CN101230101B - 一种用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种NT-proBNP重组蛋白，其具有选自于下列a)或b)的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后仍具有所述NT-proBNP重组蛋白活性的氨基酸序列；本发明还涉及编码上述NT-proBNP重组蛋白的核苷酸序列及上述NT-proBNP重组蛋白的制备方法。上述的NT-proBNP重组蛋白具有与天然NT-proBNP蛋白相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性，可代替天然NT-proBNP多肽，用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品，并为下一步研究开发NT-proBNP检测试剂盒奠定了基础。

Description

一种用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用。

背景技术

心血管疾病在中国、甚至全球，都是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。世界卫生组织在2004年9月26日第5个“世界心脏日”时，在日内瓦发表的一份公报中指出，全球每年有1700万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将突破2000万，心血管疾病和中风将成为人类死亡和致残的首要原因。其中，心力衰竭(Heart Failure，HF)是严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合症，如今已不再被简单地看作是独立临床疾病，而是作为心血管疾病发展到后期的一个阶段。从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病，最后发展成为心力衰竭。2003年，中国心血管健康多中心合作研究组应用四阶段整群随机抽样方法，在中国10省市抽样调查，结果显示心衰患病率为0.9％，随着年龄增高，心衰患病率显著上升，北方明显高于南方1.4％对0.5％，女性1.0％高于男性0.9％。由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显，HF正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。

在发达国家，HF是一种常见情况，影响着1％-2％的人口，并且有着很高的死亡率，特别是在老年患者中。有学者统计，心力衰竭患者一旦出现典型症状，5年存活率男性为25％，女性为38％，与恶性肿瘤病人相仿。目前慢性心脏衰竭在70岁以上老年人群中的发病率约为10％以上。有资料显示，由于饮食习惯的改变等原因，中国目前有2亿人超重、7000万人肥胖，高血压和高血脂的人数都超过1.6亿，所有这些，导致了中国的冠心病、中风等心血管疾病患者呈爆发性增长。在发达国家，约有7％的人群患有此病，但只有2％的人被诊断出来，还没有特异性生化参数和治疗监测方法。

HF的不良预后，使越来越多的学者开始考虑应打破传统的观念，于尚未出现明显“充血性”症状之前就着手干预治疗，从根本上防治HF，延缓HF发展进程，提高患者的远期存活率。HF尽早发现是非常重要的，因为，如果被发现得早，通常它是能用药物控制的。因此，对心衰的预防和及时正确的诊断和治疗非常重要。传统根据病史和体征对心衰患者的诊治及长期监控是非常不完善的，常需住院来调节体液的潴留。如果有一个能有效监控心衰的生化标志物应用于临床诊断，那将是非常有效的。因此，心脏生物化学标志物的准确有效的应用，显得更加重要。

目前研究证实，B型钠尿肽(BNP)或非活性的N末端前钠尿肽(NT-ProBNP)是心衰时较好的心脏标志物，能反映心室容积扩大、心室超负荷和心脏功能有无损伤及损伤程度。早在2000年“Heart”杂志在一篇名为“BNP：很快成为治疗心衰患者的常规措施”的编者社论中就明确认为脑钠肽或B型钠尿肽(brainnatriuretic peptide，B-type natriuretic peptide；BNP)有助于诊断心衰，可作为心衰患者预后标志物，是一种较新的监控心衰的方法。BNP是一种钠尿肽，由心室分泌的类肽化合物，具有利钠、利尿、舒血管、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的作用。研究表明容量负荷引起的心室压力改变以及室壁张力的增加是刺激BNP分泌的因素。BNP是32个氨基酸的多肽，是从氨基酸前体蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而来，同时产生76个氨基酸非活性的N末端脑钠尿肽原(NT-proBNP)，在血中浓度随BNP升高而升高。Mueller T与Hervas等研究发现血浆BNP、NT-proBNP浓度的升高对于心衰的诊断具有很高敏感性，可作为心力衰竭诊断的敏感指标，并能评估心功能损害严重程度。NT-proBNP和含有C端32个氨基酸的具有生物活性的BNP是等摩尔释放，因此二者在心血管系统疾病的诊断、治疗监测和预后方面有着相似的临床应用。但与BNP相比，NT-proBNP因其半衰期长(半衰期为120min)、心衰时升高幅度大而更有利于临床应用。

美国FDA在2000年11月22日首次批准了Biosite Diagnostics公司用于帮助诊断充血性心力衰竭的BNP试剂盒，Biosite Diagnostics Triage BNP。这是一种床旁检验(POCT)，使用六滴全血或血浆可在15分钟完成此项检测。如以100pg/ml为诊断心衰判断值时，特异性为95.6％，灵敏度为82.4％。与纽约心脏学会(NYHA)的心衰功能分级分相比，发现BNP的化验具有敏感、准确、快速的特点，能够准确地反映心衰的严重程度，并与心衰的功能分级有良好的相关性，而且更能分辨出早期的心脏功能紊乱。早期实验的研究对象多是急诊室呼吸困难、肺病、心脏病患者，显示BNP、NT-proBNP与心衰具有很好的相关性，有些心力衰竭患者BNP正常，阳性预测值达到90％-95％，其阴性预测能力更具有价值。当急性心力衰竭出现左室充盈压增加的临床综合征以及如缺血、肺栓塞等任何导致肌细胞伸展的情形，化验NT-proBNP非常有益，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，NT-proBNP还能辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导。

