PL211502B1 - Sposób obniżania zawartości zanieczyszczenia oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036 - Google Patents
Sposób obniżania zawartości zanieczyszczenia oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036Info
- Publication number
- PL211502B1 PL211502B1 PL374917A PL37491703A PL211502B1 PL 211502 B1 PL211502 B1 PL 211502B1 PL 374917 A PL374917 A PL 374917A PL 37491703 A PL37491703 A PL 37491703A PL 211502 B1 PL211502 B1 PL 211502B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- buffer solution
- growth hormone
- protein
- phe
- chelating agent
- Prior art date
Links
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title abstract description 74
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title abstract description 74
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title abstract description 60
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 88
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 78
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 47
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 33
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 33
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 30
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 29
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 12
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 11
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 8
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 6
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 5
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 5
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 50
- 108700037519 pegvisomant Proteins 0.000 abstract description 27
- 229960002995 pegvisomant Drugs 0.000 abstract description 25
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 108700030081 B 2036 Proteins 0.000 description 182
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 87
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 87
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 84
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 52
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 52
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 48
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 27
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 26
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 26
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 26
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 26
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 26
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 23
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 23
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 22
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 19
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 8
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 7
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 4
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 3
- SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-J EDTA monocalcium diisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Ca+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 229940103526 Growth hormone receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 229940124013 Growth hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 3
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000001201 calcium disodium ethylene diamine tetra-acetate Substances 0.000 description 3
- 235000011188 calcium disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- GWQWBFBJCRDINE-UHFFFAOYSA-M sodium;carbamodithioate Chemical compound [Na+].NC([S-])=S GWQWBFBJCRDINE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 3
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 2
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N Cys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K EDTA trisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N Glu-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 2
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 101710099093 Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N Leu-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N Tyr-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N Val-Glu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YFWTXMRJJDNTLM-LSJOCFKGSA-N Arg-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N YFWTXMRJJDNTLM-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- 229940123502 Hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102220587327 NEDD8-activating enzyme E1 catalytic subunit_H21N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- 229910007426 ZnC2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L calcium sulfite Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])=O GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- AYFCVLSUPGCQKD-UHFFFAOYSA-I calcium;trisodium;2-[bis[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl]amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Ca+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(=O)[O-])CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O AYFCVLSUPGCQKD-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003689 hormone receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L magnesium;sulfite Chemical compound [Mg+2].[O-]S([O-])=O JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940099077 somavert Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 description 1
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
- A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Wynalazek dotyczy sposobu obniżania zawartości zanieczyszczenia oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036.
Pegwisomant (Somavert®, Pharmacia Corp.) jest antagonistą receptora ludzkiego hormonu wzrostu. Jest on analogiem ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), który został zmieniony strukturalnie. Sekwencja aminokwasów białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu różni się od sekwencji aminokwasów w hGH w dziewięciu miejscach. Określone podstawienia aminokwasów są następujące: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S i I179T. W dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, powszechnie przyjmuje się, że pierwszy symbol (tj. H18D) oznacza aminokwas w sekwencji hGH w tym miejscu numerowanym (tj. w 18. miejscu aminokwasu, jak na to wskazuje symbol H18D), który jest podstawiony aminokwasem oznaczonym drugim symbolem (tj. H18D). H18D oznacza więc podstawienie aminokwasu his aminokwasem asp w 18. miejscu aminokwasowym naturalnej sekwencji aminokwasów w hGH.
Na fig. 1A przedstawiono schematycznie strukturę sekwencji aminokwasów białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu (PEG B-2036) z gwiazdkami wskazującymi możliwe miejsca przyłączenia polimeru glikolu polietylenowego (jednostki PEG). Ponadto sekwencję aminokwasów opisującą białkowy składnik/produkt pośredni (B-2036 bez przyłączenia jednostek PEG) pegwisomantu identyfikuje się tu jako SEK ID NR 1. Dla porównania sekwencję aminokwasów opisującą ludzki hrmon wzrostu identyfikuje się tu jako SEK ID NR 2. Tutaj podaje się obydwa opisy sekwencji. Zobacz również Jorgensen i in. „Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hyrophbic conditions, J. Chromatography A 817, 205-214 (1998) dla sekwencji hGH.
Srukturalnie pegwisomant jest białkiem (zawierającym 191 reszt aminokwasowych), z którym związane są kowalencyjnie jednostki PEG w liczbie od 4 do 6. Masa cząsteczkowa białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu wynosi 21998 daltonów. Masa cząsteczkowa każdej jednostki PEG pegwisomantu wynosi około 5000 daltonów. Wskutek tego masy cząsteczkowe pegwisomantu wynoszą najczęściej około 42000 (4 jednostki PEG w cząsteczce), 47000 (5 jednostek PEG w cząsteczce) i 52000 (6 jednostek PEG w cząsteczce) daltonów.
W odniesieniu do antagonisty, nie wiążąc się z teorią, uważa się, że endogenny hGH aktywuje swoje receptory wówczas, gdy pojedyncza cząsteczka hGH wiąże się z dwiema sąsiadującymi z nią (i jednakowymi) cząsteczkami receptorów, powodując homodimeryzację receptorów za pośrednictwem hormonu. Zobacz opisy patentowe USA nr nr 5849535 oraz 6057292. Aktywność hGH zależy od jego zdolności do wiązania dwóch sąsiadujących z nim (i jednakowych) receptorów w dwóch osobnych miejscach (miejscu 1 i miejscu 2) w tej samej cząsteczce hGH. Te miejsca wiązania hGH, oznaczone jako miejsce 1 i miejsce 2, otrzymują numer 1 i 2 po to, aby odzwierciedlić kolejność ich wiązań z dwoma są siednimi (i jednakowymi) receptorami hGH, które poś redniczą w homodimeryzacji zależ nej od hGH.
Ponadto uważa się, nie wiążąc się z teorią, że pegwisomant selektywnie wiąże receptory ludzkich hormonów wzrostu (receptory GH) z powierzchniami komórek, gdzie blokuje on wiązanie endogennego ludzkiego hormonu wzrostu, przeszkadzając w ten sposób transdukcji sygnału ludzkiego hormonu wzrostu. Strukturalne modyfikacje części białkowej (zwanej również „składnikiem lub „produktem pośrednim) pegwisomantu (w odniesieniu do hGH) umożliwiają pegwisomantowi całkowite blokowanie oddziaływania między cząsteczką hGH i receptorem hGH. Pegwisomant wiąże receptor GH, blokując w ten sposób wiązanie GH, ponieważ receptor jest zajmowany. Te strukturalne modyfikacje zapobiegają dimeryzacji receptorów i dzięki temu nie następuje transdukcja sygnału. Przez takie blokowanie bliskiego oddziaływania między cząsteczką hGH i receptorem hGH pegwisomant blokuje homodimeryzację receptorów hGH odbywającą się za pośrednictwem hGH, przez co pegwisomant wykazuje działanie antagonistyczne.
Tego antagonistę stosuje się do leczenia stanów obejmujących (ale nie ograniczających się do tego) akromegalię u chorych, którzy nieodpowiednio reagują na zabiegi chirurgiczne, radioterapię i/lub inne konwencjonalne metody leczenia, albo którzy nie mogą w inny sposób tolerować tych metod leczenia. Ponadto strukturalne modyfikacje białkowej części (B-2036) pegwisomantu powodują, że wykazuje on skłonność do wiązania receptora prolaktyny, która jest mniejsza niż w przypadku hGH, minimalizując w ten sposób niepożądane skutki uboczne odnoszące się do laktacji, związane ze stosowaniem pegwisomantu.
PL 211 502 B1
Białkowy produkt pośredni (B-2036) pegwisomantu syntezuje się z użyciem szczepu bakterii Escherichia coli zmodyfikowanego genetycznie przez dodanie plazmidu, który to szczep dostarcza gen do antagonisty receptora hormonu wzrostu (B-2036). Następnie B-2036 odzyskuje się z komórek bakteryjnych i oczyszcza. Potem oczyszczony B-2036 jest polietylenoglikolowany w celu wytworzenia pegwisomantu (PEG B-2036). Opisy patentowe USA 5849535 oraz 6057292 ujawniają sposoby wytwarzania B-2036 i sposoby sprzęgania jednej lub większej liczby jednostek PEG z B-2036, aczkolwiek bez szczegółów o tym, jak obniżać, zmniejszać, eliminować, odwracać i/lub uniemożliwiać powstawanie w nim niedopuszczalnie wysokich poziomów zanieczyszczeń izoformami trisiarczkowymi i des-phe.
