3.2.1.91(セルロース 1,4−β−セロビオシダーゼ)、3.2.1.8(エンド1,4−β−キシラナーゼ)の配列をダウンロードし(アクセス日:2011/12/9)、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアMetagene(Noguchi et al., DNA Research,2008,15(6))を使用して、前記<2>で得たコンティグ配列から、遺伝子領域(=オープンリーディングフレーム)を推定した(Metagene option:−m)。推定されたORFからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、BLASTP(blastall ver. 2.2.18)を使い、前記ローカルデータベースに参照した。BLASTPのoption条件は、「Filter query sequence=false」、「Expectation value(E)<1e−20」[以下、デフォルト値:Cost to open a gap=−1、Cost to extended gap=−1、X dropoff value for gapped alignment=0、Threshold for extending hits=0、Word size=default]とし、ヒットしたORF配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
前記<3>で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースpfam HMMs(Pfam version 23.0 and HMMER v2.3;Finn et al.,Nucleic Acids Research Database,2010,Issue 38,p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムHMMER(Durbin et al.,‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998,Cambridge University Press.;hmmpfam(Ver.2.3.2)、E−value cutoff<1e−5; Database=Pfam_fs(models that can be used to find fragments of the represented domains in a sequence.))を用いて、Pfam領域データベースとの相同性から、前記<3>で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素(GH)ファミリーを決定した。なお、GH触媒ドメインの配列を70%以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
β−グルコシダーゼ遺伝子又はβ−キシロシダーゼ遺伝子と推定された全てのORFについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムDNAからPCRにより遺伝子を増幅した。増幅したPCR産物はChampion pET Directional TOPO(登録商標) Expression Kits(ライフテクノロジーズ社製)のpET101/D−TOPOベクターに挿入し、One Shot TOP10株に形質転換した。コロニーPCRによりポジティブクローンを選抜し、100mg/Lアンピシリンを含むLB液体培地を用いて37℃、200rpmで17〜20時間培養した後、ミニプレップキット(Wizard(登録商標) plus SV Minipreps DNA Purification System、Promega社製)を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の3730 DNA Analyzerシーケンサーを用いて配列確認を行った。
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Champion(登録商標) pET Directional TOPO(登録商標) Expression Kits(ライフテクノロジーズ社製)に付属するBL21 Star(DE3)株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を100mg/Lアンピシリンを含むLB培地に植菌し、OD600=0.2〜0.8程度まで培養した後、IPTG(Isopropyl−β−D(−)−thiogalactopyranoside)を添加し、さらに5〜20時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。当該操作により、 β−キシロシダーゼ候補遺伝子OJ1M−273−1がコードする酵素タンパク質の弱い発現が得られた。
β−キシロシダーゼ活性測定には、PNPXを基質として用いた。PNPX(Sigma社製)を水で溶かし、所定の終濃度となるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたPNPX基質溶液は、全て当該方法により調製したPNPX水溶液を用いた。計測には、前記<6>で得られた精製酵素を0.05MのTris−HClバッファー(pH8.0)で0.1〜0.01mg/mLに希釈して用いた。
OJ1M−273−1遺伝子がコードする酵素タンパク質(OJ1M−273−1)に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。基質として、CMC(Sigma社製)、キシラン(ブナ材由来、Sigma社製)、アラビナン(シュガービート由来、Sigma社製)、アラビノガラクタン(カラマツ材由来、Sigma社製)、PNPX(Sigma社製)、PNPG(Sigma社製) 、PNPAF(Sigma社製)、PNPAP(Sigma社製)、PNPGA(Sigma社製)、PNPFP(Sigma社製)、PNPRP(Sigma社製)、PNPMP(Sigma社製)、PNPadX(Sigma社製)、及びPNPbdFP(Sigma社製)を用いた。
