MXPA05002359A - Metodo para la preparacion de hormona de crecimiento y antagonista de la misma que tiene menores niveles de impurezas isoforma de la misma. - Google Patents
Metodo para la preparacion de hormona de crecimiento y antagonista de la misma que tiene menores niveles de impurezas isoforma de la misma.Info
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Abstract
La presente invencion esta dirigida en lo general a metodos recombinantes para hacer un polipeptido deseado; este(os) metodo(s) genera(n) un producto de polipeptido que contiene menores niveles de impurezas isoforma del mismo, en particular; la presente invencion esta dirigida a (1) un metodo recombinante para preparar hormona de crecimiento con menores impurezas isoforma de la misma y (2) un metodo recombinante para preparar un antagonista de hormona del crecimiento; como pegvisomant, y su intermediario de proteina, que tambien tiene menores impurezas isoforma de la misma; mas especificamente, las impurezas isoforma que disminuyen mediante los metodos de la presente invencion son las impurezas isoforma de trisulfuro y des-phe de la hormona del crecimiento y antagonistas de la hormona de crecimiento (o su intermediario); respectivamente.
Description
isoforma trisulfuro y des-phe de la hormona de crecimiento y del antagonista de la hormona de crecimiento (o sus intermediarios), respectivamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) es un antagonista del receptor de la hormona de crecimiento de humano. Es un análogo de la hormona de crecimiento de humano ("hGH") que ha sido alterada estructu raímente. La secuencia de aminoácidos del componente proteico/intermediario (B-2036) del pegvisomant difiere de la secuencia de aminoácidos de hGH en nueve posiciones. Las sustituciones específicas de aminoácidos son las siguientes: H18D, H21 N, G120K, R167N, K168A, D171 S, K172R, E174S, y 1179T. Como se conoce bien en la técnica, la primera letra (por ejemplo, H18D) representa el aminoácido en la secuencia de hGH en la posición numerada (por ejemplo, aminoácido en la posición 18 como se indica por H18D) el cual se sustituye con el aminoácido designado por la segunda letra (por ejemplo, H18D). Por lo tanto, H18D designa una sustitución del aminoácido his por el aminoácido asj) en el aminoácido en la posición 18 de la secuencia de aminoácidos de la hGH de tipo silvestre. La figura 1A muestra esquemáticamente la estructura de la secuencia de aminoácidos del componente proteico/intermediario (B-2036) del pegvisomant (PEG B-2036) con asteriscos que indican los sitios potenciales para unión al polímero de polietilenglicol (unidad "PEG"). Adicionalmente, el listado de la secuencia de aminoácidos del componente proteico/intermediario (?-2036-sin unión a la unidad de PEG) del pegvisomant se identifica en la presente invención como SEQ. ID. NO. 1. Para comparación, el listado de la secuencia de aminoácidoa de la hormona de crecimiento de humano se identifica en la presente invención como SEQ. ID. NO. 2. Ambos listados de secuencia se proveen en la presente invención. Véase también Jorgensen et al., "Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions," J. Chromatography A 817: 205-214 (1998) para la secuencia de la hGH. Estructuralmente, el pegvisomant es una proteína (que contiene
191 residuos de aminoácidos) a los cuales están unidas covalentemente predominantemente de 4 a 6 unidades PEG. El peso molecular del componente proteico/intermediario (B-2036) del pegvisomant es de 21,998 Daltones. El peso molecular de cada unidad PEG de pegvisomant es aproximadamente de 5000 Daltones. Por lo tanto los pesos moleculares predominantes del pegvisomant son de aproximadamente 42,000 (4 unidades PEG/molécula), 47,000 (5 unidades PEG/molécula) y 52,000 (6 unidades PEG/molécula) Daltones. En referencia al agonista, y sin atenerse a la teoría, se cree que la hGH endógena activa a sus receptores cuando una sola molécula de hGH se une a dos de sus moléculas receptoras adyacentes (e idénticas), induciendo homodimerización del receptor mediado por la hormona. Véase las Patentes de E.U.A. Nos. 5,849,535 y 6,057,292. La actividad de la hGH depende de su capacidad para unirse a dos de sus receptores adyacentes (e idénticos) a través de dos sitios de unión separados (sitio 1 y sitio 2) en la misma molécula de hGH. Estos sitios de unión a hGH, designados como sitio 1 y sitio 2, se enumeran como 1 y 2 para reflejar el orden de su unión a los dos receptores adyacentes de hGH (e idénticos) los cuales median la homodimerización dependiente de hGH. Además, sin atenerse por la teoría, se cree que el pegvisomant se une selectivamente a los receptores de la hormona de crecimiento de humano ("receptores de la GH") sobre las superficies celulares, en donde bloquea la unión de la hormona de crecimiento de humano endógena, por lo tanto interfiriendo con la transducción de la señal de la hormona de crecimiento de humano. Las modificaciones estructurales a la porción proteica (también denominada "componente" o "intermediario") del pegvisomant (con relación a la hGH) permiten que el pegvisomant bloquee competitivamente la interacción entre una molécula de la hGH y un receptor de la hGH. El Pegvisomant se une al receptor de la GH, por lo tanto, bloqueando la unión a la GH puesto que el receptor está ocupado. Las modificaciones estructurales previenen la dimerízación del receptor, como un resultado no ocurre la transducción de la señal. Al bloquear así la interacción cercana requerida entre una molécula de la hGH y un receptor de la hGH, el pegvisomant bloquea la homodimerización mediada por hGH de los receptores de la hGH, dándole al pegvisomant su actividad antagonista. Este antagonista se utiliza para tratar condiciones, incluyendo, pero no limitadas a, acromegalia en pacientes que no responden de manera adecuada a la cirugía, terapia de radiación, y/o a otras terapias médicas convencionales, o quienes no pueden tolerar de otra manera estas terapias. Además, las modificaciones estructurales a la porción proteica (B-2036) del pegvisomant les produce que exhiban una afinidad de unión para el receptor de prolactina la cual es menor que aquélla para la hGH, por lo tanto minimizando los efectos laterales no deseables relacionados con la lactación asociados con el uso del pegvisomant. La porción proteica del intermediario (B-2036) del pegvisomant se sintetiza por una cepa de bacteria Escherichia coli que se ha modificado genéticamente mediante la adición de un plásmido que porta un gen para el antagonista del receptor de la hormona de crecimiento (B-2036). Luego el B-2036 se recupera a partir de las células microbianas y se purifica. El B-2036 purificado se polietilenglicosina posteriormente para producir el pegvisomant (PEG B-2036). Las Patentes de E.U.A. 5,849,535 y 6,057,292 describen métodos para elaborar el B-2036 y métodos para conjugación de una o más unidades PEG a B-2036, aunque sin detalles de cómo disminuir, reducir, eliminar, revertir y/o prevenir la formación de niveles inaceptablemente altos de las impurezas de isoformas trisulfuro y des-phe de las mismas. Uno de los problemas encontrados utilizando métodos de elaboración recombinantes convencionales para hacer B-2036 es la formación de sus impurezas de isoforma, tales como sus isoformas des-phe y trisulfuro. La impureza de isoforma des-phe es una en donde la molécula de B-2036 pierde su fenilalanina amino-terminal. Véase la figura 1A que ilustra el residuo sujeto de fenilalanina amino-terminal (por ejemplo, indicado por la letra "F") adyacente al extremo-NH2 del B-2036. La impureza del isoforma trisulfuro es una en donde la molécula de B-2036 contiene un átomo de azufre extra que forma un "enlace trisulfuro" dentro de la molécula. Véase la caja en la figura 1 B. También, véase Andersson et al., "Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli," Int. J. Peptide Protein Res. 47: 311-321 (1996) y A. Jesperson et al., "Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli," Eur. J. Biochem. 219: 365-373 (1994). Sin atenerse a la teoría, se cree que estas impurezas de isoforma típicamente se generan durante el crecimiento celular (por ejemplo, fermentación) y la expresión (síntesis y secreción) del B-2036 en las células hospederas genéticamente modificadas, y/o durante la extracción y purificación de la proteína B-2036. Con respecto a ciertas impurezas, la solicitud internacional WO 94/24157 (publicada el 27 de octubre del 1994) describe un derivado hidrófobo de la hGH que comprende un átomo de azufre extra en comparación con la hGH nativa. Véase WO 94/24 57 en la página 3, líneas 3-10. El átomo de azufre extra del derivado hidrófobo de la hGH forma un "enlace trisulfuro" produciendo una variante trisulfuro de la hGH. Véase el documento WO 94/24157 en la página 7, líneas 11-16. La referencia WO 94/24157 establece adicionalmente que esta variante trisulfuro de la hGH se puede convertir de vuelta a su forma hGH nativa mediante el tratamiento de la variante- trisulfuro de la hGH con un compuesto mercapto tal como cisteína, glutationa, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Véase el documento WO 94/24157 en las páginas 4 y 5. La Solicitud Internacional WO 96/02570 (publicada el 1 de febrero del 1996) describe otro método para convertir la variante trisulfuro de la hGH de vuelta a su forma nativa utilizando ya sea sulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio, o un sulfito de metal férreo alcalino tal como sulfito de magnesio o sulfito de calcio. Véase el documento WO 94/24157 en la página 4, líneas 17-21. La Solicitud Internacional WO 00/02900 (publicada el 20 de enero del 2000) titulada "Method for the production of recombinant peptides with a low amount of trisulfides" discute "un método para la reducción de la cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos recombinantes, por ejemplo, tanto proteínas como péptidos pequeños. La invención se basa en el hallazgo novedoso e inesperado de que la cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos recombinantes se puede reducir mediante la adición de una sal metálica, preferiblemente en exceso, ya sea durante o después de la fermentación y no, como se sugería previamente, mediante la conversión de los trisulfuros formados de la hormona de crecimiento hacia la forma nativa", (énfasis añadido.) Véase el documento WO 00/02900 en la página 2, líneas 21-27. La referencia WO 00/02900 establece adicionalmente que "[l]a proteína puede ser cualquier proteína recombinante pero preferiblemente es hormona de crecimiento recombinante la cual puede ser tanto de humano como de animal tal como hormona de crecimiento de humano (hGH), hormona de crecimiento de bovino (bGH) y hormona de crecimiento de porcino (pGH)." (énfasis añadido.) Véase el documento WO 00/02900 en la página 3, líneas 4-6. La Solicitud Internacional No. WO 02/057478 (publicada el 25 de julio del 2002) titulada "Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells" se dirige a un método para la liberación de una proteína a partir de una cédula hospedera al poner en contacto a la célula hospedera con un agente reductor y un detergente. La referencia establece que el propósito del agente reductor es "facilitar [ ] la recuperación de las proteínas en sus conformaciones nativas". Véase el documento WO 02/057478 en la página 2, líneas 16-18. Además, el documento WO 02/057478 describe que "uno o más agentes reductores son agentes... que reducen los enlaces disulfuro y/o mantienen los residuos sulfhidrilo en su[s] forma(s) reducida(s). Se pueden utilizar cualesquiera de dichos agentes reductores o agentes. En una modalidad preferida, el uno o más agentes reductores utilizados se seleccionan a partir del grupo que consiste de, ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTE); cisteína (Cis) y Tris 2-carboxietilfosfina (TCEP)." (énfasis añadido.) Véase el documento WO 02/057478 a partir de la página 3, línea 24 a la página 4, línea 4. No obstante, las referencias anteriormente mencionadas, no mencionan nada con respecto a la prevención, reversión, reducción, o eliminación de la formación de impurezas de isoforma asociadas con un antagonista de la hormona de crecimiento tal como pegvisomant o su porción proteica, B-2036. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos mejorados para elaborar B-2036 que disminuya, atenúe, prevenga, minimice, revierta y/o elimine la formación de sus impurezas de isoforma (trisulfuro y/o des-phe). De manera similar, estas referencias también no mencionan nada sobre la detección, atenuación, minimización, reversión, reducción o eliminación de la formación de la impureza de la isoforma des-phe de la hormona de crecimiento. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos mejorados para elaborar hormona de crecimiento que disminuye, atenúa, previene, minimiza, revierte y/o elimina la formación de su impureza de isoforma des-phe.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1A ilustra la secuencia de aminoácidos de B-2036 la cual corresponde a SEQ. ID. NO. 1. Los asteriscos (*) en la figura 1A indican nueve (9) sitios potenciales para unión covalente de las unidades PEG a cada molécula de B-2036. Nótese que aunque se identifican nueve (9) sitios posibles, no todos los 9 sitios tienen que estar covalentemente unidos a unidades PEG. Preferiblemente, existen 4-6 unidades PEG por molécula de B-2036. La figura 1B ilustra la estructura de la impureza de isoforma trisulfuro de B-2036 (designada "Trisulfuro (+32 amu")) en comparación con su forma deseable (designada "GHA nativa"). Las figuras 2A a 2D ilustran un diagrama de flujo del procesamiento de purificación B-2036. Las figuras 3A a 3C ilustran un diagrama de flujo del procesamiento restante de purificación B-2036.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
En vista de la necesidad precedente para proveer un procedimiento mejorado para elaborar un agonista de la hormona de crecimiento recombinante, un agonista de la hormona de crecimiento de humano recombinante, un antagonista de la hormona de crecimiento recombinante, y/o un antagonista de la hormona de crecimiento de humano recombinante, con niveles disminuidos de impurezas de ¡soforma indeseables de los mismos, la presente invención se dirige a un procedimiento mejorado o a un procedimiento para producir hormona de crecimiento recombinante (incluyendo, pero no limitado a, hormona de crecimiento de humano) y antagonista de la hormona de crecimiento recombinante (incluyendo, pero no limitado a, antagonista de la hormona de crecimiento de humano) con niveles disminuidos de sus impurezas de ¡soforma des-phe y/o trisulfuro. Con respecto a la hormona de crecimiento recombinante (incluyendo, pero no limitado a hGH), se disminuye la formación de su impureza de isoforma des-phe mediante la adición adecuada de (1 ) un agente quelante o (2) una sal metálica, respectivamente. Con respecto al antagonista de la hormona de crecimiento recombinante (incluyendo, pero no limitado a, antagonista de la hormona de crecimiento de humano), su impureza de isoforma trisulfuro disminuye mediante el contacto adecuado entre la impureza de isoforma trisulfuro y (1 ) un compuesto mercapto, (2) un agente quelante, (3) una sal metálica, (4) un compuesto mercapto junto con una sal metálica, o (5) un compuesto mercapto después del contacto con un agente quelante pero en la ausencia del agente quelante, respectivamente. Con respecto al antagonista de la hormona de crecimiento recombinante (incluyendo, pero no limitado a, antagonista de la hormona de crecimiento de humano), la formación de su impureza de isoforma des-phe disminuye mediante la adición de (1) un agente quelante o (2) una sal metálica, respectivamente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS
Los términos "antagonista de la hormona de crecimiento" y "antagonista del receptor de la hormona de crecimiento" incluyen (pero no se limitan a) polipéptidos que inhiben o que antagonizan de otra manera la unión de la hormona de crecimiento a su receptor de la hormona de crecimiento para bloquear el efecto(s) biológico(s) de la hormona de crecimiento.