Jednym z problemów, napotykanych podczas konwencjonalnych rekombinacyjnych sposobów wytwarzania B-2036, jest powstawanie zanieczyszczeń izoformami, takich jak izoformy des-phe i trisiarczkowe. Zanieczyszczenie izoformą des-phe jest to zanieczyszczenie, w którym cząsteczka B-2036 jest pozbawiona aminowej reszty fenyloanalinowej. Zobacz fig. 1A, na której przedstawiono tę aminową resztę z resztą fenyloalaninową (tj. oznaczoną literą „F), sąsiadującą z zakończeniem -NH2 w B-2036. Zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową jest to zanieczyszczenie, w którym cząsteczka B-2036 zawiera dodatkowy atom siarki, który tworzy „trisiarczkowy mostek w tej cząsteczce. Zobacz wstawkę na fig. 1B. Zobacz również: Andersson i in., „Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinat human growth hormone formed during expression in Escherichia coli, Int. J. Peptide Protein Res., 47, 311-321 (1996), oraz A. Jesperson i in., Characterization of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli, Eur. J. Blochem., 219, 365-373 (1994). Nie wiążąc się z teorią uważa się, że te zanieczyszczenia izoformami powstają najczęściej podczas wzrostu komórek (np. fermentacji) oraz ekspresji (syntezy i wydzielania) B-2036 w genetycznie modyfikowanych komórkach gospodarzach i/lub podczas wydzielania i oczyszczania białka B-2036.
Biorąc pod uwagę określone zanieczyszczenia, międzynarodowe zgłoszenie WO 94/24157 (opublikowane 27 października 1994) ujawnia hydrofobową pochodną hGH, zawierającą dodatkowy atom siarki w porównaniu z naturalnym hGH. Zobacz WO 94/24157 na stronie 3, wiersze 3-10. Dodatkowy atom siarki hydrofobowej pochodnej hGH tworzy „trisiarczkowy mostek, dając trisiarczkową odmianę hGH. Zobacz WO 94/24157 na stronie 7, wiersze 11-16. Źródło literaturowe WO 94/24157 stwierdza ponadto, że tę trisiarczkową odmianę liGH można z powrotem przekształcić w jego naturalną postać hGH przez poddanie tej trisiarczkowej odmiany hGH działaniu związku zawierającego grupę merkaptanową, takiego jak cysteina, glutation, 2-merkaptoetanol lub ditiotreitol. Zobacz WO 94/24157 na stronach 4 i 5.
Międzynarodowe zgłoszenie WO 96/02570 (opublikowane 1 lutego 1996) ujawnia inny sposób przekształcenia trisiarczkowej odmiany hGH z powrotem w jego naturalną postać z zastosowaniem albo siarczynu sodu, siarczynu potasu, siarczynu amonu, albo siarczynu metalu ziem alkalicznych, takiego jak siarczyn magnezu lub siarczyn wapnia. Zobacz WO 94/24157 na stronie 4, wiersze 17-21.
Międzynarodowe zgłoszenie WO 00/02900 (opublikowane 20 stycznia 2000), zatytułowane „Method for the production of recombinant peptides with a Iow amount of trisulfides omawia „sposób obniżania zawartości trisiarczków podczas wytwarzania rekombinacyjnych peptydów, np. białek i mniejszych peptydów. Wynalazek polega na nowym i nieoczekiwanym odkryciu, ż e zawartość trisiarczków podczas wytwarzania rekombinacyjnych peptydów można obniżyć przez dodanie soli metalu, korzystnie w nadmiarze, już podczas albo po fermentacji, a nie, jak wcześniej sugerowano, przez przemianę wytworzonych trisiarczków hormonu wzrostu w postać naturalną. Zobacz WO 00/02900 na stronie 2, wiersze 21-27. Źródło literaturowe WO 00/02900 stwierdza ponadto, że „białkiem może być dowolne białko rekombinacyjne, ale korzystnie jest rekombinacyjnym hormonem wzrostu, który może być zarówno ludzki, jak i zwierzęcy, taki jak ludzki hormon wzrostu (hGH), wołowy hormon wzrostu (bGH) i świński hormon wzrostu (pGH). Zobacz WO 00/02900 na stronie 3, wiersze 4-6.
Międzynarodowe zgłoszenie nr WO 02/057478 (opublikowane 25 lipca 2002), zatytułowane „Methods and Composition for Extracting Proteins from Cells, dotyczy sposobu uwalniania białka z komórki gospodarza przez kontaktowanie tej komórki gospodarza ze ś rodkiem redukującym i detergentem. To źródło literaturowe stwierdza, że celem tego środka redukującego jest „ułatwienie odzysku białek w ich naturalnych konformacjach. Zobacz WO 02/057478 na stronie 2, wiersze 16-18. Ponadto WO 02/057478 podaje, że „jeden lub większa liczba środków redukujących oznacza środki..., które redukują wiązania disiarczkowe i/lub utrzymują reszty tiolowe w zredukowanej postaci. Można stosować dowolny taki środek redukujący lub dowolne takie środki redukujące. W korzystnej realizacji jeden
PL 211 502 B1 lub większą liczbę stosowanych środków redukujących wybiera się z grupy, obejmującej ditiotreitol (DTT), ditioerytrytol (DTE), cysteinę (Cys) i tris-2-karboksyetylofosfinę (TCEP) (dodano podkreślenie).
Zobacz WO 02/057478 od strony 3, wiersz 24, do strony 4, wiersz 4.
Podane wyżej źródła literaturowe nie mówią jednak nic odnośnie zapobiegania, odwracania, zmniejszania lub eliminacji powstawania zanieczyszczeń izoformami, związanych z antagonistą hormonu wzrostu, takim jak pegwisomant lub jego część białkowa, B-2036. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na ulepszone sposoby wytwarzania B-2036, które obniżają, osłabiają, uniemożliwiają, minimalizują, odwracają i/lub eliminują powstawanie jego zanieczyszczeń izoformami (trisiarczkowymi i/lub des-phe). Te źródła literaturowe nie mówią także nic w sprawie wykrywania, osłabiania, minimalizacji, odwracania, zmniejszania lub eliminacji powstawania zanieczyszczeń izoformą des-phe hormonu wzrostu. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na ulepszone sposoby wytwarzania hormonu wzrostu, które obniżają, osłabiają, uniemożliwiają, minimalizują, odwracają i/lub eliminują powstawanie w nim zanieczyszczenia izoformą des-phe.
Opis rysunków
Na fig. 1A przedstawiono sekwencję aminokwasów w B-2036, która odpowiada SEK ID NR 1. Gwiazdki na fig. 1A (*) wskazują dziewięć (9) możliwych miejsc kowalencyjnego przyłączenia jednostek PEG do każdej cząsteczki B-2036. Należy zauważyć, że wprawdzie zidentyfikowano dziewięć (9) możliwych miejsc, ale nie wszystkie 9 miejsc muszą być kowalencyjnie związane z jednostkami PEG. Korzystnie występuje 4-6 jednostek PEG na cząsteczkę B-2036.
Na fig. 1B przedstawiono strukturę zanieczyszczenia B-2036 - izoformy trisiarczkowej (oznaczonej jako „Trisiarczkowy (+32 amu)) w porównaniu z jego pożądaną postacią (oznaczoną jako „Natywny GHA).
Zgodnie z wynalazkiem sposób obniżania zawartości zanieczyszczenia, oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036 z SEK ID NR1, będącego antagonistą hormonu wzrostu, w genetycznie modyfikowanych komórkach gospodarzach zawierających składnik komórkowy (składniki komórkowe), charakteryzuje się tym, że zawiera etap (a), w którym kontaktuje się czynnik chelatujący z pastą komórkową albo lizatem pasty komórkowej zawierającymi (1) zanieczyszczenie, (2) polipeptyd będący antagonistą hormonu wzrostu, (3) składnik komórkowy (składniki komórkowe) i (4) ich mieszaniny i obniża się zawartość zanieczyszczenia, przy czym stosuje się molowy stosunek czynnika chelatującego do liczby moli polipeptydu będącego antagonistą hormonu wzrostu wynoszący od 20 do 1000, a temperaturę utrzymuje się w zakresie od 0°C do 35°C. Korzystnie w dodatkowym etapie (b) polipeptyd będący antagonistą hormonu wzrostu poddaje się oczyszczaniu, a oczyszczony polipeptyd poddaje się dalej polietylenoglikolowaniu w dodatkowym etapie (c).
Według wynalazku czynnik chelatujący wybiera się korzystnie z grupy obejmującej EDTA, EGTA i DTPA, przy czym szczególnie korzystnie czynnik chelatujący oznacza EDTA.
W sposobie według wynalazku czynnik chelatujący korzystnie umieszcza się w roztworze buforowym, przy czym stosuje się początkowe stężenie EDTA wynoszące od 2 mM do 10 mM.
Jako roztwór buforowy stosuje się korzystnie roztwór wybrany z grupy obejmującej roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny, a zwłaszcza roztwór Tris, przy czym szczególnie korzystnie stosuje się roztwór buforowy wykazujący początkowe stężenie Tris od 1 mM do 200 mM. Po etapie kontaktowania (a) w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się roztwór buforowy mający pH od 6 do 9.