CMC、キシラン、アラビナン、又はアラビノガラクタンを基質とする場合には、0.02mg/mLに希釈した精製酵素と1質量%の各基質水溶液を用いて105℃で反応させた以外は前記<7>と同様にして反応させ、反応終了後に等量の3,5−dinitrosalicylic acid reagent(DNS溶液)を加えて100℃で5分間加熱処理し、5分間の冷却後に遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて540nmの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線(キシランを基質とした場合は、キシロースで作成した検量線、アラビナン、又はアラビノガラクタンを基質とした場合はアラビノースで作成した検量線)を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。1分間に1μmolの還元糖を生成する酵素活性を1Uとし、タンパク質量で除した値を比活性(U/mg)とした。
OJ1M−273−1によるPNP基質加水分解の最大初速度(Vmax)、ミカエリス定数(Km)及び触媒効率(Kcat/Km)を調べた。カイネティクスの測定は、PNPX水溶液の濃度を、0.2mM、0.5mM、1mM、3mM、5mM、10mM、又は20mMとし、PNPAF水溶液及びPNPAP水溶液の濃度を、1mM、3mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、又は60mMとし、0.01mg/mLに希釈した酵素を用い、105℃で反応させた以外は前記<7>と同様に行い、PNP基質加水分解活性(U/mg)を算出した。最大初速度(Vmax)とミカエリス定数(Km)は、データ分析ソフトOrigin(ライトストーン社製)を用いたミカエリス−メンテンモデルのフィッティングによって求め、得られた数値から触媒効率(Kcat/Km)を算出した。
OJ1M−273−1遺伝子がコードする酵素タンパク質(OJ1M−273−1)のPNPX加水分解活性の温度依存性及びpH依存性を調べた。計測には、前記<6>で得られた精製酵素を0.1mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。
結果を図6に示す。酵素活性は、最も高い分解活性を示した105℃の値を100%とした相対値(Relative activity、%)として示した。OJ1M−273−1は、温度範囲60〜110℃においてPNPX加水分解活性を示した(図6)。60〜105℃の範囲では、酵素反応温度の上昇と共にPNPX加水分解活性も上昇し、最も高い活性を示した至適温度(Topt)は、105℃であった。酵素反応温度を105℃以上にした場合には、PNPX加水分解活性は急激に減少した。
結果を図7に示す。最も高い分解活性を示したpH5.0の値を100%とした相対値(Relative activity、%)として示した。pHは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。OJ1M−273−1は、pH4.5〜7の範囲において、PNPX加水分解活性を示した。至適pHは5.14(基質、バッファーと酵素の混合液の実測値)であった。
OJ1M−273−1によるPNPX加水分解活性の熱安定性を調べた。計測には、前記<6>で得られた精製酵素を0.1mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、6μLの精製酵素溶液(0.1mg/mL)、294μLの精製水、150μLの200mM 酢酸バッファー(pH5.0)からなる混合液を、85℃、90℃、95℃、100℃、又は105℃の各温度で、0、30、60、120、又は240分間保温(プリインキュベーション)した後、前記<7>と同様にして、PNPX加水分解活性を95℃で測定し、酵素の加水分解によって生成したp−ニトロフェノール量を求め、比活性(U/mg)を算出した。
Claims (10)
- (A)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−キシロシダーゼ。 - α−L−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−L−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される1種以上を有する、請求項1に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ。
- (a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号3又は4で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも105℃、pH5.0の条件下でp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−キシロシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドが、α−L−アラビノフラノシダーゼ活性及びα−L−アラビノピラノシダーゼ活性からなる群より選択される1種以上も有する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。 - 請求項5に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
- 真核微生物である、請求項6に記載の形質転換体。
- 請求項6又は7に記載の形質転換体内で、耐熱性β−キシロシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法。
- 請求項1若しくは2に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項3若しくは4に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、又は請求項8に記載の耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
- セルロースを含む材料を、請求項1若しくは2に記載の耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項3若しくは4に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−キシロシダーゼ、請求項6若しくは7に記載の形質転換体、請求項8に記載の耐熱性β−キシロシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−キシロシダーゼ、又は請求項9に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
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