2000年左右，国际上已经认定脑钠肽前体，NT-proBNP，是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。2002年11月19日，FDA批准上市NT-proBNP，一种用于实验室帮助诊断充血性心力衰竭(congestive heart failure)的新的酶联免疫检测试剂盒。这种检测试剂，Elecsys proBNP测定(Elecsys proBNPImmunoassay)，是由印地安纳州Indianapolis的罗氏诊断学公司(RocheDiagnostics，Inc)制造的。FDA批准这种检验试剂是基于生产厂商在美国和欧洲16个医学中心对2000多位健康和病患男女进行的临床研究。此项研究显示充血性心力衰竭症状的严重性与NT-proBNP的水平有关。

目前，中国国内的医院使用的同类产品，全部依赖进口，而且国际上只有少数几家公司拥有此项技术。如前所述，NT-ProBNP作为一种良好的心肌标志物已经获得临床认可，得到广泛的应用，但由于目前的相关检测试剂依赖进口，导致患者使用成本相对较高，进口的NT-ProBNP的ELISA检测试剂盒的价格为7200元人民币/96次检测、RIA检测试剂盒的价格为9800元/125次检测。定量检测人NT-proBNP常用的是免疫学方法，建立免疫学定量检测方法除了需要特异性良好的抗体之外，还需要相应的检测标准品与之配套。目前国际还没有国际统一的标准品提供，中国国内使用的标准品是由提供NT-ProBNP试剂的公司单独提供，并且价格昂贵，每包装达到上万元。由于NT-proBNP的分子量仅由8.9KD，在体内降解速度较快，在血液中稳定约48小时。人体内NT-proBNP极低，正常外周血浓度为100pg/ml左右；因而无法从血浆(血清)中纯化，NT-proBNP主要由心肌组织生成，以上使得天然NT-ProBNP多肽制备十分困难。而直接多肽合成成本过高。用基因工程制备低分子量多肽，一般采用融合蛋白表达，能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷，但较大的标签蛋白对小分子蛋白的免疫原性有一定的影响。所以通常使用一些蛋白酶切除标签蛋白，切除标签后的蛋白需要进一步纯化和去除加入的蛋白酶，操作比较麻烦并且蛋白酶十分昂贵。对检测标准品要求主要为：与天然存在的人NT-proBNP有相同或相近的结构，具有相同的免疫原性及高度的稳定性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种NT-proBNP重组蛋白，其具有选自于下列a)或b)的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后仍具有所述NT-proBNP重组蛋白活性的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码上述NT-proBNP重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列c)、d)或e)的核苷酸序列：

c)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

d)不同于SEQ ID NO：2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述NT-proBNP重组蛋白活性的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种上述NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其主要包含以下步骤：

1)根据GENEBANK中提供的BNP编码序列，获得NT-proBNP的编码序列SEQ ID NO：3，将编码序列SEQ ID NO：3同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列SEQ ID NO：4，进行NT-proBNP基因的克隆，获得NT-proBNP基因；

2)NT-proBNP基因与载体连接，构建NT-proBNP重组质粒，获得NT-proBNP重组质粒；

3)NT-proBNP重组质粒转化大肠杆菌，进行NT-proBNP重组蛋白的表达，获得NT-proBNP重组蛋白；

4)NT-proBNP重组蛋白的可溶性鉴定；

5)NT-proBNP重组蛋白的纯化；

6)NT-proBNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定；

7)NT-proBNP重组蛋白的活性鉴定。

上述制备方法中，步骤1)包括：将编码序列SEQ ID NO：3中第41、54、69、73、76位氨基酸同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，根据改造后的基因序列设计N端引物和C端引物；其中上述的大肠杆菌优选为BL21。

上述的N端引物优选为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；C端引物优选为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

上述步骤1)还包括采用核心模板法，采用上述的N端引物和C端引物，进行基因拼接PCR扩增上述的NT-proBNP基因。

上述制备方法中，步骤2)中使用的载体包括pET32a或pET42a。

上述制备方法中，步骤5)包括采用阳离子交换层析纯化，其中采用的阳离子交换介质优选为快流速琼脂糖凝胶(SP Sepharose Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤5)还包括采用亲和层析纯化，其中采用的亲和层析纯化介质优选为快流速组氨酸标签(Histrap Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤5)还包括脱盐柱(Desalting)处理。