Temperaturę w sposobie według wynalazku utrzymuje się korzystnie w zakresie 2°C do 15°C.
W sposobie według wynalazku po etapie (b) oczyszczania wprowadza się korzystnie dalej etap (b') kontaktowania zanieczyszczenia ze związkiem zawierającym grupę merkaptanową w nieobecności środka chelatującego z tym, że związek zawierający grupę merkaptanową wybiera się z grupy obejmującej siarczyny, glutation, beta-merkaptoetanol, ditiotreitol, merkaptoetyloaminę, ditioerytrytol, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny, cysteinę oraz cysteinę w mieszaninie z cystyną, przy czym związek zawierający grupę merkaptanową oznacza szczególnie korzystnie cysteinę lub mieszaninę cysteiny i cystyny.
Związek zawierający grupę merkaptanową jest dostarczany w drugim roztworze buforowym, korzystnie wybranym z grupy obejmującej roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego,
PL 211 502 B1 trietyloaminy i histydyny, przy czym szczególnie korzystnie jako drugi roztwór buforowy stosuje się roztwór Tris, a zwłaszcza stosuje się roztwór buforowy wykazujący początkowe stężenie Tris od 1 mM do 200 mM.
W przypadku kontaktowania w etapie (b') zanieczyszczenia z mieszaniną cysteiny i cystyny stosuje się początkowe stężenie mieszaniny cysteiny i cystyny wynoszące od 1 mM do 5 mM.
Pojęcia „antagonista hormonu wzrostu i „antagonista receptora hormonu wzrostu obejmują (ale nie ograniczają się do nich) polipeptydy, które powstrzymują lub w inny sposób przeciwdziałają wiązaniu hormonu wzrostu z jego receptorem hormonu wzrostu w celu zablokowania biologicznego skutku (biologicznych skutków) działania hormonu wzrostu. Korzystnie „antagonista hormonu wzrostu lub „antagonista receptora hormonu wzrostu oznacza B-2036 lub jego odmianę. Takie „odmiany obejmują (ale nie ograniczają się do nich) jego homologi (zwłaszcza homologi z zachowawczymi podstawieniami aminokwasowymi, dodatkami lub delecjami, pokrewne B-2036), analogi, fragmenty, pseudopeptydy, przeciwciała itd. (odpowiednio), wykazujące działanie antagonisty receptora hormonu wzrostu.
Pojęcia „agonista hormonu wzrostu i „agonista receptora hormonu wzrostu obejmują (ale nie ograniczają się do nich) polipeptydy, które wiążą i aktywują receptor hormonu wzrostu. Korzystnie „agonista hormonu wzrostu lub „agonista receptora hormonu wzrostu oznacza ludzki hormon wzrostu lub jego odmianę. Takie „odmiany obejmują (ale nie ograniczają się do nich) homologi (zwłaszcza homologi z zachowawczymi podstawieniami aminokwasowymi, dodatkami lub delecjami, pokrewne ludzkiemu hormonowi wzrostu), analogi, fragmenty, pseudopeptydy, przeciwciała itd. (odpowiednio), wykazujące działanie agonisty receptora hormonu wzrostu.
Pojęcie „hormon wzrostu i jego antagonista oznacza agonistę hormonu wzrostu (tj. „hormon wzrostu) oraz antagonistę hormonu wzrostu (tj. „i jego antagonista).
Pojęcie „i może oznaczać „i albo „lub, jeśli to potrzebne lub konieczne dla zrelacjonowania sposobu w celu uzyskania żądanego obniżenia poziomu istotnego zanieczyszczenia (np. zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową lub des-phe).
Pojęcie „lub może oznaczać „i albo „lub, jeśli to potrzebne lub konieczne dla zrelacjonowania sposobu w celu uzyskania żądanego obniżenia poziomu istotnego zanieczyszczenia (np. zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową lub des-phe).
Stosowane tu pojęcie „obniżenia (lub jego oczywiste odmiany), jeśli nie wskazano inaczej, oznacza eliminację, minimalizację, zmniejszenie, zapobieganie i/lub osłabianie ilości istotnego zanieczyszczenia izoformą, zarówno zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, jak i zanieczyszczenia izoformą des-phe.
Jeśli nie wskazano inaczej, to pojęcie „komórka gospodarz (lub jego oczywiste odmiany) oznacza dowolną komórkę gospodarza, w której można rekombinacyjnie wytworzyć B-2036 lub hGH. Zgodnie z tym komórka gospodarz może oznaczać komórkę gospodarza ssaka, komórkę gospodarza roślinną albo komórkę gospodarza bakteryjną, taką jak Escherichia coli, a nawet komórki drożdży. Należy wziąć pod uwagę, aby komórka gospodarz była wystarczająca dla wzrostu w niej żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH. W związku z tym nie ma ograniczeń, jaka to może być komórka, z wyjątkiem tego, aby była ona zdolna do rekombinacyjnego wytwarzania białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH, będących przedmiotem zainteresowania, albo ich „odmian.
Ponadto używane tutaj pojęcie „wzrost (lub jego oczywiste odmiany), jeśli nie wskazano inaczej, obejmuje (ale nie ogranicza się do tego) fermentację i hodowlę, albo inne sposoby powodujące, że komórka gospodarz (komórki gospodarze) rozrasta się dostatecznie do wytwarzania żądanych ilości rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH.
Wprawdzie niniejszy wynalazek opisuje się w odniesieniu do rekombinacyjnego B-2036 i rekombinacyjnego PEG B-2036, ale jeśli nie wskazano inaczej, to jest rzeczą zrozumiałą, że ten wynalazek można stosować w odniesieniu do dowolnego rekombinacyjnego agonisty hormonu wzrostu i rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu, niezależ nie od tego, czy jest to hormon wzrostu ssaka lub jego antagonista, ludzki hormon wzrostu lub jego antagonista, czy też wołowy hormon wzrostu lub jego antagonista itd.
Pegwisomant (PEG B-2036) jest polietylenoglikolowaną postacią rekombinacyjnego białka (B-2036), wytworzonego w rekombinacyjnych komórkach gospodarzach (np. rekombinacyjnych, genetycznie modyfikowanych komórkach gospodarzach Escherichia coli). Białko B-2036 wytwarza się podczas wzrostu komórek (np. przez fermentację) i ekspresji (synteza i wydzielanie). B-2036 po jego wy6
PL 211 502 B1 tworzeniu wydziela się (np. przez homogenizację), a następnie oczyszcza (np. przez ekstrakcję, odwirowywanie, chromatografię w odwróconych fazach i anionowymienną oraz wymianę buforową). Zauważono jednak, iż podczas rekombinacyjnego wytwarzania białka B-2036 powstają niepożądane zanieczyszczenia izoformami w B-2036, którymi są zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową i des-phe w B-2036.
Podano, że fig. 1A ilustruje sekwencję aminokwasów w B-2036 ze standardowymi jednoliterowymi skrótami, wskazującymi, jaki aminokwas występuje w każdym miejscu oznaczonym literą. W celu poinformowania się zobacz niż ej tablicę 1, wskazują c ą , jakie litery odpowiadają podanym aminokwasom.
T a b l i c a 1
| Polipeptyd |
| Aminokwas |
| Ala (A) |
| Glu (E) |
| Gin (Q) |
| Asp(D) |
| Asn(N) |
| Leu (L) |
| Gly (G) |
| Lys (K) |
| Ser (S) |
| Val (V) |
| Arg (R) |
| Thr (T) |
| Pro (P) |
| Ile (1) |
| Met (M) |
| Phe (F) |
| Tyr (Y) |
| Cys (C) |
| Trp (W) |
| His (H) |
Ponadto sekwencję aminokwasów w B-2036 podaje się tu jako SEK ID NR 1, a sekwencję aminokwasów w hGH podaje się tu jako SEK ID NR 2.
1. Rekombinacyjny antagonista hormonu wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową
Na fig. 1B zilustrowano strukturę sekwencji aminokwasów zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową w B-2036. Zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową zawiera w szczególności dodatkowy atom siarki w mostku między cysteinami w miejscach 182 oraz 189 białkowego składnika B-2036.
a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem związku (związków) zawierającego grupę merkaptanową
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że kontakt między wybranym związkiem (związkami) zawierającym grupę merkaptanową i zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje przekształcenie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem w jego naturalną postać cysteina-S-S-cysteina. Ponadto, również nie wiążąc się z teorią, jest moż liwe, że obecność związku (związków) zawierającego grupę merkaptanową zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
PL 211 502 B1
Najczęściej związek (związki) zawierający grupę merkaptanową dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). W kwestii sposobu postępowania przy polietylenoglikolowaniu zobacz opis patentowy USA nr 5849535.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolny związek zawierający grupę merkaptanową, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne związki zawierające grupę merkaptanową, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) siarczyny, glutation, betamerkaptoetanol, ditiotreitol, merkaptoetyloaminę, ditioerytrytol, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny, cysteinę oraz cysteinę w mieszaninie z cystyną.
