KR20070100236A - 프로가스트린에 대한 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신 연장된 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는, 프로가스트린에 특이적인 프로가스트린-결합 분자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 가스트린 전구체 분자인 프로가스트린의 N-말단 및 C-말단의 서열에 선택적인 모노클로날 항체(MAb) 및 이러한 MAb를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 또한, 면역-검출 및 정량 검정에서 프로가스트린 및 가스트린 호르몬 종의 검출 및 정량에 유용한 MAb의 패널이 제공된다. 이들 검정은 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 진단 및 모니터하거나 치료 과정의 진행을 모니터하는데 유용하다. 본 발명은 생검 샘플 또는 조직 절편과 같은 고체 샘플 중에서 가스트린 종의 검출 및 가시화에 적합한 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF) 검정을 포함하는 고체 상 검정법을 추가로 제공한다. 프로가스트린-결합 분자는 프로가스트린 촉진된 질환 또는 상태에서 프로가스트린에 대한 수동 면역화에 있어서 치료학적으로 유용하다. 또한, 약 50개 초과의 아미노산의 관심대상 단백질에서 발견되는 2개 이상의 에피토프를 포함하는, 약 10 내지 약 35개 아미노산의 펩타이드 쇄인 대용 참조 표준(SRS) 분자가 제공된다. 이러한 SRS 분자는 관심대상의 진성 단백질을 대신하는 표준으로서 유용하다.
프로가스트린, 모노클로날 항체, 대용 참조 표준, 면역검정

Description

프로가스트린에 대한 모노클로날 항체{Monoclonal antibolies to progastrin}
본 발명은 동물, 특히 사람의 생체내에서 발견되는 가스트린 호르몬 전구체인 프로가스트린의 특정 영역에 대해 유도된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 가스트린-촉진된 질환 및 상태의 검출, 진단 및 모니터에 대한 이들 모노클로날 항체(MAb)의 적용 및 가스트린-촉진된 질환 및 상태의 예방 및 치료를 위한 본 발명의 MAb의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대용 분자 및 특히 펩타이드 호르몬에 적용되는 면역검정에서 참조 표준으로서의 이의 용도에 관한 것이다.
101개의 아미노산의 펩타이드인 사람 프리프로가스트린은 가스트린 유전자의 1차 해독 산물이며 다음의 구조를 갖는다:
MQRLCVYVLIFALALAAFSEASWKPRSQQPDAPLGTGANRDLELPWLEQQGPASHHRRQLGPQGPPHLVA DPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (서열번호 1).
프로가스트린은 프리프로가스트린으로부터 처음 21개 아미노산(시그널 펩타이드를 구성)이 절단됨으로써 형성된다. 프로가스트린의 80개 아미노산 길이 쇄는 절단 및 변형 효소에 의해 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly) 및 글리신 연장된 가스트린-34(G34-Gly)를 포함하는 몇가지 생물학적 활성 가스트린 호르몬 형태로 추가 프로세싱된다.
성숙한 G17은 아미노- 및 카복시-말단 잔기 둘다에서 변형된다: N-말단 글루탐산은 폐환되어 피로글루탐산(pGlu)을 형성하고, C-말단 페닐알라닌 잔기의 유리 카복실 그룹은 효소인 펩티딜 α-아미드화 모노-옥시게나제(PAM)에 의해 아미드화되어 C-말단 Phe-NH2을 형성한다. 성숙한 G34는 이의 C-말단에서 동일하게 아미드화되어 C-말단 Phe-NH2를 형성한다[참조: Dockray et al, Ann. Rev. Physiol. (2001) 63: 119-139].
사람에서 "소형" 가스트린의 주된 형태인 성숙한 G17은 다음의 아미노산 서열을 갖는다: pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2 (서열번호 2). G17-Gly는 건강한 사람 피험체에서 "소형" 가스트린의 부수 성분으로서 발견되는 가스트린의 불완전하게 프로세싱된 형태이며 다음 아미노산 서열을 갖는다: pEGPWLEEEEEAYGWMDFG (서열번호 3).