上述的步骤5)具体包括以下步骤：

①将含目的NT-proBNP重组蛋白的破菌上清用快流速琼脂糖凝胶初纯化，采用连续洗脱并收集目的NT-proBNP重组蛋白蛋白峰；

②初纯化的NT-proBNP重组蛋白用快流速组氨酸标签亲和层析柱再次纯化，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱收集后者；

③用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50mM Tris-HCl，pH8.0；

④脱盐后NT-proBNP重组蛋白内加入带有His标签的重组EK酶，重组EK酶与NT-proBNP重组蛋白量比为1∶1000，置于4℃低速摇床24-48小时；

⑤再次用快流速组氨酸标签亲和层析柱纯化及去除重组EK酶，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱，40mM洗下蛋白即为所需NT-proBNP重组蛋白。

上述制备方法中，步骤6)中采用Lowry法(Folin酚法)测定NT-proBNP重组蛋白浓度；采用高效液相色谱法(HPLC)测定NT-proBNP重组蛋白纯度。

本发明还有一个目的是提供上述的NT-proBNP重组蛋白在免疫诊断中的应用，其可代替天然NT-proBNP多肽用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品，或NT-proBNP重组蛋白用于制备NT-proBNP检测试剂盒。

本发明获得的NT-proBNP重组蛋白为含83个氨基酸的多肽，与天然NT-proBNP的76个氨基酸相比，仅在N端多带有7个从融合表达蛋白切下的氨基酸-AMADIGS。经密码子改造的基因构建的原核表达质粒在大肠杆菌中实现了高效可溶性表达，大肠杆菌表达蛋白制备工艺简单，价格低廉，能大规模生产。发明获得的NT-proBNP重组蛋白为含83个氨基酸的多肽在纯化过程中发现，它在与融合蛋白切开后能非特异性的结合到HisTrap HP柱，经(20mmol/Lsodium phosphate，0.5M NaCl，20-50mmol/L咪唑pH7.4)可以将其洗脱，而未切开的蛋白及切下的标签蛋白与加入的EK酶(带His标签)不能洗脱，达到纯化分离和去除加入的蛋白酶的效果，制备的NT-proBNP-83纯度很高，方法简单，所用的纯化材料也是很常见的纯化填料。并且研究发现：在相同的保存条件和测定条件下，Trx-NT-proBNP在4℃保存15天活性下降为7.8％；NT-proBNP-83(表示共83个氨基酸的NT-proBNP蛋白)下降了13.2％；而NT-proBNP-76(表示共76个氨基酸的NT-proBNP蛋白)下降了47.0％，Trx-NT-proBNP和NT-proBNP-83的稳定性明显优于NT-proBNP-76。由于NT-proBNP-83切除了标签蛋白，与天然存在的人NT-proBNP相比仅在N端多7个氨基酸，具有相同或相近的结构，能被现在的NT-proBNP的检测试剂检测，其具有与天然NT-proBNP相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性；而且上述的纯化工艺简单，成产成本低。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为基因拼接(GeneSOEing)PCR引物设计原理图；

图2为NT-proBNP基因密码子偏性分析图，其中柱高值在10以下的部分为在大肠杆菌使用频率较低的密码子；

图3GeneSOEing PCR构建NT-proBNP基因的电泳图，

其中：M为Marker；泳道1、2、3、4、5为第一轮PCR的产物；泳道6为第二轮PCR产物；泳道7为第三轮PCR产物；泳道8为以S1和A1为引物的PCR产物，泳道9为以S2和A1为引物的PCR产物；

图4为pET32a-NT-proBNP重组质粒酶切鉴定电泳图；

图5为pET32a-NT-proBNP重组质粒的测序图谱；

图6为pET32a-NT-proBNP重组质粒诱导表达的SDS-PAGE电泳图，

其中：M为Marker；泳道1为pET32a-NT-proBNP重组质粒诱导；泳道2为pET32a-NT-proBNP重组质粒未诱导；泳道3为空质粒诱导；泳道4为空质粒未诱导；

图7为NT-proBNP诱导表达蛋白的可溶性鉴定，

其中，泳道1为NT-proBNP诱导表达；泳道2为NT-proBNP破菌上清；

图8为Trx-NT-proBNP纯化后蛋白与EK酶切割后电泳鉴定结果，

其中：M为Marker；泳道1为Trx-NT-proBNP未切割；泳道2为Trx-NT-proBNP切的标签；泳道3为NT-proBNP-83；

图9为Trx-NT-proBNP切割后HisTrap HP纯化结果，8％B洗脱峰即为NT-proBNP-83，

其中：M表示Marker；泳道1为pET32a-NT-proBNP重组质粒诱导；泳道2为pET32a-NT-proBNP重组质粒未诱导；泳道3为空质粒诱导；泳道4为空质粒未诱导；

图10为pET42a-NT-proBNP重组质粒诱导表达的SDS-PAGE电泳图；

图11GST-NT-proBNP纯化后蛋白与EK酶切割后电泳鉴定结果，

其中：M为Marker；泳道1为GST-NT-proBNP未切割；泳道2为GST-NT-proBNP切下的标签；泳道3为NT-proBNP-76。

具体实施方式

材料和来源

菌种、质粒、所用菌株E.coli BL21(DE3)、DH5α为本实验室保存；pGEM-T购自promega公司；pET32a(+)及pET42a(+)购自Novagen公司。