Inne związki zawierające grupę merkaptanową, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (1) J. Houk i G. M. Whitesides, „Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange, J. M. Chem. Soc, 109, 6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, 1. wydanie, Pergamon, Nowy Jork (1973). W szczególności zobacz tablicę II w powyższej pozycji (1) (Houk i in.), przedstawiającą przykładowe związki zawierające grupę merkaptanową, nadające się do stosowania w niniejszym wynalazku.
Wśród odpowiednich związków zawierających grupę merkaptanową najkorzystniejsza jest cysteina albo cysteina w mieszaninie z cystyną (dimeryzowana cysteina). Ilość cysteiny lub mieszaniny cysteiny i cystyny (dimeryzowanej cysteiny, jeśli się ją stosuje), która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniż enia zawartoś ci powstał ego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio przynajmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe łączne stężenie cysteiny i ewentualnie cystyny, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio przynajmniej około 0,1 mM, od około 0,1 mM do około 10 mM lub od około 1 mM do około 5 mM.
Korzystne jest umieszczenie związku, zawierającego grupę merkaptanową, w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemoż liwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego.
Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 7,5 do około 8,5 lub od około 7,5 do około 8,0. W szczególności, gdy stosuje się związek, zawierający grupę merkaptanową, w wyższych stężeniach, to można dopuszczać wyższe wartości pH, np. nawet około 9,5. Jeśli więc np. stosuje się duży nadmiar cysteiny w stosunku do B-2036, to wartość pH roztworu buforowego może wynosić nawet około 9,5.
Podano wyżej, że korzystne jest umieszczanie związku, zawierającego grupę merkaptanową, w roztworze buforowym. Ponadto zawartość zwią zku zawierają cego grupę merkaptanową w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli związku zawierającego grupę merkaptanową do liczby moli białka B-2036 wynosił od około 0,5 do około 1000. W szczególności występuje to wówczas, gdy stosowany związek zawierający grupę merkaptanową znajduje się w mieszaninie z cysteiną i ewentualnie cysteina znajduje się w mieszaninie z cystyną . Alternatywnie molowy stosunek liczby moli związku zawierającego grupę merkaptanową do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 1 do około 1000, od około 1 do około 500 lub od około 1 do około 10.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między związkiem zawierającym grupę merkaptanową i białkowym składnikiem B-2036
PL 211 502 B1 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/cm3 do około mg/cm3, od około 0,5 mg/cm3 do około 20 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 10 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, związek (związki) zawierający grupę merkaptanową i inne składniki, obejmujące B-2036 (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 25°C po dodaniu związku zawierającego grupę merkaptanową do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 8°C. Należy zauważyć, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, związki zawierające grupy merkaptanowe i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i związkiem zawierającym grupę merkaptanową powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej około 30 minut, od około 1 godziny do około 24 godzin lub od około 1 godziny do około 4 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między związkiem (związkami) zawierającym grupę merkaptanową i składnikiem B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 10 dm3 do około 500 dm3 lub od około 100 dm3 do około 300 dm3. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wszędzie wynosić od 160 dm3 do około 500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między związkiem (związkami) zawierającym grupę merkaptanową i składnikiem B-2036 obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, związku (związków) zawierającego grupę merkaptanową, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących jedno środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
b. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem czynnika (czynników) chelatującego
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że kontakt między wybranym czynnikiem (czynnikami) chelatującym i (1) zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, (2) rekombinacyjnym antagonistą hormonu wzrostu B-2036, (3) komórkowym składnikiem (składnikami) komórek gospodarzy (dla rekombinacyjnego wytwarzania tego antagonisty) i (4) wszelkimi kombinacjami (1) - (3) powoduje przekształcanie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem w jego naturalną postać cysteina-S-S-cysteina albo obniżanie poziomów tego zanieczyszczenia. Ponadto, również nie wiążąc się z teorią, jest możliwe, że obecność czynnika (czynników) chelatującego zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
Najczęściej czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowaniu korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). W kwestii sposobu postępowania przy polietylenoglikolowaniu zobacz opis patentowy USA nr 5849535.
W odniesieniu do wynalazku moż na stosować dowolny czynnik chelatują cy, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (ale nie ograniczają się do nich) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapniodisodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan
PL 211 502 B1 trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zauważyć, że etylenodiaminotetraoctan sodu jest solą EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg serii produkcyjnych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio przynajmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio przynajmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do około 10 mM lub od około 2 mM do około 5 mM.
Korzystne jest umieszczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
Podano wyżej, że korzystne jest umieszczanie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 wynosił od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między czynnikiem chelatującym i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/cm3 do około 20 mg/cm3, od około 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące B-2036 (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego B-2036 wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
PL 211 502 B1
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem B-2036 roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 10 dm3 do około 500 dm3 lub od około 100 dm3 do około 300 dm3. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wszędzie wynosić od 160 dm3 do około 500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującymi i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
c. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem soli metali
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że kontakt między wybraną solą metalu (solami metali) i (1) zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, (2) rekombinacyjnym antagonistą hormonu wzrostu B-2036, (3) komórkowym składnikiem (składnikami) komórek gospodarzy (dla rekombinacyjnego wytwarzania tego antagonisty) i (4) wszelkimi kombinacjami (1)-(3) powoduje przekształcanie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem w jego naturalną postać cysteina-S-S-cysteina albo obniżanie poziomów tego zanieczyszczenia. Ponadto, również nie wiążąc się z teorią, jest możliwe, że obecność soli metali zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
Najczęściej sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowaniu korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). W kwestii sposobu postępowania przy polietylenoglikolowaniu zobacz opis patentowy USA nr 5849535.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Sól metalu (sole metali), nadająca się do stosowania w wynalazku, oznacza (ale nie ogranicza się do niej) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne odpowiednie sole metali są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Wśród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnCl2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg serii produkcyjnych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio przynajmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najPL 211 502 B1 wyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforanu sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio przynajmniej około 0,1 mM, od około 1 mM do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około mM do okoł o 175 mM, od oko ł o 10 mM do okoł o 150 mM lub od okoł o 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest umieszczanie soli metalu w roztworze buforowym. Fosforan sodu może jednak działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową odpowiednią sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po umieszczeniu soli metalu w roztworze buforowym (w przypadku fosforanu sodu jego roztwór działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub fosforanu sodu w roztworze działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 wynosił od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między solą metalu (solami metali) i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/cm3do około 20 mg/cm3, od około 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące B-2036 (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. fosforanem sodu) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, B-2036 i ewentualnie związek zawierający grupę merkaptanową itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036 roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 100 dm3do około 2000 dm3 lub od około 200 dm3 do około 1500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prę dkość mieszania. Prę dkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
PL 211 502 B1
2. Rekombinacyjny antagonista hormonu wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą des-phe
a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem czynnika chelatującego
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że dodanie czynnika (czynników) chelatującego do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe albo przez bieżące zmniejszenie jego poziomu i/lub przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Najczęściej czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowaniu korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). W kwestii sposobu postępowania przy polietylenoglikolowaniu zobacz opis patentowy USA nr 5649535.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolny czynnik chelatujący, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z zanieczyszczeniem izoformą des-phe wystarcza do obniż enia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (ale nie ograniczają się do nich) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapnio-disodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zauważyć, że etylenodiaminotetraoctan sodu jest solą EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio przynajmniej 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odowiednio przynajmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do okoł o 10 mM lub od okoł o 2 mM do okoł o 5 mM.
Korzystne jest umieszczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
PL 211 502 B1
Podano wyżej, że korzystne jest umieszczanie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 wynosił od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między czynnikiem chelatującym i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od okoł o 0,1 mg/cm3 do oko ł o 20 mg/cm3, od okoł o 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące B-2036 (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego B-2036 wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 min, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem B-2036 roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 10 dm3 do około 500 dm3 lub od około 100 dm3 do około 300 dm3. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wszędzie wynosić od 160 dm3 do około 500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
b. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem soli metali
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że dodanie soli metalu (soli metali) do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe albo przez bieżące obniżenie jego poziomu i/lub przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Najczęściej sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowaniu korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). W kwestii sposobu postępowania przy polietylenoglikolowaniu zobacz patent USA nr 5849535.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą des-phe wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub po znacznej degradacji) uzysku B-2036.
