KR20050059163A - 성장 호르몬 및 낮은 수준의 이성체 불순물을 갖는 성장 호르몬 대항제의 제조 방법 - Google Patents
성장 호르몬 및 낮은 수준의 이성체 불순물을 갖는 성장 호르몬 대항제의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
앞서 언급한 바와 같이, 감소된 수준의 바람직하지 않은 이성체 불순물을 포함하는 재조합 성장 호르몬 작용제, 재조합 인간 성장 호르몬 작용제, 재조합 성장 호르몬 대항제 및/또는 재조합 인간 성장 호르몬 대항제를 제조하는 향상된 방법의 요구와 관련하여, 본 발명은 감소된 수준의 데-프 및/또는 트리설파이드 이성체 불순물을 포함하는 재조합 성장 호르몬(인간성장 호르몬을 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음) 및 재조합 성장 호르몬 대항제(인간 성장 호르몬 대항제를 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음)의 생산을 위한 향상된 방법을 제공한다.
상기 재조합 성장 호르몬(hGH를 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음)과 관련하여, (1) 킬레이트제(chelating agent) 또는 (2) 금속 염(metal salt)을 각각 충분히 첨가함에 따라 상기 성장 호르몬의 데-프 이성체 불순물의 형성을 감소시킬 수 있다.
상기 재조합 성장 호르몬 대항제(인간 성장 호르몬 대항제를 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음)와 관련하여, (1) 머캅토 화합물(mercapto compound), (2) 킬레이트제, (3) 금속 염, (4) 머캅토 화합물 및 금속염을 함께, 또는 (5) 킬레이트제를 접촉시킨 후, 킬레이트제의 부재(不在)하에 머캅토 화합물을 각각 트리설파이드 이성체 불순물과 충분히 접촉시킴으로써 상기 트리설파이드 이성체 불순물을 감소시킬 수 있다.
상기 재조합 성장 호르몬 대항제(인간 성장 호르몬 대항제를 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음)와 관련하여, (1) 킬레이트제 또는 (2) 금속염을 각각 첨가함에 따라 상기 성장 호르몬 대항제의 데-프 이성체 불순물의 형성을 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 요구되는 폴리펩티드(polypeptide)를 만들 수 있는 재조합(recombinant) 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 의하여 감소된 양의 이성체 불순물들(isoform impurities)을 포함하는 폴리펩티드 산물을 수득할 수 있다. 보다 상세하게 본 발명은 (1) 감소된 이성체 불순물을 포함하는 성장 호르몬을 제조하기 위한 재조합 방법 및 (2) 감소된 이성체 불순물을 포함하며, 페그비소만트(pegvisomant) 및 페그비소만트의 단백질 중간물(protein intermediate) 등과 같은 성장 호르몬 대항제를 제조하기 위한 재조합 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 따라 감소된 상기 이성체 불순물들은 각각 성장 호르몬 및 성장 호르몬 대항제(혹은 이의 중간물)의 트리설파이드(trisulfide) 및 데-프 이성체 (des-phe isoform) 불순물이다.
본 발명은 2002년 8월 28일 미국 특허청에 출원된 출원번호 제60/406,553호를 우선권 주장의 기초로 하는 출원이다.
페그비소만트(pegvisomant)(소마베르트(Somavert );파마시아 社(Pharmacia Corp.))는 인간 성장 호르몬 수용기 대항제(human growth hormone receptor antagonist)이다. 이것은 구조적으로 변경된 인간 성장 호르몬("hGH") 유사체이다. 페그비소만트의 단백질 성분/중간체(component/intermediate) (B-2036)의 아미노산 서열은 9개의 위치에서 hGH의 아미노산 서열과 다르다. 구체적인 아미노산 치환들은 다음과 같다: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S 및 I179T. 널리 알려진 바와 같이, 첫 번째 문자(즉, H18D에서 H)는 숫자로 표시된 위치(즉, H18D에 나타난 바와 같이 18번째 아미노산 위치)에서 두 번째 문자(즉, H18D에서의 D)로 표시되는 아미노산에 의하여 치환된 hGH 서열의 아미노산을 나타낸다. 따라서, H18D는 야생형(wild-type) hGH 아미노산 서열의 18번째 아미노산 위치에서 히스티딘(his) 아미노산이 아스파르트산(asp) 아미노산으로 치환되었음을 나타낸다.
도 1a는 페그비소만트(PEG B-2036)의 단백질 성분/중간체(B-2036)의 아미노산 서열 구조를 개략적으로 보여주며, 별표는 폴리에틸렌 글리콜 폴리머(polyethylene glycol polymer)("PEG" 단위)가 부착할 수 있는 잠재적인 위치를 나타낸다. 또한, 페그비소만트의 단백질 성분/중간체(B-2036- PEG 단위가 부착되지 않음)의 아미노산 서열 목록(listing)은 서열 번호 1(SEQ. ID. NO. 1)에 나타나있다. 또한, 비교를 위하여 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열 목록은 서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)에 나타나있다. 상기 서열 목록들은 본 출원서에 첨부되어 있다. hGH의 서열을 알기 위해서는 Jorgensen et al.의 "Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions," J. Chromatography A 817:205-214 (1998)를 참조할 수도 있다.
구조적으로, 페그비소만트는 주로 4 내지 6개의 PEG 단위들이 공유결합된 단백질(191개의 아미노산 잔기들을 포함)이다. 상기 페그비소만트의 단백질 성분/중간체(B-2036)의 분자량은 21998 달튼(Daltons)이다. 페그비소만트의 각 PEG 단위의 분자량은 대략 5000 달튼이다. 따라서, 페그비소만트의 주된 분자량은 대략 42000(4 PEG 단위/molecule), 47000(5 PEG 단위/molecule), 및 52000(6 PEG 단위/molecule)달튼이다.
이론에 얽매이지 않고 작용제(agonist)를 고려하면, 내재(內在; endogenous) hGH는 하나의 hGH 분자에 두 개의 상기 hGH의 분자에 인접한(혹은 동일한) 수용기 분자들이 결합되는 경우 호르몬-매개 수용체 호모디머라이제이션(hormone-mediated receptor homodimerization)을 유발하며 hGH의 수용기들을 활성화시키는 것으로 알려져있다. 이와 관련하여, 미합중국 특허 제5,849,535호 및 제6,057,292호를 참조할 수 있다. 상기 hGH의 활성도는 동일한 hGH 분자에서 두 개의 분리된 결합 위치(binding sites)들(위치 1 및 위치 2)에 두 개의 인접한(그리고 동일한) 수용기 분자들을 결합시키는 능력에 달려있다. 위치 1 및 위치 2로 표시되는 이러한 hGH 결합 위치들은 1 및 2의 숫자로 표시되며, 이는 hGH-의존성 호모디머라이제이션을 매개하는 인접한(그리고 동일한) hGH 수용체들에 결합하는 순서를 나타낸다.
또한, 이론에 얽매이지 않고, 페그비소만트는 세포 표면에서 선택적으로 인간 성장 호르몬 수용체("GH 수용체")에 결합하며, 이는 내재 인간 성장 호르몬의 결합을 차단함으로써 인간 성장 호르몬 단일 형질 도입(human growth hormone signal transduction)을 방해하는 것으로 알려져있다. 페그비소만트(hGH와 관련하여)의 단백질 부분("성분(component)" 또는 "중간체(intermediate)"라고도 할 수 있다.)에 대한 구조적 변형은 페그비소만트가 hGH 분자와 hGH 수용체 사이의 상호 작용을 경쟁적으로 차단할 수 있도록 한다. 페그비소만트는 GH 수용체에 결합하여 상기 수용체를 점유함으로써 GH 결합을 차단하게 된다. 상기 구조적 변형은 단일 형질 도입이 발생하지 않은 결과로써 수용체 이합체화(dimerization)를 막게 된다. 상기 페그비소만트 요구되는 hGH 분자 및 hGH 수용체 사이의 가까운 상호작용을 차단함으로써, hGH 수용체들의 hGH-매개 호모디머라이제이션을 막게 되므로 대항제 능력을 갖게 된다.
이러한 대항제는 이에 한정되지는 않지만, 수술이나 방사선 요법 및/또는 다른 통상적인 의학적 치료에 적절히 반응하지 않거나, 이러한 치료들을 견디지 못하는 말단비대증 환자를 치료하는데 사용된다. 또한, 페그비소만트의 단백질 부분(B-2036)에 대한 구조적 변형은 상기 페그비소만트가 hGH의 결합 친화력보다 낮은 프로락틴 수용체(prolactin acceptor)에의 결합 친화력을 나타내도록 하여, 상기 페그비소만트를 사용함에 따른 바람직하지 않은 젖분비-관련 부작용(lactation-related side effect)을 최소화한다.
상기 페그비소만트의 단백질 매개 부분(protein intermediate portion of pegvisomant)(B-2036)은 성장 호르몬 수용체 대항제(B-2036)를 위한 유전자를 운반할 수 있는 플라즈미드(plasmid)를 첨가하여 유전적으로 변형된 대장균(Escherichia coli) 박테리아의 균주(strain)에 의하여 합성된다. 이어서, 상기 B-2036은 미생물 세포(microbial cell)로부터 회복되고 정제된다. 이후, 상기 정제된 B-2036을 PEG화시켜(pegylated) 페그비소만트(PEG B-2036)를 형성한다. 미합중국 특허 제5,849,535호 및 제6,057,292호는 상기 B-2036의 제조 방법 및 하나 이상의 PEG 단위를 B-2036에 결합시키는 방법이 개시되어 있지만, 수용할 수 없을 정도로 높은 수준의 트리설파이드(trisulfide) 및 데-프 이성체 불순물들(des-phe isoform impurities)의 형성을 어떻게 감소시키거나, 줄이거나, 제거하거나, 반전시키거나 및/또는 방지할 지에 대해서는 상세히 언급하고 있지 않다.
B-2036을 제조하기 위하여 사용되는 통상적인 재조합 제조 방법에서 발생되는 문제들 중 하나는 상기 B-2036의 데-프(des-phe) 및 트리설파이드 이성체들(trisulfide isoform) 등과 같은 이성체 불순물의 형성이다. 상기 데-프 이성체(des-phe isoform) 불순물은 아미노 말단의 페닐알라닌(phenylalanine)기가 결여된 B-2036 분자를 의미한다. 이와 관련하여 B-2036의 -NH2 종단에 인접한 아미노 말단의 페닐알라닌 잔기(phenylalanine residue)(즉, "F" 문자로 표시되는 부분)를 나타낸 도 1a를 참조할 수 있다. 상기 트리설파이드 이성체 불순물은 분자 내에 "트리설파이드 브리지(trisulfide bridge)를 형성하는 추가의 황 원자(sulfur atom)를 더 포함하는 B-2036 분자를 의미한다. 이와 관련하여, 도 1b의 박스 부분을 참조할 수 있다. 또한, Andersson et al.의 "Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli," Int. J. Peptide Protein Res. 47:311-321(1996) 및 A. Jesperson et al.의 "characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli," Eur. J. Biochem. 219:365-373(1994)을 참조할 수도 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 이성체 불순물들은 통상적으로 유전적으로 변형된 숙주 세포들(host cells)에서 B-2036이 세포 성장(즉, 발효(fermentation)) 및 발현(expression)(즉, 합성 및 분비(secretion))하는 동안 및/또는 상기 B-2036 단백질을 추출(extraction) 및 정제(purification)하는 동안 발생한다고 알려져있다.