主要试剂：Sal I、BamH I购自ToYoBo公司；pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自promega公司；DL2000DNA Marker，DNA胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自Tiangen生物科技有限公司；NT-proBNP检测试剂盒购自Roche公司；蛋白质BCA法定量检测试剂购自PIERCE公司；蛋白质Marker为中科院生物制品研究所产品；纯化所用层析柱及填料购自Amersham公司；肠激酶(EK酶)为本室自制(带HIS-Tag)。引物合成及测序均由Invitrogen公司完成；其它试剂均为中国产化学分析纯。

实施例一NT-proBNP基因的克隆

1引物设计与合成

根据GENEBANK提供的BNP基因序列(CR54976)得到NT-proBNP编码序列为pro-BNP基因中编码第27-103个氨基酸的共228个碱基(SEQ ID NO：3)。将此序列递交于Graphical codon usage analyzer(http://guca.schoedl.del)分析发现该基因中第41、54、69、73、76位氨基酸编码的密码子在E.coli BL21中使用的频率较低(参照图2的NT-proBNP基因密码子偏性分析图，其中柱高值为10以下的部分为在大肠杆菌使用频率较低的密码子)，对其进行同义改造后获得编码序列SEQ ID NO：4，将该编码序列分十段合成并设计了一对特异引物-上游引物S1(SEQ ID NO：5)和下游引物A1(SEQ ID NO：7)。上游引物S1(SEQ ID NO：5)为5′CGCGGATCCCACCCGCTGGG 3′(含BamH I位点)；下游引物A1(SEQ IDNO：7)为5′AGGCGTCGACTTAGCGCGGTGC 3′(含Sal I位点)，上下游引物的5’端均带有保护碱基，将上述引物委托上海英骏生物工程有限公司进行合成。

2基因拼接(GeneSOEing)PCR构建NT-proBNP基因

取合成的寡核苷酸引物片段1-10各100pmol，按如下核心模板法进行PCR：①将引物1和2、3和4、5和6、7和8、9和10两两混合(片段1-10如表1所示)，按照pfu酶扩增反应体系配成100μl(2.5mmol/L的dNTP各8μl，pfu缓冲液10μl，寡核苷酸片段各100pmol，pfu 2U)反应体系。PCI皈应条件：94℃5min-(94℃30S，55℃30S，72℃1min)X20-72℃5min。②以(5+6)的PCR产物为核心模板，(3+4)、(7+8)的PCR产物作为两头的引物，各取33μl混合，补加1U pfu，PCR反应条件同上。③以3-8片段的PCI皈应产物为核心模板，(1+2)、(9+10)的PCR产物作为两头的引物，各取33μl混合，补加1U pfu，PCR反应条件同上。④用S1和A1端引物对组装好的1-10的PCR产物进行扩增，反应体系：2.5mmol/L的dNTP各8μl，pfu缓冲液10μl，第③步PCI皈应产物10μl，pfu 2U，总体积100μl。PCR反应条件：94℃5min-(94℃40s，60℃40S，72℃1min)X25-72℃5min。基因拼接原理图请详见图1。反应结束后取④步物10μl做1.5％琼脂糖凝胶电泳，证实得到大小为250的特异性片段(图3)。

表1：

引物名称	引物序列
		1-SEQ ID NO：82-SEQ ID NO：93-SEQ ID NO：104-SEQ ID NO：115-SEQ ID NO：126-SEQ ID NO：137-SEQ ID NO：148-SEQ ID NO：159-SEQ ID NO：1610-SEQ ID NO：17S1-SEQ ID NO：5A1-SEQ ID NO：7	5′CACCCGCTGGGCAGCCCGGGTAGCGCCAGCGACCTGGAAACG 3′5′CTGCTCCTGCAGGCCGCTCGTTTCCAGGTCGCTGGCGCTA 3′5′AGCGGCCTGCAGGAGCAGCGCAACCATCTGCAGGGCAAACTG 3′5′CCACCTGCAGCTCGCTCAGTTTGCCCTGCAGATGGTTGCG 3′5′AGCGAGCTGCAGGTGGAGCAGACCAGCCTGGAGCCGCTGC 3′5′ACCGGTCGGACGCGGGCTCTCCTGCAGCGGCTCCAGGCTGGTCTGCT 3′5′AGGAGAGCCCGCGTCCGACCGGTGTCTGGAAGAGCCGCGAGGTGG 3′5′TGGCCACGGATGCCCTCGGTGGCCACCTCGCGGCTCTTCCAGAC 3′5′CCACCGAGGGCATCCGTGGCCACCGCAAAATGGTCCTGTACACCCTGC 3′5′TTAGCGCGGTGCGCGCAGGGTGTACAGGACCATTTTGCGG 3′5′CGCGGATCCCACCCGCTGGG 3′5′AGGCGTCGACTTAGCGCGGTGC 3′