Preferiblemente, el "antagonista de la hormona de crecimiento" o el "antagonista del receptor de la hormona de crecimiento" es B-2036 o una variante del mismo. Dichas "variantes" incluyen, pero no se limitan a, homólogos (particularmente homólogos con sustituciones conservativas de aminoácidos, adiciones o deleciones relativas a B-2036), análogos, fragmentos, pseudopéptidos, antibióticos, etc. de los mismos (respectivamente) teniendo actividad antagonista del receptor de la hormona de crecimiento. Los términos "agonista de la hormona de crecimiento" y "agonista del receptor de la hormona de crecimiento" incluyen (pero no se limitan a) polipéptidos que se unen a y activan su receptor de la hormona de crecimiento. Preferiblemente, el "agonista de la hormona de crecimiento" o el "agonista del receptor de la hormona de crecimiento" es hormona de crecimiento de humano o una variante de la misma. Dichas "variantes" incluyen, pero no se limitan a, homólogos (particularmente homólogos con sustituciones conservativas de aminoácidos, adiciones o deleciones relativas a la hormona de crecimiento de humano), análogos, fragmentos, pseudopéptidos, antibióticos, etc. (respectivamente) teniendo actividad de agonista del receptor de la hormona de crecimiento. El término "HORMONA DE CRECIMIENTO Y ANTAGONISTA
DE LA MISMA" se refiere a un agonista de la hormona de crecimiento (por ejemplo, "HORMONA DE CRECIMIENTO") y antagonista de la hormona de crecimiento (por ejemplo, "Y ANTAGONISTA DE LA MISMA").
El término "y" puede significar "y" u "o" como sea apropiado o necesario para citar un procedimiento para producir la disminución deseada en el nivel de la impureza relevante (por ejemplo, impureza de isoforma trisulfuro o des-phe). El término "o" puede significar "y" u "o" como sea apropiado o necesario para citar un procedimiento para producir la disminución deseada en el nivel de la impureza relevante (por ejemplo, impureza de isoforma trisulfuro o des-phe). Como se utiliza en la presente invención, a menos que se indique de otra manera, el término "disminuye" (o variaciones evidentes del mismo) significa eliminar, minimizar, reducir, prevenir y/o atenuar la cantidad de la impureza de la isoforma relevante, ya sea la impureza de isoforma trisulfuro o la impureza de isoforma des-phe. A menos que se indique de otra manera, el término "célula hospedera" (o variaciones evidentes del mismo) se refiere a cualquier célula hospedera en la cual se puede formar B-2036 recombinante o hGH recombinante. Por consiguiente, la célula hospedera puede ser una célula hospedera de mamífero, una célula hospedera vegetal, o una célula hospedera microbiana tal como E. coli. o incluso células de levadura. Es importante mencionar que la célula hospedera sea una que sea adecuada para crecer el componente proteico B-2036 recombinante deseado o hGH recombinante en ésta. Como tal, no existe limitación sobre cuál célula hospedera pueda ser excepto que sea una capaz de producir recombinantemente el componente proteico B-2036 o hGH recombinante de interés o "variantes" de los mismos. Además, como se utiliza en la presente invención, a menos que se indique de otra manera, el término "crecimiento" (o variaciones evidentes del mismo, por ejemplo, crecer) incluye, pero no se limita a, fermentar y cultivar, o de otra manera ocasionar que la célula(s) hospedera(s) prolifere de manera adecuada para producir cantidades deseadas del componente pretéico B-2036 recombinante o hGH recombinante. Además, aunque la presente invención se describe con respecto al B-2036 recombinante, y al PEG B-2036 recombinante, a menos que se indique de otra manera, se entiende que la presente invención se puede utilizar con cualquier agonista de la hormona de crecimiento recombinante, antagonista de la hormona de crecimiento recombinante, ya sea hormona de crecimiento de humano o su antagonista, hormona de crecimiento de humano o su antagonista, o hormona de crecimiento de bovino o su antagonista, etc. El pegvisomant (PEG B-2036) es la forma polietilenglicosilada de la proteína recombinante (B-2036) producida en las células recombinantes hospederas (por ejemplo, células hospederas de E. coli. recombinantes, genéticamente modificadas). La proteína B-2036 se produce durante el crecimiento celular (por ejemplo, mediante fermentación) y expresión (síntesis y secreción). Después de su producción, se aisla el B-2036 (por ejemplo, mediante homogeneización) seguido por purificación (por ejemplo, mediante extracción, centrifugación, cromatografía de fase reversa y cromatografía de intercambio iónico, y cambio de regulador de pH). No obstante, como se evidenció durante la producción recombinante de la proteína B-2036, se forman impurezas de isoforma de B-2036 indeseables, las cuales son las impurezas de isoforma trisulfuro y des-phe de B-2036.
Como se mencionó, la figura 1A ilustra la secuencia de aminoácidos de B-2036 con las abreviaturas estándares de 1 letra indicando cuál aminoácido está presente en cada posición de letra. Para referencia, véase el cuadro 1 a continuación indicando la correspondencia entre la letra y
su aminoácido asociado.
CUADRO 1
Polipéptido Aminoácido Ala (A) Glu (E) Gln (Q) Asp (D) Asn (N) Leu (L) Gly (G) Lys (K) Ser (S) Val (V) Arg (R) Thr (T) Pro (P) lie (I) Met (M) Phe (F) Tyr (Y) Cys (C) Trp (W) His (H) Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de B-2036 se provee en la presente invención como SEQ. ID. NO.1 y la secuencia de aminoácidos de hGH se provee en la presente invención como SEQ. ID. NO. 2. 1. Antagonista de la hormona de crecimiento recombinante v su impureza de isoforma trisulfuro La figura 1B ilustra la estructura de la secuencia de aminoácidos de la impureza de isoforma trisulfuro de B-2036. En particular, la impureza de isoforma trisulfuro contiene un átomo extra de azufre en el puente entre las cisteínas en las posiciones 182 y 189 del componente proteico de B-2036.
a. Disminución de la impureza de isoforma trisulfuro con compuesto(s) mercapto Sin atenerse a la teoría, se cree que el contacto entre el compuesto(s) mercapto seleccionado y la impureza de isoforma trisulfuro del antagonista de la hormona de crecimiento recombinante B-2036 resulta en la conversión del puente trisulfuro cisteína-S-S-S-cisteína de vuelta a su forma nativa cisteína-S-S-cisteína. Adicionalmente, también sin atenerse a la teoría, es posible que la presencia del compuesto(s) mercapto prevenga la formación adicional del mismo puente trisulfuro. Típicamente, el compuesto(s) mercapto es/son añadidos a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente proteico B-2036 recombinante deseado durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de que se ha llevado a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar a la proteína B-2036. Posteriormente, la proteína purificada preferiblemente se polietilenglicosila para producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para los procedimientos de polietilenglicosilación véase la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Cualquier compuesto mercapto se puede utilizar en conexión con la presente invención el cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente, con mezclado adecuado) con el componente proteico de B-2036 junto con su impureza de isoforma trisulfuro, es uno que es adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de B-2036. Los compuestos mercapto preferidos adecuados para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, sulfitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. Otros compuestos mercapto adecuados para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1 ) J. Houk y G. M. Whitesides, "Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfuro Interchange, "J. M. Chem. Soc, 109: 6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, 1a Ed. Pergamon, New York (1973). En particular, véase el cuadro II de Houk et al. identificado en el artículo (1) anteriormente mencionado para un listado de compuestos mercapto ejemplares adecuados para uso con la presente invención. De los compuestos mercapto adecuados, se prefiere más cisteína, o cisteína en combinación con cistina (cisteína dimerizada). La cantidad de cisteína o combinación de cisteína y cistina (cisteína dimerizada, si está presente) que es adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10% de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma trisulfuro es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta) formada. La concentración combinada inicial de la cisteína y cualquier cistina adecuada para uso con la presente invención es preferiblemente de al menos aproximadamente 0.1 mM, de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, respectivamente. Se prefiere proveer el compuesto mercapto en un regulador de pH. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico de B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, 8 histidina. El regulador de pH preferido es Tris. La concentración preferida inicial del regulador de pH es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM, y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.5, o de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.0, respectivamente. De manera notable, en donde se utilizan concentraciones más altas del compuesto mercapto, se pueden tolerar niveles más altos de pH, por ejemplo, tan altos como de aproximadamente 9.5. Así, por ejemplo, si se utliza un gran exceso de cisteína a B-2036, entonces el pH del regulador de pH puede ser tan alto como de aproximadamente 9.5. Como se mencionó anteriormente, se prefiere proveer el compuesto mercapto en un regulador de pH. Además, la cantidad del compuesto mercapto en el regulador de pH debe ser tal que la relación molar de las moles del compuesto mercapto con respecto a las moles de la proteína B-2036 sea de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 ,000. Esto es de esta manera especialmente cuando el compuesto mercapto así utilizado es una combinación de cisteína y, opcionalmente, cisteína en combinación con cistina. Alternativamente, la relación molar de las moles del compuesto mercapto con respecto a las moles de la proteína B-2036 puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,000, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, respectivamente. Típicamente, después de contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro) entre el compuesto mercapto y el componente proteico B-2036 (dentro o a partir de la célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), el componente proteico B-2036 en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, el compuesto(s) mercapto y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitado a, B-2036, se debe mantener a una temperatura preferiblemente de aproximadamente 0°C a aproximadamente 25°C después de que el compuesto mercapto se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contiene el componente proteico de B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente B-2036 se mantiene de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C, respectivamente. Es importante mencionar que la desnaturalización de la proteína B-2036 se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, compuestos mercapto y B-2036, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína de B-2036. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente B-2036 y el compuesto mercapto debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro debe ser por al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas, respectivamente. Típicamente, después de contacto adecuado entre el compuesto(s) mercapto y el componente B-2036, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros, o de 100 litros a aproximadamente 300 litros, respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser cualesquiera a partir de 160 litros a aproximadamente 500 litros. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre el compuesto(s) mercapto y el componente B-2036 incluyen cuestiones tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, compuesto(s) mercapto, el componente B-2036 y cualesquiera de otros componentes en un medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico de B-2036 se minimiza.