이러한 불순물들과 관련하여, 국제출원(International Application) 제WO 94/24157호(1994년 10월 27일 공개)에는 자연(native) hGH와 비교하여 추가의 황 원자를 포함하는 소수성의 hGH 유도체가 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 국제출원 제WO 94/24157호 제3쪽 3-10줄을 참조할 수 있다. 상기 hGH의 소수성 유도체에 포함된 추가의 황 원자는 "트리설파이드 브리지(trisulfide bridge)"를 형성하며, hGH 트리설파이드 변이형을 생산한다. 구체적으로, 상기 국제출원 제WO 94/24157호 제7쪽 11-16줄을 참조할 수 있다. 또한, 상기 WO 94/24157 문헌에는 상기 hGH 트리설파이드 변이형을 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione), 2-머캅토 에탄올(2-mercapto ethanol) 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등과 같은 머캅토 화합물(mercapto compound)로 처리함으로써 상기 hGH 트리설파이드 변이형을 다시 자연 hGH 형태로 전환시킬 수 있다고 언급되어 있다. 구체적으로, 상기 국제출원 제WO 94/24157호 제4쪽 및 제5쪽을 참조할 수 있다.
국제출원 제WO 96/02570호(1996년 2월 1일 공개)에는 아황산 나트륨(sodium sulfite), 아황산 칼륨(potassium sulfite), 아황산 암모니아(ammonia sulfite) 또는 아황산 마그네슘(magnesium sulfite), 아황산 칼슘(calcium sulfite) 등과 같은 아황산 알칼리 토금속(alkaline-earth metal sulfite) 등을 사용하여 상기 hGH 트리설파이드 변이형을 자연 hGH의 형태로 전화시키는 다른 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 국제출원 제WO 96/02570호 제4쪽의 17 내지 21줄을 참조할 수 있다.
2000년 1월 20일 공개된 국제출원 제WO 00/02900호(발명의 명칭: "Method for the production of recombinant peptides with a low amount of trisulfide")에서는 단백질 및 보다 작은 펩티드(smaller peptides)와 같은 재조합 펩티드의 생산에 있어서 트리설파이드 양을 감소시키는 방법에 대해 논의하고 있다. 상기 발명은 재조합 펩티드의 생산에 있어서 일찍이 제안된바와 같이 기형성된 성장 호르몬의 트리설파이드를 자연 형태(native form)로 전환시키는 것이 아니라 발효(fermentation) 동안이나 발효 후에 금속염을 바람직하게는 과도한 양으로 첨가함에 따라 트리설파이드의 양을 감소시킬 수 있다"(Emphasis added)는 신규하고 기대치 못한 발견에 근거한 것이다. 이와 관련하여 상기 국제출원 제WO 00/02900호 제2쪽 21-27줄을 참조하라. 또한, 상기 WO 00/02900 문헌은 "상기 단백질은 어떠한 재조합 단백질일 수도 있지만, 바람직하게는 인간 성장 호르몬, 소(bovine) 성장 호르몬 및 돼지(porcine) 성장 호르몬과 같은 인간 및 동물 성장 호르몬일 수 있는 재조합 성장 호르몬이다."(Emphasis added)라고 언급하고 있다. 이와 관련하여 상기 국제출원 제WO 00/02900호 제3쪽 4-6줄을 참조하라.
2002년 7월 25일 공개된 국제출원 제WO 02/057478호(발명의 명칭:"Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells")은 환원제(reducing agent) 및 세제(detergent)를 숙주 세포에 접촉시켜 숙주로부터 단백질을 방출시키는 방법에 관한 것이다. 상기 문헌에서 상기 환원제의 목적은 자연 형태(native conformation)의 단백질로의 회복을 촉진시키는 것이라고 설명되어 있다. 이와 관련하여 상기 국제출원 제WO 00/057478호 제2쪽 16-18줄을 참조하라. 또한, WO 02/057478호는 "하나 또는 그 이상의 환원제는 디설파이드 결합들(disulfide bonds)의 감소 및/또는 설프하이드릴 잔기들(sulfhydryl residues)을 환원된 형태로 유지하는 물질..."이라고 설명하고 있다. 어떠한 환원제 또는 물질들이라도 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 상기 사용되는 하나 또는 그 이상의 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 디티오에리트리올(dithioerythriol; DTE), 시스테인(cysteine; Cys) 및 트리 2-카르복시에틸포스핀(Tris 2-carboxyethylphosphine; TCEP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다"(Emphasis added). 이와 관련하여 국제출원 제WO 02/057478호의 제3쪽 제24줄부터 제4쪽 제4줄까지를 참조하라.
그러나, 상기 문헌들은 페그비소만트 또는 페그비소만트의 단백질 부분인 B-2036과 같은 성장 호르몬 대항제와 관련하여 이성체 불순물의 형성을 방해, 반전, 감소 또는 제거하는 방법에 관하여는 개시하고 있지 않다. 따라서, B-2036의 이성체 불순물(트리설파이드 및/또는 데-프)의 형성을 감소, 경감, 방해, 최소화, 반전 및/또는 제거할 수 있는 향상된 B-2036의 제조 방법이 필요하다. 이와 마찬가지로, 상기 문헌들은 성장 호르몬의 데-프 이성체 불순물(des-phe isoform impurity)의 형성을 탐지, 경감, 최소화, 반전, 감소 또는 제거하는 방법에 관해서도 개시하고 있지 않다. 따라서, 상기 데-프 이성체 불순물의 형성을 감소, 경감, 방해, 최소화, 반전 및/또는 제거할 수 있는 개선된 성장 호르몬 제조 방법도 필요하다.
도 1a는 서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)에 상응하는 B-2036의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 도 1a에 있어서, 별표(☆)는 B-2036 각 분자에 PEG 단위가 공유결합할 수 있는 9개의 잠재적 위치를 나타낸다. 비록 9개의 공유결합 가능한 위치가 나타나있지만, 9개의 위치 모두가 PEG 단위에 의해 공유결합 될 필요가 없음을 유의하여야 한다. 바람직하게는, 각 B-2036 분자 당 4 내지 6개의 PEG 단위가 공유결합된다.
도 1b는 B-2036의 트리설파이드 이성체 불순물("Trisulphide(+32 amu")로 표시)의 구조를 상기 B-2036의 바람직한 형태("Native GHA"로 표시)와 비교하여 나타내는 도면이다.
"성장 호르몬 대항제(growth hormone antagonist)" 및 "성장 호르몬 수용체 대항제(growth hormone receptor antagonist)"와 같은 용어는 성장 호르몬의 성장 호르몬 수용체와의 결합을 억제하거나 중화시켜 성장 호르몬의 생물학적 효과를 차단시키는 폴리펩티드(polypeptides)를 의미한다(그러나, 이에 한정되지는 않는다.). 바람직하게, 상기 "성장 호르몬 대항제" 혹은 "성장 호르몬 수용체 대항제"는 B-2036이거나, 이의 변이형(variant)이다. 상기 "변이형"은 동족(同族)체(특히, B-2036에 대하여 보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution), 부가(addition) 또는 삭제(deletion)한 동족체), 유사체(analogue), 조각(fragment), 가성(假性)펩티드(pseudopeptides), 항체(antibodies) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 이들 각각은 성장 호르몬 수용체 대항제 활성 능력(growth hormone receptor antagonist activity)을 갖고 있다.
"성장 호르몬 작용제(growth hormone agonist)" 및 "성장 호르몬 수용체 작용제(growth hormone receptor agonist)"와 같은 용어는 성장 호르몬 수용체와 결합하고 이를 활성화시키는 폴리펩티드(polypeptides)를 의미한다(그러나, 이에 한정되지는 않는다.). 바람직하게, 상기 "성장 호르몬 작용제" 혹은 "성장 호르몬 수용체 작용제"는 인간 성장 호르몬이거나, 이의 변이형이다. 상기 "변이형"은 동족체(특히, 인간 성장 호르몬에 대하여 보존성 아미노산 치환, 부가 또는 삭제한 동족체), 유사체(analogue), 조각(fragment), 가성(假性)펩티드(pseudopeptides), 항체(antibodies) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 이들 각각은 성장 호르몬 수용체 작용제 활성 능력(growth hormone receptor agonist activity)을 갖고 있다.
"성장 호르몬 및 이의 대항제"와 같은 용어는 성장 호르몬 작용제(즉, "성장 호르몬") 및 성장 호르몬 대항제(즉 " 및 이의 대항제")를 의미한다.
"및(그리고)"라는 용어는 관련 불순물(즉, 트리설파이드 또는 데-프 이성체 불순물)을 요구되는 수준까지 감소시키기 위한 공정을 설명하기 위하여 적절히 또는 필요하게 "및(그리고)" 또는 "또는(혹은)"을 의미할 수 있다.
"또는(혹은)이라는 용어는 관련 불순물(즉, 트리설파이드 또는 데-프 이성체 불순물)을 요구되는 수준까지 감소시키기 위한 공정을 설명하기 위하여 적절히 또는 필요하게 "및(그리고)" 또는 "또는(혹은)"을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "감소시키다"라는 용어(또는 상기 용어의 명백한 변형들)는 특별한 언급이 없는 한, 그리고 관련 이성체 불순물이 트리설파이드 이성체 불순물 또는 데-프 이성체 불순물이든지 간에, 상기 이성체 불순물의 양을 제거하다, 최소화하다, 줄이다, 막다 및/또는 경감하다를 의미한다.
특별한 언급이 없는 한, "숙주 세포(host cell)"라는 용어(또는 상기 용어의 명백한 변형들)는 재조합 B-2036 또는 재조합 hGH를 형성할 수 있는 숙주 세포를 의미한다. 따라서, 상기 숙주 세포는 포유류(mammalian) 숙주 세포, 식물(plant) 숙주 세포, 또는 대장균(E. coli.)과 같은 미생물 숙주 세포나 심지어 효모(yeast) 숙주 세포일 수도 있다. 상기 숙주 세포는 바람직한 재조합 B-2036 단백질 성분이나 재조합 hGH를 상기 숙주세포 내에서 성장시키기에 충분한 것일 수 있음을 주의해야한다. 이러한 관점에서, 관심 대상인 상기 B-2036 단백질 성분이나 재조합 hGH 또는 이들의 "변형체"를 재조합 적으로 생산할 수 있을 것을 제외하고는 숙주 세포가 어떤 것이어야 한다는 특별한 제한은 없다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "성장함"이라는 용어(또는 상기 용어의 명백한 변형들, 즉 성장)는 특별한 언급이 없는 한, 발효 및 배양함, 또는 숙주세포가 상기 재조합 B-2036 단백질 성분이나 재조합 hGH의 요구되는 양을 충분히 생산할 수 있을 정도로 증식하는 것을 야기함을 의미하지만, 이에 한정되지는 않는다.
나아가, 본 발명이 재조합 B-2036 및 재조합 PEG B-2036에 관하여 설명하고 있지만, 특별한 언급이 없는 한, 본 발명은 포유류 성장 호르몬 또는 이의 대항제, 인간 성장 호르몬 또는 이의 대항제, 소 성장 호르몬 또는 이의 대항제 등과 같은 어떠한 재조합 성장 호르몬 작용제, 및 재조합 성장 호르몬 대항제에도 적용할 수 있다.
페그비소만트(pegvisomant)(PEG B-2036)는 재조합 숙주 세포(즉, 재조합된, 유전적으로 변형된 대장균(E. coli.) 숙주세포) 에서 생산된 재조합 단백질(B-2036)의 PEG화된(pegylate) 형태이다.