3 NT-proBNP目的基因的回收

紫外灯下切下含特异PCR产物的胶条，放入EP管中称重，加入3倍体积的缓冲液QG，50℃水浴10分钟直至胶条完全融化，并检查颜色是否是黄色，如为紫色或橙色，加10μl 3mol/L醋酸钠(pH5.0)，混匀直至颜色恢复，加入等胶条体积的100％异丙醇(如1mg胶加1μl)，颠倒混匀，将1个MinElute柱放入提供的2ml收集管中，并放于架子上，将全部样品移入柱内，离心1分钟，倒出流过柱子的液体，将MinElute柱放回同一收集管中，加500μl缓冲液QG于MinElute柱内，离心1分钟，倒出流过柱子的液体，将MinElute柱放回同一收集管中，加750μl缓冲液PE于MinElute柱内洗涤，放置5分钟后离心1分钟，倒出流过柱子的液体，离心1分钟，将MinElute柱放入1个干净的1.5ml离心管，加10μl缓冲液EB于MinElute柱上的膜中心，洗脱DNA，柱子放置1分钟后离心1分钟，收集洗脱的DNA。

实施例二  pET32a-NT-proBNP重组质粒的构建

将pET32a载体和回收的PCR产物BamH I和Sal I双酶切消化4小时后用T₄DNA连接酶4℃过夜连接，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α菌200μl，冰浴，吸取1μl连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，分别将50μl、200μl及剩下的全部转化菌液涂于3个含氨苄青霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于2×YT培养基扩大培养。

实施例三  pET32a-NT-proBNP重组质粒的酶切鉴定

沉淀菌体，12000rpm，离心1分钟，弃上清，尽量吸干，用150μl预冷的溶液I将上述细菌沉淀重悬，剧烈振荡，新鲜配制的溶液II300μl轻轻颠倒混匀5次，冰浴3-5分钟，使其澄清，加入预冷的溶液III 150μl，轻轻混匀后冰浴10分钟，使蛋白质均匀分布于水相中，加入预冷的溶液IV150μl，轻轻混匀，12000rpm离心10分钟。小心吸取水相(约400μl)移于另一1.5ml离心管中，加入2μlRNaseA(10μg/ml)，55℃水浴10分钟。再加400μlTris-酚及400μl氯仿，涡振混匀，12000rpm离心10分钟。取上清至另一装有600μl异丙醇的1.5ml离心管中，来回颠倒几次，4℃12000rpm离心10分钟，弃上清。用70％乙醇1ml洗涤DNA2次，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温干燥10-20分钟，加入TE 20μl溶解质粒DNA，-20℃保存。

取10μl质粒用BamH I/Sal I双酶切后跑1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切反应体系为：pET32a-NT-proBNP质粒DNA 10μl，BamH I 1μl，Sal I 1μl，10×缓冲液K2μl，ddH₂O6μl，离心30秒，37℃水浴4小时，取酶切产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见切下的一个大小约为250bp的特异片段，表明pET11b质粒中已插入大小约为250bp的片段(图4)。

实施例四  pET32a-NT-proBNP重组质粒插入片断测序

将pET32a/NT-proBNP重组质粒送往上海英骏测序，并应用Blast软件将测序结果与设计序列比对。测序的结果显示，插入片段长度为250bp，与设计的NT-proBNP序列完全一致(图5)。

实施例五  NT-proBNP重组蛋白的诱导表达及鉴定

1  转化BL21菌

取上次提取的重组pET32a-NT-proBNP质粒转化BL21(DE3)菌，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用BamH I/Sal I双酶切4小时，酶切体系同前，并取酶切产物10μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定与设计值一致。

2  NT-proBNP重组蛋白的诱导表达

将扩大培养的转pET32a-NT-proBNP重组质粒的BL21菌，用LB固体培养基筛选单克隆菌落，将转化菌扩大培养，测细菌OD值达0.6-0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，按时间点2、4、6、8、10、12小时收集诱导的细菌。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为30kD的特异性蛋白条带，与预期pET32a-NT-proBNP的分子量值相符，且6小时时NT-proBNP表达量最高，约占细菌总蛋白的30％。再将IPTG诱导6小时的BL21重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而沉淀无此蛋白条带，证实重组融合蛋白为可溶性表达(图6)。

3  NT-proBNP重组蛋白的可溶性鉴定

将1mlIPTG诱导6小时的菌液加入到离心管中，5000rpm离心10分钟，收集细菌，1mlGTE液重悬细菌，5000rpm离心5分钟，弃上清，1ml GTE重悬细菌，加入100μl溶菌酶(10mg/ml)，混匀，冰浴20分钟，再依次加入20μl脱氧胆酸钠(40mg/ml)、10μl MgCl₂(1mol/L)和5μl DNase I(1mg/ml)，室温下颠倒混匀使溶液由稠变稀，12000rpm离心10分钟，分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6小时的菌液分别作为阴性对照和阳性对照，观察电泳结果(图7)。