b. Disminución de la impureza de isoforma trisulfuro con agente(s) quelante(s) Sin atenerse a la teoría, se cree que el contacto entre el agente(s) quelante(s) seleccionado y (1) la impureza de isoforma trisulfuro, (2) el antagonista de la hormona de crecimiento recombinante B-2036, (3) componente(s) celular de célula hospedera (para la producción recombinante del antagonista), y (4) todas las combinaciones de (1)-(3) resulta en la conversión del puente trisulfuro cisteína-S-S-S-cisteína de regreso a su forma nativa cisteína-S-S-cisteína o disminuir los niveles de impureza. Adicionalmente, también sin atenerse a la teoría, es posible que la presencia del agente(s) quelante(s) prevenga la formación adicional del mismo puente trisulfuro. Típicamente, el agente(s) quelante(s) es/son añadidos a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente proteico B-2036 recombinante deseado durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de que se ha llevado a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la proteína B-2036. Posteriormente, la proteína purificada preferiblemente se polietilenglicosila para producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para los procedimientos de polietilenglicosilación véase la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Se puede utilizar cualquier agente quelante en conexión con la presente invención la cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con el componente proteico de B-2036 junto con su impureza de isoforma trisulfuro, es uno que es adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de B-2036. Los agentes quelantes preferidos adecuados para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, EDTA, EGTA, y DTPA. Los agentes quelantes ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, Deferoxamina, Ditiocarb Sódico, Edetato Calcico Disódico, Edetato Disódico, Edetato Sódico, Edetato Trisódico, Penicilamina, Pentetato Calcico Trisódico, Acido Pentético, Succímero, y Trientina. Nótese que el Edetato Sódico es la forma en sal del EDTA. Otros agentes quelantes adecuados para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharnnacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De los agentes quelantes adecuados, se prefiere más el EDTA. La cantidad de agente quelante que es adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10% de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma trisulfuro es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta) formada. La concentración inicial del EDTA adecuado para uso con la presente invención es preferiblemente al menos aproximadamente 0.01 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mM, respectivamente. Se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH.
Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico de B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. El regulador de pH preferido es Tris. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM, y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Como se mencionó anteriormente, se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH. Además, la cantidad del agente quelante en el regulador de pH debe ser tal que la relación molar de las moles del agente quelante con respecto a las moles de proteína de B-2036 sea de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. Alternativamente, la relación molar de las moles del agente quelante con respecto a las moles de proteína B-2036 puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 1,000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 110, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro) entre el agente quelante y el componente proteico B-2036 (dentro o a partir de la célula hospedera (s) en que se ha completado), el componente proteico B-2036 en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, el agente(s) quelante(s) y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitados a, B-2036, se deben mantener a una temperatura preferiblemente de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que el agente quelante se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contienen el componente proteico de B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente B-2036 se mantiene de aproximadamente 1°C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que, preferiblemente, después de la adición del agente quelante (por ejemplo, EDTA), la temperatura del cual es de aproximadamente 4°C, la temperatura del homogeneizado que contiene el B-2036 se eleva a aproximadamente 30°C después de la homogeneización. Es importante mencionar que la desnaturalización de la proteína B-2036 se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene las células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, agentes quelantes, y B-2036, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína de B-2036. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente B-2036 y el agente quelante debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre el agente(s) quelante(s) y el componente B-2036, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros, o de 100 litros a aproximadamente 300 litros, respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser cualesquiera a partir de 160 litros a aproximadamente 500 litros. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre el agente(s) quelante(s) y el componente B-2036 incluyen cuestiones tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, agente(s) quelante(s), el componente B-2036 y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico B-2036 se minimiza.
c. Disminución de la impureza de isoforma trisulfuro con sal(es) metálica(s) Sin atenerse a la teoría, se cree que el contacto entre la sal(es) metálica(s) seleccionada y (1 ) la impureza de isoforma trisulfuro, (2) el antagonista de la hormona de crecimiento recombinante B-2036, (3) el componente(s) celular de célula hospedera (para la producción recombinante del antagonista), y (4) todas las combinaciones de (1)-(3) resulta en la conversión del puente trisulfuro cisteína-S-S-S-cisteína de regreso a su forma nativa cisteína-S-S-cisteína o disminuir los niveles de impureza.
Adicionalmente, también sin atenerse a la teoría, es posible que la presencia de la sal(es) metál'ica(s) previene la formación adicional del puente trisulfuro mismo. Típicamente, la sal(es) metálica(s) es/son añadidas a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente proteico B-2036 recombinante deseado durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula hospedera(s). Además, después de que se ha realizado el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la proteína B-2036. Posteriormente, la proteína purificada preferiblemente se polietilenglicosila para producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para los procedimientos de polietilenglicosilación véase la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Cualquier sal metálica se puede utilizar en conexión con la presente invención la cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con el componente proteico de B-2036 junto con su impureza de ¡soforma trisulfuro, es una que es adecuada para disminuir el nivel de la impureza de ¡soforma trisulfuro, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de B-2036. La sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención incluye, pero no se limita a, sal(es) metálica(s) térrea(s) de álcali, sal(es) metálica(s) térrea(s) alcalina(s), sal(es) metálica(s) de transición y combinaciones de las mismas. Las sales metálicas preferidas adecuadas para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos.
Otras sales metálicas adecuadas se mencionan en las siguientes referencias: (1 ) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001 ) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De las sales metálicas adecuadas para uso con la presente invención también se prefieren fosfato de sodio, ZnCI2 y combinaciones de los mismos. La cantidad de sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10% de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma trisulfuro es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta) formada. La concentración inicial de la sal metálica (por ejemplo, fosfato de sodio) adecuada para uso con la presente invención es preferiblemente al menos aproximadamente 0.1 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mM, respectivamente. Se prefiere proveer la sal metálica en un regulador de pH. No obstante, el fosfato de sodio puede actuar tanto como un regulador de pH y como una sal metálica adecuada. No obstante, la sal(es) metálica(s) adicional adecuada se puede añadir al regulador de pH de fosfato de sodio. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico de B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Después de que la sal metálica se provee en un regulador de pH
(o en el caso de NaP, en donde la solución de NaP actúa tanto como la sal metálica como el regulador de pH), la cantidad de la sal metálica en el regulador de pH (o la solución de NaP también actúa tanto como el regulador de pH) debe ser tal que la relación molar de las moles de la sal metálica con respecto a las moles de la proteína B-2036 es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000. Alternativamente, la relación molar de las moles de la sal metálica con respecto a las moles de la proteína B-2036 puede ser de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500, respectivamente.. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro) entre la sal(es) metálica(s) y el componente proteico B-2036 (dentro o a partir de la célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), el componente proteico B-2036 en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, la sal(es) metálica(s) y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitado a, B-2036, preferiblemente debe mantenerse a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que la sal metálica se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contiene el componente proteico B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente B-2036 se mantiene de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que después de la homogeneización con la sal metálica (por ejemplo, NaP), la temperatura del homogeneizado se puede elevar. Es importante mencionar que la desnaturalización de la proteína B-2036 se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene las células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, sal metálica, B-2036, y opcionalmente compuesto mercapto, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína de B-2036. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente B-2036 y el agente quelante debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir ei nivel de la impureza de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre la sal(es) metálica(s) y el componente B-2036, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 2,000 litros, o de 200 litros a aproximadamente 1 , 500 litros, respectivamente. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre la sal(es) metálica(s) y el componente B-2036 incluyen cuestiones tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, sal(es) metálica(s), el componente B-2036 y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico de B-2036 se minimiza.
2. Antagonista de la hormona de crecimiento recombinante y su impureza de isoforma Des-Phe a. Disminución de la impureza de isoforma des-phe con agente quelante Sin atenerse a la teoría, se cree que la adición del agente(s) quelante(s) al antagonista de la hormona de crecimiento recombinante B-2036 resulta en una disminución en el nivel de la impureza de isoforma des-phe ya sea mediante una reducción real en el nivel de la misma y/o prevención de formación adicional de des-phe. Típicamente, el agente(s) quelante(s) es/son añadidos a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente proteico B-2036 recombinante deseado durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de llevar a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la proteína B-2036. Posteriormente, la proteína purificada preferiblemente se polietilenglicosila para producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para los procedimientos de polietilenglicosilación véase la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Se puede utilizar cualquier agente quelante en conexión con la presente invención el cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con el componente proteico de B-2036 junto con su impureza de isoforma des-phe, es uno que es adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de B-2036. Los agentes quelantes preferidos adecuados para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, EDTA, EGTA, y DTPA. Los agentes quelantes ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, Deferoxamine, Ditiocarb Sódico, Edetato Cálcico Disódico, Edetato Disódico, Edetato Sódico, Edetato Trisódico, Penicilamina, Pentetato Calcico Trisódico, Acido Pentético, Succímero, y Trientina. Nótese que el Edetato Sódico es la forma de sal a partir del EDTA. Otros agentes quelantes adecuados para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De los agentes quelantes adecuados, se prefiere más el EDTA. La cantidad de agente quelante que es adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de ¡soforma des-phe por al menos aproximadamente 10% de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma des-phe es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta) formada. La concentración inicial del EDTA adecuada para uso con la presente invención es preferiblemente al menos de aproximadamente 0.01 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mM, respectivamente. Se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico de B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. El regulador de pH preferido es Tris. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM, y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Como se mencionó anteriormente, se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH. Además, la cantidad del agente quelante en el regulador de pH debe ser tal que la relación molar de las moles de agente quelante con respecto a las moles de proteína B-2036 sea de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. Alternativamente, la relación molar de las moles del agente quelante con respecto a las moles de la proteína B-2036 puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 110, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe) entre el agente quelante y el componente proteico B-2036 (dentro o a partir de la célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), el componente proteico B-2036 en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, el agente(s) quelante(s) y sus otros contenidos incluye, pero no se limita a, B-2036, se deben mantener a una temperatura preferiblemente de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que el agente quelante se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contiene el componente proteico B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente B-2036 se mantiene de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que, preferiblemente, después de la adición del agente quelante (por ejemplo, EDTA), la temperatura del cual es de aproximadamente 4°C, la temperatura del homogeneizado que contiene el B-2036 se eleva a aproximadamente 30°C después de la homogeneización. Es importante mencionar que la desnaturalización de la proteína B-2036 se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, agentes quelantes, y B-2036, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína de B-2036. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente B-2036 y el agente quelante debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre el agente(s) quelante(s) y el componente B-2036, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros, o de 100 litros a aproximadamente 300 litros, respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser cualesquiera a partir de 160 litros a aproximadamente 500 litros. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre el agente(s) quelante(s) y el componente B-2036 incluyen circunstancias tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser aquella que es adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, agente(s) quelante(s), el componente B-2036 y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico B-2036 se minimiza.