B-2036 단백질은 세포 성장(즉, 발효(fermentation)에 의하여) 및 발현(expression)(합성(synthesis) 및 분비(secretion) 동안 생성된다. B-2036이 생성된 후, 상기 B-2036은 분리되고(isolated)(즉, 균질화(homogenization)에 의하여), 이어서 정제(purification)(즉, 추출(extraction), 원심분리(centrifugation), 역상(reverse phase) 및 음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography), 및 완충액 교환(buffer exchange)에 의하여) 된다. 그러나, 상기 B-2036 단백질이 재조합 생성되는 동안에 바람직하지 않은 B-2036 이성체 불순물들이 형성되며, 이러한 불순물들은 B-2036의 트리설파이드 및 데-프 이성체 불순물들이다.
앞서 언급한 바와 같이, 도 1a는 B-2036의 아미노산 서열을 설명하기 위한 도면이며, 도 1a에 있어서 약어(abbreviation)는 특정 아미노산이 약어가 표시된 위치에 존재하는지를 나타낸다. 상기 약어 및 약어에 상응하는 아미노산을 나타내는 하기 표1을 참조하라.
[표 1]
| 폴리펩티드 아미노산(Polypeptide Amino Acid) |
| Ala(A) |
| Glu(E) |
| Gln(Q) |
| Asp(D) |
| Asn(N) |
| Leu(L) |
| Gly(G) |
| Lys(K) |
| Ser(S) |
| Val(V) |
| Arg(R) |
| Thr(T) |
| Pro(P) |
| Ile(I) |
| Met(M) |
| Phe(F) |
| Tyr(Y) |
| Cys(C) |
| Trp(W) |
| His(H) |
또한, 상기 B-2036의 아미노산 서열은 서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)에 나타나 있으며, hGH의 아미노산 서열은 서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)에 나타나 있다.
1. 재조합 성장 호르몬 대항제 및
이의 트리설파이드 이성체 불순물
도 1b는 B-2036의 트리설파이드 이성체 불순물의 아미노산 서열 구조를 나타낸다. 구체적으로, 상기 트리설파이드 이성체 불순물은 B-2036 단백질 성분의 182번 및 189번 위치의 시스테인 사이의 브리지에 추가의 황 이온(extra sulfur atom)을 포함한다.
a.
머캅토 화합물(Mercapto Compound(s))
을 이용한 트리설파이드 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 재조합 성장 호르몬 대항제 B-2036의 트리설파이드 이성체 불순물과 선택된 머캅토 화합물을 접촉시키면 시스테인-S-S-S-시스테인 트리설파이드 브리지(bridge)가 시스테인-S-S-시스테인의 자연 형태로 전환되는 것으로 알려져있다. 또한, 역시 이론에 얽매이지 않고, 상기 머캅토 화합물의 존재는 트리설파이드 브리지 자체가 더 형성되는 것을 방지할 수 있다.
통상적으로, 상기 머캅토 화합물(들)은 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 B-2036 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 B-2036 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 이후, 정제된 단백질은 바람직하게 PEG화(pegylated)되어 PEG B-2036(페그비소만트)을 수득할 수 있다. 상기 PEG화 과정은 미합중국특허 제5,849,535호에 나타나있다.
B-2036 단백질 성분 및 이의 트리설파이드 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 B-2036의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 트리설파이드 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 머캅토 화합물도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 머캅토 화합물은 설파이트(sulfite), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine) 및 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 머캅토 화합물과 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) J.Houk and G.M. Whitesides, "Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange," J.M. Chem. Soc., 109:6825-6836(1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, 1st Ed. Pergamon, New York(1973). 구체적으로, 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 머캅토 화합물의 예시적인 목록이 상기 Houk et al.의 항목(item)(1)에 나타나있는 표 II에 나타나있다.
상기 적합한 머캅토 화합물 중, 시스테인 또는 시스테인과 결합한 시스테인(중합된(dimerized) 시스테인)이 가장 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 시스테인 또는 시스테인과 시스테인의 결합(중합된(dimerized) 시스테인, 어떤 것이라도))의 양은 트리설파이드 이성체 불순물을 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 평형 농도(highest average equilibrium concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 트리설파이드 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 가장 높은 평균 평형 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 시스테인 또는 임의의 시스테인의 초기 결합 농도(combined concentration)는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약10mM 혹은 약 1mM 내지 약 5mM이다.
상기 머캅토 화합물을 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, B-2036 단백질 성분의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 B-2036 단백질 성분을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 완충액은 트리스이다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 4 내지 약 9, 약 7.5 내지 약 8.5 혹은 약 7.5 내지 약 8.0으로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다. 명백히, 보다 높은 농도의 머캅토 화합물을 사용하면, 보다 높은 pH 수준, 예를 들어 약 9,5 정도의 pH도 허용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 아주 과도한 양의 시스테인이 B-2036에 사용되면, 완충액의 pH는 약 9.5 정도로 높을 수도 있다.
앞서 주지한 바와 같이, 상기 머캅토 화합물을 완충액에 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 완충액에서 머캅토 화합물의 양은 B-2036 단백질의 몰(moles)에 대한 머캅토 화합물 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 0.5 내지 약 1000일 수 있다. 이는 특히 사용된 머캅토 화합물이 시스테인의 결합 및, 임의로 시스테인과 결합한 시스테인일 경우이다. 선택적으로, 상기 B-2036 단백질의 몰에 대한 머캅토 화합물 몰의 몰비는 각각 약 1 내지 약 1000, 약 1 내지 약 500, 또는 약 1 내지 약 10일 수 있다.
통상적으로, 상기 머캅토 화합물과 상기 B-2036 단백질 성분 사이에 충분한 접촉(상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여)이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 B-2036 단백질 성분은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 30mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 20mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 10mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 머캅토 화합물이 숙주 세포(들) 혹은 상기 B-2036 단백질 성분을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 머캅토 화합물 및 B-2036, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃내지 약 25℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 B-2036 성분을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃로 유지되는 것이 바람직하다. 상기 B-2036 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 머캅토 화합물들 및 B-2036 등을 포함하는)의 온도는 상기 B-2036 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 B-2036 성분과 상기 머캅토 화합물의 접촉 시간은 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 24시간, 또는 약 1시간 내지 약 4시간이다.
일반적으로, 상기 머캅토 화합물과 상기 B-2036 성분을 충분히 접촉시킨 후, 상기 머캅토 화합물과 상기 B-2036 성분을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 10리터 내지 약 500리터, 또는 약 100리터 내지 약 300리터의 부피를 갖는다. 160리터 내지 500리터 사이의 다른 적합한 부피도 가질 수 있다.
상기 머캅토 화합물과 상기 B-2036 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(하나의 성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 머캅토 화합물(들), B-2036 성분 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, B-2036 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
b.
킬레이트제(Chelating Agent(s))
를 이용한 트리설파이드 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 선택된 킬레이트제를 (1) 트리설파이드 이성체 불순물, (2) 재조합 성장 호르몬 대항제 B-2036, (3) (대항제의 재조합 생산을 위한) 숙주 세포 세포 성분(들)(host cell cellular component(s)), 및 (4) (1) 내지 (3)의 모든 성분의 결합과 접촉시키면 시스테인-S-S-S-시스테인 트리설파이드 브리지(bridge)가 시스테인-S-S-시스테인의 자연 형태로 전환되거나, 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다. 또한, 역시 이론에 얽매이지 않고, 상기 킬레이트제의 존재는 트리설파이드 브리지 자체가 더 형성되는 것을 방지할 수 있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제(들)는 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 B-2036 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 B-2036 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 이후, 상기 정제된 단백질은 바람직하게 PEG화(pegylated)되어 PEG B-2036(페그비소만트)을 수득할 수 있다. 상기 PEG화 과정은 미합중국특허 제5,849,535호에 나타나있다.
B-2036 단백질 성분 및 이의 트리설파이드 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 B-2036의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 트리설파이드 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 킬레이트제도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 사용할 수 있는 킬레이트제의 예로는 데페록사민(Deferoxamine), 디티오카브 소듐(Ditiocarb Sodium), 에데트산 칼슘 디소듐(Edetate Calcium Disodium), 에데트산 디소듐(Edetate Disodium), 에데트산 소듐(Edetate Sodium), 에데트산 트리소듐(Edetate Trisodium), 페니실라민(Penicillamine), 펜테테이트 칼슘 트리소듐(Pentetate Calcium Trisodium), 펜테틱 산(Pentetic Acid), 석시머(Succimer), 및 트리엔틴(Trientine) 등을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 에데트산 소듐은 EDTA의 염의 형태임을 주의하라.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 킬레이트제와 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
상기 적합한 킬레이트제들 중, EDTA가 가장 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 킬레이트제의 양은 트리설파이드 이성체 불순물을 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 평형 농도(highest average equilibrium concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 트리설파이드 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 가장 높은 평균 평형 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 EDTA의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.01mM, 약 0.01mM 내지 약100mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 2mM 내지 약 10mM 또는 약 2mM 내지 약 5mM이다.
상기 킬레이트제를 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, B-2036 단백질 성분의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 B-2036 단백질 성분을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 완충액은 트리스이다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 6 내지 약 9, 약 6.5 내지 약 7.5 혹은 약 7.2 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
앞서 주지한 바와 같이, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 완충액에서 킬레이트제의 양은 B-2036 단백질의 몰(moles)에 대한 킬레이트제 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 1000일 수 있다. 선택적으로, 상기 B-2036 단백질의 몰에 대한 킬레이트제 몰의 몰비는 각각 약 20 내지 약 1000, 약 50 내지 약 250, 또는 약 60 내지 약 110일 수 있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 단백질 성분 사이에 (상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 B-2036 단백질 성분은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 킬레이트제가 숙주 세포(들) 혹은 상기 B-2036 단백질 성분을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 킬레이트제 및 B-2036, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 B-2036 성분을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 약 4℃의 온도를 갖는 킬레이트제(즉, EDTA)를 첨가함에 따라, B-2036을 포함하는 상기 균등질(homogenate)이 균질화되는 동안 B-2036을 포함하는 상기 균등질의 온도는 약 30℃까지 올라간다는 점을 유념하라. 상기 B-2036 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 킬레이트제 및 B-2036 등을 포함하는)의 온도는 상기 B-2036 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 B-2036 성분과 상기 킬레이트제의 접촉 시간은 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분을 충분히 접촉시킨 후, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 10리터 내지 약 500리터, 또는 약 100리터 내지 약 300리터의 부피를 갖는다. 160리터 내지 500리터 사이의 다른 적합한 부피도 가질 수 있다.
상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(하나의 성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 킬레이트제(들), B-2036 성분 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, B-2036 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
c.
금속염(Metal Salt(s))
을 이용한 트리설파이드 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 선택된 금속염(들)을 (1) 트리설파이드 이성체 불순물, (2) 재조합 성장 호르몬 대항제 B-2036, (3) (대항제의 재조합 생산을 위한) 숙주 세포 세포 성분(들)(host cell cellular component(s)), 및 (4) (1) 내지 (3)의 모든 성분의 결합과 접촉시키면 시스테인-S-S-S-시스테인 트리설파이드 브리지(bridge)가 시스테인-S-S-시스테인의 자연 형태로 전환되거나, 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다. 또한, 역시 이론에 얽매이지 않고, 상기 금속염(들)의 존재는 트리설파이드 브리지 자체가 더 형성되는 것을 방지할 수 있다.
