CN113265346A - 一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在毕赤酵母中整合了猪肌红蛋白的基因，实现了猪肌红蛋白的高效分泌与表达。对启动子和信号肽分别进行了优化，所得基因工程菌株在摇瓶水平可以实现46.15mg/L肌红蛋白的合成，为工业化生产猪肌红蛋白提供了广阔前景。

Description

一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
肌红蛋白是一种含血红素的球状蛋白，它在结构上与血红蛋白的α亚基相似，可储存氧气。也可用于铁补充剂、疾病诊断等领域。肌红蛋白与肉类的颜色息息相关，不同状态的肌红蛋白使得肉类的颜色发生不同的变化，肌红蛋白一般有三种存在形式，氧化肌红蛋白(oxy-Myoglobin，oxy-Mb)，脱氧肌红蛋白(deoxy-Myoglobin，deoxy-Mb)和高铁肌红蛋白(met-Mb，met-Mb)，这三者之间的比例使得肉以不同的颜色进行呈现。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟出真实的肉色，会在人造肉的产品中添加肌红蛋白。
目前，猪肌红蛋白的生产主要有两种途径。第一，传统化学提取法。从心脏组织中提取猪肌红蛋白，这种方法生长周期较长且提取工艺复杂，难以应用于大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成猪肌红蛋白。该方法目前还未有报道，因此很有必要开展关于猪肌红蛋白食品级宿主表达系统的研究。
发明内容
为了解决目前猪肌红蛋白生产困难、还没有合适有效、简便的方法制备猪肌红蛋白的问题，本发明通过启动子、信号肽的筛选在毕赤酵母中成功表达了猪肌红蛋白，并使得在摇瓶条件下产量可达到46.15mg/L。
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主，在毕赤酵母中表达猪肌红蛋白，所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。
在一种实施方式中，编码猪肌红蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一种实施方式中，所述猪肌红蛋白基因通过含有GAP启动子或G1启动子的表达载体表达。
在一种实施方式中，编码所述G1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一种实施方式中，所述表达载体的信号肽为α-factor(核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)、α-amalyse(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、Glucoamylase(核苷酸序列如SEQID NO:3所示)、Inulinase(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、Invertase(核苷酸序列如SEQID NO:5所示)、Lysozyme(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、Killer protein(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)、Serum albumin(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、sp23(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、nsB(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)或pre-Ost1-αfactor(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)。
在一种实施方式中，以毕赤酵母X33或毕赤酵母KM71为宿主。
本发明的第二个目的是提供一种发酵生产猪肌红蛋白的方法，所述方法是利用权利要求1～6任一项所述的基因工程菌发酵生产猪肌红蛋白。
在一种实施方式中，将所述基因工程菌培养至OD＝2～8，以1～5mL/100mL的接种量接种至发酵体系中，在25～35℃，150～300rpm下发酵至少60h。
在一种实施方式中，所述发酵体系含有添加量血红素的培养基，所述培养基为YPD培养基或BMGY培养基。
本发明的第三个目的是提供所述的基因工程菌在制备含肌红蛋白或肌红蛋白衍生物的产品中的应用。
有益效果：本发明实现了猪肌红蛋白在毕赤酵母中的高效合成与生产，解决了之前猪肌红蛋白无法应用微生物宿主进行合成的问题。通过合适的表达系统的选择，可实现猪肌红蛋白在毕赤酵母中的高效表达。在摇瓶水平，所得猪肌红蛋白产量可达46.15mg/L，该结果为猪肌红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为重组菌P.pastoris X33-αGAP-Mb、P.pastoris GS115-αGAP-Mb、P.pastorisKM71-αGAP-Mb、P.pastoris SMD1168-αGAP-Mb发酵生产猪肌红蛋白的胶图及产量图。
图2为不同信号肽的重组菌发酵生产猪肌红蛋白的胶图及产量图。
图3为含有G1启动子重组菌P.pastoris X33-G1-Mb、P.pastoris X33-αGAP-Mb发酵生产猪肌红蛋白的对比胶图及产量图。
具体实施方式
菌体OD的测定：取1mL菌液于离心管中，吸取相应的菌液，用无菌水稀释相应的倍数，于紫外分光光度计中进行测量，此步骤重复三次。
蛋白含量的测定：使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参参见试剂盒使用说明。
发酵培养基：YPD培养基，每升YPD培养基中含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物。
在摇瓶水平应用添加了血红素的YPD培养基、BMGY培养基或其他酿酒酵母发酵培养基。
表1 实施例中所使用的引物
Figure BDA0003078729720000031