实施例六  NT-proBNP重组蛋白的纯化

转化pET32a-NT-proBNP重组质粒的菌经1.0mmol/L的IPTG诱导表达后，6000r/分钟离心10分钟，收集菌体，使用阳离子层析柱HiTrap SP.F.F的结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，pH5.8)重悬后冰上超声破菌，4℃高速离心留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，Binding buffer平衡后用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸三钠(sodium phosphate)，1M NaCl，pH5.8)线性洗脱，收集主洗脱峰。将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，pH7.4)按1∶9的体积比稀释后上HisTrap HP再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，0.5M咪唑PH7.4)先10％B洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100％B将目的蛋白洗下。

将获得的纯化重组蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，按EK酶与蛋白1∶1000的质量比加入EK酶，4℃低速摇床(60r/min)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrapHP纯化，分别收集穿透、10％B和100％B的蛋白，17.5％SDS-PAGE电泳进行鉴定。pET32a-NT-proBNP切下的蛋白除76个氨基酸的NT-proBNP外在其N端带有7个质粒氨基酸(Ala-Met-Ala-Asp-Ile-Gly-Ser)，共83个氨基酸，大小为9.5KD(记为NT-proBNP-83)。在纯化过程中申请人发明发现其会以非特异的形式结合到HisTrap HP层析柱，在8％B(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，40mM咪唑pH7.4)的条件被洗脱(图8、图9)。

实施例七  NT-proBNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定

1  Lowry法(Folin酚法)测定NT-proBNP-83蛋白质含量

表1：制备标准曲线：

单位：(ml)

空白管

标准管1

标准管2

标准管3

标准管4

标准管5

标准蛋白液蒸馏水

01.0

0.20.8

0.40.6

0.60.4

0.80.2

1.00

试剂甲

5.0(室温放置10分钟)

试剂乙

0.5(迅速混匀，反应30分钟)

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，只作标准曲线。

将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A₂₆₀值和，A₂₈₀值。根据公式，蛋白浓度C＝(1.45×A₂₈₀-0.75×A₂₆₀)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25-250μg范围，按照上表的操作程序反应，测定出650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，在乘以稀释倍数计为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.240g/L。Tioredoxin-NT-proBNP经HPLC检测纯度为98％，每升诱导菌获得28.4mg该融合蛋白，经切割后可以获得7mg左右的NT-proBNP-83。

2  纯化产物用高效液相色谱法(HPLC)进行纯度测定。

Tioredoxin-NT-proBNP经HPLC检测纯度为98％，每升诱导菌获得28.4mg该融合蛋白，经切割后可以获得7mg左右纯度达98.3％的NT-proBNP-83。

实施例八  天然76个氨基酸NT-proBNP重组蛋白的制备

设计两条N端引物S2(SEQ ID NO：6)(5′GGATCCGATGATGATGATAAGCACCCGCTGGG 3′)，加入BamH I酶切位点，酶切位点后加入GATGATGATGATAAG序列，其编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列为EK酶的识别位点。用S2和A1端引物对组装好的1-10的PCR产物进行扩增，反应体系：2.5mmol/L的dNTP各8μl，pfu缓冲液10μl，第③步PCR反应产物10μl，pfu2U，总体积100μl。PCR反应条件：94℃5分钟-(94℃40秒，60℃40秒，72℃1分钟)25个循环-72℃5分钟。反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，证实得到大小为250的特异性片段(图3)。

将pET42a载体和回收的PCR产物BamH I/Sal I双酶切消化4小时后用T4DNA连接酶4℃过夜连接，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α菌200μl，冰浴，吸取1μl连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，分别将50μl、200μl及剩下的全部转化菌液涂于3个含卡那霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于2×YT培养基扩大培养。提取的重组pET42a/NT-proBNP质粒转化BL21(DE3)菌，涂布于含卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用BamHI Sal I双酶切4小时，酶切体系同前，并取酶切产物10μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定与设计值一致。

将扩大培养的转pET42a/NT-proBNP重组质粒的BL21菌，用LB固体培养基筛选单克隆菌落，将转化菌扩大培养，测细菌OD值达0.6-0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，按时间点2、4、6、8、10、12小时收集诱导的细菌。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为40kD的特异性蛋白条带，与预期pET42a/NT-proBNP的分子量值相符，约占细菌总蛋白的30％。再将IPTG诱导6小时的BL21重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而沉淀无此蛋白条带，证实重组融合蛋白为可溶性表达(图10)。