통상적으로, 상기 금속염(들)은 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 B-2036 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 B-2036 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 이후, 상기 정제된 단백질은 바람직하게 PEG화(pegylated)되어 PEG B-2036(페그비소만트)을 수득할 수 있다. 상기 PEG화 과정은 미합중국특허 제5,849,535호에 나타나있다.
B-2036 단백질 성분 및 이의 트리설파이드 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 B-2036의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 트리설파이드 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 금속염도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 금속염은 알칼리 금속 염(들)(alkali metal salt(s)), 알칼리 토금속 염(들)(alkaline earth metal salt(s)), 전이 금속 염(transition metal salt(s)) 또는 이들의 조합(combination) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용할 수 있는 바람직한 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride) 및 이들의 조합(combination)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 금속염과 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 적합한 금속염들 중, 소듐 포스페이트, ZnCl2 및 이들의 조합(combination)이 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염의 양은 트리설파이드 이성체 불순물을 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 농도(highest average concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 트리설파이드 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 농도(또는, 가장 높은 평균 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염(즉, 소듐 포스페이트)의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.1mM, 약 1mM 내지 약500mM, 약 1mM 내지 약 200mM, 약 5mM 내지 약 175mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM이다.
상기 금속염을 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 소듐 포스페이트는 완충액 및 적합한 금속염 모두로 작용할 수 있다. 하지만, 추가의 적합한 금속염이 소듐 포스페이트 완충액에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, B-2036 단백질 성분의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 B-2036 단백질 성분을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 4 내지 약 9, 약 4.5 내지 약 7.5 혹은 약 5.5 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
상기 금속염을 완충액(또는, NaP의 경우, NaP 용액이 금속염 및 완충액으로 모두 작용하는 경우)에 제공한 후, 상기 완충액(또는 완충액으로서도 작용하는 NaP 용액)에서 금속염의 양은 B-2036 단백질의 몰(moles)에 대한 금속염 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 10000일 수 있다. 선택적으로, 상기 B-2036 단백질의 몰에 대한 금속염 몰의 몰비는 각각 약 300 내지 약 10000, 약 500 내지 약 5000, 또는 약 500 내지 약 2500일 수 있다.
통상적으로, 상기 금속염과 상기 B-2036 단백질 성분 사이에 (상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 B-2036 단백질 성분은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 금속염이 숙주 세포(들) 혹은 상기 B-2036 단백질 성분을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 금속염 및 B-2036, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 B-2036 성분을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 상기 금속염(즉, NaP)과 함께 균질화되는 동안, 상기 균등질(homogenate)의 온도는 상승할 수 있다는 점을 유념하라. 상기 B-2036 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 금속염 B-2036, 및 선택적으로 머캅토 화합물 등을 포함하는)의 온도는 상기 B-2036 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 B-2036 성분과 상기 금속염의 접촉 시간은 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 트리설파이드 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 금속염과 상기 B-2036 성분을 충분히 접촉시킨 후, 상기 금속염과 상기 B-2036 성분을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 100리터 내지 약 2000리터, 또는 약 200리터 내지 약 1500리터의 부피를 갖는다.
상기 금속염과 상기 B-2036 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 금속염(들), B-2036 성분 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, B-2036 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
2. 재조합 성장 호르몬 대항제 및
이의 데-프 이성체 불순물(Des-Phe Isoform Impurity)
a.
킬레이트제(Chelating Agent)
를 이용한 데-프 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 재조합 성장 호르몬 대항제 B-2036에 킬레이트제(들)를 첨가하면 데-프 이성체 불순물 수준의 실질적 감소에 의해 및/또는 데-프가 더 형성되는 것을 방지함에 따라 상기 데-프 이성체 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제(들)는 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 B-2036 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 B-2036 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 이후, 정제된 단백질은 바람직하게 PEG화(pegylated)되어 PEG B-2036(페그비소만트)을 수득할 수 있다. 상기 PEG화 과정은 미합중국특허 제5,849,535호에 나타나있다.
B-2036 단백질 성분 및 이의 데-프 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 B-2036의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 데-프 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 킬레이트제도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 사용할 수 있는 킬레이트제의 예로는 데페록사민(Deferoxamine), 디티오카브 소듐(Ditiocarb Sodium), 에데트산 칼슘 디소듐(Edetate Calcium Disodium), 에데트산 디소듐(Edetate Disodium), 에데트산 소듐(Edetate Sodium), 에데트산 트리소듐(Edetate Trisodium), 페니실라민(Penicillamine), 펜테테이트 칼슘 트리소듐(Pentetate Calcium Trisodium), 펜테틱 산(Pentetic Acid), 석시머(Succimer), 및 트리엔틴(Trientine) 등을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 에데트산 소듐은 EDTA의 염의 형태임을 주의하라.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 킬레이트제와 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
상기 적합한 킬레이트제들 중, EDTA가 가장 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 킬레이트제의 양은 데-프 이성체 불순물을 상기 데-프 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 평형 농도(highest average equilibrium concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 데-프 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 가장 높은 평균 평형 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 EDTA의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.01mM, 약 0.01mM 내지 약100mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 2mM 내지 약 10mM 또는 약 2mM 내지 약 5mM이다.
상기 킬레이트제를 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, B-2036 단백질 성분의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 B-2036 단백질 성분을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 완충액은 트리스이다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 6 내지 약 9, 약 6.5 내지 약 7.5 혹은 약 7.2 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
앞서 주지한 바와 같이, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 완충액에서 킬레이트제의 양은 B-2036 단백질의 몰(moles)에 대한 킬레이트제 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 1000일 수 있다. 선택적으로, 상기 B-2036 단백질의 몰에 대한 킬레이트제 몰의 몰비는 각각 약 20 내지 약 1000, 약 50 내지 약 250, 또는 약 60 내지 약 110일 수 있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 단백질 성분 사이에 (상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 B-2036 단백질 성분은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 킬레이트제가 숙주 세포(들) 혹은 상기 B-2036 단백질 성분을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 킬레이트제 및 B-2036, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 B-2036 성분을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 약 4℃의 온도를 갖는 킬레이트제(즉, EDTA)를 첨가함에 따라, B-2036을 포함하는 상기 균등질(homogenate)이 균질화되는 동안 B-2036을 포함하는 상기 균등질의 온도는 약 30℃까지 올라간다는 점을 유념하라. 상기 B-2036 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 킬레이트제 및 B-2036 등을 포함하는)의 온도는 상기 B-2036 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 B-2036 성분과 상기 킬레이트제의 접촉 시간은 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분을 충분히 접촉시킨 후, 상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 10리터 내지 약 500리터, 또는 약 100리터 내지 약 300리터의 부피를 갖는다. 160리터 내지 500리터 사이의 다른 적합한 부피도 가질 수 있다.
상기 킬레이트제와 상기 B-2036 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 킬레이트제(들), B-2036 성분 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, B-2036 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
b.
금속염(Metal Salt(s))
을 이용한 데-프 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 금속염(들)을 재조합 성장 호르몬 대항제 B-2036에 첨가하면 데-프 이성체 불순물의 실질적 감소에 의하여 및/또는 데-프가 더 형성되는 것을 방해함에 따라 데-프 이성체 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다.
통상적으로, 상기 금속염(들)은 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 B-2036 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 B-2036 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 이후, 상기 정제된 단백질은 바람직하게 PEG화(pegylated)되어 PEG B-2036(페그비소만트)을 수득할 수 있다. 상기 PEG화 과정은 미합중국특허 제5,849,535호에 나타나있다.
B-2036 단백질 성분 및 이의 데-프 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 B-2036의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 데-프 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 금속염도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 금속염은 알칼리 금속 염(들)(alkali metal salt(s)), 알칼리 토금속 염(들)(alkaline earth metal salt(s)), 전이 금속 염(transition metal salt(s)) 또는 이들의 조합(combination) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용할 수 있는 바람직한 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride) 및 이들의 조합(combination)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 금속염과 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 적합한 금속염들 중, 소듐 포스페이트, ZnCl2 및 이들의 조합(combination)이 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염의 양은 데-프 이성체 불순물을 상기 데-프 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 농도(highest average concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 데-프 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 농도(또는, 가장 높은 평균 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염(즉, 소듐 포스페이트)의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.1mM, 약 1mM 내지 약500mM, 약 1mM 내지 약 200mM, 약 5mM 내지 약 175mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM이다.
상기 금속염을 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 소듐 포스페이트는 완충액 및 적합한 금속염 모두로 작용할 수 있다. 하지만, 추가의 적합한 금속염이 소듐 포스페이트 완충액에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, B-2036 단백질 성분의 형성을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 4 내지 약 9, 약 4.5 내지 약 7.5 혹은 약 5.5 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
상기 금속염을 완충액(또는, NaP의 경우, NaP 용액이 금속염 및 완충액으로 모두 작용하는 경우)에 제공한 후, 상기 완충액(또는 완충액으로서도 작용하는 NaP 용액)에서 금속염의 양은 B-2036 단백질의 몰(moles)에 대한 금속염 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 10000일 수 있다. 선택적으로, 상기 B-2036 단백질의 몰에 대한 금속염 몰의 몰비는 각각 약 300 내지 약 10000, 약 500 내지 약 5000, 또는 약 500 내지 약 2500일 수 있다.
통상적으로, 상기 금속염(들)과 상기 B-2036 단백질 성분 사이에 (상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 B-2036 단백질 성분은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 금속염이 숙주 세포(들) 혹은 상기 B-2036 단백질 성분을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 금속염 및 B-2036, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 B-2036 성분을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 상기 금속염(즉, NaP)과 함께 균질화되는 동안, 상기 균등질(homogenate)의 온도는 상승할 수 있다는 점을 유념하라. 상기 B-2036 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 금속염 B-2036, 및 선택적으로 머캅토 화합물 등을 포함하는)의 온도는 상기 B-2036 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 B-2036 성분과 상기 금속염의 접촉 시간은 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 금속염과 상기 B-2036 성분을 충분히 접촉시킨 후, 상기 금속염과 상기 B-2036 성분을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 100리터 내지 약 2000리터, 또는 약 200리터 내지 약 1500리터의 부피를 갖는다.
상기 금속염과 상기 B-2036 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 금속염(들), B-2036 성분 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, B-2036 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
3. 재조합 성장 호르몬 및
이의 데-프 이성체 불순물(Des-Phe Isoform Impurity)
a.
킬레이트제(Chelating Agent)
를 이용한 데-프 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 재조합 성장 호르몬에 킬레이트제(들)를 첨가하면 데-프 이성체 불순물 수준의 실질적 감소에 의해 및/또는 데-프가 더 형성되는 것을 방지함에 따라 상기 데-프 이성체 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제(들)는 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 성장 호르몬 단백질을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 성장 호르몬 단백질을 정제하는 것이 바람직하다.
상기 성장 호르몬 단백질 및 이의 데-프 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 상기 성장 호르몬의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 데-프 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 킬레이트제도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 사용할 수 있는 킬레이트제의 예로는 데페록사민(Deferoxamine), 디티오카브 소듐(Ditiocarb Sodium), 에데트산 칼슘 디소듐(Edetate Calcium Disodium), 에데트산 디소듐(Edetate Disodium), 에데트산 소듐(Edetate Sodium), 에데트산 트리소듐(Edetate Trisodium), 페니실라민(Penicillamine), 펜테테이트 칼슘 트리소듐(Pentetate Calcium Trisodium), 펜테틱 산(Pentetic Acid), 석시머(Succimer), 및 트리엔틴(Trientine) 등을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 에데트산 소듐은 EDTA의 염의 형태임을 주의하라.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 킬레이트제와 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
상기 적합한 킬레이트제들 중, EDTA가 가장 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 킬레이트제의 양은 데-프 이성체 불순물을 상기 데-프 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 평형 농도(highest average equilibrium concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 데-프 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 평형 농도(또는, 가장 높은 평균 평형 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 EDTA의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.01mM, 약 0.01mM 내지 약100mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 2mM 내지 약 10mM 또는 약 2mM 내지 약 5mM이다.
