CN111848775B - 一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NT‑proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法，所述保存液以质量分数计包括5％～20％胎牛血清、1％～5％PVP10000、1％～10％乙二醇、1％～3％普鲁兰多糖、0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽、0.1％～1％BSA、0.02％～0.06％防腐剂、pH7～8的PBS缓冲液。该保存液使得NT‑proBNP重组蛋白生物活性能在37℃稳定7天，2～8℃稳定100天，‑20℃稳定150天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法。
背景技术
1988年，日本学者首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为脑钠肽或称钠尿肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)。当心肌细胞受刺激后，会产生含134个氨基酸的B型利钠肽原前体(pre-proBNP)，随后在相关酶的作用下切掉N端的信号肽序列，形成含108个氨基酸的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N端产物--N末端B型脑利钠肽前体(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的C端产物--B型利钠肽(BNP)。美国在2004年和2008年分别发表了BNP临床应用专家共识和国际NT-proBNP专家共识，系统阐述了BNP和NT-proBNP的生物学和临床应用，已经被各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断和评估十分有用的生物标志物。
但BNP半衰期短(22min)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期相对较长(120min)，体外稳定性相对更强，在心力衰竭患者中的浓度也较BNP高，在有些情况下更有利于心力衰竭的诊断。天然的NT-proBNP具有76个氨基酸，分子量小，原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，其稳定性较天然蛋白更差。因此，NT-proBNP试剂盒开发和使用过程中，对校准品的稳定性要求较高。
因此，如何开发一种稳定保护NT-proBNP，防止其发生降解的稀释液，使得NT-proBNP重组蛋白的保存时间长，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法，可延长NT-proBNP重组蛋白的保存时间，该保存液使得NT-proBNP重组蛋白生物活性能在37℃稳定7天，2～8℃稳定100天，-20℃稳定150天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。
为了实现上述目的，本发明提供了一种NT-proBNP重组蛋白的保存液，所述保存液以质量分数计包括5％～20％胎牛血清、1％～5％PVP10000、1％～10％乙二醇、1％～3％普鲁兰多糖、0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽、0.1％～1％BSA、0.02％～0.06％防腐剂、pH7～8的PBS缓冲液。
进一步地，所述BSA的质量分数为0.1％。
进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
进一步地，所述普鲁兰多糖的质量分数为2％。
进一步地，所述保存液以质量分数计包括5％胎牛血清、2.5％PVP10000、5％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.25％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
进一步地，所述保存液以质量分数计包括5％胎牛血清、5％PVP10000、5％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.1％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
进一步地，述保存液以质量分数计包括10％胎牛血清、5％PVP10000、1％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.5％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
进一步地，所述防腐剂包括Proclin300、叠氮钠中的至少一种。
进一步地，所述保存液还包括摩尔浓度为100mM～200mM盐类，所述盐类为NaCl。本发明还提供了一种NT-proBNP重组蛋白的保存液的制备方法，采用所述的配方配制而得。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种NT-proBNP重组蛋白的保存液，在pH7～8的PBS缓冲液体系下，添加1％～5％PVP10000防冻剂，0.02％～0.06％防腐剂，1％～10％乙二醇+1％～3％普鲁兰多糖+0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽+0.1％～1％BSA起到协同增效的作用，稳定保护NT-proBNP重组蛋白，防止其发生降解，其中，1％～10％乙二醇保持蛋白表面的水分，1％～3％普鲁兰多糖可以防止氧化，0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽可以对抗氧化剂对蛋白巯基的破坏。该保存液使得NT-proBNP重组蛋白生物活性能在37℃稳定7天，2～8℃稳定100天，-20℃稳定150天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种NT-proBNP重组蛋白的保存液，所述保存液以质量分数计包括5％～20％胎牛血清、1％～5％PVP10000、1％～10％乙二醇、1％～3％普鲁兰多糖、0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽、0.1％～1％BSA、0.02％～0.06％防腐剂、pH7～8的PBS缓冲液。