转化pET42a-N-proBNP重组质粒的菌经1.0mmol/L的IPTG诱导表达后使用GSTrap F.F.初纯化，使用GSTrap F.F.的结合缓冲液(20mmol/L sodiumphosphate，0.15M NaCl，pH7.3)重悬后冰上超声破菌，4℃高速离心留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脱液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L还原型谷胱苷肽，pH8.0)洗脱，收集洗脱蛋白，洗脱蛋白也用HisTrap HP再次纯化，方法与上同。将获得的纯化重组蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，按EK酶与蛋白1∶1000的质量比加入EK酶，4℃低速摇床(60r/分钟)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrap HP纯化，分别收集穿透、10％B和100％B的蛋白，17.5％SDS-PAGE电泳进行鉴定。

pET42a-NT-proBNP表达的融合蛋白是以GST-NT-proBNP形式存在，经EK酶切后得到76个氨基酸的目的蛋白(记为NT-proBNP-76)，其氨基酸序列与天然完全相同。GST-NT-proBNP经HPLC检测纯度为90％，每升诱导菌获得38.5mg融合蛋白，经切割后可以获得3.5mg左右的NT-proBNP-76(图11)。

实施例九  NT-proBNP-83特异免疫反应性鉴定

采用Roche公司NT-proBNP检测试剂盒测定其特异免疫反应性：稀释成合适的浓度后，将稀释后的蛋白1μl加入到299μl的人血清中，分别测定人血清和加了重组蛋白的人血清中NT-proBNP含量。

经Roche电化学发光免疫测定试剂测定其特异免疫反应性，结果如下(表2)。制备的四种NT-proBNP重组蛋白均具有较强的特异免疫反应活性，但切下的NT-proBNP-76和NT-proBNP-83免疫反应活性明显优于带有标签的NT-proBNP蛋白，原因可能为大分子量标签对NT-proBNP特异免疫反应活性的影响，而NT-proBNP-76可能由于存在降解的小片断使蛋白定量结果偏低。

表2：电化学发光免疫测定试剂测定重组NT-proBNP特异免疫反应性

(浓度单位：pg/ml)

测定样品	测定浓度	增加浓度	理论增加浓度	增加浓度/理论增加浓度(*100％)
					人血清+PBS	3122	0	0	0
人血清+Trx-NT-proBNP	8648	5526	7325	75％
					人血清+GST-NT-proBNP	9754	6632	9605	69％
人血清+NT-proBNP-83	28645	25523	27050	94％
					人血清+NT-proBNP-76	15467	12345	10800	114％

增加浓度＝测定浓度-人血清测定浓度；

理论增加浓度＝(融合蛋白分子量/NT-proBNP分子量)*蛋白纯度*蛋白浓度；

实施例十  NT-proBNP重组蛋白稳定性试验

将纯化的NT-proBNP重组蛋白用保存液(含BSA、抑肽酶aprotinin、EDTA和庆大霉素)稀释后等份分装，各种蛋白初始浓度相近。置于4℃保存，分别于1、3、7、9、11、15d后后用NT-proBNP电化学发光免疫测定试剂测定，计算免疫活性比率。测定结果如下(表3)。

表3：NT-proBNP重组蛋白稳定性试验

(浓度单位：pg/ml)

测定样品

1d

3d

7d

9d

11d

15d

保存液Trx-NT-proBNPNT-proBNP-83

＜5993512432

＜5988612366

＜5970312309

＜5945011792

＜5933311589

＜5915810795

NT-proBNP-76

8892

7663

6946

6402

5623

4709

结果表明：在相同的保存条件和测定条件下，Trx-NT-proBNP在4℃保存15天活性下降为7.8％；NT-proBNP-83下降了13.2％；而NT-proBNP-76下降了47.0％，Trx-NT-proBNP和NT-proBNP-83的稳定性明显优于NT-proBNP-76。由于NT-proBNP-83切除了标签蛋白，与天然存在的人NT-proBNP相比仅在N端多7个氨基酸，具有有相同或相近的结构，能被现在的NT-proBNP的检测试剂检测，故认为可以代替天然NT-proBNP多肽用于NT-proBNP免疫诊断试剂标准品。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>一种用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用