상기 킬레이트제를 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, 성장 호르몬 단백질의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 성장 호르몬 단백질을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 완충액은 트리스이다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 6 내지 약 9, 약 6.5 내지 약 7.5 혹은 약 7.2 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
앞서 주지한 바와 같이, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 완충액에서 킬레이트제의 양은 성장 호르몬 단백질(즉, hGH)의 몰(moles)에 대한 킬레이트제 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 1000일 수 있다. 선택적으로, 상기 성장 호르몬 단백질(즉, hGH)의 몰에 대한 킬레이트제 몰의 몰비는 각각 약 20 내지 약 1000, 약 50 내지 약 250, 또는 약 60 내지 약 110일 수 있다.
통상적으로, 상기 킬레이트제와 상기 성장 호르몬 단백질(즉, hGH) 사이에 (상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 성장 호르몬 단백질(즉, hGH)은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 킬레이트제가 숙주 세포(들) 혹은 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 킬레이트제 및 성장 호르몬 단백질, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 약 4℃의 온도를 갖는 킬레이트제(즉, EDTA)를 첨가함에 따라, 상기 성장 호르몬을 포함하는 상기 균등질(homogenate)이 균질화(homogenization)되는 동안 상기 균등질의 온도는 약 30℃까지 올라간다는 점을 유념하라. 상기 성장 호르몬 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 킬레이트제 및 성장 호르몬 단백질 등을 포함하는)의 온도는 상기 성장 호르몬 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 성장 호르몬 단백질과 상기 킬레이트제의 접촉 시간은 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 킬레이트제와 상기 성장 호르몬 단백질을 충분히 접촉시킨 후, 상기 킬레이트제와 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 10리터 내지 약 500리터, 또는 약 100리터 내지 약 300리터의 부피를 갖는다. 160리터 내지 500리터 사이의 다른 적합한 부피도 가질 수 있다.
상기 킬레이트제와 상기 성장 호르몬 단백질이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 킬레이트제(들), 성장 호르몬 단백질 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, 성장 호르몬 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
b.
금속염(Metal Salt(s))
을 이용한 데-프 이성체
불순물
의 감소
이론에 얽매이지 않고, 금속염(들)을 재조합 성장 호르몬에 첨가하면 데-프 이성체 불순물의 실질적 감소에 의하여 및/또는 데-프가 더 형성되는 것을 방해함에 따라 데-프 이성체 불순물의 수준이 감소되는 것으로 알려져있다.
통상적으로, 상기 금속염(들)은 숙주 세포(들)에 첨가되어 숙주 세포(들)의 성장 동안 혹은 성장 후(또는, 성장 동안 및 성장 후) 원하는 재조합 성장 호르몬 단백질 성분을 합성한다. 또한, 성장 및 접촉 단계가 수행된 후, 상기 성장 호르몬 단백질을 정제하는 것이 바람직하다.
성장 호르몬 단백질 성분 및 이의 데-프 이성체 불순물과 함께 접촉되는 경우(바람직하게는 적절히 혼합하여), 바람직하게는 성장 호르몬의 수율을 저하시키지 않고(또는 실질적으로 저하시키지 않고) 데-프 이성체 불순물의 양을 충분히 저하시키는 것이라면 본 발명과 관련하여 어떠한 금속염도 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 금속염은 알칼리 금속 염(들)(alkali metal salt(s)), 알칼리 토금속 염(들)(alkaline earth metal salt(s)), 전이 금속 염(transition metal salt(s)) 또는 이들의 조합(combination) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용할 수 있는 바람직한 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride) 및 이들의 조합(combination)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용할 수 있는 다른 적합한 금속염과 관련하여 하기 문헌들을 참조할 수 있다: (1) The Merck Index, 12th Edition, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (under "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) and each and every subsequent edition to date thereof; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) and each and every subsequent edition to date thereof; (3) The United States Pharmacopeia, 21st Revision (16th edition), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) and each and every subsequent edition to date thereof; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); 및 (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) and (2002-2003) editions thereof.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 적합한 금속염들 중, 소듐 포스페이트, ZnCl2 및 이들의 조합(combination)이 바람직하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염의 양은 데-프 이성체 불순물을 상기 데-프 이성체 불순물의 형성된 가장 높은 농도(또는, 다수의 배치를 평균한 가장 높은 평균 농도(highest average concentration)인 적어도 약 10% 정도 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 바람직하게, 상기 데-프 이성체 불순물 양의 감소는 형성된 가장 높은 농도(또는, 가장 높은 평균 농도)인 각각 적어도 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 적합한 금속염(즉, 소듐 포스페이트)의 초기 농도는 바람직하게는 각각 적어도 약 0.1mM, 약 1mM 내지 약500mM, 약 1mM 내지 약 200mM, 약 5mM 내지 약 175mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM이다.
상기 금속염을 완충액(buffer)에 제공하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 소듐 포스페이트는 완충액 및 적합한 금속염 모두로 작용할 수 있다. 하지만, 추가의 적합한 금속염이 소듐 포스페이트 완충액에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 상기 완충액은 본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 것, 즉, 성장 호르몬 단백질 성분의 형성을 방해하거나, 한번 형성된 성장 호르몬 단백질 성분을 저하시키지(degrade) 않는 것이어야 한다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용할 수 있는 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 초기 완충액의 농도는 약 1mM 내지 약 200mM, 보다 바람직하게는 약 5mM 내지 약 100mM, 보다 더 바람직하게는 약 8mM 내지 약 70mM, 가장 바람직하게는 약 10mM 내지 약 50mM이다. 다른 적합한 완충액도 사용될 수 있다. 이러한 완충액들은 성장 배지(growth medium) 어느 곳에서도 pH를 각각 약 4 내지 약 9, 약 4.5 내지 약 7.5 혹은 약 5.5 내지 약 7.5로 유지할 수 있도록 충분한 것이 바람직하다.
상기 금속염을 완충액(또는, NaP의 경우, NaP 용액이 금속염 및 완충액으로 모두 작용하는 경우)에 제공한 후, 상기 완충액(또는 완충액으로서도 작용하는 NaP 용액)에서 금속염의 양은 성장 호르몬 단백질(즉, hGH)의 몰(moles)에 대한 금속염 몰(mole)의 몰비(molar ratio)로서 약 1 내지 약 10000일 수 있다. 선택적으로, 상기 성장 호르몬 단백질(즉, hGH)의 몰에 대한 금속염 몰의 몰비는 각각 약 300 내지 약 10000, 약 500 내지 약 5000, 또는 약 500 내지 약 2500일 수 있다.
통상적으로, 상기 금속염(들)과 상기 성장 호르몬 단백질(즉, hGH) 사이에 (상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위한) 충분한 접촉이 있은 후(숙주세포가 완전해지기 이내에, 혹은 완전해진 후로부터), 상기 완충액에서 상기 성장 호르몬 단백질은 각각 약 0.1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 5mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 5mg/ml의 농도를 갖는다.
게다가, 상기 금속염이 숙주 세포(들) 혹은 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 숙주 세포의 용해질(lysate)에 첨가된 후, 상기 완충액, 상기 금속염 및 성장 호르몬 단백질, 이에 한정되지는 않지만, 등을 포함하는 다른 성분들과 함께 상기 성장 배지의 온도 범위는 바람직하게 약 0℃ 내지 약 35℃로 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 숙주 세포(들) 및/또는 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 상기 숙주 세포로부터의 용해질의 온도는 각각 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 15℃로 유지되는 것이 바람직하다. 상기 금속염(즉, NaP)과 함께 균질화되는 동안, 상기 균등질(homogenate)의 온도는 상승할 수 있다는 점을 유념하라. 상기 성장 호르몬 단백질의 변성은 약 40+℃에서 일어난다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 상기 균등질(homogenate)(즉, 숙주 세포들, 성장 배지, 완충액, 금속염, 성장 호르몬 단백질, 및 선택적으로 머캅토 화합물 등을 포함하는)의 온도는 상기 성장 호르몬 단백질의 변성온도보다 낮게 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 성장 호르몬 단백질과 상기 금속염의 접촉 시간은 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시킬 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 예를 들어, 상기 데-프 이성체 불순물의 수준을 감소시키기 위하여 적합한 접촉 시간은 각각 적어도 약 30분, 약 1시간 내지 약 48시간, 또는 약 5시간 내지 약 15시간이다.
일반적으로, 상기 금속염과 상기 성장 호르몬 단백질을 충분히 접촉시킨 후, 상기 금속염과 상기 성장 호르몬 단백질을 포함하는 완충액은 각각 약 1리터 내지 약 5000리터, 약 100리터 내지 약 2000리터, 또는 약 200리터 내지 약 1500리터의 부피를 갖는다.
상기 금속염과 상기 성장 호르몬 단백질 성분이 접촉하는 동안 관심을 가질만한 다른 변수로서 혼합율(mixing rate) 등을 들 수 있다. 상기 혼합율은 형성될 수 있는 기포(foaming)의 양을 최소화하면서 충분히 균질한 혼합물(homogeneous mixture)(성장 배지에 포함된 숙주 세포(들), 숙주 세포의 용해질, 완충액, 금속염(들), 성장 호르몬 단백질 및 다른 성분들)을 형성할 수 있어야 한다. 해당 기술의 통상의 지식을 가진 자들은 충분한 혼합율은 어떠해야 할지 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 명백히, 상기 혼합율은 상술한 범위의 온도를 유지할 수 있으며, 상기 성장 호르몬 단백질 성분의 어떠한 분해(degradation)도 최소화할 수 있는 것이어야 한다.
1. (a) 머캅토 화합물이 충분한 상태에서, 불순물을 상기 머캅토 화합물과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 유전적으로 변형된 숙주 세포에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
2. 제1 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포를 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
3. 제2 실시예에 있어서,
(c) 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
4. 제3 실시예에 있어서,
(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
5. 제2 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리올(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
6. 제1 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리올(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
7. 제5 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인 또는 시스테인과 시스테인의 결합물(combination of cysteine and cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
8. 제6 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인 또는 시스테인과 시스테인의 결합물(combination of cysteine and cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
9. 제7 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 시스테인 또는 상기 시스테인과 시스테인의 결합물 (combination of cysteine and cysteine)과 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
10. 제9 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
11. 제8 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 시스테인과 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
12. 제11 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
13. 제1 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
14. 제2 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
15. 제7 실시예에 있어서, 상기 시스테인 또는 상기 시스테인과 시스테인의 결합물을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
16. 제8 실시예에 있어서, 상기 시스테인 또는 상기 시스테인과 시스테인의 결합물을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
17. 제15 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액은 적어도 0.1mM의 결합된 시스테인과 시스테인의 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
18. 제16 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액은 적어도 0.1mM의 결합된 시스테인과 시스테인의 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
19. 제17 실시예에 있어서, 상기 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도는 0.1mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
20. 제18 실시예에 있어서, 상기 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도는 0.1mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
21. 제19 실시예에 있어서, 상기 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도는 1mM 내지 5mM인 것을 특징으로 하는 공정.