Sól metalu (sole metali), nadającą się do stosowania w wynalazku, oznacza (ale nie ogranicza się do niej) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują
PL 211 502 B1 (ale nie ograniczają się do nich) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne odpowiednie sole metali są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Eguipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Wśród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnC2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg serii produkcyjnych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio przynajmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia (lub jego najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforan sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio przynajmniej około 0,1 mM od około 1 mM, do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około 5 mM do około 175 mM, od około 10 mM do około 150 mM lub od około 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest umieszczanie soli metalu w roztworze buforowym. Fosforan sodu może jednak działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie degraduje powstawania białkowego składnika B-2036. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po umieszczeniu soli metalu w roztworze buforowym (w przypadku fosforanu sodu jego roztwór działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub fosforanu sodu w roztworze działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 wynosił od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między solą metalu (solami metali) i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/cm3 do około 20 mg/cm3, od około 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące B-2036 (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od okoł o 1°C do około 15°C, od około 2°C do okoł o 10°C lub od około 2°C do okoł o 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. fosforanem sodu) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, B-2036 i ewentualnie związek zawierający grupę merkaptanową itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
PL 211 502 B1
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i solą metalu powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036 roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 100 dm3 do około 2000 dm3 lub od około 200 dm3do około 1500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prę dkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
3. Rekombinacyjny hormon wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą des-phe
a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem czynnika chelatującego
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że dodanie czynnika (czynników) chelatujących do rekombinacyjnego hormonu wzrostu powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe albo przez bieżące zmniejszenie jego poziomu i/lub przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Najczęściej czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białka hormonu wzrostu podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania korzystne jest oczyszczanie białka hormonu wzrostu.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolny czynnik chelatujący, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkiem hormonu wzrostu wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą des-phe wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku hormonu wzrostu. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (ale nie ograniczają się do nich) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapnio-disodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zauważyć, że etylenodiaminotetraoctan sodu jest solą EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Eguipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg serii produkcyjnych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio przynajmniej 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odowiednio przynajmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do okoł o 10 mM lub od okoł o 2 mM do okoł o 5 mM.
PL 211 502 B1
Korzystne jest umieszczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
Podano wyżej, że korzystne jest umieszczanie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) wynosił od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka hormonu wzrostu (hGH) może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między czynnikiem chelatującym i białkiem hormonu wzrostu (np. hGH) (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białka hormonu wzrostu (np. hGH) w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/cm3 do około 20 mg/cm3, od około 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące białko hormonu wzrostu (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białko hormonu wzrostu. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego białko hormonu wzrostu utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego hormon wzrostu wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka hormonu wzrostu następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i białko hormonu wzrostu itd.) poniżej temperatury denaturacji białka hormonu wzrostu.
Oprócz tego czas kontaktu między białkiem hormonu wzrostu i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i białkiem hormonu wzrostu roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 10 cm3 do około 500 dm3 lub od około 100 dm3 do około 300 dm3. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wszędzie wynosić od 160 dm3 do około 500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i białkiem hormonu wzrostu obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, białka hormonu wzrostu i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika hormonu wzrostu.
b. Obniżenie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem soli metali
Nie wiążąc się z teorią uważa się, że dodanie soli metalu (soli metali) do rekombinacyjnego hormonu wzrostu powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe albo przez bieżące obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe i/lub przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
PL 211 502 B1
Najczęściej sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika hormonu wzrostu podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania korzystne jest oczyszczanie białka hormonu wzrostu.
W odniesieniu do wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem hormonu wzrostu wraz z jego zanieczyszczenien im izoformą des-phe wystarcza do obniż enia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku hormonu wzrostu. Sól metalu (sole metali), nadająca się do stosowania w wynalazku, oznacza (ale nie ogranicza się do niej) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck lndex, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity lndex, strona THER-19 (pod CHELATING AGENTS), Whitehouse Station, New Yersey (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie przejrzane (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Luis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Eguipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Wśród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnCl2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe przynajmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg serii produkcyjnych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio przynajmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia (albo najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforanu sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio przynajmniej około 0,1 mM, odo około 1 mM, do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około 5 mM do około 175 mM, od około 10 mM do około 150 mM lub od około 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest umieszczanie soli metalu w roztworze buforowym. Fosforan sodu może jednak działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (ale nie ograniczają się do nich) roztwory tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po umieszczeniu soli metalu w roztworze buforowym (w przypadku fosforanu sodu jego roztwór działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub fosforanu sodu w roztworze działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) wynosił od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowy stosunek liczby moli soli metalu do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu (np. hGH) (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białka hormonu wzrostu
PL 211 502 B1 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od okoł o 0,1 mg/cm3 do około 20 mg/cm3, od okoł o 0,5 mg/cm3 do około 5 mg/cm3 lub od około 1 mg/cm3 do około 5 mg/cm3.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące białko hormonu wzrostu (ale nie ograniczające się do niego), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej lizatu zawierającego białko hormonu wzrostu. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej lizatu zawierającego białko hormonu wzrostu utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. fosforanem sodu) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka hormonu wzrostu następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, białko hormonu wzrostu i ewentualnie związek zawierający grupę merkaptanową itd.) poniżej temperatury denaturacji białka hormonu wzrostu.
Oprócz tego czas kontaktu między białkiem hormonu wzrostu i solą metalu powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio przynajmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 dm3 do około 5000 dm3, od około 100 dm3 do około 2000 dm3 lub od około 200 dm3 do około 1500 dm3.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu, obejmują takie parametry, jak prę dkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), białka hormonu wzrostu i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie techniki, do której należy wynalazek, mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową w antagoniście hormonu wzrostu (GHA) z zastosowaniem związku (związków) zawierającego grupę merkaptanową.
Obniżanie poziomu trisiarczkowej postaci B-2036 prowadzono z zastosowaniem retentatu 1 (zobacz niżej schemat przepływu 1) w procesie oczyszczania B-2036. Fermentację rekombinacyjną B-2036 z ekspresją Eschierichia coli prowadzono według Cunninghama i in., opis patentowy USA nr 5849535. Początkowe etapy wydzielania i oczyszczania (wszystkie etapy prowadzone przed otrzymywaniem retentatu 1 w poniższym schemacie przepływowym 1, np. wszelkie procesy tworzenia zawiesin i homogenizacji, ekstrakcji dwufazowej, chromatografii z odwróconymi fazami i chromatografii anionowymiennej) prowadzono tak, jak to opisano w załączonym schemacie przepływowym 1. Po pierwszym etapie ultrafiltracji/diafiltracji produkt występował w 25 mM HEPES, wartość pH roztworu buforowego wynosiła 7,0 (~150 dm3), a stężenie białka wynosiło 3,7 g/dm3. Temperaturę wytworzonego roztworu obniżano do zakresu od 2 do 8°C i dodawano do tego roztworu 1/10 objętości (-15 dm3) świeżo wytworzonego roztworu buforowego o wartości pH 8,0, zawierającego 200 mlM tris i 20 mM cysteinę , który ochł odzono do temperatury w zakresie od 2 do 8°C. Roztwór B-2036 i cysteiny utrzymywano w temperaturze od 2 do 8°C i mierzono przez 174 minuty. Następnie mieszaninę tę zatężono do 131 dm3 z zastosowaniem membran ultrafiltracyjnych Millipore Biomax 5 i diafiltrowano względem 6x objętości 25 mM HEPES o wartości pH 7,0. Następnie wytworzony produkt poddawano pozostałemu procesowi oczyszczania B-2036, jak to opisano niżej w schemacie przepływowym 1.
Przed dodaniem cysteiny zmierzony poziom trisiarczku B-2036 wynosił 3,7%. Zaraz po dodaniu cysteiny poziom ten obniżył się do 2% (spadek o 46%).
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
i I -ζ-J θ cj γ
CO
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
Przesącz
Odciek - (odpad) 1
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
Retentat 1 cu 'c o
c o
'o.
.92 c:
CU $
o o
>, > c I 'cd ♦ 60 ' θ’ Ϊ
I i co : C 1 CO J ;
>. C i i n :
W
UJ o
o
CL
CL o
QC
H
H
O
ZD
CZ3
UJ
O o
oi
CL ω
CL
O
_< >. o zę e jQ2 C O. - (Λ o τ c >>
Z
S óEail(ll<.Sc S N CO V Λ —1 00 CO ώ
CO O . . CN
S2m o-κι σ>
> «-o o > § 3 o c: 2 isoggjś ŁSŁ£i£ =3
JZ ᤣ ou5 oQ $ N . . 5*0 O <- k(/5 U
O
| LO | X |
| X | o. |
| CU E | ω ULI |
| o | CL |
| 00 | UJ |
| 2o | X |
| Q-r-i c |
·= O *csoin =t c\[ ci o
O)
CD c
cc s
LO CM <0 P
CN
E (f)
E
LO . O_<i? CN u j£ co JL Λ v <o v cc 'c (V Q>
·* . . o .2 <D Ό
o. g o .. o o o co £ O) c00 CC 'z— ί* f— n ° o O $ Łc <D iBlt! 0.0. O.O.