b. Disminución de la impureza de isoforma Des Phe con sal metálica Sin atenerse a la teoría, se cree que la adición de sal(es) metálica(s) al antagonista de la hormona de crecimiento recombinante B-2036 resulta en una disminución en el nivel de la impureza de isoforma des-phe ya sea mediante una reducción real en el nivel de la misma y/o prevención de formación adicional de des-phe. Típicamente, la sal(es) metálica(s) es/son añadidas a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente proteico B-2036 recombinante deseado durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de que se ha llevado a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la proteína B-2036. Posteriormente, la proteína purificada preferiblemente se polietilenglicosila para producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para los procedimientos de polietilenglicosilación véase la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. Cualquier sal metálica se puede utilizar en conexión con la presente invención la cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con el componente proteico de B-2036 junto con su impureza de isoforma des-phe, es una que es adecuada para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de B-2036. La sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención incluye, pero no se limita a, sal(es) metálica(s) térrea(s) de álcali(s), sal(es) metálica(s) térrea(s) alcalina(s), sal(es) metálica(s) de transición y combinaciones de las mismas. Las sales metálicas preferidas adecuadas para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de las mismas. Otras sales metálicas adecuadas para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha, (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De las sales metálicas adecuadas para uso con la presente invención también se prefieren fosfato de sodio, ZnC y combinaciones de los mismos. La cantidad de sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de ¡soforma des-phe por al menos aproximadamente 10% de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma des-phe es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta) formada. La concentración inicial de la sal metálica (por ejemplo, fosfato de sodio) adecuada para uso con la presente invención preferiblemente es de al menos aproximadamente 0.1 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mM, respectivamente. Se prefiere proveer la sal metálica en un regulador de pH. No obstante, el fosfato de sodio puede actuar tanto como un regulador de pH y como una sal metálica adecuada. No obstante, la sal(es) metálica(s) adicional adecuada se puede añadir al regulador de pH con fosfato de sodio. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no degrada la formación del componente proteico de B-2036. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Después de que la sal metálica se provee en un regulador de pH (o en el caso de NaP, en donde la solución de NaP actúa tanto como la sal metálica como el regulador de pH), la cantidad de la sal metálica en el regulador de pH (o la solución de NaP que también actúa como el regulador de pH) debe ser tal que la relación molar de las moles de sal metálica con respecto a las moles de proteína B-2036 es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000. Alternativamente, la relación molar de las moles de la sal metálica con respecto a las moles de proteína B-2036 puede ser de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de ¡soforma des-phe) entre la sal(es) metálica(s) y el componente proteico B-2036 (dentro o a partir de la célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), el componente proteico B-2036 en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, la sal(es) metálica(s) y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitado a, B-2036, preferiblemente debe mantenerse a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que la sal metálica se ha añadido a ia célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contiene el componente proteico B-2036. También preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente B-2036 se mantiene de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que después de la homogeneización con la sal metálica (por ejemplo, NaP), la temperatura del homogeneizado se puede elevar. Es importante mencionar que la desnaturalización de la proteína B-2036 se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene las células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, sal metálica, B-2036, y opcionalmente compuesto mercapto, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína de B-2036. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente B-2036 y la sal metálica debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre la sal(es) metálica(s) y el componente B-2036, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 2,000 litros, o de 200 litros a aproximadamente 1,500 litros, respectivamente. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre la sal(es) metálica(s) y el componente B-2036 incluyen circunstancias tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, sal(es) metálica(s), del componente B-2036 y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico de B-2036 se minimiza.
3. Hormona de crecimiento recombinante y su impureza de isoforma Des-Phe a. Disminución de la impureza de isoforma des-phe con agente quelante Sin atenerse a la teoría, se cree que la adición de agente(s) quelante(s) a la hormona de crecimiento recombinante resulta en una disminución en el nivel de la impureza de isoforma des-phe ya sea mediante una reducción real en el nivel de la misma y/o prevención de formación adicional de des-phe. Típicamente, el agente(s) quelante(s) es/son añadidos a la célula(s) hospedera(s) sintetizando la proteína recombinante de la hormona de crecimiento deseada durante o después (o durante y después) del crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de que se ha llevado a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la hormona de crecimiento proteica. Se puede utilizar cualquier agente quelante en conexión con la presente invención el cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con la hormona de crecimiento proteica junto con su impureza de isoforma des-phe, es uno que es adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de la hormona de crecimiento. Los agentes quelantes preferidos adecuados para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, EDTA, EGTA, y DTPA. Los agentes quelantes ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, Deferoxamina, Ditiocarb Sódico, Edetato Cálcico Disódico, Edetato Disódico, Edetato Sódico, Edetato Trisódico, Penici!amina, Pentetato Cálcico Trisódico, Acido Pentético, Succímero, y Trientina. Nótese que el Edetate Sódico es la forma en sal del EDTA. Otros agentes quelantes adecuados para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1 ) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania(1980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De los agentes quelantes adecuados, se prefiere más el EDTA. La cantidad de agente quelante que es adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de ¡soforma des-phe por al menos aproximadamente 10% de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma des-phe es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta) formada. La concentración inicial del EDTA adecuada para uso con la presente invención preferiblemente es al menos aproximadamente 0.01 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mM, respectivamente. Se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. El regulador de pH preferido es Tris. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM, y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Como se mencionó anteriormente, se prefiere proveer el agente quelante en un regulador de pH. Además, la cantidad del agente quelante en el regulador de pH debe ser tal que la relación molar de las moles del agente quelante con respecto a las moles de la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. Alternativamente, la relación molar de las moles del agente quelante con respecto a las moles de la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 1,000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 1 0, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe) entre el agente quelante y la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) (dentro o a partir de la célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente. Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, el agente(s) quelante(s) y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitado a, la hormona de crecimiento proteica, preferiblemente se debe mantener a una temperatura preferiblemente de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que el agente quelante se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de la misma que contiene la hormona de crecimiento proteica. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente de la hormona de crecimiento proteica se mantiene de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que, preferiblemente, después de la adición del agente quelante (por ejemplo, EDTA), la temperatura del cual es de aproximadamente 4°C, la temperatura del homogeneizado que contiene la hormona de crecimiento se eleva a aproximadamente 30°C después de la homogeneización. Es importante mencionar que la desnaturalización de la hormona de crecimiento proteica se presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, agentes quelantes, y hormona de crecimiento proteica, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la hormona de crecimiento proteica. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente de la hormona de crecimiento proteica y el agente quelante debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe.
Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre el agente(s) quelante(s) y la hormona de crecimiento proteica, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros, o de 100 litros a aproximadamente 300 litros, respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser cualesquiera a partir de 160 litros a aproximadamente 500 litros. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre el agente(s) quelante(s) y la hormona de crecimiento proteica incluyen circunstancias tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, agente(s) quelante(s), la hormona de crecimiento proteica y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico de la hormona de crecimiento se minimiza.
b. Disminución de la impureza de isoforma des-phe con sal metálica Sin atenerse a la teoría, se cree que la adición de sal(es) metálica(s) a la hormona de crecimiento recombinante resulta en una disminución en el nivel de la impureza de isoforma des-phe ya sea mediante una reducción real en el nivel del mismo y/o prevención de la formación adicional de des-phe. Típicamente, la sal(es) metálica(s) es/son añadidas a la célula(s) hospedera(s) sintetizando el componente de la hormona de crecimiento proteica recombinante deseada durante o después (o durante y después) el crecimiento de la célula(s) hospedera(s). Además, después de que se ha llevado a cabo el crecimiento y los pasos de contacto, se prefiere purificar la hormona de crecimiento proteica. Cualquier sal metálica se puede utilizar en conexión con la presente invención la cual, cuando se pone en contacto (preferiblemente con mezclado adecuado) con el componente proteico de la hormona de crecimiento junto con su impureza de isoforma des-phe, es una que es adecuada para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe, preferiblemente sin degradar (o degradando sustancialmente) la producción de la hormona de crecimiento. La sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención incluye, pero no se limita a, sal(es) metálica(s) térrea(s) de álcali(s), sal(es) metálica(s) térrea(s) alcalina(s), sal(es) metálica(s) de transición y combinaciones de las mismas. Las sales metálicas preferidas adecuadas para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. Otras sales metálicas adecuadas para uso con la presente invención se mencionan en las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12a Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania ( 980) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisión (16a Edición), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y cada una y cada edición subsecuente de la misma hasta la fecha; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001 ) y (2002-2003) ediciones de las mismas. De las sal metálicas adecuadas para uso con la presente invención también se prefieren fosfato de sodio, ZnCb y combinaciones de los mismos. La cantidad de sal(es) metálica(s) adecuada para uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es adecuada para disminuir la impureza de isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10% de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta, en donde se promediaron múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de isoforma des-phe es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, o 50%, respectivamente, de su concentración más alta (o su concentración promedio más alta) formada. La concentración inicial de la sal metálica (por ejemplo, fosfato de sodio) adecuada para uso con la presente invención preferiblemente es al menos aproximadamente 0.1 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mM, respectivamente. Se prefiere proveer la sal metálica en un regulador de pH. No obstante, el fosfato de sodio puede actuar tanto como un regulador de pH como una sal metálica adecuada. No obstante, la sal(es) metálica(s) adicional adecuada se puede añadir al regulador de pH de fosfato de sodio. Preferiblemente, el regulador de pH es uno que es adecuado para uso con la presente invención, por ejemplo, no previene la formación del componente proteico de B-2036 o lo degrada una vez que se forma. Los reguladores de pH para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. La concentración preferida del regulador de pH inicial es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM y más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden utilizar otros reguladores de pH. Preferiblemente, estos reguladores de pH son adecuados para mantener el pH del medio de crecimiento dondequiera en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, respectivamente. Después de que la sal metálica se provee en un regulador de pH (o en el caso de NaP, en donde la solución de NaP actúa tanto como la sal metálica como el regulador de pH), la cantidad de la sal metálica en el regulador de pH (o la solución de NaP que también actúa como el regulador de pH) debe ser tal que la relación molar de las moles de sal metálica con respecto a las moles de la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000. Alternativamente, la relación molar de las moles de la sal metálica con respecto a las moles de la hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) puede ser de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado (para disminuir el nivel de la impureza de ¡soforma des-phe) entre la sal(es) metálica(s) y la
hormona de crecimiento proteica (por ejemplo, hGH) (dentro o a partir de la
célula(s) hospedera(s) en que se ha completado), la hormona de crecimiento i proteica en el regulador de pH tiene una concentración de aproximadamente
0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a
aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de crecimiento junto con el regulador de pH, la sal(es) metálica(s) y sus otros contenidos incluyendo, pero no limitado a, la hormona de crecimiento proteica, preferiblemente debe mantenerse a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de que la sal metálica se ha añadido a la célula(s) hospedera(s) o lisado de las mismas que contiene la hormona de crecimiento proteica. También, preferiblemente, la temperatura de la célula(s) hospedera(s) y/o lisado de la misma que contiene el componente de la hormona de crecimiento proteica se mantiene de aproximadamente 1°C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 2°C a aproximadamente 10°C, o de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C, respectivamente. Nótese que después de la homogeneización con la sal metálica (por ejemplo, NaP), la temperatura del homogeneizado se puede elevar. Es importante mencionar que la desnaturalización de la hormona de crecimiento proteica se
presenta a aproximadamente más de 40°C. Como tal, es deseable mantener
la temperatura del homogeneizado (por ejemplo, que contiene las células hospederas, medio de crecimiento, regulador de pH, sal metálica, hormona de crecimiento proteica, y opcionalmente compuesto mercapto, etc.) a una temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la hormona de crecimiento proteica. Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el componente de la hormona de crecimiento proteica y la sal metálica debe ser durante un tiempo adecuado para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe. Los tiempos de contacto ejemplares adecuados para disminuir el nivel de la impureza de isoforma des-phe deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas, respectivamente. Típicamente, después del contacto adecuado entre la sal(es) metálica(s) y la hormona de crecimiento proteica, el regulador de pH que contiene el mismo tiene un volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5,000 litros, de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 2,000 litros, o de 200 litros a aproximadamente 1 ,500 litros, respectivamente. Otros parámetros que pueden ser de interés durante el contacto entre la sal(es) metálica(s) y la hormona de crecimiento proteica incluyen circunstancias tales como velocidad de mezclado. La velocidad de mezclado debe ser tal que sea adecuada para formar una mezcla homogénea (de la célula(s) hospedera(s), lisado de la misma, regulador de pH, sal metálica(s), la hormona de crecimiento proteica y cualesquiera otros componentes en el medio de crecimiento) a la vez que se minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezclado adecuada. Obviamente, la velocidad de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos anteriormente mencionados y cualquier degradación del componente proteico de la hormona de crecimiento se minimiza.