22. 제20 실시예에 있어서, 상기 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도는 1mM 내지 5mM인 것을 특징으로 하는 공정.
23. 제13 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
24. 제14 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
25. 제15 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
26. 제16 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
27. 제23 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
28 제26 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
29. 제25 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
30. 제24 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
31. 제29 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
32. 제28 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
33. 제31 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
34. 제32 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
35. 제1 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
36. 제2 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
37. 제25 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
38. 제26 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
39. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액은 적어도 0.1mM의 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
40. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액은 적어도 0.1mM의 결합된 시스테인과 시스테인의 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
41. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 시스테인과 시스테인의 결합물 및 상기 B-2036은 0.5 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 결합된 시스테인과 시스테인의 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
42. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 시스테인과 시스테인의 결합물 및 상기 B-2036은 0.5 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 결합된 시스테인과 시스테인의 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
43. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 30mg/ml의 상기 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
44. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 30mg/ml의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
45. 제43 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 20mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
46. 제44 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 20mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
47. 제45 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 1mg/ml 내지 10mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
48. 제46 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 1mg/ml 내지 10mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
49. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
50. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
51. 제49 실시예에 있어서, 상기 pH는 7.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 공정.
52. 제50 실시예에 있어서, 상기 pH는 7.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 공정.
53. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 25℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
54. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 25℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
55. 제53 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 8℃인 것을 특징으로 하는 공정.
56. 제54 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 8℃인 것을 특징으로 하는 공정.
57. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 적어도 30분의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
58. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 적어도 30분의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
59. 제57 실시예에 있어서, 상기 시간은 1시간 내지 24시간인 것을 특징으로 하는 공정.
60. 제58 실시예에 있어서, 상기 시간은 1시간 내지 24시간인 것을 특징으로 하는 공정.
61. 제59 실시예에 있어서, 상기 시간은 1시간 내지 4시간인 것을 특징으로 하는 공정.
62. 제60 실시예에 있어서, 상기 시간은 1시간 내지 4시간인 것을 특징으로 하는 공정.
63. 제37 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
64. 제38 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
65. 제63 실시예에 있어서, 상기 부피는 10L 내지 500L인 것을 특징으로 하는 공정.
66. 제64 실시예에 있어서, 상기 부피는 10L 내지 500L인 것을 특징으로 하는 공정.
67. 제65 실시예에 있어서, 상기 부피는 100L 내지 300L인 것을 특징으로 하는 공정.
68. 제66 실시예에 있어서, 상기 부피는 100L 내지 300L인 것을 특징으로 하는 공정.
69. (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
70. 제69 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
71. 제70 실시예에 있어서,
(c) 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
72. 제71 실시예에 있어서,
(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
73. 제70 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
74. 제69 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
75. 제73 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
76. 제74 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
77. 제75 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 EDTA와 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
78. 제77 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
79. 제76 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 EDTA와 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
80. 제79 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
81. 제69 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
82. 제70 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
83. 제75 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
84. 제76 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
85. 제83 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
86. 제84 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
87. 제85 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
88. 제86 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
89. 제87 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
90. 제87 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
91. 제89 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
92. 제89 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
93. 제81 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
94. 제82 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
95. 제83 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
96. 제84 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
97. 제93 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
98 제96 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
99. 제95 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
100. 제94 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
101. 제99 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
102. 제98 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
103. 제101 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
104. 제102 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
105. 제69 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
106. 제70 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
107. 제95 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
108. 제96 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
109. 제107 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
110. 제108 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
111. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 EDTA 및 상기 B-2036은 1 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 상기 EDTA 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
112. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 EDTA 및 상기 B-2036은 1 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 상기 EDTA몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
113. 제111 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
114. 제112 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
115. 제113 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
116. 제114 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
117. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
118. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
119. 제117 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
120. 제118 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
121. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
122. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
123. 제121 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
124. 제122 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
125. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
126. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
127. 제125 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
128. 제126 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
129. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
130. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
131. 제129 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
132. 제130 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
133. 제107 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
134. 제108 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
135. 제133 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
136. 제134 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
137. (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
138. 제137 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
139. 제138 실시예에 있어서,
(c) 선택적으로 상기 불순물을 머캅토 화합물과 추가적으로 접촉시키는 단계, 및
(c') 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
140. 제139 실시예에 있어서,
(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
141. 제138 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
142. 제137 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
143. 제141 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
144. 제142 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
145. 제143 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
146. 제144 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
147. 제137 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 금속염과 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
148. 제147 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
149. 제138 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 금속염과 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
150. 제149 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 트리설파이드 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
151. 제137 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
152. 제138 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
153. 제151 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
154. 제152 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
155. 제153 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
156. 제154 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
157. 제145 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
158. 제146 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
159. 제151 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
160. 제153 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
161. 제137 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
162. 제138 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
163. 제160 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
164. 제159 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
165. 제163 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
166. 제164 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
167. 제165 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
168. 제166 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
169. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 금속염 및 상기 B-2036은 300 내지 10000의 B-2036의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
170. 제164 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 금속염 및 상기 B-2036은 300 내지 10000의 B-2036의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
171. 제169 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
172. 제170 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
173. 제171 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
174. 제172 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
175. 제153 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
176. 제154 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
177. 제175 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
178. 제176 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
179. 제177 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
180. 제178 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
181. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
182. 제164 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
183. 제181 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
184. 제182 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
185. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
186. 제184 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
187. 제185 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
188. 제186 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
189. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
190. 제164 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
191. 제189 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
192. 제190 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
193. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
194. 제164 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
195. 제193 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
196. 제194 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
197. 제163 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
198. 제164 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
199. 제197 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
200. 제198 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
201. (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
202. 제201 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
203. 제202 실시예에 있어서,
(c) 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
204. 제203 실시예에 있어서,
(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
205. 제202 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
206. 제201 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
207. 제205 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
208. 제206 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
209. 제207 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 EDTA와 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
210. 제209 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
211. 제208 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 EDTA와 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
212. 제211 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
213. 제201 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
214. 제202 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
215. 제207 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
216. 제208 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
217. 제215 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
218. 제216 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
219. 제217 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
220. 제218 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
221. 제219 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
222. 제220 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
223. 제221 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
224. 제222 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
225. 제213 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
226. 제214 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
227. 제215 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
228. 제216 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
229. 제225 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
230. 제226 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
231. 제227 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
232. 제228 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
233. 제229 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
234. 제230 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
235. 제233 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
236. 제234 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
237. 제201 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
238. 제202 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
239. 제227 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
240. 제228 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
241. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
242. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
243. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 EDTA 및 상기 B-2036은 1 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 상기 EDTA 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
244. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 EDTA 및 상기 B-2036은 1 내지 1000의 B-2036의 몰에 대한 상기 EDTA몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
245. 제243 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
246. 제244 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
247. 제245 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
248. 제246 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
249. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
250. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
251. 제249 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
252. 제250 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
253. 제249 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 1mg/ml 내지 10mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
254. 제250 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 1mg/ml 내지 10mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
255. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
256. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
257. 제255 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
258. 제256 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
259. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
260. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
261. 제259 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
262. 제260 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
263. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
264. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
265. 제263 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
266. 제264 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
267. 제239 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
268. 제240 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
269. 제267 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
270. 제268 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
271. (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
272. 제271 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
273. 제272 실시예에 있어서,
(c) 선택적으로 상기 불순물을 머캅토 화합물과 추가적으로 접촉시키는 단계, 및
(c') 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
274. 제273 실시예에 있어서,
(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
275. 제272 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
276. 제271 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
277. 제275 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
278. 제276 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
279. 제277 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
280. 제278 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
281. 제271 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 금속염과 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
282. 제281 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
283. 제272 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 금속염과 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
284. 제283 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
285. 제271 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
286. 제272 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
287. 제285 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
288. 제286 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
289. 제287 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
290. 제288 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
291. 제286 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
292. 제285 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
293. 제285 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
294. 제286 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
295. 제271 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
296. 제272 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드는 [서열번호 1(SEQ. ID. NO. 1)]의 B-2036을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
297. 제295 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
298. 제296 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
299. 제297 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
300. 제298 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
301. 제295 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 금속염 및 상기 B-2036은 300 내지 10000의 B-2036의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
302. 제296 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 금속염 및 상기 B-2036은 300 내지 10000의 B-2036의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
303. 제301 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
304. 제302 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
305. 제303 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
306. 제304 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
307. 제287 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
308. 제288 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
309. 제307 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
310. 제308 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
311. 제309 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
312. 제310 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
313. 제295 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
314. 제296 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 B-2036은 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 B-2036 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
315. 제313 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
316. 제314 실시예에 있어서, 상기 B-2036의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
317. 제293 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
318. 제294 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
319. 제317 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
320. 제318 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
321. 제295 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
322. 제296 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 B-2036의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
323. 제321 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
324. 제322 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
325. 제295 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
326. 제296 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
327. 제325 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
328. 제326 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
329. 제295 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
330. 제296 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 B-2036은 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
331. 제329 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
332. 제330 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
333. (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
334. 제333 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
335. 제334 실시예에 있어서,
(c) 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
336. 제333 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
337. 제334 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 DTPA로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
338. 제336 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
339. 제337 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
340. 제338 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 EDTA와 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
341. 제340 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
342. 제339 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 EDTA와 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
343. 제342 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
344. 제333 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
345. 제334 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
346. 제338 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
347. 제339 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
348. 제346 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
349. 제347 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
350. 제348 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
351. 제349 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.01mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
352. 제350 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
353. 제351 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 0.1mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 공정.
354. 제352 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
355. 제353 실시예에 있어서, 상기 EDTA의 초기 농도는 2mM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 공정.
356. 제344 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
357. 제345 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
358. 제346 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
359. 제347 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
360. 제356 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
361. 제357 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
362. 제358 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
363. 제359 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
364. 제360 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
365. 제361 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 트리스 완충액은 1mM 내지 200mM의 트리스 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
366. 제364 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
367. 제365 실시예에 있어서, 상기 트리스의 농도는 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 공정.
368. 제333 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬은 [서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)]의 폴리펩티드 hGH를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
369. 제334 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬은 [서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)]의 폴리펩티드 hGH를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
370. 제368 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
371. 제369 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
372. 제370 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.01mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
373. 제371 실시예에 있어서, 상기 EDTA를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 전에 상기 완충액에서 상기 EDTA는 적어도 0.1mM의 EDTA 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
374. 제370 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 EDTA 및 상기 hGH는 1 내지 1000의 hGH의 몰에 대한 상기 EDTA 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
375. 제371 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 EDTA 및 상기 hGH는 1 내지 1000의 hGH 몰에 대한 상기 EDTA몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
376. 제374 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
377. 제375 실시예에 있어서, 상기 몰비는 20 내지 1000인 것을 특징으로 하는 공정.
378. 제376 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
379. 제377 실시예에 있어서, 상기 몰비는 50 내지 250인 것을 특징으로 하는 공정.
380. 제368 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 hGH는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 hGH 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
381. 제369 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 hGH는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 hGH 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
382. 제380 실시예에 있어서, 상기 hGH의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
383. 제381 실시예에 있어서, 상기 hGH의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
384. 제368 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
385. 제369 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 6 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
386. 제384 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
387. 제385 실시예에 있어서, 상기 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
388. 제368 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 hGH의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
389. 제369 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 hGH의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
390. 제388 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
391. 제389 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
392. 제368 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
393. 제369 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
394. 제392 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
395. 제393 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
396. 제368 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 hGH는 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
397. 제369 실시예에 있어서, 상기 킬레이트제를 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 hGH는 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
398. 제396 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
399. 제397 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
400. (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계,
를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성된 불순물의 양을 감소시키는 공정.