사람의 "대형" 가스트린의 주된 형태인 가스트린-34는 다음 아미노산 서열을 갖는다: pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2 (서열번호 4). 글리신-연장된 가스트린 34(G34-Gly)는 C-말단 글리신 잔기를 갖고 있으며 다음의 아미노산 서열을 갖는다: pELGPQGPPHL VADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG (서열번호 5).
가스트린은 가스트린-방출 펩타이드(GRP)에 반응하여 위의 유문 위전정부-G 세포에 의해 분비되고 위산 및 몇몇 펩타이드 호르몬, 가장 특히, 소마토스사틴의 주변분비(paracrine) 작용에 의해 억제된다. 가스트린 펩타이드는 건강한 개체의 위에서 산 분비를 촉진하는 작용을 하는 것으로 오랫동안 인식되어 왔지만, 최근에서야 이들 펩타이드가 위장관(GI) 시스템에서 상이한 세포 유형의 증식, 분화 및 성숙을 또한 조절한다는 것이 제시되었다.
프로가스트린은 정상적으로는 가스트린 호르몬 형태로 완전히 프로세싱된다. 과량으로 생산되는 경우, 프로가스트린은 위장관 시스템에 작용하는 하나 이상의 가스트린 호르몬 형태로 적어도 부분적으로 프로세싱되고 가스트린-촉진된 종양의 형성을 강화시킬 수 있다. 일부 경우에, 프로가스트린은 혈중에서 순환되고 프로가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 앓는 환자의 뇨중에서 검출될 수 있다.
GI 시스템에서의 국소 활성 이외에도 G17 및 덜한 정도로 G17-Gly는 혈류로 방출되고 위장관 장애 및 질환, 예를 들면, 위암, 직장결장암 및 췌장암을 앓는 환자의 혈청중에서 증가되는 것으로 확인되었다. 이들 가스트린 종은 보다 최근에 작은 세포 폐암(SCLC) 및 간 전이된 종양을 포함하는, 위장관과 관련되지 않는 기타 질환과 관련되는 것으로도 확인되었다[참조: "Gastrin and Colon Cancer: a unifying hypothesis" S. N. Joshi et al., Digestive Diseases (1996) 14: 334-344; and "Gastrin and Colorectal Cancer" Smith, A.M. and Watson, S.A. (2000) Alimentary Pharmacology and Therapeutics 14(10): 1231-1247].
항체는 의학, 수의학 및 기타 면역검출 분야에서 사용되는 수많은 검정 기술에서 주요 시약이다. 이러한 시험에는 예를 들면, 효소 연관 면역흡착 검 정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF) 검정과 같은 통상적으로 사용되는 많은 면역검정 기술이 포함된다.
항-가스트린 폴리클로날 항체는 가스트린 활성을 억제하는데 있어 효과적인 것으로 나타났고[참조: "Inhibition of gastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide of gastrin" Jaffe et al., Surgery (1969) 65(4): 633 -639], 비-사람 항-가스트린 폴리클로날 항체는 음식섭취에 의한 자극이 없어도 과도한 가스트린이 생산되는 병리학적 상태인 졸링거-엘리슨 증후군을 앓는 환자의 치료법에 적용되었다[참조: Hughes et al., "Therapy with gastrin Antibody in the Zollinger-Ellison Syndrome" Hughes et al., Digestive Diseases (1976) 21(3) :201-204]. 그러나, 이러한 토끼 항-가스트린 항체는 "이러한 환자에서 기껏해야 단기간 효과"만을 가졌다[참조: Hughes at p. 204]. 미국 특허 제5,886,128호 및 제5,785,970호에는 그 성장이 가스트린 호르몬에 의존적이거나 가스트린 호르몬에 의해 자극되는 궤양 또는 종양을 가스트린 호르몬 펩타이드 접합체로 면역화시켜 치료하는 방법이 개시되어 있다.