MODALIDADES DE LA INVENCION
1. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas, el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto con dicha impureza bajo condiciones adecuadas a un compuesto mercapto para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido. 2. El procedimiento de la modalidad 1 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a).
3. El procedimiento de la modalidad 2 que comprende adicionalmente el paso de: (c) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado. 4. El procedimiento de la modalidad 3 que comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado. 5. El procedimiento de la modalidad 2 en donde dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de sulfitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 6. El procedimiento de la modalidad 1 en donde dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de sulfitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 7. El procedimiento de la modalidad 5 en donde dicho compuesto mercapto comprende cisteína o una combinación de cisteína y cistina. 8. El procedimiento de la modalidad 6 en donde dicho compuesto mercapto comprende cisteína o una combinación de cisteína y cistina. 9. El procedimiento de la modalidad 7 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma trisulfuro se pone en contacto con dicha cisteína o combinación de cisteína y cistina por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 10. El procedimiento de la modalidad 9 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha ¡soforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 11. El procedimiento de la modalidad 8 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha ¡soforma trisulfuro se pone en contacto con dicha cisteína por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 12. El procedimiento de la modalidad 11 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 13. El procedimiento de la modalidad 1 en donde dicho compuesto mercapto se provee en un regulador de pH. 14. El procedimiento de la modalidad 2 en donde dicho compuesto mercapto se provee en un regulador de pH. 5. El procedimiento de la modalidad 7 en donde dicha cisteína o combinación de cisteína y cistina se provee en un regulador de pH. 16. El procedimiento de la modalidad 8 en donde dicha cisteína o combinación de cisteína y cistina se provee en un regulador de pH. 17. El procedimiento de la modalidad 15 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho regulador de pH tiene una concentración de cisteína combinada inicial y de cistina de al menos aproximadamente 0.1 m . 18. El procedimiento de la modalidad 16 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho regulador de pH tiene una concentración de cisteína combinada inicial y de cistina de al menos aproximadamente 0.1 mM. 19. El procedimiento de la modalidad 17 en donde dicha concentración de cisteína combinada inicial y de cistina es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 10 mM. 20. El procedimiento de la modalidad 18 en donde dicha concentración de cisteína combinada inicial y de cistina es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 10 mM. 21. El procedimiento de la modalidad 19 en donde dicha concentración de cisteína combinada inicial y de cistina es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM. 22. El procedimiento de la modalidad 20 en donde dicha concentración de cisteína combinada inicial y de cistina es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM. 23. El procedimiento de la modalidad 13 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 24. El procedimiento de la modalidad 14 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 25. El procedimiento de la modalidad 15 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina.
26. El procedimiento de la modalidad 16 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 27. El procedimiento de la modalidad 23 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 28. El procedimiento de la modalidad 26 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 29. El procedimiento de la modalidad 25 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 30. El procedimiento de la modalidad 24 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 31. El procedimiento de la modalidad 29 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 32. El procedimiento de la modalidad 28 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 33. El procedimiento de la modalidad 31 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 34. El procedimiento de la modalidad 32 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 35. El procedimiento de la modalidad 1 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 36. El procedimiento de la modalidad 2 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ.ID. NO. 1]. 37. El procedimiento de la modalidad 25 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 38. El procedimiento de la modalidad 26 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 39. El procedimiento de la modalidad 38 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho regulador de pH tiene una concentración de cisteína combinada inicial y de cisteína de al menos aproximadamente 0.1 mM. 40. El procedimiento de la modalidad 37 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho regulador de pH tiene una concentración de cisteína combinada inicial y de cisteína de al menos aproximadamente 0.1 mM. 41. El procedimiento de la modalidad 37 en donde dicha combinación de cisterna y cistina en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar combinada de moles de cisteína y moles de cistina en relación con las moles de B-2036 de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1000. 42. El procedimiento de la modalidad 38 en donde dicha combinación de cisteína y cistina en dicho regulador de pH y dicho B-2036 y antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar combinada de moles de cisteína y moles de cistina en relación con las moles de B-2036 de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1000. 43. El procedimiento de la modalidad 37 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. 44. El procedimiento de la modalidad 38 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. 45. El procedimiento de la modalidad 43 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 46. El procedimiento de la modalidad 44 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml.
47. El método de la modalidad 45 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. 48. El método de la modalidad 46 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. 49. El procedimiento de la modalidad 37 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 50. El procedimiento de la modalidad 38 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 51. El procedimiento de la modalidad 49 en donde dicho pH es de aproximadamente 7. 5 a aproximadamente 8. 5. 52. El procedimiento de la modalidad 50 en donde dicho pH es de aproximadamente 7. 5 a aproximadamente 8.5. 53. El procedimiento de la modalidad 37 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 25°C después de dicho paso de contacto (a). 54. El procedimiento de la modalidad 38 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 25°C después de dicho paso de contacto (a). 55. El procedimiento de la modalidad 53 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. 56. El procedimiento de la modalidad 54 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. 57. El procedimiento de la modalidad 37 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de al menos aproximadamente 30 minutos. 58. El procedimiento de la modalidad 38 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de al menos aproximadamente 30 minutos. 59. El procedimiento de la modalidad 57 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas. 60. El procedimiento de la modalidad 58 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas. 61. El procedimiento de la modalidad 59 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas. 62. El procedimiento de la modalidad 60 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas. 63. El procedimiento de la modalidad 37 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 64. El procedimiento de la modalidad 38 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L.
65. El procedimiento de la modalidad 63 en donde dicho volumen es de aproximadamente 10 L a aproximadamente 500 L. 66. El procedimiento de la modalidad 64 en donde dicho volumen es de aproximadamente 10 L a aproximadamente 500 L. 67. El procedimiento de la modalidad 65 en donde dicho volumen es de aproximadamente 100 L a aproximadamente 300 L. 68. El procedimiento de la modalidad 66 en donde dicho volumen es de aproximadamente 100 L a aproximadamente 300 L. 69. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismo para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido. 70. El procedimiento de la modalidad 69 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a). 71. El procedimiento de la modalidad 70 que comprende adicionalmente el paso de: (c) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado. 72. El procedimiento de la modalidad 71 que comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado. 73. El procedimiento de la modalidad 70 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA, EGTA, y
DTPA. 74. El procedimiento de la modalidad 69 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA, EGTA, y DTPA. 75. El procedimiento de la modalidad 73 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 76. El procedimiento de la modalidad 74 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 77. El procedimiento de la modalidad 75 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma trisulfuro se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 78. El procedimiento de la modalidad 77 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 79. El procedimiento de la modalidad 76 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma trisulfuro se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 80. El procedimiento de la modalidad 79 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 81. El procedimiento de la modalidad 69 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 82. El procedimiento de la modalidad 70 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 83. El procedimiento de la modalidad 75 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 84. El procedimiento de la modalidad 76 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 85. El procedimiento de la modalidad 83 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 86. El procedimiento de la modalidad 84 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0. 01 mM.
87. El procedimiento de la modalidad 85 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM. 88. El procedimiento de la modalidad 86 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM. 89. El procedimiento de la modalidad 87 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. 90. El procedimiento de la modalidad 87 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. 91. El procedimiento de la modalidad 89 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. 92. El procedimiento de la modalidad 89 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. 93. El procedimiento de la modalidad 81 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato,
HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 94. El procedimiento de la modalidad 82 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 95. El procedimiento de la modalidad 83 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 96. El procedimiento de la modalidad 84 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 97. El procedimiento de la modalidad 93 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 98. El procedimiento de la modalidad 96 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 99. El procedimiento de la modalidad 95 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 100. El procedimiento de la modalidad 94 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 101. El procedimiento de la modalidad 99 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 102. El procedimiento de la modalidad 98 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM.
103. El procedimiento de la modalidad 101 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 104. El procedimiento de la modalidad 102 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 105. El procedimiento de la modalidad 69 en donde dicho poiipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 106. El procedimiento de la modalidad 70 en donde dicho poiipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 107. El procedimiento de la modalidad 95 en donde dicho poiipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 108. El procedimiento de la modalidad 96 en donde dicho poiipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 109. El procedimiento de la modalidad 107 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH y en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 1 0. El procedimiento de la modalidad 108 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH y en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 111. El procedimiento de la modalidad 107 en donde dicho EDTA en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. 112. El procedimiento de la modalidad 108 en donde dicho EDTA en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 1 a aproximadamente ,000. 113. El procedimiento de la modalidad 111 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 114. El procedimiento de la modalidad 112 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 115. El procedimiento de la modalidad 113 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 116. El procedimiento de la modalidad 114 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 17. El procedimiento de la modalidad 107 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml.
118. El procedimiento de la modalidad 108 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 119. El procedimiento de la modalidad 117 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 120. El procedimiento de la modalidad 118 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 121. El procedimiento de la modalidad 107 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 122. El procedimiento de la modalidad 108 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 123. El procedimiento de la modalidad 121 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 124. El procedimiento de la modalidad 122 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 125. El procedimiento de la modalidad 107 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 126. El procedimiento de la modalidad 108 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 127. El procedimiento de la modalidad 125 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 128. El procedimiento de la modalidad 126 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 5°C. 129. El procedimiento de la modalidad 107 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 130. El procedimiento de la modalidad 108 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 131. El procedimiento de la modalidad 129 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 132. El procedimiento de la modalidad 130 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 133. El procedimiento de la modalidad 107 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 134. El procedimiento de la modalidad 108 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 135. El procedimiento de la modalidad 133 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 136. El procedimiento de la modalidad 134 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 137. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido. 138. El procedimiento de la modalidad 137 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a).
139. El procedimiento de la modalidad 138 que comprende adicionalmente los pasos de: (c) opcionalmente poner en contacto de manera adicional a dicha impureza con un compuesto mercapto, y (c') purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado. 140. El procedimiento de la modalidad 139 que comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado. 141. El procedimiento de la modalidad 138 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de las mismas. 142. El procedimiento de la modalidad 37 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de las mismas. 143. El procedimiento de la modalidad 141 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 144. El procedimiento de la modalidad 142 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 145. El procedimiento de la modalidad 143 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y ZnCI2. 146. El procedimiento de la modalidad 144 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y ZnCI2. 147. El procedimiento de la modalidad 137 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma trisulfuro se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 0%. 148. El procedimiento de la modalidad 147 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 149. El procedimiento de la modalidad 138 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma trisulfuro se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 150. El procedimiento de la modalidad 149 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 50%. 151. El procedimiento de la modalidad 137 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 152. El procedimiento de la modalidad 138 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 153. El procedimiento de la modalidad 51 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 154. El procedimiento de la modalidad 152 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 155. El procedimiento de la modalidad 153 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 156. El procedimiento de la modalidad 154 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 157. El procedimiento de la modalidad 145 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 158. El procedimiento de la modalidad 146 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio.