本发明经过试验发现，在pH7～8的PBS缓冲液体系下，添加1％～5％PVP10000低温保存剂，0.02％～0.06％防腐剂，1％～10％乙二醇+1％～3％普鲁兰多糖+0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽+0.1％～1％BSA起到协同增效的作用，稳定保护NT-proBNP重组蛋白，防止其发生降解，其中，1％～10％乙二醇能保持蛋白表面的水分，1％～3％普鲁兰多糖可以防止氧化，0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽能保护蛋白的巯基不被破坏。该保存液使得NT-proBNP重组蛋白生物活性能在37℃稳定7天，2～8℃稳定100天，-20℃稳定150天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。
若所述乙二醇的质量分数小于1％，对蛋白起不到稳定保护效果；若大于5％，对浓度测值大小有影响
若所述普鲁兰多糖的质量分数小于1％，对蛋白起不到稳定保护效果；若大于3％，溶液粘度增大，测试精密度(CV)变差。
若所述还原型谷胱甘肽的质量分数小于0.1％，对蛋白起不到稳定保护效果；若大于0.5％，不利于稳定性
若所述BSA的质量分数小于0.1％，对蛋白起不到稳定保护效果；若大于1％，在37℃保存条件下稳定性变差。
表明1％～10％乙二醇+1％～3％普鲁兰多糖+0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽+0.1％～1％BSA能起到最佳的协同增效作用，任何一种组分过大或过小均不利于起到协同增效的作用，来稳定保护NT-proBNP重组蛋白，防止其发生降解。
作为一种可选的实施方式，所述BSA的质量分数为0.1％。
作为一种可选的实施方式，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
作为一种可选的实施方式，所述普鲁兰多糖的质量分数为2％。
作为一种优选的实施方式，经试验发现以下3种配方的保存液，保存时间更长。
配方1：所述保存液以质量分数计包括5％胎牛血清、2.5％PVP10000、5％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.25％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
配方2：所述保存液以质量分数计包括5％胎牛血清、5％PVP10000、5％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.1％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
配方3：所述保存液以质量分数计包括10％胎牛血清、5％PVP10000、1％乙二醇、2％普鲁兰多糖、0.5％还原型谷胱甘肽、0.1％BSA、0.05％防腐剂、pH7.4的PBS缓冲液。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种NT-proBNP重组蛋白的保存液的制备方法，采用所述的配方配制而得。
本发明的一种NT-proBNP重组蛋白的保存液的使用方法为：
将NT-proBNP重组蛋白以浓度为1900-2000pg/mL的范围加入NT-proBNP重组蛋白的保存液中。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的NT-proBNP重组蛋白的保存液进行详细说明。
各实施例与对比例的配方如表1所示。
表1
试验例
使用各实施例和各对比例的NT-proBNP重组蛋白的保存液进行性能评价：
1、NT-proBNP重组蛋白37℃储存7天稳定性
NT-proBNP重组蛋白用各实施例和对比例的稀释液稀释后，在37℃储存，分别在第1、3、5、7天测试，每组测试重复3次求平均值、SD、CV，与第0天比较，计算浓度降幅，进行显著性分析，若P≥0.05，视为稳定，P＜0.05视为不稳定。
表2-NT-proBNP重组蛋白用25种稀释液稀释后在37℃7天稳定性
如表2所示，在37℃储存7天，胎牛血清含量达5％(实施例1、2、3、10、11、12)时，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；胎牛血清含量达10％(实施例4、5、6、13、14、15)时，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；胎牛血清含量达20％(实施例7、8、9)时，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天。整体上来说，胎牛血清浓度对37℃稳定性有影响，5％-20％的胎牛血清在浓度较低时稳定性更好。
实施例2加0.1％BSA，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天，相同条件下，对比例7未加0.1％BSA，P＜0.05，说明在37℃不能稳定7天。BSA对37℃稳定性有影响，添加0.1％BSA时稳定性更好。
pH7.4(实施例15)时，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；相同条件下，pH7.0(实施例16)、pH8.0(实施例17)时P≥0.05，说明在37℃能稳定7天，pH6.5(对比例8)时P＜0.05，说明在37℃不能稳定7天，pH对37℃稳定性有影响，超过pH7.0-8.0稳定性不好，pH7.0-8.0范围内，pH7.4时稳定性更好。