현재까지는, 가스트린 호르몬의 프로세싱된 형태로부터 프로가스트린을 선택적으로 검출하고 정확하게 구별해낼 수 있는 MAb를 이용할 수 없었다. 게다가, 본 발명에 이르기까지, 샘플, 예를 들면, 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린의 양을 정확하게 측정할 수 없었다. 본 발명의 MAb는 정상 및 질환 상태에서 프로가스트린의 생물학을 정확히 규정하기 위한 임상 시험용 검정에서 사용될 수 있다. 본 발명은 약제용 MAb 조성물 및 프로가스트린-촉진된 질환 및 상태의 예방 및 치료 방법을 또한 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 프로가스트린에 선택적으로 결합하고 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에는 결합하지 않는 프로가스트린-결합 분자를 제공한다. 프로가스트린-결합 분자는 모노클로날 항체, 항체 결합 영역 또는 일본쇄 항체와 같은 항체 분자일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 프로가스트린의 아미노산 서열 1-9, 즉 SWKPRSQQP(서열번호 6)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체(MAb)를 제공한다. 프로가스트린의 아미노산 서열 1-9, 즉 SWKPRSQQP(서열번호 6)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 생산하는 하이브리도마가 또한 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 6-14, 즉 SQQPDAPLG(서열번호 7)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다. 아미노산 서열 6-14, SQQPDAPLG(서열번호 7)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 생산하는 하이브리도마가 또한 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 72-80, 즉 GRRSAEDEN(서열번호 8)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다. 아미노산 서열 72-80, GRRSAEDEN(서열번호 8)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적 으로 결합하는 MAb를 생산하는 하이브리도마가 또한 제공된다.
본 발명에 따라서, 분자가 가스트린- 17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는 2개 이상의 프로가스트린의 배합물을 프로가스트린-결합 분자의 패널에서 사용할 수 있다.
또한, 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된, 가스트린-17(G 17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는 프로가스트린-결합 분자의 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 특정 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된, (1) 프로가스트린의 아미노산 서열 1-9, SWKPRSQQP(서열번호 6)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb; (2) 아미노산 서열 6-14, SQQPDAPLG(서열번호 7)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb; 또는 (3) 아미노산 서열 72-80, GRRSAEDEN(서열번호 8)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb의 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 프로가스트린 면역검정을 추가로 제공한다. 본 발명은, 먼저 프로가스트린에 대해 검정될 샘플을 수득하고, 상기 샘플을, 존재하는 임의의 프로가스트린에 결합하여 프로가스트린-프로가스트린-결합 분자 복합체를 형성할 수 있는 조건하에, 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린- 17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는 프로가스트린-결합 분자와 접촉시킨 다음, 프로가스트린-프로가스트린-결합 분자 복합체의 존재 또 는 부재를 검출하고/하거나 면역검정 방법에 의해 샘플 중의 프로가스트린-프로가스트린-결합 분자 복합체의 양을 측정함을 포함한다.
본 발명은 환자로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 측정하고 상기 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 하나 이상의 대조 개체로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린의 수준 또는 참조 표준과 비교함으로써 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 진단하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 가스트린-촉진된 질환 또는 상태는 이를 필요로 하는 환자에게 (1) 프로가스트린의 아미노산 1-9, SWKPRSQQP(서열번호 6)에 상응하는 아미노산 서열내의 에피토프에서 프로가스트린에; (2) 프로가스트린의 아미노산 6-14, SQQPDAPLG (서열번호 7) 내의 에피토프에서 프로가스트린에; 또는 (3) 프로가스트린의 아미노산 72-80, GRRSAEDEN(서열번호 8) 내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 프로가스트린-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여 예방 또는 치료할 수 있다.
환자에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 모니터하는 방법이 또한 제공된다. 당해 방법은 제1 시점에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 앓고 있거나 이러한 위험이 있는 환자로부터의 생물학적 유체 샘플 중에서 프로가스트린의 수준을 측정하고; 하나 이상의 상이한 시점에서 상기 환자로부터의 하나 이상의 생물학적 유체 샘플 중에서 프로가스트린의 수준을 측정하고; 상이한 시점에서 측정된 프로가스트린의 수준을 비교함으로써 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 모니터함을 포함한다. 본 발명은 항-프로가스트린-결합 분자와 적합한 용기를 포함하는, 면역검 정을 수행하기 위한 키트를 추가로 제공한다. 프로가스트린-결합 분자는 프로가스트린에 선택적으로 결합하지만, 가스트린-17(G 17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에는 결합하지 않는다.
또한, 본질적으로 약 10개 내지 약 35개 아미노산의 펩타이드 쇄로 이루어진 대용 참조 표준(SRS) 분자가 제공된다. SRS 분자는 약 50개 초과의 아미노산의 관심대상 단백질에서 발견되는 2개 이상의 에피토프의 면역모사체를 포함한다.