159. El procedimiento de la modalidad 151 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 160. El procedimiento de la modalidad 153 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato,
HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 161. El procedimiento de la modalidad 137 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 162. El procedimiento de la modalidad 138 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ.ID. NO. 1]. 163. El procedimiento de la modalidad 160 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 164. El procedimiento de la modalidad 159 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 165. El procedimiento de la modalidad 163 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 166. El procedimiento de la modalidad 164 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 167. El procedimiento de la modalidad 165 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 168. El procedimiento de la modalidad 166 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 169. El procedimiento de la modalidad 163 en donde dicha sal metálica en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 170. El procedimiento de la modalidad 164 en donde la sal metálica en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 171. El procedimiento de la modalidad 169 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000. 172. El procedimiento de la modalidad 170 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000. 173. El procedimiento de la modalidad 171 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 174. El procedimiento de la modalidad 172 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 175. El procedimiento de la modalidad 153 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio.
176. El procedimiento de la modalidad 154 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio. 177. El procedimiento de la modalidad 175 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 178. El procedimiento de la modalidad 176 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 179. El procedimiento de la modalidad 177 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM. 180. El procedimiento de la modalidad 178 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM. 181. El procedimiento de la modalidad 163 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 182. El procedimiento de la modalidad 164 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 183. El procedimiento de la modalidad 181 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 184. El procedimiento de la modalidad 182 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 85. El procedimiento de la modalidad 163 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 186. El procedimiento de la modalidad 184 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 187. El procedimiento de la modalidad 185 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 188. El procedimiento de la modalidad 186 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 189. El procedimiento de la modalidad 163 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 190. El procedimiento de la modalidad 164 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a).
191. El procedimiento de la modalidad 189 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 192. El procedimiento de la modalidad 190 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 193. El procedimiento de la modalidad 163 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 194. El procedimiento de la modalidad 164 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 195. El procedimiento de la modalidad 193 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 196. El procedimiento de la modalidad 194 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 197. El procedimiento de la modalidad 163 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 198. El procedimiento de la modalidad 164 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 199. El procedimiento de la modalidad 197 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 200. El procedimiento de la modalidad 198 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 201. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un pollpéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1 ) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismo para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es la isoforma des-phe de dicho polipéptido. 202. El procedimiento de la modalidad 201 que comprende adicionalmente ei paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a). 203. El procedimiento de la modalidad 202 que comprende adicionalmente el paso de: (c) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado. 204. El procedimiento de la modalidad 203 que comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado. 205. El procedimiento de la modalidad 202 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA, EGTA, y DTPA. 206. El procedimiento de la modalidad 201 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA, EGTA, y DTPA. 207. El procedimiento de la modalidad 205 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 208. El procedimiento de la modalidad 206 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 209. El procedimiento de la modalidad 207 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 210. El procedimiento de la modalidad 209 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 211. El procedimiento de la modalidad 208 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 212. El procedimiento de la modalidad 2 1 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha ¡soforma des-phe por ai menos aproximadamente 50%. 213. El procedimiento de la modalidad 201 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 214. El procedimiento de la modalidad 202 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 215. El procedimiento de la modalidad 207 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 216. El procedimiento de la modalidad 208 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 2 7. El procedimiento de la modalidad 2 5 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 218. El procedimiento de la modalidad 216 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 219. El procedimiento de la modalidad 217 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM. 220. El procedimiento de la modalidad 218 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM. 221. El procedimiento de la modalidad 219 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 m a aproximadamente 20 mM. 222. El procedimiento de la modalidad 220 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. 223. El procedimiento de la modalidad 221 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de 2 mM a aproximadamente 10 mM. 224. El procedimiento de la modalidad 222 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de 2 mM a aproximadamente 10 mM. 225. El procedimiento de la modalidad 213 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 226. El procedimiento de la modalidad 214 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 227. El procedimiento de la modalidad 215 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 228. El procedimiento de la modalidad 216 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato,
HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 229. El procedimiento de la modalidad 225 en donde dicho regulador de pH comprende Tris.
230. El procedimiento de la modalidad 226 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 231. El procedimiento de la modalidad 227 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 232. El procedimiento de la modalidad 228 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 233. El procedimiento de la modalidad 229 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 234. El procedimiento de la modalidad 230 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 235. El procedimiento de la modalidad 233 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 236. El procedimiento de la modalidad 234 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 237. El procedimiento de la modalidad 201 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1].
238. El procedimiento de la modalidad 202 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 239. El procedimiento de la modalidad 227 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 240. El procedimiento de la modalidad 228 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ.ID. NO. 1]. 241. El procedimiento de la modalidad 239 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 242. El procedimiento de la modalidad 240 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 243. El procedimiento de la modalidad 239 en donde dicho EDTA en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. 244. El procedimiento de la modalidad 240 en donde dicho EDTA en dicho regulador de pH y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000.
245. El procedimiento de la modalidad 243 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 246. El procedimiento de la modalidad 244 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 247. El procedimiento de la modalidad 245 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 248. El procedimiento de la modalidad 246 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 249. El procedimiento de la modalidad 239 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 250. El procedimiento de la modalidad 240 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 251. El procedimiento de la modalidad 249 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 252. El procedimiento de la modalidad 250 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 253. El procedimiento de la modalidad 249 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. 254. El procedimiento de la modalidad 250 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. 255. El procedimiento de la modalidad 239 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 256. El procedimiento de la modalidad 240 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 257. El procedimiento de la modalidad 255 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 258. El procedimiento de la modalidad 256 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 259. El procedimiento de la modalidad 239 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 260. El procedimiento de la modalidad 240 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a).
261. El procedimiento de la modalidad 259 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 262. El procedimiento de la modalidad 260 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 263. El procedimiento de la modalidad 239 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 264. El procedimiento de la modalidad 240 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 265. El procedimiento de la modalidad 263 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 266. El procedimiento de la modalidad 264 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 267. El procedimiento de la modalidad 239 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 268. El procedimiento de la modalidad 240 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 269. El procedimiento de la modalidad 267 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 270. El procedimiento de la modalidad 268 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 271. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1 ) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismo para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una ¡soforma des-phe de dicho polipéptido. 272. El procedimiento de la modalidad 271 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a). 273. El procedimiento de la modalidad 272 que comprende adicionalmente los pasos de: (c) opcionalmente poner en contacto dicha impureza con un compuesto mercapto, y (c1) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado.
274. El procedimiento de la modalidad 273 que comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado. 275. El procedimiento de la modalidad 272 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de las mismas. 276. El procedimiento de la modalidad 271 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de las mismas. 277. El procedimiento de la modalidad 275 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 278. El procedimiento de la modalidad 276 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 279. El procedimiento de la modalidad 277 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y ZnCI2. 280. El procedimiento de la modalidad 278 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y ZnCI2. 281. El procedimiento de la modalidad 271 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 282. El procedimiento de la modalidad 281 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 283. El procedimiento de la modalidad 272 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 284. El procedimiento de la modalidad 283 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos 50%. 285. El procedimiento de la modalidad 271 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 286. El procedimiento de la modalidad 272 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 287. El procedimiento de la modalidad 285 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 288. El procedimiento de la modalidad 286 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 289. El procedimiento de la modalidad 287 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 290. El procedimiento de la modalidad 288 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 291. El procedimiento de la modalidad 286 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 292. El procedimiento de la modalidad 285 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 293. El procedimiento de la modalidad 285 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 294. El procedimiento de la modalidad 286 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato,
HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 295. El procedimiento de la modalidad 271 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 296. El procedimiento de la modalidad 272 en donde dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento comprende B-2036 de [SEQ. ID. NO. 1]. 297. El procedimiento de la modalidad 295 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 298. El procedimiento de la modalidad 296 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 299. El procedimiento de la modalidad 297 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 300. El procedimiento de la modalidad 298 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 301. El procedimiento de la modalidad 295 en donde dicha sal metálica y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 302. El procedimiento de la modalidad 296 en donde dicha sal metálica y dicho B-2036 antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de B-2036 de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 303. El procedimiento de la modalidad 301 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000. 304. El procedimiento de la modalidad 302 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000. 305. El procedimiento de la modalidad 303 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 306. El procedimiento de la modalidad 304 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 307. El procedimiento de la modalidad 287 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio. 308. El procedimiento de la modalidad 288 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio. 309. El procedimiento de la modalidad 307 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 310. El procedimiento de la modalidad 308 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 311. El procedimiento de la modalidad 309 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM fosfato de sodio. 312. El procedimiento de la modalidad 310 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM.
313. El procedimiento de la modalidad 295 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 314. El procedimiento de la modalidad 296 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 tiene una concentración de B-2036 de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 315. El procedimiento de la modalidad 313 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 316. El procedimiento de la modalidad 314 en donde dicha concentración del B-2036 es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 317. El procedimiento de la modalidad 293 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 318. El procedimiento de la modalidad 294 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 319. El procedimiento de la modalidad 317 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 320. El procedimiento de la modalidad 318 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 321. El procedimiento de la modalidad 295 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 322. El procedimiento de la modalidad 296 en donde dicho regulador de pH y dicho B-2036 se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 323. El procedimiento de la modalidad 321 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 324. El procedimiento de la modalidad 322 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 325. El procedimiento de la modalidad 295 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 326. El procedimiento de la modalidad 296 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 327. El procedimiento de la modalidad 325 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 328. El procedimiento de la modalidad 326 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 329. El procedimiento de la modalidad 295 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 330. El procedimiento de la modalidad 296 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho B-2036 en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 331. El procedimiento de la modalidad 329 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 332. El procedimiento de la modalidad 330 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 333. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismo para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho polipéptido. 334. El procedimiento de la modalidad 333 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a). 335. El procedimiento de la modalidad 334 que comprende adicionalmente el paso de: (c) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado. 336. El procedimiento de la modalidad 333 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA, EGTA, y DTPA. 337. El procedimiento de la modalidad 334 en donde dicho agente quelante se selecciona a partir del grupo que consiste de EDTA,
EGTA, y DTPA. 338. El procedimiento de la modalidad 336 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 339. El procedimiento de la modalidad 337 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 340. El procedimiento de la modalidad 338 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 341. El procedimiento de la modalidad 340 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 342. El procedimiento de la modalidad 339 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicho EDTA por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 343. El procedimiento de ia modalidad 342 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 344. El procedimiento de la modalidad 333 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 345. El procedimiento de la modalidad 334 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH. 346. El procedimiento de la modalidad 338 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 347. El procedimiento de la modalidad 339 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH. 348. El procedimiento de la modalidad 346 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 349. El procedimiento de la modalidad 347 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 350. El procedimiento de la modalidad 348 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM.