实施例2添加2％普鲁兰多糖，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；相同条件下，对比例1添加普鲁兰多糖浓度0.5％，对比例5不加普鲁兰多糖，P＜0.05，说明在37℃不能稳定7天；普鲁兰多糖对37℃稳定性有影响，添加2％时稳定性更好。
实施例2添加5％乙二醇，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；相同条件下，对比例2添加0.1％乙二醇，对比例4不加乙二醇，P＜0.05，说明在37℃不能稳定7天；乙二醇对37℃稳定性有影响，添加5％时稳定性更好。
当普鲁兰多糖浓度为3％时(实施例3、5、9、10、13、)，5％＜CV＜10％；普鲁兰多糖浓度为1％，同时乙二醇浓度为1％时(实施例1、7)CV＜5％，1％-3％的普鲁兰糖和1％-10％的乙二醇对稳定性有帮助，但是浓度越高，CV越差。乙二醇浓度为10％时(实施例3、6、8、10、14)测得浓度值也相对其他实施例低。适当浓度的普鲁兰多糖和乙二醇对稳定性有帮助同时CV也较好。
实施例2添加0.25％还原型谷胱甘肽，P≥0.05，说明在37℃能稳定7天；相同条件下，对比例3添加1％还原型谷胱甘肽，P＜0.05，说明在37℃不能稳定7天。0.25％还原型谷胱甘肽37℃稳定性更好，1％还原型谷胱甘肽不利于稳定。
2、NT-proBNP重组蛋白2-8℃储存100天稳定性
NT-proBNP重组蛋白用各实施例和对比例的的稀释液稀释后，在2-8℃储存，分别在第7、14、28、60、100天测试每组测试重复3次求平均值、SD、CV，与第0天比较，计算浓度降幅，进行显著性分析，若P≥0.05，视为稳定，P＜0.05视为不稳定。
表3-NT-proBNP重组蛋白用19种稀释液稀释后4℃100天稳定性
如表3所示，在4℃储存100天，实施例1-15稀释液均CV＜10％，P≥0.05，降幅＜5％，都能使NT-proBNP重组蛋白在2-8℃稳定100天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。
3、NT-proBNP重组蛋白-20℃储存150天稳定性
NT-proBNP重组蛋白用各实施例和对比例的稀释液稀释后，在-20℃储存，分别在第14、28、60、120、150天测试；每组测试重复3次求平均值、SD、CV，与第0天比较计算浓度降幅，并进行显著性分析，若P≥0.05视为稳定，P＜0.05视为不稳定。
表4-NT-proBNP重组蛋白用19种稀释液稀释后-20℃150天稳定性
由表2-表4的数据可知：
对比例1中，普鲁兰多糖为0.5％，不在本发明的1％～3％范围内，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例2中，乙二醇为0.1％，不在本发明的1％～10％范围内，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例3中，还原型谷胱甘肽为1％，不在本发明的0.1％～0.5％范围内，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例4中，不含乙二醇，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例5中，不含普鲁兰多糖，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例6中，不含还原型谷胱甘肽，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例7中，不含BSA，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
对比例8中，pH6.5，其余均同实施例2，表2中P＜0.05，在37℃不能稳定7天；表3中P＜0.05，2-8℃不能稳定100天，表4中P＜0.05，-20℃不能稳定150天；
实施例1-6，10-15的保存液都能使得NT-proBNP重组蛋白生物活性能在37℃稳定7天，2～8℃稳定100天，-20℃稳定150天，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。其中，实施例2、实施例12和实施例15的效果最佳。
表2-表4的数据表明，1％～10％乙二醇+1％～3％普鲁兰多糖+0.1％～0.5％还原型谷胱甘肽+0.1％～1％BSA、pH7.4同时满足要求时，才能达到延长保存时间的作用。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.一种NT-proBNP重组蛋白的保存液，其特征在于，所述保存液以质量分数计由5%胎牛血清、2.5%PVP10000、5%乙二醇、2%普鲁兰多糖、0.25%还原型谷胱甘肽、0.1%BSA、0.05%防腐剂和pH7.4的PBS缓冲液组成；或由5%胎牛血清、5%PVP10000、5%乙二醇、2%普鲁兰多糖、0.1%还原型谷胱甘肽、0.1%BSA、0.05%防腐剂和pH7.4的PBS缓冲液组成；或由10%胎牛血清、5%PVP10000、1%乙二醇、2%普鲁兰多糖、0.5%还原型谷胱甘肽、0.1%BSA、0.05%防腐剂和pH7.4的PBS缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种NT-proBNP重组蛋白的保存液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin300。
3.一种NT-proBNP重组蛋白的保存液的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一所述的NT-proBNP重组蛋白的保存液的配方配制而得。
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