본 발명은 또한 면역검정에서 생성된 시그널을 대용 참조 표준(SRS) 분자의 표준 양을 사용하여 검출 또는 측정함을 포함하여, 제1 및 제2 에피토프를 포함하는 약 50개 초과의 아미노산의 관심대상 단백질에 대한 샌드위치 면역검정을 표준화시키는 방법을 추가로 제공한다. SRS 분자는 관심대상 단백질의 제1 및 제2 에피토프의 면역모사체를 포함하는 10개 내지 약 35개 아미노산의 펩타이드 쇄로 본질적으로 이루어진다.
하기에 본 명세서에서 사용되는 용어 및 어구의 정의가 제공된다.
본원에서 사용되는 "프리프로가스트린"은 가스트린 유전자의 101개 아미노산 1차 해독 산물로서 N-말단 21개 아미노산 시그널 서열, 프로-펩타이드 서열 및 가스트린 호르몬 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 "프로가스트린"은 프리프로가스트린으로부터 21개의 아미노산 시그널 서열이 절단된 후에 형성되는 80개 아미노산 산물이다. "프로가스트린"은 가스트린 호르몬의 모든 생물학적 활성 형태의 1차 전구체이다.
본원에서 사용되는 "프로가스트린-면역모사체"는 프로가스트린에 결합하는 항체를 유발하고 항-프로가스트린 항체에 의해 결합되는 잔기이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로가스트린 면역모사체 잔기는 C-말단에서 아미드화되는지 유리 C-말단을 갖는지 여부와 관계없이 가스트린-17(G17); 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly); C-말단이 아미드화된 형태 및 유리 C-말단을 갖는 형태 둘다를 포함하는 가스트린-34 (G34); 또는 글리신 연장된 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는다.
본원에서 사용되는 "가스트린 호르몬" 또는 "가스트린 호르몬 형태"는 상호교환적으로 사용되며 임의의 생물학적 활성 및/또는 면역학적 교차-반응성 가스트린 호르몬 펩타이드를 의미한다. 가스트린 호르몬의 주요 형태는 C-말단에서 아미드화되는지 유리 C-말단을 갖는지 여부와 관계없이 가스트린-17(G17); 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly); C-말단이 아미드화된 형태 및 유리 C-말단을 갖는 형태 둘다를 포함하는 가스트린-34(G34); 글리신 연장된 가스트린-34 (G34-Gly)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "생물학적 유체"는 생물학적 기원의 물질을 포함하는 임의의 유체를 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 생물학적 유체는 동물, 예를 들면, 포유동물, 바람직하게는 사람 피험체의 체액을 포함한다. 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 뇌척수액(CSF), 타액, 땀 및 뇨를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 체액일 수 있다.
본원에서 사용되는 "보존제"는 생물학적 유체 샘플 또는 생물학적 성분을 포함하는 액체 샘플 중에서 가스트린의 시간 의존적 분해를 감소시키는 임의의 제제, 보충제 또는 첨가제를 의미한다. 본 발명의 실시에서 유용한 보존제는 일반적 화학적 보존제, 예를 들면 나트륨 아지드, EDTA 및 프로테아제 억제제, 예를 들면, PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드) 및 아프로티닌(예: 트라실롤), 또는 생물학적 보존제, 예를 들면 헤파린을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 널리 공지된 임의의 많은 보존제를 포함한다.
본원에서 사용되는 "프로가스트린-결합 분자"는 프로가스트린에 결합하지만, 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)에는 결합하지 않는 임의의 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "가스트린-촉진된 질환 또는 상태"는 가스트린 및/또는 프로가스트린이 자극제로서 역할을 하는 모든 질환 또는 상태를 의미한다. 예를 들면, 가스트린은 많은 종양 형태, 특히, 위장관 종양, 예를 들면, 직장결장 종양의 성장 및 증식을 자극하는 것으로 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제 6,548,066호(Michaeli 등)]
본 발명의 프로가스트린-결합 분자는 임의의 프로가스트린-결합 분자, 예를 들면, 항체 분자 또는 수용체 분자일 수 있다. 항체 분자는 모든 항체 분자, 예를 들면, 모노클로날 항체일 수 있다. 항-프로가스트린 항체 분자는 프로가스트린-결합 영역을 포함하는, 일본쇄 항체 분자 또는 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편 또는 임의의 기타 항체 단편일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-프로가스트린 항체 분자는 포유동물 항체 분자, 예를 들면, 토끼, 마우스 또는 사람 항체 분자이다. 본 발명의 항-프로가스트린 항체 분자는 키메라 사람/비-사람 항체(예: 사람/마우스 키메라), 사람화 또는 완전한 사람 항체일 수 있다.