Figure BDA0003078729720000041
实施例1：表达猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌的构建及蛋白表达
将猪肌红蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，连接至整合型表达载体pGAPZαA的多克隆位点，构建得到重组质粒pGAPZα-A-Mb。
将构建得到的重组质粒pGAPZα-A-Mb，转化至大肠杆菌DH5α中，将转化液涂布于含有20μg/mLZeocin的LB平板上，在37℃至长出单克隆，将单克隆经菌落PCR和测序验证后，从正确的阳性克隆中提取质粒，将提取的质粒通过电转的方法分别转化至毕赤酵母X33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168中，分别构建得到重组菌P.pastoris X33-αGAP-Mb、P.pastoris GS115-αGAP-Mb、P.pastoris KM71-αGAP-Mb、P.pastoris SMD1168-αGAP-Mb。
将构建得到的毕赤酵母重组菌株分别发酵生产蛋白：将OD＝6～8的毕赤酵母菌体细胞接种至含有终浓度为20mg/L血红素的48mL YPD培养基中，接种量为2％(2mL/100mL)，在30℃，220rpm下发酵至少60h。应用SDS-PAGE与Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测发酵上清中猪肌红蛋白的表达情况。
如图1所示，利用重组菌P.pastoris X33-αGAP-Mb(产量为24.25mg/L)、P.pastoris KM71-αGAP-Mb(产量为20.01mg/L)能够实现猪血红蛋白的表达，而P.pastorisGS115-αGAP-Mb、P.pastoris SMD1168-αGAP-Mb无法实现猪肌红蛋白的表达。其中，泳道1-4分别对应了P.pastoris X33-αGAP-Mb、P.pastoris GS115-αGAP-Mb、P.pastoris SMD1168-αGAP-Mb、P.pastoris KM71-αGAP-Mb。
实施例2：表达猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌的改造及蛋白的表达
(1)信号肽的改造
合成信号肽α-amalyse(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、Glucoamylase(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)、Inulinase(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、Invertase(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)、Lysozyme(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、Killer protein(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)、Serum albumin-HSA(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、sp23(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、nsB(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)和pre-Ost1-alpha factor(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)，并将其分别插入质粒pGAPZαA-Mb中，以替代原始的α-factor信号序列。
①pGAPZαA-α-amalyseGAP-Mb质粒的构建：以pGAPZαA-Mb质粒为模板，以α-amalyse-F1和α-amalyse-R引物进行第一轮扩增，得到第一轮PCR产物；然后将第一轮PCR产物用作模板，将α-amalyse-F2和α-amalyse-R引物用于第二轮扩增，回收PCR产物。通过DNA测序验证得到正确的pGAPZαA-α-amalyse-Mb质粒。
②pGAPZαA-GlucoamalyseGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为Glu-F1和Glu-R，第二轮PCR的引物为Glu-F2和Glu-R，构建得到质粒。
③pGAPZαA-InuGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为Inu-F1和Inu-R，第二轮PCR的引物为Inu-F2和Inu-R，构建得到质粒。
④pGAPZαA-InvertaseGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为Invert-F1和Invert-R，第二轮PCR的引物为Invert-F2和Invert-R，构建得到质粒。
⑤pGAPZαA-LysoenzymeGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为Lyso-F1和Lyso-R，第二轮PCR的引物为Lyso-F2和Lys-R，构建得到质粒。
⑥pGAPZαA-Killer proteinGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为Killer-F1和Killer-R，第二轮PCR的引物为Killer-F2和Killer protein-R，构建得到质粒。
⑦pGAPZαA-HSAGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为HSA-F1和HSA-R，第二轮PCR的引物为HSA-F2和HSA-R，构建得到质粒。
⑧pGAPZαA-sp23GAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为sp23-F1和sp23-R，第二轮PCR的引物为sp23-F2和sp23-R，构建得到质粒。