401. 제400 실시예에 있어서,
(b) 상기 숙주 세포들을 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
402. 제401 실시예에 있어서,
(c) 선택적으로 상기 불순물을 머캅토 화합물과 추가적으로 접촉시키는 단계, 및
(c') 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
403. 제400 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
404. 제401 실시예에 있어서, 상기 금속염은 알칼리 금속 염(alkali metal salt), 알칼리 토금속 염(alkaline earth metal salt), 전이 금속 염(transition metal salt) 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
405. 제403 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
406. 제404 실시예에 있어서, 상기 금속염은 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 징크 클로라이드(zinc chloride), 및 이들의 조합(combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
407. 제405 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
408. 제406 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 ZnCl2로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
409. 제400 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 금속염과 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
410. 제409 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
411. 제401 실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 데-프 이성체를 상기 금속염과 상기 데-프 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
412. 제411 실시예에 있어서, 상기 기간은 상기 데-프 이성체의 양을 50% 정도 감소시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 공정.
413. 제400 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
414. 제401 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
415. 제413 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
416. 제414 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 이전에 상기 완충액에서 상기 금속염은 1mM 내지 500mM의 금속염 초기농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
417. 제415 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
418. 제416 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
419. 제417 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
420. 제418 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
421. 제413 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
422. 제414 실시예에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris), 포스페이트(phosphate), HEPES, 시트르산(citric acid), 트리에틸아민(triethylamine) 및 히스티딘(histidine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
423. 제400 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬은 [서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)]의 폴리펩티드 hGH를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
424. 제401 실시예에 있어서, 상기 성장 호르몬은 [서열번호 2(SEQ. ID. NO. 2)]의 폴리펩티드 hGH를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
425. 제407 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
426. 제408 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
427. 제425 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
428. 제426 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에 상기 소듐 포스페이트(sodium phosphate)는 적어도 0.1mM의 소듐 포스페이트 초기 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
429. 제423 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 금속염 및 상기 hGH는 300 내지 10000의 hGH의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
430. 제424 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 전에, 상기 완충액에서의 상기 금속염 및 상기 hGH는 300 내지 10000의 hGH의 몰에 대한 상기 금속염 몰의 몰비(molar ratio)를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
431. 제429 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
432. 제430 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 5000인 것을 특징으로 하는 공정.
433. 제431 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
434. 제432 실시예에 있어서, 상기 몰비는 500 내지 2500인 것을 특징으로 하는 공정.
435. 제415 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
436. 제416 실시예에 있어서, 상기 금속염은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 또는 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
437. 제435 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
438. 제436 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 10mM 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 공정.
439. 제437 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
440. 제438 실시예에 있어서, 상기 금속염의 초기 농도는 25mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 공정.
441. 제423 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 hGH는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 hGH 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
442. 제424 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후, 상기 완충액에서 상기 hGH는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 hGH 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
443. 제441 실시예에 있어서, 상기 hGH의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
444. 제442 실시예에 있어서, 상기 hGH의 농도는 0.5mg/ml 내지 5mg/ml인 것을 특징으로 하는 공정.
445. 제413 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
446. 제414 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액은 4 내지 9의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
447. 제445 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
448. 제446 실시예에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 공정.
449. 제423 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 hGH의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
450. 제424 실시예에 있어서, 상기 금속염을 완충액에 제공하며, 상기 (a)단계 후 상기 완충액 및 상기 hGH의 온도는 0℃ 내지 35℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
451. 제449 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
452. 제450 실시예에 있어서, 상기 온도는 2℃ 내지 15℃인 것을 특징으로 하는 공정.
453. 제423 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
454. 제424 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 1시간 내지 48시간의 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
455. 제453 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
456. 제454 실시예에 있어서, 상기 시간은 5시간 내지 15시간인 것을 특징으로 하는 공정.
457. 제423 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 hGH는 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
458. 제424 실시예에 있어서, 상기 (a)단계 후 상기 완충액에서 상기 hGH는 1L 내지 5000L의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 공정.
459. 제457 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
460. 제458 실시예에 있어서, 상기 부피는 200L 내지 1500L인 것을 특징으로 하는 공정.
461. 제69 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 머캅토 화합물의 부재(不在)하에 수행되는 것을 특징으로 하는 공정.
462. 제69 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 상기 킬레이트제와 접촉시킨 후, 상기 킬레이트제의 부재(不在)하에 머캅토 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
463. 제462 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 시스테인의 결합물(cysteine in combination with cysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
464. 제463 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인(cysteine) 또는 시스테인과 시스테인의 결합물(cysteine in combination with cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
465. 제137 실시예에 있어서, 상기(a)단계는 상기 금속염과 머캅토 화합물의 결합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
466. 제465 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 시스테인의 결합물(cysteine in combination with cysteine)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 공정.
467. 제466 실시예에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인(cysteine) 또는 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
468. 제137 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 상기 금속염과 접촉시킨 후, 상기 금속염의 부재(不在), 또는 존재 하에 머캅토 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
이하 설명하는 내용들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 이에 한정되어 해석되어서는 안될 것이다. 본 명세서에서 언급된 책, 학술지, 신문기사, 특허 또는 그 밖의 출판물에 대한 인용들은 본 명세서에 참조문헌으로 명백히 언급되어 있다.
실험예
실험예 1
머캅토 화합물(들)에 의한 성장 호르몬 대항제(GHA)의 트리설파이드 이성체 불순물의 감소(Decrease of Trisulfide Isoform Impurity of Growth Hormone Antagonist (GHA) with Mercapto Compound(s))
B-2036의 정제 공정(purification process)에서 보존물 1(Retentate 1)(하기 플로우차트 1(flowchart 1)을 참조)을 사용하여 B-2036-트리설파이드(B-2036-trisulfide)의 수준을 감소시켰다. B-2036을 발현시키는 재조합 대장균(recombinant E. coli)의 발효(fermentation)는 Cunningham et al.의 미합중국 특허 제5,849,535호에서 설명되어 있는 바와 같이 수행하였다. 초기 추출(extraction) 및 정제(purification) 단계(하기 플로우차트 1에 있어서, 보존물 1을 수득하기에 앞서 수행되는 모든 단계들, 즉, 모든 재현탁(resuspension), 균질화(homogenization), 2상 추출(two-phase extraction), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 및 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography))는 첨부된 플로우차트 1에 설명되어 있는 바와 같이 수행되었다. 초미세여과(ultrafiltration)/투석여과(diafiltration) 단계에 따르면, 상기 생성물(product)은 3.7g/L의 단백질 농도를 갖고, 25mM의 HEPES를 포함하는 pH 7.0의 완충액(~150L)(25mM HEPES, pH 7.0 buffer(~150L) at a protein concentration of 3.7g/L)에 존재하였다. 상기 생성물 용액(product solution) 2 내지 8℃의 온도를 갖도록 냉각되었으며, 이에 새로 제조된 200mM의 트리스(Tris), 20mM의 시스테인(cysteine)을 포함하며 2 내지 8℃로 냉각된 pH 8.0의 완충액(freshly prepared 200mM Tris, 20mM cysteine, pH 8.0 buffer that had been cooled to 2 to 8℃)이 1/10(1/10th)의 부피(~15L)로 첨가되었다. 상기 B-2036/시스테인 용액은 2 내지 8℃의 온도로 유지되었으며, 174분간 혼합되었다. 이어서, 상기 혼합물은 Millipore Biomax 5 초미세여과 막들(ultrafiltraion membranes)을 사용하여 131L로 농축되었으며, pH 7.0의 25mM HEPES의 6배의 부피에 대하여 투석여과되었다(diafiltered against a 6X volume of 25mM HEPES, pH 7.0). 이후, 하기 플로우차트 1에 나타난 바와 같이, 상기 결과물은 상기 B-2036 정제 공정의 나머지를 통하여 처리되었다(carried through the remainder of the B-2036 purification process).
상기 시스테인을 배양(incubation)하기 전에, 상기 B-2036/트리설파이드 수준은 3.7 area%(area percent)이었다. 상기 시스테인을 배양한 직후, 상기 B-2036/트리설파이드 수준은 2.0 area%로 떨어졌다(약 46% 정도 감소하였다.).
실험예 2
킬레이트제(들)에 의한 성장 호르몬 대항제(GHA)의 트리설파이드 이성체 불순물의 감소(Decrease of Trisulfide Isoform Impurity of Growth Hormone Antagonist (GHA) with Chelating Agent(s))
상기 플로우차트 1을 참조하면, 165Kg의 냉동된 GHA 세포 페이스트를 pH 7.2를 가지며 ~1013L의 150mM 트리스(Tris) 및 5mM EDTA에 첨가시켰다. 상기 세포 페이스트의 융해(thawing)가 완료된 경우(determined by stable A550 readings), 상기 혼합물을 950+/-50 Bar의 압력 하에서 250l/hour의 지정 유량(nominal flowrate)으로 Niro 균질화기(homogenizer)에 통과시켰다. 상기 균등질(homogenate)은 온도가 24 내지 33℃ 사이로 유지되는 탱크에 집합되었다. 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)와 PEG-4600을 용해질 혼합물(lysate mixture)에 첨가하여 두 화합물의 농도가 10%(w/w)가 되도록 하였다. 상기 이-상 혼합 결과물(resulting two-phase mixture)을 60-120분간 혼합한 후, 상기 용액을 액체/액체, 고체 배출 원심분리기(liquid/liquid, solids discharging centrifuge)를 통과시킴으로써 상기 두 상을 분해하였다(resolved). 원하는 생성물을 포함하는 상부 상(top phase)은 "delipidating" 필터, "depth" 필터, 및 0.2㎛ 필터로 구성된 필터 트레인(filter train)에 의하여 수집되고 여과되었다. 상기 여과액은 세 개의 분리된 토트들(totes)에 집합되었으며, 각각의 샘플들은 B-2036 트리설파이드를 위하여 분석되었다. 상기 수준은 3.1 내지 3.8 area%의 범위에 있었다. 이후, 상기 결과 물질(resulting material)은 제1 실험예의 플로우차트에서 설명된 바와 같은 과정에 의하여 벌크 중간물(bulk intermediate)로 가공되었다.
비교해보면, 상기 과정에 의하여(그러나, 용해 완충액(lysis buffer)에서의 EDTA 성분(킬레이트제)없이 그리고 보존물 1(Retentate 1)의 시스테인 처리 없이)가공된 로트들(lots)로부터의 샘플들은 상기 플로우차트 1의 전(全) 공정의 끝에서 평균(mean)이 5.1이고 3.2 내지 6.4 area%의 범위를 갖는 트리설파이드 수준(n=10)을 나타내었다. EDTA가 상기 용해 완충액에 포함되고, 보존물 1의 시스테인 배양 단계가 수행된 경우, 상기 트리설파이드 수준은 플로우차트 1의 전 공정의 끝에서 1.5 area%이었다.