351. El procedimiento de la modalidad 349 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 100 mM. 352. El procedimiento de la modalidad 350 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. 353. El procedimiento de la modalidad 351 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. 354. El procedimiento de la modalidad 352 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de 2 mM a aproximadamente 10 mM. 355. El procedimiento de la modalidad 353 en donde dicha concentración inicial de EDTA es de 2 mM a aproximadamente 10 mM 356. El procedimiento de la modalidad 344 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato,
HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 357. El procedimiento de la modalidad 345 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 358. El procedimiento de la modalidad 346 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 359. El procedimiento de la modalidad 347 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 360. El procedimiento de la modalidad 356 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 361. El procedimiento de la modalidad 357 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 362. El procedimiento de la modalidad 358 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 363. El procedimiento de la modalidad 359 en donde dicho regulador de pH comprende Tris. 364. El procedimiento de la modalidad 360 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 365. El procedimiento de la modalidad 361 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH con Tris tiene una concentración de Tris de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. 366. El procedimiento de la modalidad 364 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 367. El procedimiento de la modalidad 365 en donde dicha concentración de Tris es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. 368. El procedimiento de la modalidad 333 en donde dicha hormona de crecimiento comprende un polipéptido de hGH de [SEQ. ID. NO. 2]. 369. El procedimiento de la modalidad 334 en donde dicha hormona de crecimiento comprende un polipéptido de hGH de [SEQ. ID. NO. 2]. 370. El procedimiento de la modalidad 368 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 371. El procedimiento de la modalidad 369 en donde dicho agente quelante comprende EDTA. 372. El procedimiento de la modalidad 370 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH y en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.01 mM. 373. El procedimiento de la modalidad 371 en donde dicho EDTA se provee en un regulador de pH y en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho EDTA en dicho regulador de pH tiene una concentración inicial de EDTA de al menos aproximadamente 0.1 mM. 374. El procedimiento de la modalidad 370 en donde dicho EDTA y dicha hGH antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de hGH de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000.
375. El procedimiento de la modalidad 371 en donde dicho EDTA y dicha hGH antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de EDTA con respecto a las moles de hGH de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. 376. El procedimiento de la modalidad 374 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 377. El procedimiento de la modalidad 375 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. 378. El procedimiento de la modalidad 376 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 379. El procedimiento de la modalidad 377 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 50 a aproximadamente 250. 380. El procedimiento de la modalidad 368 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH tiene una concentración de hGh de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 381. El procedimiento de la modalidad 369 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH tiene una concentración de hGh de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 382. El procedimiento de la modalidad 380 en donde dicha concentración de hGh es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente
5 mg/ml. 383. El procedimiento de la modalidad 381 en donde dicha concentración de hGh es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 384. El procedimiento de la modalidad 368 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 385. El procedimiento de la modalidad 369 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. 386. El procedimiento de la modalidad 384 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 387. El procedimiento de la modalidad 385 en donde dicho pH es de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. 388. El procedimiento de la modalidad 368 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde dicho regulador de pH y dicha hGH se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 389. El procedimiento de la modalidad 369 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde dicho regulador de pH y dicha hGH se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 390. El procedimiento de la modalidad 388 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C.
391. El procedimiento de la modalidad 389 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 392. El procedimiento de la modalidad 368 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 393. El procedimiento de la modalidad 369 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 394. El procedimiento de la modalidad 392 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 395. El procedimiento de la modalidad 393 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 396. El procedimiento de la modalidad 368 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho hGH en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 397. El procedimiento de la modalidad 369 en donde dicho agente quelante se provee en un regulador de pH y en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 398. El procedimiento de la modalidad 396 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 399. El procedimiento de la modalidad 397 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 400. Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un poiipéptido de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho poiipéptido de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho poiipéptido. 401. El procedimiento de la modalidad 430 que comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho poiipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a). 402. El procedimiento de la modalidad 401 que comprende adicionalmente los pasos de: (c) opcionalmente poner en contacto dicha impureza con un compuesto mercapto, y (c') purificar dicho poiipéptido para producir un poiipéptido purificado. 403. El procedimiento de la modalidad 400 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de los mismos. 404. El procedimiento de la modalidad 401 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de una sal de metal álcali, una sal de metal térreo alcalino, una sal de metal de transición, y combinaciones de las mismas. 405. El procedimiento de la modalidad 403 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 406. El procedimiento de la modalidad 404 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de potasio, acetato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de zinc, y combinaciones de los mismos. 407. El procedimiento de la modalidad 405 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y ZnCI2. 408. El procedimiento de la modalidad 406 en donde dicha sal metálica se selecciona a partir del grupo que consiste de fosfato de sodio y
ZnCI2. 409. El procedimiento de la modalidad 400 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha ¡soforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 410. El procedimiento de la modalidad 409 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 411. El procedimiento de la modalidad 401 en donde en dicho paso de contacto (a), dicha isoforma des-phe se pone en contacto con dicha sal metálica por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma des-phe por al menos aproximadamente 10%. 412. El procedimiento de la modalidad 411 en donde dicho periodo de tiempo es adecuado para disminuir dicha cantidad de isoforma des-phe por al menos aproximadamente 50%. 413. El procedimiento de la modalidad 400 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 414. El procedimiento de la modalidad 401 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH. 415. El procedimiento de la modalidad 413 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 416. El procedimiento de la modalidad 414 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicha sal metálica en dicho regulador de pH tiene una concentación inicial de sal metálica de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM. 417. El procedimiento de la modalidad 415 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 418. El procedimiento de la modalidad 416 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 419. El procedimiento de la modalidad 417 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 420. El procedimiento de la modalidad 418 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 421. El procedimiento de la modalidad 413 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 422. El procedimiento de la modalidad 414 en donde dicho regulador de pH se selecciona a partir del grupo que consiste de Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina, e histidina. 423. El procedimiento de la modalidad 400 en donde dicha hormona de crecimiento comprende un polipéptido de hGH de [SEQ. ID. NO. ?- 424. El procedimiento de la modalidad 401 en donde dicha hormona de crecimiento comprende un polipéptido de hGH de [SEQ. ID. NO. 2].
425. El procedimiento de la modalidad 407 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 426. El procedimiento de la modalidad 408 en donde dicha sal metálica comprende fosfato de sodio. 427. El procedimiento de la modalidad 425 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 428. El procedimiento de la modalidad 426 en donde antes de dicho paso de contacto (a), dicho fosfato de sodio tiene una concentración inicial de fosfato de sodio de al menos aproximadamente 0.1 mM. 429. El procedimiento de la modalidad 423 en donde dicha sal metálica en dicho regulador de pH y dicha hGH antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de hGH de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 430. El procedimiento de la modalidad 424 en donde dicha sal metálica en dicho regulador de pH y dicha hGH antes de dicho paso de contacto (a) tienen una relación molar de moles de sal metálica con respecto a las moles de hGH de aproximadamente 300 a aproximadamente 10,000. 431. El procedimiento de la modalidad 429 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000. 432. El procedimiento de la modalidad 430 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000. 433. El procedimiento de la modalidad 431 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 434. El procedimiento de la modalidad 432 en donde dicha relación molar es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. 435. El procedimiento de la modalidad 415 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio. 436. El procedimiento de la modalidad 416 en donde dicha sal metálica es fosfato de sodio o fosfato de potasio. 437. El procedimiento de la modalidad 435 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 438. El procedimiento de la modalidad 436 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM. 439. El procedimiento de la modalidad 437 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM. 440. El procedimiento de la modalidad 438 en donde dicha concentración inicial de la sal metálica es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM. 441. El procedimiento de la modalidad 423 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH en dicho regulador de pH tiene una concentración de hGh de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml.
442. El procedimiento de la modalidad 424 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH en dicho regulador de pH tiene una concentración de hGh de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. 443. El procedimiento de la modalidad 441 en donde dicha concentración de hGh es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 444. El procedimiento de la modalidad 442 en donde dicha concentración de hGh es de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. 445. El procedimiento de la modalidad 413 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 446. El procedimiento de la modalidad 414 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicho regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 447. El procedimiento de la modalidad 445 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 448. El procedimiento de la modalidad 446 en donde dicho pH es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. 449. El procedimiento de la modalidad 423 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH y en donde dicho regulador de pH y dicha hGH se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 450. El procedimiento de la modalidad 424 en donde dicha sal metálica se provee en un regulador de pH y en donde dicho regulador de pH y dicha hGH se mantienen a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C después de dicho paso de contacto (a). 451. El procedimiento de la modalidad 449 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 452. El procedimiento de la modalidad 450 en donde dicha temperatura es de aproximadamente 2°C a aproximadamente 15°C. 453. El procedimiento de la modalidad 423 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 454. El procedimiento de la modalidad 424 en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo por un tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas. 455. El procedimiento de la modalidad 453 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 456. El procedimiento de la modalidad 454 en donde dicho tiempo es de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 15 horas. 457. El procedimiento de la modalidad 423 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 458. El procedimiento de la modalidad 424 en donde después de dicho paso de contacto (a) dicha hGH en dicho regulador de pH tiene un volumen de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5000 L. 459. El procedimiento de la modalidad 457 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 460. El procedimiento de la modalidad 458 en donde dicho volumen es de aproximadamente 200 L a aproximadamente 1500 L. 461. El procedimiento de la modalidad 69, en donde dicho paso de contacto (a) se lleva a cabo en la ausencia de un compuesto mercapto. 462. El procedimiento de la modalidad 69, en donde dicho paso de contacto (a) comprende adicionalmente poner en contacto con dicho agente quelante seguido por el contacto con un compuesto mercapto en la ausencia de dicho agente quelante. 463. El procedimiento de la modalidad 462, en donde dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de suifitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 464. El procedimiento de la modalidad 463, en donde dicho compuesto mercapto comprende cisteína o cisteína en combinación con cistina. 465. El procedimiento de la modalidad 137, en donde dicho paso de contacto (a) comprende adicionalmente poner en contacto con dicha sal metálica en combinación con un compuesto mercapto.
466. El procedimiento de la modalidad 465, en donde dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de sulfitos, giutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioerítritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 467. El procedimiento de la modalidad 466, en donde dicho compuesto mercapto comprende cisteína o cisteína en combinación con cistina. 468. El procedimiento de la modalidad 137, en donde dicho paso de contacto (a) comprende adicionalmente poner en contacto con dicha sal metálica seguido por el contacto con un compuesto mercapto en la ausencia o presencia de dicha sal metálica. Lo siguiente se presenta a manera de ejemplo y no se considera como una limitación al alcance de la invención. Todas las citas a los libros, publicaciones periódicas, artículos de revistas, patentes, o cualesquiera de otras publicaciones, etc., citados en esta solicitud se incorporan expresamente en la presente invención como referencia.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 Disminución de la impureza de isoforma trisulfuro del antagonista de la hormona de crecimiento (GHA) con el compuesto(s) mercapto(s)
La reducción del nivel de ?-2036-trisulfuro se logró utilizando el elemento retenido 1 (véanse las figuras 2A a 2D) en el procedimiento de purificación de B-2036. La fermentación de la E. coli recombinante que expresa B-2036 se llevó a cabo como se describe por Cunningham et al. en la Patente de E.U.A. No. 5,849,535. La extracción inicial y los pasos de purificación (todos los pasos se llevaron a cabo antes de la obtención del elemento retenido 1 en las figuras 2A a 2D, por ejemplo, toda la resuspensión y homogenización, extracción en dos fases, cromatografía de fase reversa, y cromatografía de intercambio aniónico) se llevaron a cabo como se describe en las figuras 2A a 2D. Después del primer paso de ultrafiltración/diafiltración, el producto estuvo presente en regulador de pH HEPES 25 mM, pH 7.0 (-150 L) a una concentración de proteína de 3.7 g/L. La temperatura de la solución del producto se enfrió de 2 a 8°C y se trató con 1/10 del volumen de adición (- 5 L) del regulador de pH recientemente preparado de Tris 200 mM, cisteína 20 mM, pH 8.0 que ha sido enfriado de 2 a 8°C. La solución de B-2036/cisteína se mantuvo de 2 a 8°C y se mezcló por 174 minutos. Luego la mezcla se concentró a 131 L utilizando membranas de ultrafiltración Millipore Biomax 5 y se diafilíró en contra de un volumen 6X de HEPES 25 m , pH 7.0. Luego el producto resultante se llevó hasta su residuo término del procedimiento de purificación de B-2036 como se describe en las figuras 2A a 2D. Antes de la incubación con cisteína, se midió el nivel de B- 2036/trisulfuro como del 3.7 en área porcentual. Inmediátamente después de la incubación con cisteína, su nivel disminuyó hasta 2.0 en área porcentual (disminución de aproximadamente 46%).