<£ cn Z
2-a
3« <f LO §2 źź iś^-R
4= O <C — TJ LO O OC4 CO o ,2oo c >,° fc C'=.
® 5^ 2:2 to n75w= φ
-o
-aO ^.2 _J co _T . H <CL λ-όο:
Ό
-<Z>
O c
.'ÓT-LJ T5 cc
S LLi >S c
s n
E <D
E 'n?
N
Ό
O
Ct ,<ę sJ!=
O ZS -Q LO *±
SQbi 82 cc o
PL 211 502 B1
PL 211 502 B1
P r z y k ł a d 2
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową w antagoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem czynnika (czynników) chelatującego
W odniesieniu do schematu przepł ywowego 1 dodawano 165 kg zamroż onej pasty komórkowej GHA do ~1013 dm3 150 mM Tris, 5 mM EDTA o wartości pH 7,2. Po zakończeniu rozmrażania pasty komórkowej (określonym przez stałe odczyty A550) mieszaninę tę przepuszczano przez homogenizator Niro przy 950+50 x 10-1 MPa z nominalnym natężeniem przepływu 250 dm3/godz. Homogenat zbierano w zbiorniku, w którym utrzymywano temperaturę w zakresie między 24 i 33°C. Do mieszaniny lizatu dodawano siarczan amonu i PEG-4600 w celu wytworzenia stężenia 10% wagowych obydwu tych związków. Uzyskaną dwufazową mieszaninę mieszano przez 60-120 minut, a następnie fazy te rozdzielano, przepuszczając roztwór przez wirówkę ciecz/ciecz, odrzucają c ą ciała stałe. Górna faza zawierała żądany produkt i zbierano ją oraz filtrowano przez zespół filtrów, składający się z filtra „delipidującego, filtra „głębokiego i filtra 0,2 μm. Filtrat zbierano w trzech osobnych pojemnikach i próbki z każdego z nich analizowano na zawartość trisiarczku B-2036. Zawartości te wahały się w granicach od 3,1 do 3,8%. Następnie wytworzony materiał poddawano przeróbce na uśrednioną masę, stosując sposób postępowania przestawiony w ogólnym zarysie na schemacie przepływowym z przykładu 1.
Dla porównania próbki z serii poddawanych obróbce wyżej podanym sposobem postępowania (ale bez składnika EDTA (czynnika chelatującego) w roztworze buforowym lizatu i bez cysteinowej obróbki retentatu 1) wykazywały poziom trisiarczku (n=10) w granicach od 3,2 do 6,4% ze średnią 5,1 po zakończeniu całego procesu z wyżej podanego schematu przepływowego 1. Gdy do roztworu buforowego lizatu dodano EDTA i przeprowadzono etap cysteinowej inkubacji retentatu 1, to poziom trisiarczku po zakończeniu całego procesu ze schematu przepływowego 1 wynosił 1,5%.
P r z y k ł a d 3
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową w antagoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem soli metalu (metali)
W odniesieniu do schematu przepływowego 1 dodawano 165 kg zamrożonej pasty komórkowej do —1013 dm3 100 mM fosforanu sodu o wartości pH 6,0. Po zakończeniu rozmrażania pasty komórkowej (określonym przez stałe odczyty A550) mieszaninę tę przepuszczano przez homogenizator Niro przy 950+50 x 10-1 MPa z nominalnym natężeniem przepływu 250 dm3/godz. Homogenat zbierano w zbiorniku, w którym utrzymywano temperaturę w zakresie między 24 i 33°C. Do mieszaniny lizatu dodawano siarczan amonu i PEG-4600 w celu wytworzenia stężenia 10% wagowych obydwu tych związków. Uzyskaną dwufazową mieszaninę mieszano przez 60-120 minut, a następnie fazy te rozdzielano, przepuszczając roztwór przez wirówkę ciecz/ciecz, odrzucającą ciała stałe. Górna faza zawierała żądany produkt i zbierano ją oraz filtrowano przez zespół filtrów, składający się z filtra „delipidującego, filtra „głębokiego i filtra 0,2 um. Materiał ten poddawano pozostałemu procesowi B-2036, opisanemu niżej w schemacie przepływowym 2. Poziom trisiarczku B-2036 po zakończeniu obróbki wynosił 1,4%. Porównano to z poziomami trisiarczku B-2036, wynoszącymi od 3,2 do 6,4% (średnio 5,1%) w przypadku serii produkcyjnych B-2036 (n=10) poddawanych obróbce z zastosowaniem zwykłego roztworu buforowego lizatu (150 mM tris, pH 7,2).
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
| 9535 -2036 | |
| • LD | |
| ; 0-= • co a> | |
| O £ c | |
| : n <= « | |
| i»-0 CB . ~ p- «— ; -o o e | |
| [ O CV3 } O £ N | |
| o — | |
| » (/> r— 1 5 i 0.3 | |
ar i
Filtracja fazy górnej ......-j r<M^e;........j ' , iexhplc, hihplc ; 2) Naładowany celulozowy głęboki (Seitz lub równ.) : Odzysk właściwy. >/=2,5 g B-2036 na kg ! 3) 0,2 um absolutny octan celulozy i j pasty komórkowej
CO
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
Przesącz
<x>
Odciek | (odpad) —I Retentat 1
PL 211 502 B1
OPERACJA JEDNOSTKOWA OPIS PROCESU KONTROLA PROCESU
PL 211 502 B1
P r z y k ł a d 4
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe w antagoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem czynnika (czynników) chelatującego
W odniesieniu do schematu przepływowego 1 dodawano 165 kg zamrożonej pasty komórkowej do -1013 dm3 150 mM tris, 5 mM EDTA o wartości pH 7,2. Po zakończeniu rozmrażania pasty komórkowej (określonym przez stałe odczyty A550) mieszaninę tę przepuszczano przez homogenizator Niro przy 950±50 x 10-1 MPa z nominalnym natężeniem przepływu 250 dm3/godz. Homogenat zbierano w zbiorniku, w którym utrzymywano temperaturę w zakresie między 24 i 33°C. Do mieszaniny lizatu dodawano siarczan amonu i PEG-4600 w celu wytworzenia stężenia 10% wagowych obydwu tych związków. Uzyskaną dwufazową mieszaninę mieszano przez 60-120 minut, a następnie fazy te rozdzielano, przepuszczając roztwór przez wirówkę ciecz/ciecz, odrzucającą ciała stałe. Górna faza zawierała żądany produkt i zbierano ją oraz filtrowano przez zespół filtrów, składający się z filtra „delipidującego, filtra „głębokiego filtra 0,2 um. Filtrat (uzyskany po filtracji górnej fazy, zobacz schemat przepływowy 1) zbierano w trzech osobnych pojemnikach i próbki z każdego z nich analizowano na zawartość des-phe B-2036. Zawartości te wahały się w granicach od 3,2 do 6,3%. Dla porównania dalsza obróbka według schematu przepływowego 1 dalej obniżała poziom des-phe B-2036 do 0,3% retentatu 3. To dalsze obniżenie poziomu des-phe B-2036 osiągano dzięki parametrom zbierania produktu w drugim etapie chromatografii anionowymiennej. Gdy roztwór buforowy lizatu zawierał EDTA i przeprowadzano procedury zbierania w etapie chromatografii jonowymiennej, to uzyskiwano poziomy des-phe B-2036 wynoszące 0,3%, w porównaniu z końcowymi poziomami wynoszącymi od 4,6 do 16,2% (średnio 10,2%) w przypadku serii produkcyjnych B-2036 (n=10), wytwarzanych w procesie obróbki bez użycia EDTA (np. 150 mM tris, pH 7,2) i bez wyżej przedstawionych procedur zbierania.
P r z y k ł a d 5
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe w antagoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem soli metalu (metali)
W odniesieniu do schematu przepływowego 2 dodawano 165 kg zamrożonej pasty komórkowej do —1013 dm3 100 mM fosforanu sodu o wartości pH 6,0. Po zakończeniu rozmrażania pasty komórkowej (określonym przez stałe odczyty A550) mieszaninę tę przepuszczano przez homogenizator Niro przy 950±50 x 10-1 MPa z nominalnym natężeniem przepływu 250 dm3/godz. Homogenat zbierano w zbiorniku, w którym utrzymywano temperaturę w zakresie między 24 i 33°C. Do mieszaniny lizatu dodawano siarczan amonu i PEG-4600 w celu wytworzenia stężenia 10% wagowych obydwu tych związków. Uzyskaną dwufazową mieszaninę mieszano przez 60-120 minut, a następnie fazy te rozdzielano, przepuszczając roztwór przez wirówkę ciecz/ciecz, odrzucającą ciała stałe. Górna faza zawierała żądany produkt i zbierano ją oraz filtrowano przez zespół filtrów, składający się z filtra „delipidującego, filtra „głębokiego i filtra 0,2 um. Filtrat zbierano w trzech osobnych pojemnikach i próbki z każdego z nich analizowano na zawartość des-phe B-2036. Zawartości te wahały się od 6,0 do 9,4%. Dla porównania dalsza obróbka według schematu przepływowego 2 dalej obniżała poziom desphe B-2036 do 0,8% retentatu 2. To dalsze obniżenie poziomu des-phe B-2036 osiągano dzięki parametrom zbierania produktu w drugim etapie chromatografii anionowymiennej. Gdy roztwór buforowy lizatu zawierał fosforan sodu i przeprowadzano procedury zbierania w drugim etapie chromatografii jonowymiennej, to uzyskiwano poziom des-phe B-2036 wynoszący 0,8%, w porównaniu z końcowymi poziomami wynoszącymi od 4,6 do 16,2% (średnio 10,2%) w przypadku serii produkcyjnych B-2036 (n=10), wytwarzanych w procesie obróbki bez użycia fosforanu sodu (np. 150 mM tris, pH 7,2) i bez wyżej przedstawionych procedur zbierania.