<130>8P99004-CN

<160>17

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>83

<212>PRT

<213>NT-proBNP重组蛋白氨基酸序列

<400>1

Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala

1                  5                      10                    15

Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln

             20                      25                     30

Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu

         35                      40                      45

Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala

     50                      55                      60

Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg

65                      70                     75               80

Ala Pro Arg

<210>2

<211>250

<212>DNA

<213>编码NT-proBNP重组蛋白的核苷酸序列

<400>2

cgcggatccc acccgctggg cagcccgggt agcgccagcg acctggaaac gagcggcctg     60

caggagcagc gcaaccatct gcagggcaaa ctgagcgagc tgcaggtgga gcagaccagc    120

ctggagccgc tgcaggagag cccgcgtccg accggtgtct ggaagagccg cgaggtggcc    180

accgagggca tccgtggcca ccgcaaaatg gtcctgtaca ccctgcgcgc accgcgctaa    240

cagctgcgga                                                           250

<210>3

<211>228

<212>DNA

<213>GENE BANK中获得的NT-proBNP编码序列

<400>3

cacccgctgg gcagccccgg ttcagcctcg gacttggaaa cgtccgggtt acaggagcag     60

cgcaaccatt tgcagggcaa actgtcggag ctgcaggtgg agcagacatc cctggagccc    120

ctccaggaga gcccccgtcc cacaggtgtc tggaagtccc gggaggtagc caccgagggc    180

atccgtgggc accgcaaaat ggtcctctac accctgcggg caccacga                 228

<210>4

<211>228

<212>DNA

<213>同义置换后的NT-proBNP编码序列

<400>4

cacccgctgg gcagcccggg tagcgccagc gacctggaaa cgagcggcct gcaggagcag     60

cgcaaccatc tgcagggcaa actgagcgag ctgcaggtgg agcagaccag cctggagccg    120

ctgcaggaga gcccgcgtcc gaccggtgtc tggaagagcc gcgaggtggc caccgagggc    180

atccgtggcc accgcaaaat ggtcctgtac accctgcgcg caccgcgc                 228

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>扩增NT-proBNP基因的上游引物

<400>5

cgcggatccc acccgctggg                                                 20

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>扩增NT-proBNP基因的上游引物

<400>6

ggatccgatg atgatgataa gcacccgctg gg                                   32

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>扩增NT-proBNP基因的下游引物

<400>7

aggcgtcgac ttagcgcggt gc                                              22

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>8

cacccgctgg gcagcccggg tagcgccagc gacctggaaa cg               42

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>9

ctgctcctgc aggccgctcg tttccaggtc gctggcgcta                  40

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>10

agcggcctgc aggagcagcg caaccatctg cagggcaaac tg               42

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>11

ccacctgcag ctcgctcagt ttgccctgca gatggttgcg                  40

<210>12

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>12

agcgagctgc aggtggagca gaccagcctg gagccgctgc                  40

<210>13

<211>47

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>13

accggtcgga cgcgggctct cctgcagcgg ctccaggctg gtctgct          47

<210>14

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>14

aggagagccc gcgtccgacc ggtgtctgga agagccgcga ggtgg        45

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>15

tggccacgga tgccctcggt ggccacctcg cggctcttcc agac         44

<210>16

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>16

ccaccgaggg catccgtggc caccgcaaaa tggtcctgta caccctgc     48

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列

<400>17

ttagcgcggt gcgcgcaggg tgtacaggac cattttgcgg              40

Claims (11)

1.一种NT-proBNP重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO：1。

2.一种编码权利要求1的NT-proBNP重组蛋白的基因，其特征在于所述重组蛋白的基因序列为SEQ ID NO：2。

3.一种权利要求1的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1)根据GENEBANK中提供的BNP编码序列，获得NT-proBNP的编码序列SEQ ID NO：3，将编码序列SEQ ID NO：3同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列SEQ ID NO：4，将编码序列SEQ ID NO：4合成，设计上游引物SEQID NO：5和下游引物SEQ ID NO：7；

2)取引物片段SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：17，进行NT-proBNP基因的克隆，获得NT-proBNP基因；

3)NT-proBNP基因与载体连接，构建NT-proBNP重组质粒，获得NT-proBNP重组质粒；

4)NT-proBNP重组质粒转化大肠杆菌，进行NT-proBNP重组蛋白的表达，获得NT-proBNP重组蛋白；

5)NT-proBNP重组蛋白的可溶性鉴定；

6)NT-proBNP重组蛋白的纯化；

7)NT-proBNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定；

8)NT-proBNP重组蛋白的活性鉴定。

4.根据权利要求3所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤1)包括：将编码序列SEQ ID NO：3中第41、54、69、73、76位氨基酸同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，根据改造后的基因序列设计N端引物和C端引物。

5.根据权利要求4所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

6.根据权利要求4所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于所述的N端引物为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于所述的C端引物为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求3所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤2)还包括采用核心模板法，进行基因拼接PCR扩增所述的NT-proBNP基因。

9.根据权利要求3所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤3)中使用的载体包括pET32a或pET42a。

10.根据权利要求3所述的NT-proBNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤6)包括以下步骤：

①将含目的NT-proBNP重组蛋白的破菌上清用快流速琼脂糖凝胶初纯化，采用连续洗脱并收集目的NT-proBNP重组蛋白蛋白峰；

②初纯化的NT-proBNP重组蛋白用快流速组氨酸标签亲和层析柱再次纯化，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱收集后者；

③用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50mM Tris-HCl，pH 8.0；

④脱盐后NT-proBNP重组蛋白内加入带有His标签的重组EK酶，重组EK酶与NT-proBNP重组蛋白量比为1∶1000，置于4℃低速摇床24-48小时；

⑤再次用快流速组氨酸标签亲和层析柱纯化及去除重组EK酶，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱，40mM洗下蛋白即为所需NT-proBNP重组蛋白。

11.权利要求1所述的NT-proBNP重组蛋白在制备NT-proBNP检测试剂盒中的应用。

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