⑨pGAPZαA-nsBGAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为nsB-F1和nsB-R，第二轮PCR的引物为nsB-F2和nsB-R，构建得到质粒。
⑩pGAPZαA-pre-Ost1GAP-Mb质粒的构建：具体构建步骤参见上述质粒的构建方法，第一轮PCR的引物为pre-Ost1-F1和pre-Ost1-R，第二轮PCR的引物为pre-Ost1-F2和pre-Ost1-R，构建得到质粒。
将构建得到的重组质粒pGAPZαA-α-amalyse GAP-Mb、pGAPZαA-GlucoamylaseGAP-Mb、pGAPZαA-Inulinase GAP-Mb、pGAPZαA-InvertaseGAP-Mb、pGAPZαA-LysozymeGAP-Mb、pGAPZαA-Killer proteinGAP-Mb、pGAPZαA-HSAGAP-Mb、pGAPZαA-sp23GAP-Mb、pGAPZαA-nsBGAP-Mb、pGAPZαA-pre-Ost1GAP-Mb，分别转化至大肠杆菌DH5α中，将转化液涂布于含有Zeocin的LB平板上，在37℃至长出单克隆，将单克隆经菌落PCR和测序验证后，从正确的阳性克隆中提取质粒，将提取的质粒通过电转的方法转化至毕赤酵母X33菌株，分别构建得到重组菌P.pastoris X33-α-amalyseGAP-Mb、P.pastoris X33-GlucoamylaseGAP-Mb、P.pastoris X33-InulinaseGAP-Mb、P.pastoris X33-InvertaseGAP-Mb、P.pastoris X33-Killer proteinGAP-Mb、P.pastoris X33-HSAGAP-Mb、P.pastoris X33-sp23GAP-Mb、P.pastoris X33-nsBGAP-Mb、P.pastoris X33-pre-Ost1GAP-Mb。
将构建得到的毕赤酵母重组菌株分别发酵生产蛋白：将OD＝6～8的毕赤酵母菌体细胞接种至终浓度20mg/L血红素的48mL YPD培养基中，接种量2％(2mL/100mL)，在30℃，220rpm下发酵至少60h。应用SDS-PAGE与Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测发酵上清中猪肌红蛋白的表达情况。
结果如图2所示，其中，1-9泳道分别代表了P.pastoris X33-SP23 GAP-Mb，X33-HSA GAP-Mb，X33-α-amylase GAP-Mb，X33-nsB GAP-Mb，X33-Inulinase GAP-Mb，X33-Invertase GAP-Mb，X33-Glucoamylase GAP-Mb，X33-Killer protein GAP-Mb，X33-Lysozyme GAP-Mb；右边胶图中的泳道分别为P.pastoris X33-pre-Ost1-Mb，X33-HSA GAP-Mb。
从图2中看出，P.pastoris X33-αGAP-Mb，X33-SP23 GAP-Mb，X33-HSA GAP-Mb，X33-pre-Ost1-Mb可分泌猪肌红蛋白。产量分别为21.90、12.38、8.84、19.01mg/L。
(2)启动子的改造
合成G1启动子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)，以质粒pGAPZα-A-Mb作为模板，通过酶切酶连的方式，以G1启动子替换GAP启动子，得到重组质粒pG1-Mb。
将重组质粒pG1-Mb，转化至大肠杆菌DH5α中，将转化液涂布于含有Zeocin的LB平板上，在37℃至长出单克隆，将单克隆经菌落PCR和测序验证后，从正确的阳性克隆中提取质粒，将提取的质粒通过电转的方法转化至毕赤酵母X-33菌株，分别构建得到重组菌P.pastoris X33-G1-Mb。
将构建得到的毕赤酵母重组菌株P.pastoris X33-G1-Mb发酵生产蛋白：将OD＝6～8的毕赤酵母菌体细胞接种至含有终浓度为20mg/L血红素的48mLYPD培养基中，接种量为2％(2mL/100mL)，在30℃，220rpm下发酵至少60h。应用SDS-PAGE与Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测发酵上清中猪肌红蛋白的表达情况。结果如图3所示，利用G1启动子构建得到的重组菌能表达猪肌红蛋白，并且，蛋白产量较含GAP启动子的重组菌的21.90mg/mL提升至46.15mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
江苏东汇生物科技有限公司
<120> 一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用
<130> BAA210624A
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggtttgt ctgatggtga atggcaattg gttttaaatg tttggggtaa agttgaagct 60
gatgttgcag gtcatggtca agaagttttg atcagattgt ttaaaggtca tccagaaact 120
ttggaaaagt tcgataagtt taaacatttg aagtctgaag atgaaatgaa ggcttcagaa 180
gatttgaaga aacatggtaa cactgttttg acagctttgg gtggtatttt gaaaaagaaa 240
ggtcatcatg aagcagaatt gactccatta gctcaatctc atgcaacaaa gcataagatc 300
cctgttaagt atttggaatt catttctgaa gcaatcatcc aagttttaca atcaaaacat 360
cctggtgact ttggtgctga tgcacaaggt gctatgtcaa aggcattgga attgtttaga 420
aacgatatgg ctgcaaagta caaggaatta ggttttcaag gttaa 465