EJEMPLO 2 Disminución de la impureza de isoforma trisulfuro del antagonista de la hormona de crecimiento con agente(s) quelante(s)
Con referencia a las figuras 2A a 2D, se añadieron 165 Kg de pasta celular de pasta de células GHA congeladas a -1013 litros de Tris 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7.2. Cuando la pasta de células terminó de descongelarse (determinado por lecturas estables a A550) la mezcla se pasó a través de un homogeneizador Niro a 937.5 +/- 49.3 Atmósferas a una velocidad de flujo nominal de 250 l/hora. El homogeneizado se recolectó en un tanque en donde la temperatura se mantuvo entre 24 y 33°C. Se añadieron sulfato de amonio y PEG-4600 a la mezcla de lisado para formar una concentración de 10% (p/p) de ambos compuestos. La mezcla resultante en dos fases se mezcló por 60-120 minutos y luego estas fases se resolvieron al pasar la solución a través de una centrífuga de descarga líquida/líquida, de sólidos. La fase superior contenía el producto deseado y se recolectó y se filtró a través de un filtro en tren que consiste de un filtro "eliminador de lípídos", filtro "profundo", y un filtro de 0.2 µ??. El filtrado se recolectó en tres cargas separadas y las muestras de cada una se analizaron para B-2036-trisulfuro. Los niveles tuvieron un intervalo a partir de 3.1 a 3.8 en área porcentual. Luego el material resultante se procesó para aumentar el intermediario utilizando el procedimiento descrito en las figuras 2A a 2D y el ejemplo 1. En comparación, las muestras a partir de los lotes se procesaron mediante el procedimiento anteriormente mencionado (pero sin el componente de EDTA (agente quelante) en el regulador de pH para lisis y sin tratamiento con cisteína del elemento retenido 1 ) produciendo un nivel de trisulfuro (n=10) con un intervalo de 3.2 a 6.4 en área porcentual con una medía de 5.1 al término de todo el procedimiento de las figuras 2A a 2D anteriormente mencionadas. Cuando se incluye EDTA en el regulador de pH para lisis, y se lleva a cabo el paso de incubación con cisteína del elemento retenido 1 , el nivel de trisulfuro al término de todo el procedimiento de las figuras 2A a 2D fue de 1.5% en área porcentual.
EJEMPLO 3 Disminución de la impureza de isoforma trísulfuro del antagonista de la hormona de crecimiento con sal(es) metálica(s)
En referencia a las figuras 3A a 3C a continuación, se añadieron
165 Kg de pasta celular de pasta de células GHA congeladas a -1013 litros de fosfato de sodio 100 mM, pH 6.0. Cuando la pasta de células terminó de descongelarse (determinado por lecturas estables a A550) la mezcla se pasó a través de un homogeneizador Niro a 937.5 +/- 49.3 Atmósferas a una velocidad de flujo nominal de 250 l/hora. El homogeneizado se recolectó en un tanque en donde la temperatura se mantuvo entre 24 y 33°C. Se añadieron sulfato de amonio y PEG-4600 a la mezcla de lisado para formar una concentración de 10% (p/p) de ambos compuestos. La mezcla resultante en dos fases se mezcló por 60-120 minutos y luego estas fases se resolvieron al pasar la solución a través de una centrífuga de descarga líquida/líquida, de sólidos. La fase superior contenía el producto deseado y se recolectó y se filtró a través de un filtro en tren que consiste de un filtro "eliminador de lípidos", filtro "profundo", y un filtro de 0.2 µ??. El material se llevó hasta su residuo término del procedimiento del B-2036 como se describe en las figuras 3A a 3C. El nivel de ?-2036-trisuIfuro presente al término del procesamiento fue de 1.4 en área porcentual. Esto se comparó con los niveles de B-2036-trisulfuro de 3.2 a 6.4 en área porcentual (media = 5.1 en área porcentual) para los lotes de B-2036 (n=10) procesados con el regulador de pH para lisis normal (Tris 150 mM, pH 7.2).
EJEMPLO 4 Disminución de ia impureza de isoforma des-phe del antagonista de la hormona de crecimiento con agente(s) quelante(s)
En referencia a las figuras 2A a 2D, se añadieron 165 Kg de pasta celular de pasta de células GHA congeladas a -1013 litros de Tris 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7.2. Cuando la pasta de células terminó de descongelarse (determinado por lecturas estables a A550) la mezcla se pasó a través de un homogeneizador Niro a 937.5 +/- 49.3 Atmósferas a una velocidad de flujo nominal de 250 l/hora. El homogeneizado se recolectó en un tanque en donde la temperatura se mantuvo entre 24 y 33°C. Se añadieron sulfato de amonio y PEG-4600 a la mezcla de lisado para formar una concentración de 10% (p/p) de ambos compuestos. La mezcla resultante en dos fases se mezcló por 60-120 minutos y luego estas fases se resolvieron al pasar la solución a través de una centrífuga de descarga líquida/líquida, de sólidos. La fase superior contenía el producto deseado y se recolectó y se filtró a través de un filtro en tren que consiste de un filtro "eliminador de lípidos", filtro "profundo", y un filtro de 0.2 µ??. El filtrado (obtenido después de la filtración de la fase superior; véase las figuras 2A a 2D) se recolectó en tres cargas separadas y las muestras de cada una se analizaron para ?-2036/des-phe. Los niveles tuvieron un intervalo de 3.2 a 6.3 en área porcentual. Para comparación, el procesamiento adicional de conformidad con las figuras 2A a 2D redujo adicionalmente el nivel de B-2036 des-phe a 0.3 en área porcentual del elemento retenido 3. Esta reducción adicional del nivel de B-2036 des-phe se logró mediante los parámetros de recolección del producto del segundo paso de cromatografía de intercambio aniónico. Cuando el regulador de pH de lisis incluye EDTA y se llevan a cabo los procedimientos de recolección del paso de la cromatografía de intercambio iónico, los niveles de ?-2036/des-phe de 0.3 son un porcentaje que se obtuvo en comparación con los niveles de procesamiento final de 4.6 a 16.2 en área porcentual (media = 10.2 en área porcentual) para los lotes de B-2036 (n=10) procesados sin EDTA (por ejemplo, Tris 150 mM, pH 7.2) y sin los procedimientos de recolección anteriormente mencionados.
EJEMPLO 5 Disminución de la impureza de isoforma Des-Phe del antagonista de la hormona de crecimiento con sal(es) metálica(s)
En referencia a las figuras 3A a 3C, se añadieron 2,165 Kg de pasta celular de pasta de células GHA congeladas a -1013 litros de fosfato de sodio 100 mM, pH 6.0. Cuando la pasta de células terminó de descongelarse (determinado por lecturas estables a A550) la mezcla se pasó a través de un homogeneizador Niro a 937.5 +/- 49.3 Atmósferas a una velocidad de flujo nominal de 250 I/hora. El homogeneizado se recolectó en un tanque en donde la temperatura se mantuvo entre 24 y 33°C. Se añadieron sulfato de amonio y PEG-4600 a la mezcla de lisado para formar una concentración de 10% (p/p) de ambos compuestos. La mezcla resultante en dos fases se mezcló por 60-120 minutos y luego estas fases se resolvieron al pasar la solución a través de una centrífuga de descarga líquida/líquida, de sólidos. La fase superior contenía el producto deseado y se recolectó y se filtró a través de un filtro en tren que consiste de un filtro "eliminador de lípidos", filtro "profundo", y un filtro de 0.2 µ?t?. El filtrado se recolectó en tres cargas separadas y se analizaron las muestras de cada uno para ?-2036/des-phe. Los niveles tuvieron un intervalo de 6.0 a 9.4 en área porcentual. Para comparación, el procesamiento adicional de conformidad con las figuras 3A a 3C redujo adicionalmente el nivel de ?-2036/des-phe a 0.8 en área porcentual del elemento retenido 2. Esta reducción adicional del nivel de ?-2036/des-phe se logró mediante los parámetros de recolección del producto siguiendo el segundo paso de cromatografía de intercambio aniónico. Cuando el regulador de pH para lisis incluyó fosfato de sodio y se llevaron a cabo los procedimientos de recolección del segundo paso de cromatografía de intercambio iónico, el nivel de ?-2036/des-phe de 0.8 en área porcentual se obtuvo en comparación con los niveles de procesamiento final de 4.6 a 16.2 en área porcentual (media = 10.2 en área porcentual) para los lotes B-2036 (n=10) procesados sin fosfato de sodio (por ejemplo, Tris 150 mM, pH 7.2) y sin los procedimientos de recolección anteriormente mencionados.
EJEMPLO 6 Disminución de la impureza de Isoforma Des-Phe del agonista de la hormona de crecimiento con aqente(s) quelante(s)
Las células frescas suspendidas o células recombinantes congeladas expresan agonista de la hormona de crecimiento en un regulador de pH que contiene EDTA. Luego se fragmentan las células ya sea completamente mediante un procedimiento tal como homogenización, o parcialmente en un procedimiento tal como choque osmótico o congelamiento/descongelamiento para liberar el agonista de la hormona de crecimiento. Luego se aisla la solución de células fragmentadas mediante la extracción en dos fases, centrifugación sólida/líquida, o filtración. Purificación del agonista mediante una serie de pasos de cromatografía líquida.
EJEMPLO 7 Disminución de la impureza de isoforma Des-Phe del agonista de la hormona de crecimiento con sal(es) metálica(s)
Las células frescas suspendidas o células recombinantes congeladas expresan agonista de la hormona de crecimiento en un regulador de pH que contiene fosfato de sodio. Luego se fragmentan las células ya sea completamente mediante un procedimiento tal como homogenización, o parcialmente en un procedimiento tal como choque osmótico o congelamiento/descongelamiento para liberar el agonista de la hormona de crecimiento. Luego se aisla la solución de células fragmentadas mediante la extracción en dos fases, centrifugación sólida/líquida, o filtración. Purificación del agonista mediante una serie de pasos de cromatografía líquida.
Listado de secuencia
<120 Método para la preparación de Hormona de Crecimiento de Humano y Antagonista de la misma que tiene niveles más bajos de impurezas de isoforma ÍSÍi Í£HSS . 00530 <Í5Ü> 03 60/4135 , 553
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Claims (15)
1. - Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas, el procedimiento comprendiendo el paso de: (a) poner en contacto con dicha impureza bajo condiciones adecuadas un compuesto mercapto para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido.
2. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de: (b) crecer dichas células hospederas para producir dicho polipéptido, en donde dicho crecimiento se lleva a cabo ya sea antes o durante dicho paso de contacto (a).
3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de: (c) purificar dicho polipéptido para producir un polipéptido purificado.
4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de: (d) polietilenglicosilar dicho polipéptido purificado.
5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de sulfitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto mercapto se selecciona a partir del grupo que consiste de sulfitos, glutationa, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína, y cisteína en combinación con cistina. 7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho compuesto mercapto comprende cisteína o una combinación de cisteína y cistina. 8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho compuesto mercapto comprende cisteína o una combinación de cisteína y cistina. 9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho paso de contacto (a), dicha ¡soforma trisulfuro se pone en contacto con dicha cisteína o combinación de cisteína y cistina por un periodo de tiempo adecuado para disminuir dicha cantidad de dicha isoforma trisulfuro por al menos aproximadamente 10%. 10. - Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) ceiular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1 ) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido. 11. - Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma trisulfuro de dicho polipéptido. 12. - Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho polipéptido. 13.- Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celulares), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho polipéptido. 14.- Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto un agente quelante bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho polipéptido. 15.- Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza producida en la producción recombinante de un polipéptido de la hormona de crecimiento en las células hospederas genéticamente modificadas que contienen el componente(s) celular(es), el procedimiento que comprende el paso de: (a) poner en contacto una sal metálica bajo condiciones adecuadas con (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido de la hormona de crecimiento, (3) dicho componente(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir dicha cantidad de dicha impureza, en donde dicha impureza es una isoforma des-phe de dicho polipéptido.
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