P r z y k ł a d 6
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe w agoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem czynnika (czynników) chelatującego
Tworzono zawiesinę świeżych lub zamrożonych rekombinacyjnych komórek, powodujących ekspresję agonisty hormonu wzrostu, w roztworze buforowym zawierającym EDTA. Następnie niszczono te komórki albo całkowicie takim sposobem jak homogenizacja, albo częściowo takim sposobem jak szok osmotyczny lub zamrażanie i rozmrażanie w celu uwolnienia agonisty hormonu wzrostu. Następnie wydzielano roztwór zniszczonych komórek przez dwufazową ekstrakcję, odwirowywanie ciał stałych od cieczy lub filtrację. Oczyszczano tego agonistę za pomocą kilkuetapowej chromatografii cieczowej.
P r z y k ł a d 7
Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe w agoniście hormonu wzrostu z zastosowaniem soli metalu (metali)
PL 211 502 B1
Tworzono zawiesinę zamrożonych rekombinacyjnych komórek, powodujących ekspresję agonisty hormonu wzrostu, w roztworze buforowym zawierającym fosforan sodu. Następnie niszczono te komórki albo całkowicie takim sposobem jak homogenizacja, albo częściowo takim sposobem jak szok osmotyczny lub zamrażanie i rozmrażanie w celu uwolnienia agonisty hormonu wzrostu. Następnie wydzielano roztwór zniszczonych komórek przez dwufazową ekstrakcję, odwirowywanie ciał stałych od cieczy lub filtrację. Oczyszczano tego agonistę pomocą szeregu etapów chromatografii cieczowej.
Lista sekwencji <110> Lyle <120> Sposób wytwarzania ludzkiego hormonu wzrostu i jego antagoni sty o obniżonym poziomie zanieczyszczeń izoformami <130> 161765.00520 <150> US 60/406.553 <151> 2002-08-28 <160> 2 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
| Phe 1 | Pro | Thr | Ile | Pro 5 | Leu | Ser | Arg | Leu | Phe 10 | Asp | Asn | Ala | Met | Leu 15 | Arg |
| Ala | Asp | Arg | Leu | Asn | Gin | Leu | Ala | Phe | Asp | Thr | Tyr | Gin | Glu | Phe | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Tyr | Ile | Pro | Lys | Glu | Gin | Lys | Tyr | Ser | Phe | Leu | Gin | Asn | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Thr | Ser | Leu | Cys | Phe | Ser | Glu | Ser | Ile | Pro | Thr | Pro | Ser | Asn | Arg |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Thr | Gin | Gin | Lys | Ser | Asn | Leu | Glu | Leu | Leu | Arg | Ile | Ser | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Leu | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu | Glu | Pro | Val | Gin | Phe | Leu | Arg | Ser | Val |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Phe | Ala | Asn | Ser | Leu | Val | Tyr | Gly | Ala | Ser | Asp | Ser | Asn | Val | Tyr | Asp |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Lys | Ile | Gin | Thr | Leu | Met | Gly | Arg | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Asp | Gly | Ser | Pro | Arg | Thr | Gly | Gin | Ile | Phe | Lys | Gin | Thr | Tyr | Ser |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Phe | Asp | Thr | Asn | Ser | His | Asn | Asp | Asp | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Leu | Leu | Tyr | Cys | Phe | Asn | Ala | Asp | Met | Ser | Arg | Val | Ser | Thr | Phe |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Thr | Val | Gin | Cys | Arg | Ser | Val | Glu | Gly | Ser | Cys | Gly | Phe | |
| 180 | 185 | 190 |
PL 211 502 B1 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
| Phe 1 | Pro | Thr | Ile | Pro 5 | Leu | Ser | Arg | Leu | Phe 10 | Asp | Asn | Ala | Met | Leu 15 | Arg |
| Ala | His | Arg | Leu | His | Gin | Leu | Ala | Phe | Asp | Thr | Tyr | Gin | Glu | Phe | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Tyr | Ile | Pro | Lys | Glu | Gin | Lys | Tyr | Ser | Phe | Leu | Gin | Asn | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Thr | Ser | Leu | Cys | Phe | Ser | Glu | Ser | Ile | Pro | Thr | Pro | Ser | Asn | Arg |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Thr | Gin | Gin | Lys | Ser | Asn | Leu | Glu | Leu | Leu | Arg | Ile | Ser | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Leu | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu | Glu | Pro | Val | Gin | Phe | Leu | Arg | Ser | Val |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Phe | Ala | Asn | Ser | Leu | Val | Tyr | Gly | Ala | Ser | Asp | Ser | Asn | Val | Tyr | Asp |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Gly | Ile | Gin | Thr | Leu | Met | Gly | Arg | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Asp | Gly | Ser | Pro | Arg | Thr | Gly | Gin | Ile | Phe | Lys | Gin | Thr | Tyr | Ser |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Phe | Asp | Thr | Asn | Ser | His | Asn | Asp | Asp | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Leu | Leu | Tyr | Cys | Phe | Arg | Lys | Asp | Met | Asp | Lys | Val | Glu | Thr | Phe |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Ile | Val | Gin | Cys | Arg | Ser | Val | Glu | Gly | Ser | Cys | Gly | Phe | |
| 180 | 185 | 190 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (20)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób obniżania zawartości zanieczyszczenia oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036 z SEK ID NR1, będącego antagonistą hormonu wzrostu, w genetycznie modyfikowanych komórkach gospodarzach zawierających składnik komórkowy (składniki komórkowe), znamienny tym, że zawiera etap (a), w którym kontaktuje się czynnik chelatujący z pastą komórkową albo lizatem pasty komórkowej zawierającymi (1) zanieczyszczenie, (2) polipeptyd będący antagonistą hormonu wzrostu, (3) składniki komórkowy (składniki komórkowe) i (4) ich mieszaniny i obniż a się zawartość zanieczyszczenia, przy czym stosuje się molowy stosunek czynnika chelatującego do liczby moli polipeptydu będącego antagonistą hormonu wzrostu wynoszący od 20 do 1000, a temperatura utrzymuje się w zakresie od 0°C do 35°C.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w dodatkowym etapie (b) polipeptyd będący antagonistą hormonu wzrostu poddaje się oczyszczaniu.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczony polipeptyd poddaje się polietylenoglikolowaniu w dodatkowym etapie (c).
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że czynnik chlatujący wybiera się z grupy obejmują cej EDTA, EGTA i DTPA.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że czynnik chlatujący oznacza EDTA.
- 6. Sposób według jednego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że czynnik chlatujący umieszcza się w roztworze buforowym.PL 211 502 B1
- 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się począ tkowe stężenie EDTA wynoszące od 2 mM do 10 mM.
- 8. Sposób wedł ug zastrz. 6, znamienny tym, ż e stosuje się roztwór buforowy wybrany z grupy, obejmującej roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że roztwór buforowy oznacza roztwór Tris.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się roztwór buforowy wykazujący początkowe stężenie Tris od 1 mM do 200 mM.
- 11. Sposób według zastrz. 6-10, znamienny tym, że po etapie kontaktowania (a) stosuje się roztwór buforowy mający pH od 6 do 9.
- 12. Sposób według zastrz. 1-11, znamienny tym, że stosuje się temperaturę w zakresie 2°C do 15°C.
- 13. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że po etapie (b) oczyszczania wprowadza się dalej etap (b') kontaktowania zanieczyszczenia ze związkiem zawierającym grupę merkaptanową w nieobecnoś ci ś rodka chelatują cego.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że związek zawierający grupę merkaptanową wybiera się z grupy, obejmującej siarczyny, glutation, beta-merkaptoetanol, ditiotreitol, merkaptoetyloaminę, ditioerytrytol, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny, cysteinę oraz cysteinę w mieszaninie z cystyną .