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aattcgaaac gatggtcgct tggtggtctt tgtttctgta cggtcttcag gtcgctgcac 60
ctgctttggc t 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aattcgaaac gatgtctttt agatccttgt tggctttgtc tggtttggtt tgttctggtt 60
tggct 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aattcgaaac gatgcttttg caagctttcc ttttcctttt ggctggtttt gcagccaaaa 60
tatctgca 68
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tcatcacatt actacatcta gtcgtagct 89
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<212> DNA
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<212> DNA
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atgaggcagg tttggttctc ttggattgtg ggattgttcc tatgtttttt caacgtgtct 60
tctgct 66
<210> 12
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tttttgtaga aatgtcttgg tgtcctcgac caatcaggta gccatccctg aaatacctgg 60
ctccgtggca acaccgaacg acctgctggc aacgttaaat tctccggggt aaaacttaaa 120
tgtggagtaa tagaaccaga aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc 180
gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct 240
cttcccagca ttacgttgcg ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg 300
atggaaagtc ccggccgtcg ctggcaataa ctgcgggcgg acgcatgtct tgagattatt 360
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cccaaagact ttaaatttaa tttatttgtc cctatttcaa tcaattgaac aactat 476

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，在毕赤酵母中表达猪肌红蛋白，所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码猪肌红蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述猪肌红蛋白基因通过含有GAP启动子或G1启动子的表达载体表达。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述G1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达载体的信号肽为α-factor(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)、α-amalyse(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、Glucoamylase(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)、Inulinase(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、Invertase(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)、Lysozyme(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、Killer protein(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)、Serum albumin(核苷酸序列如SEQID NO:8所示)、sp23(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、nsB(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)或pre-Ost1-alpha factor(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母X33或毕赤酵母KM71为宿主。
7.一种发酵生产猪肌红蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1～6任一项所述的基因工程菌发酵生产猪肌红蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌培养至OD＝2～8，以1～5mL/100mL的接种量接种至发酵体系中，在25～35℃，150～300rpm下发酵至少60h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵体系含有添加量血红素的培养基，所述培养基为YPD培养基或BMGY培养基。
10.权利要求1～6任一项所述的基因工程菌在制备含肌红蛋白或肌红蛋白衍生物的产品中的应用。
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