모노클로날 항체(MAb)는 이들 검정 다수에서 사용되는 경우에 많은 측면에서 폴리클로날 항혈청 및 폴리클로날 항체로부터 정제된 항체에 비해서 이를 더욱 우수하게 만드는 고유한 특징을 갖고 있다. 이러한 특징에는 표적 항원에 대한 단일결정기(monodeterminant) 특이성(즉, 단일 에피토프에 대한 특이성), 상이한 항체 제제들 간의 일정한 특이성 뿐만 아니라 시간에 따른 일정한 친화성 및 화학 조성이 포함된다. 게다가, MAb는 시험관내 방법에 의해 무제한적 양으로 무한정 생산될 수 있다. 이러한 특성들은, 생체내 면역화 방법을 필요로 하고 관련 생물학적 가변성을 피할 수 없으며 면역화된 동물의 수명에 따라 항체 생산능이 제한된 폴리클로날 항체의 특성과 매우 대조적이다.
이러한 이점에도 불구하고, 동일한 에피토프에 대해 특이적일 수 있다 해도개별적 MAb 간에 차이가 존재한다. 예를 들면, 단일 항원성 에피토프 영역으로의 면역화에 의해 유도된 MAb 간의 차이가 다음의 특징들 중 어느 하나 또는 모두와 관련하여 발생할 수 있다: 1) 에피토프의 분자 조성 및 3차 구조에 대한 미세한 특이성; 2) 항체 이디오타입(idiotype); 3) 항체 친화성; 4) 항체 알로타입(allotype); 및 5) 항체 동종형(isotype). 이러한 특징상의 차이는 특정 면역검정에서 MAb의 작용에 영향을 주어, 동일한 영역에 대해 발생한 상이한 MAb 분리체는 소정의 검정에서 상이하게 작용할 수 있다. 따라서, 일부 MAb는 특정 면역검정에서 시약으로 사용되는 경우 동일한 에피토프에 결합하는 다른 MAb에 비해서 우수할 수 있다.
본 발명의 항-프로가스트린 결합 분자, 특히 항-프로가스트린 MAb는 면역검정에서 특히 유용하다. 면역검정은 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역확산 검정 또는 면역-검출 검정, 예를 들면, 표면 플라즈몬 저항 검정(예: BiacoreR 검정), ELISPOT, 슬롯-블롯 또는 웨스턴 블롯일 수 있다. 이러한 기술들에 관한 일반적 지침은 예를 들면, 문헌[참조: Ausubel et al. (eds) (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N. Y.]을 참조한다.
특별히 유용한 양태에서, 본 발명의 프로가스트린-결합 분자는 조직 샘플 중의 가스트린 호르몬 형태의 가시화를 위한 면역조직화학(IHC) 염색 검정 또는 면역형광(IF) 방법과 같은 면역검정에서 사용될 수 있다[참조: "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, N. Y.]
면역조직화학 염색은 종양의 검출 및 진단에서 상당한 가치가 있다[참조: Bodey, B. "The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms" (2002) Expert Opin Biol Ther. 2(4):371-93., 또한 Osin PP, Lakhani SR. (1999) The Pathology of Familial Breast Cancer: Immunohistochemistry and Molecular Analysis. Breast Cancer Res. 1(1):36-40].