실험예 3
금속염(들)에 의한 성장 호르몬 대항제의 트리설파이드 이성체 불순물의 감소(Decrease of Trisulfide Isoform Impurity of Growth Hormone Antagonist with Metal Salt(s))
하기 플로우차트 2를 참조하면, 165Kg의 냉동된 세포 페이스트를 pH 6.0을 가지며 ~1013L의 100mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate)에 첨가시켰다. 상기 세포 페이스트의 융해(thawing)가 완료된 경우(determined by stable A550 readings), 상기 혼합물을 950+/-50bar의 압력 하에서 250l/hour의 지정 유량(nominal flowrate)으로 Niro 균질화기(homogenizer)에 통과시켰다. 상기 균등질(homogenate)은 온도가 24 내지 33℃ 사이로 유지되는 탱크에 집합되었다. 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)와 PEG-4600을 용해질 혼합물(lysate mixture)에 첨가하여 두 화합물의 농도가 10%(w/w)가 되도록 하였다. 상기 이-상 혼합 결과물(resulting two-phase mixture)을 60-120분간 혼합한 후, 상기 용액을 액체/액체, 고체 배출 원심분리기(liquid/liquid, solids discharging centrifuge)를 통과시킴으로써 상기 두 상을 분해하였다(resolved). 원하는 생성물을 포함하는 상부 상(top phase)은 "delipidating" 필터, "depth" 필터, 및 0.2㎛ 필터로 구성된 필터 트레인(filter train)에 의하여 수집되고 여과되었다. 상기 물질은 하기 플로우차트 2에 설명된 바와 같이 상기 B-2036 공정의 나머지를 통하여 처리되었다(carried through the remainder of the B-2036 process). 공정의 끝에서 B-2036-트리설파이드의 수준은 1.4 area%이었다. 이는 노말 용해 완충액(normal lysis buffer)(150mM Tris, pH 7.2)으로 가공된 B-2036 로트들(lots)(n=10)의 B-2036-트리설파이드 수준인 3.2 내지 6.4 area%(평균 = 5.1 area%)와 비교되었다.
실험예 4
킬레이트제(들)에 의한 성장 호르몬 대항제의 데-프 이성체 불순물의 감소(Decrease of Des-Phe Isoform Impurity of Growth Hormone Antagonist with Chelating Agent(s))
상기 플로우차트 1을 참조하면, 165Kg의 냉동된 GHA 세포 페이스트를 pH 7.2를 가지며 ~1013L의 150mM 트리스(Tris) 및 5mM EDTA에 첨가시켰다. 상기 세포 페이스트의 융해(thawing)가 완료된 경우(determined by stable A550 readings), 상기 혼합물을 950+/-50 Bar의 압력 하에서 250l/hour의 지정 유량(nominal flowrate)으로 Niro 균질화기(homogenizer)에 통과시켰다. 상기 균등질(homogenate)은 온도가 24 내지 33℃ 사이로 유지되는 탱크에 집합되었다. 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)와 PEG-4600을 용해질 혼합물(lysate mixture)에 첨가하여 두 화합물의 농도가 10%(w/w)가 되도록 하였다. 상기 이-상 혼합 결과물(resulting two-phase mixture)을 60-120분간 혼합한 후, 상기 용액을 액체/액체, 고체 배출 원심분리기(liquid/liquid, solids discharging centrifuge)를 통과시킴으로써 상기 두 상을 분해하였다(resolved). 원하는 생성물을 포함하는 상부 상(top phase)은 "delipidating" 필터, "depth" 필터, 및 0.2㎛ 필터로 구성된 필터 트레인(filter train)에 의하여 수집되고 여과되었다. 상기 여과액(상부 상의 여과 후 수득한; 플로우차트 1 참조)은 세 개의 분리된 토트들(totes)에 집합되었으며, 각각의 샘플들은 B-2036/데-프를 위하여 분석되었다. 상기 수준은 3.2 내지 6.3 area%의 범위에 있었다. 비교를 위하여, 플로우차트 1에 따라 추가의 공정을 수행하여 보존물 3(Retentate 3)의 B-2036 데-프 수준을 0.3 area%로 더 감소시켰다. 이러한 B-2036 데-프 수준의 추가적인 감소는 제2 음이온 교환 크로마토그래피(second anion exchange chromatography) 단계의 생성물 수집 파라미터들(product collection parameters)에 의해 이루어졌다. 용해 완충액이 EDTA를 포함하고 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 단계의 수집 과정들(collection procedures)이 수행되면, EDTA(즉, 150mM Tris, pH 7.2) 와 상술한 수집 과정 없이 가공된 B-2036 로트들(n=10)의 4.6 내지 16.2 area% (평균 = 10.2 area%)의 최종 공정 수준과 비교하여 0.3 area%의 B-2036/데-프 수준을 얻을 수 있었다.
실험예 5
금속염(들)에 의한 성장 호르몬 대항제의 데-프 이성체 불순물의 감소(Decrease of Des-Phe Isoform Impurity of Growth Hormone Antagonist with Metal Salt(s))
플로우차트 2를 참조하면, 165Kg의 냉동된 세포 페이스트를 pH 6.0을 가지며 ~1013L의 100mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate)에 첨가시켰다. 상기 세포 페이스트의 융해(thawing)가 완료된 경우(determined by stable A550 readings), 상기 혼합물을 950+/-50bar의 압력 하에서 250l/hour의 지정 유량(nominal flowrate)으로 Niro 균질화기(homogenizer)에 통과시켰다. 상기 균등질(homogenate)은 온도가 24 내지 33℃ 사이로 유지되는 탱크에 집합되었다. 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)와 PEG-4600을 용해질 혼합물(lysate mixture)에 첨가하여 두 화합물의 농도가 10%(w/w)가 되도록 하였다. 상기 이-상 혼합 결과물(resulting two-phase mixture)을 60-120분간 혼합한 후, 상기 용액을 액체/액체, 고체 배출 원심분리기(liquid/liquid, solids discharging centrifuge)를 통과시킴으로써 상기 두 상을 분해하였다(resolved). 원하는 생성물을 포함하는 상부 상(top phase)은 "delipidating" 필터, "depth" 필터, 및 0.2㎛ 필터로 구성된 필터 트레인(filter train)에 의하여 수집되고 여과되었다. 상기 여과액은 세 개의 분리된 토트들(totes)에 집합되었으며, 각각의 샘플들은 B-2036/데-프를 위하여 분석되었다. 상기 수준은 6.0 내지 9.4 area%의 범위에 있었다. 비교를 위하여, 플로우차트 2에 따라 추가의 공정을 수행하여 보존물 2(Retentate 2)의 B-2036/데-프 수준을 0.8 area%로 더 감소시켰다. 이러한 B-2036/데-프 수준의 추가적인 감소는 제2 음이온 교환 크로마토그래피(second anion exchange chromatography) 단계에 따른 생성물 수집 파라미터들(product collection parameters)에 의해 이루어졌다. 용해 완충액이 소듐 포스페이트를 포함하고 제2 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 단계의 수집 과정들(collection procedures)이 수행되면, 소듐 포스페이트(즉, 150mM Tris, pH 7.2) 와 상술한 수집 과정 없이 가공된 B-2036 로트들(n=10)의 4.6 내지 16.2 area% (평균 = 10.2 area%)의 최종 공정 수준과 비교하여 0.8 area%의 B-2036/데-프 수준을 얻을 수 있었다.
실험예 6
킬레이트제(들)에 의한 성장 호르몬 대항제의 데-프 이성체 불순물의 감소(Decrease of Des-Phe Isoform Impurity of Growth Hormone Agonist with Chelating Agent(s))
EDTA를 포함하는 완충액에서 성장 호르몬 대항제를 발현하는 신선한 또는 냉동된 재조합 세포들을 현탁시킨다(suspend). 이어서, 균질화(homogenization)와 같은 공정을 통해 완전히, 또는 삼투압 충격(osmotic shock 혹은 냉동/융해(freeze/thaw) 등과 같은 공정을 통해 부분적으로 상기 세포들을 분리(disrupt)하여 성장 호르몬 대항제를 유리시킨다(release). 이후, 이-상 추출(two-phase extraction), 고체/액체 원심분리(solid/liquid centrifugation), 또는 여과(filtration)에 의하여 상기 유리된 용액을 분리시킨다(isolate). 일련의 액체 크로마토그래피 단계들(series of liquid chromatography steps)에 의하여 상기 대항제를 정제한다.
실험예 7
금속염(들)에 의한 성장 호르몬 대항제의 데-프 이성체 불순물의 감소(Decrease of Des-Phe Isoform Impurity of Growth Hormone Agonist with Metal Salt(s))
소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 포함하는 완충액에서 성장 호르몬 대항제를 발현하는 신선한 또는 냉동된 재조합 세포들을 현탁시킨다(suspend). 이어서, 균질화(homogenization)와 같은 공정을 통해 완전히, 또는 삼투압 충격(osmotic shock 혹은 냉동/융해(freeze/thaw) 등과 같은 공정을 통해 부분적으로 상기 세포들을 분리하여(disrupt) 성장 호르몬 대항제를 유리시킨다(release). 이후, 이-상 추출(two-phase extraction), 고체/액체 원심분리(solid/liquid centrifugation), 또는 여과(filtration)에 의하여 상기 유리된 용액을 분리시킨다(isolate). 일련의 액체 크로마토그래피 단계들(series of liquid chromatography steps)에 의하여 상기 대항제를 정제한다.
<110> LYLE
<120> METHOD FOR THE PREPARATION OF GROWTH HORMONE AND ANTAGONIST
THEREOF HAVING LOWER LEVELS OF ISOFORM IMPURITIES THEREOF
<130> 161765.00520
<150> US 60/406,553
<151> 2002-08-28
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala Asp Arg Leu Asn Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Asn Ala Asp Met Ser Arg Val Ser Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Thr Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
Claims (15)
- (a) 머캅토 화합물이 충분한 상태에서, 불순물을 상기 머캅토 화합물과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 유전적으로 변형된 숙주 세포에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- 제1항에 있어서,(b) 상기 숙주 세포를 성장시켜 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계를 더 포함하고, 상기 숙주 세포의 성장은 상기 (a)단계 전이나 (a)단계 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제2항에 있어서,(c) 상기 폴리펩티드를 정제하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제3항에 있어서,(d) 상기 정제된 폴리펩티드를 PEG화(pegylated)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제2항에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 설파이트(sulfites), 글루타티온(glutathione), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 트리(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), 시스테인(cysteine), 및 시스테인과 결합한 시스테인(cysteine in combination with cysteine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제5항에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인 또는 시스테인과 시스테인의 결합물(combination of cysteine and cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제6항에 있어서, 상기 머캅토 화합물은 시스테인 또는 시스테인과 시스테인의 결합물(combination of cysteine and cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
- 제7항에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 트리설파이드 이성체를 상기 시스테인 또는 상기 시스테인과 시스테인의 결합물 (combination of cysteine and cysteine)과 상기 트리설파이드 이성체의 양을 10% 정도 감소시키기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 특징으로 하는 공정.
- (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 트리설파이드 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 대항제 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- (a) 킬레이트제가 충분한 상태에서, 상기 킬레이트제를 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고,상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
- (a) 금속염이 충분한 상태에서, 상기 금속염을 (1) 불순물, (2) 성장 호르몬 폴리펩티드, (3) 세포 성분 및 (4) 이들의 조합(combination)과 접촉시켜 상기 불순물의 양을 감소시키는 단계를 포함하고, 상기 불순물은 상기 폴리펩티드의 데-프 이성체인 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 폴리펩티드를 세포 성분(들)을 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포들에서 재조합 생산함에 있어 생성되는 불순물의 양을 감소시키는 공정.
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