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że związek zawierający grupę merkaptanową oznacza cysteinę lub mieszaninę cysteiny i cystyny.
- 16. Sposób według zastrz. 13 do 15, znamienny tym, że związek zawierający grupę merkaptanową dostarcza się w drugim roztworze buforowym.
- 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się początkowe stężenie mieszaniny cysteiny i cystyny wynoszące od 1 mM do 5 mM.
- 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że drugi roztwór buforowy wybiera się z grupy, obejmującej roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny.
- 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako drugi roztwór buforowy stosuje się roztwór Tris.
- 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się roztwór buforowy wykazujący początkowe stężenie Tris od 1 mM do 200 mM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40655302P | 2002-08-28 | 2002-08-28 | |
| US10/646,798 US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2003-08-25 | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL374917A1 PL374917A1 (pl) | 2005-11-14 |
| PL211502B1 true PL211502B1 (pl) | 2012-05-31 |
Family
ID=31997673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL374917A PL211502B1 (pl) | 2002-08-28 | 2003-08-26 | Sposób obniżania zawartości zanieczyszczenia oznaczającego trisiarczkową izoformę, powstającego podczas rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu B-2036 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040048315A1 (pl) |
| EP (1) | EP1546185B1 (pl) |
| JP (1) | JP4312154B2 (pl) |
| KR (1) | KR101176588B1 (pl) |
| AT (1) | ATE428721T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003260045B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0313829B1 (pl) |
| CA (1) | CA2497146C (pl) |
| CY (1) | CY1109167T1 (pl) |
| DE (1) | DE60327228D1 (pl) |
| DK (1) | DK1546185T3 (pl) |
| ES (1) | ES2323586T3 (pl) |
| IL (1) | IL167121A (pl) |
| MX (1) | MXPA05002359A (pl) |
| PL (1) | PL211502B1 (pl) |
| PT (1) | PT1546185E (pl) |
| RU (1) | RU2337920C2 (pl) |
| SI (1) | SI1546185T1 (pl) |
| TW (2) | TW200700553A (pl) |
| WO (1) | WO2004031213A1 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| JP4865728B2 (ja) * | 2004-12-29 | 2012-02-01 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ポリペプチドの三硫化物誘導体の形成を防止する方法 |
| US9005926B2 (en) | 2009-10-02 | 2015-04-14 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| SG181496A1 (en) * | 2009-12-18 | 2012-07-30 | Csl Ltd | Method of purifying polypeptides |
| US9562252B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-02-07 | Biogen Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| US20130053551A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Hoffman-La Roche. Inc. | Cation and anion exchange chromatography method |
| RU2744978C2 (ru) | 2014-07-24 | 2021-03-17 | Дженентек, Инк. | Способы конъюгации агента с тиольным компонентом в белке, который содержит по меньшей мере одну трисульфидную связь |
| SG11201809959PA (en) * | 2016-05-10 | 2018-12-28 | Genentech Inc | Methods of decreasing trisulfide bonds during recombinant production of polypeptides |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5153265A (en) | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5969109A (en) | 1990-02-28 | 1999-10-19 | Bona; Constantin | Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA955789B (en) * | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
| DE122006000003I1 (de) * | 1995-09-21 | 2006-05-04 | Genentech Inc | Varianten des Menschlichen Wachstumshormons |
| SE9802454D0 (sv) * | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
| AR026743A1 (es) * | 1999-12-09 | 2003-02-26 | Pharmacia Ab | Produccion de peptidos |
| US7229789B1 (en) | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| ZA200502320B (en) * | 2002-09-20 | 2006-10-25 | Pharmacia Corp | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein |
-
2003
- 2003-08-25 US US10/646,798 patent/US20040048315A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-26 CA CA2497146A patent/CA2497146C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-26 EP EP03799266A patent/EP1546185B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 KR KR1020057003458A patent/KR101176588B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-26 ES ES03799266T patent/ES2323586T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 JP JP2004541486A patent/JP4312154B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 PL PL374917A patent/PL211502B1/pl unknown
- 2003-08-26 AT AT03799266T patent/ATE428721T1/de active
- 2003-08-26 RU RU2005109388/13A patent/RU2337920C2/ru active
- 2003-08-26 DE DE60327228T patent/DE60327228D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 BR BRPI0313829-1A patent/BRPI0313829B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-08-26 WO PCT/US2003/026498 patent/WO2004031213A1/en not_active Ceased
- 2003-08-26 AU AU2003260045A patent/AU2003260045B2/en not_active Expired
- 2003-08-26 DK DK03799266T patent/DK1546185T3/da active
- 2003-08-26 SI SI200331584T patent/SI1546185T1/sl unknown
- 2003-08-26 MX MXPA05002359A patent/MXPA05002359A/es active IP Right Grant
- 2003-08-26 PT PT03799266T patent/PT1546185E/pt unknown
- 2003-08-28 TW TW095130368A patent/TW200700553A/zh unknown
- 2003-08-28 TW TW092123686A patent/TWI289603B/zh not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-27 IL IL167121A patent/IL167121A/en unknown
-
2009
- 2009-03-17 US US12/405,857 patent/US8148331B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-06-24 CY CY20091100660T patent/CY1109167T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0313829A (pt) | 2005-07-26 |
| MXPA05002359A (es) | 2005-07-15 |
| EP1546185A1 (en) | 2005-06-29 |
| SI1546185T1 (sl) | 2009-08-31 |
| ES2323586T3 (es) | 2009-07-21 |
| AU2003260045A1 (en) | 2004-04-23 |
| US8148331B2 (en) | 2012-04-03 |
| TW200407428A (en) | 2004-05-16 |
| EP1546185A4 (en) | 2006-09-06 |
| HK1077074A1 (en) | 2006-02-03 |
| TW200700553A (en) | 2007-01-01 |
| RU2337920C2 (ru) | 2008-11-10 |
| DE60327228D1 (de) | 2009-05-28 |
| RU2005109388A (ru) | 2005-10-27 |
| CA2497146A1 (en) | 2004-04-15 |
| EP1546185B1 (en) | 2009-04-15 |
| JP4312154B2 (ja) | 2009-08-12 |
| US20040048315A1 (en) | 2004-03-11 |
| ATE428721T1 (de) | 2009-05-15 |
| KR20050059163A (ko) | 2005-06-17 |
| JP2006517091A (ja) | 2006-07-20 |
| TWI289603B (en) | 2007-11-11 |
| PL374917A1 (pl) | 2005-11-14 |
| US20100021966A1 (en) | 2010-01-28 |
| IL167121A (en) | 2010-11-30 |
| DK1546185T3 (da) | 2009-06-22 |
| CA2497146C (en) | 2012-05-22 |
| AU2003260045B2 (en) | 2010-01-07 |
| PT1546185E (pt) | 2009-07-14 |
| BRPI0313829B1 (pt) | 2021-10-26 |
| KR101176588B1 (ko) | 2012-08-23 |
| WO2004031213A1 (en) | 2004-04-15 |
| CY1109167T1 (el) | 2014-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8148331B2 (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| US4652630A (en) | Method of somatotropin naturation | |
| US20050085631A1 (en) | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein | |
| IE66334B1 (en) | Production of proteins in active forms | |
| Stöcker et al. | The quaternary structure of four crustacean two-hexameric hemocyanins: immunocorrelation, stoichiometry, reassembly and topology of individual subunits | |
| Chang et al. | The primary structures of growth hormones of three cyprinid species: bighead carp, silver carp, and grass carp | |
| RU2073686C1 (ru) | Способ получения стабильных соматотропинов, стабильные соматотропины и композиция стабильного соматотропина | |
| CA2196569A1 (en) | Aspb1 insulin analogs | |
| IE860466L (en) | Somatotropin solubilisation and naturation | |
| US6437101B1 (en) | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction | |
| US4731440A (en) | Method of somatotropin solubilization using dimethylsulfone and naturation | |
| CN1078910A (zh) | 生物适合的生长激素溶液 | |
| Arámburo et al. | Characterization of a bioactive 15 kDa fragment produced by proteolytic cleavage of chicken growth hormone | |
| PL212726B1 (pl) | Sposób obnizenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 i jego izoform | |
| AU5945290A (en) | Somatotropin analogs | |
| CZ272895A3 (en) | Method of converting hydrophobic derivative of growth hormone to the growth hormone natural form and detection method of said hydrophobic derivative | |
| US5663305A (en) | Somatotropin analogs | |
| HK1077074B (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| ZA200501841B (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| Martinat et al. | Purification and partial characterization of growth hormone from the dromedary (Camelus dromedarius) | |
| Caulfield et al. | A Chemically Synthesized Radiolabeled Signal Peptide: Design, Preparation, and Biological Evaluation of an lodinated Analog of Preproparathyroid Hormone | |
| KAWAUCHI et al. | Evolutionary aspects of growth hormones |