항-프로가스트린 모노클로날 항체
특정한 적용시 사용하기 위한 최적의 모노클로날 항체(MAb)의 선별은 바람직하게는 특정한 의도된 적용에서의 개별적 후보 MAb 각각의 성능을 평가하여 달성한다. 이러한 이유로, 의도된 적용에서의 최적의 기능성에 대해 후보 MAb를 시험하는 것은 의도된 용도에 최적인 MAb를 유도하는 선별 과정의 일부분이다. 이러한 선별 단계는 MAb를 유도하는데 있어 통상적으로 이루어지는 선택 과정에 추가하여 수행되며, 이는 지속적 세포 성장과 분열 및 무한정한 기간에 걸쳐서 일관된 무제한적 항체 생산을 포함하는 하이브리도마 세포주의 필수적 특징의 안정성을 보장하기 위해 표적화된 항원에 대한 결합 및 MAb를 생산하는 하이브리도마의 연속적 클로닝을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프로가스트린의 특정한 표적 에피토프에 "선택적"인 항체는 항체가 다른 가스트린 에피토프보다 약 10배 이상 높은, 바람직하게는 임의의 다른 가스트린 에피토프보다 100배 높은, 보다 바람직하게는 임의의 다른 가스트린 에피토프보다 약 1000배 높은 Ka로 프로가스트린의 특정 표적 에피토프에 결합함을 의미한다.
한 측면에서, 본 발명은 프로가스트린의 N- 말단 및 C-말단에 대해 선택적이고 보다 우수한 특성을 갖는 MAb를 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 MAb는 유체, 특히 생물학적 유체 중의 가스트린 호르몬의 특정 형태를 측정하도록 고안된 면역효소측정 검정(immunoenzymometric assay)(통상 "ELISA" 또는 효소 연관 면역흡착 검정으로 지칭됨)에서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 MAb는 또한 면역검출 검정, 예를 들면, ELISPOT, 방사선면역검정, 항체-이용 샌드위치 포획 검정, 표면 플라즈몬 저항 검출기 시스템(예: BiacoreR형 시스템), 돗트-블롯, 슬롯 블롯 및 웨스턴 블롯 검정 뿐만 아니라 면역형광 및 면역조직화학 검정에서 가스트린 호르몬을 검출 및/또는 정량하기에 적합하다.
다른 측면에서, 본 발명은 프리프로가스트린 (가스트린 유전자의 1차 해독 산물)으로부터 21개의 아미노산 시그널 서열이 절단된 후에 형성된 산물인 프로가스트린의 아미노산 서열 1-9(SWKPRSQQP , 서열번호 6)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 프리프로가스트린(가스트린 유전자의 1차 해독 산물)으로부터 21개의 아미노산 시그널 서열이 절단된 다음에 프로가스트린의 아미노산 1 내지 5가 추가 제거된 후에 형성된 산물인 프로가스트린의 아미노산 서열 6-14(SQQPDAPLG, 서열번호 7)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 프리프로가스트린으로(가스트린 유전자의 1차 해독 산물)부터 21개의 아미노산 시그널 서열이 절단 후에 형성된 산물인 프로가스트린의 C-말단 영역의 아미노산 서열 72-80(GRRSAEDEN , 서열번호 8)내의 에피토프에서 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 프로가스트린에 선택적으로 결합하는 MAb를 제공한다. 이들 MAb는 프로가스트린에 결합하지만, 프로세싱된 가스트린 호르몬 형태: G17, G34, G17-Gly 또는 G34-Gly에는 결합하지 않는다. 프로가스트린에 선택적인 본 발명의 MAb는 사람 프로가스트린의 C-말단 영역에 결합하는 MAb를 포함한다. 사람 프로가스트린의 C-말단 영역에 결합하는 이러한 MAb는 101개 아미노산의 펩타이드 쇄로 이루어진 프리프로가스트린에도 결합하며, 이러한 프리프로가스트린으로부터 프로가스트린 및 가스트린으로 연속적으로 프로세싱된다. 그러나, 프리프로가스트린의 프로세싱은 신속하며, 프리프로가스트린이 합성되는 소포체(ER)에서 일어난다. 프로가스트린에 결합하는 본 발명의 MAb는 샘플 중의 프로가스트린을 검출하고 정량하기 위한 본원에서 기술하는 검정에서 유용하다.
본 발명의 MAb는 당업계에 널리 공지된 확립된 기술에 따라서 키메라화 또는 사람화될 수 있다[참조: "Recombinant immunoglobin preparations"를 표제로 하는 미국 특허 제4,816,567호(Cabilly) 및 "Labeled humanized anti-CD-18 antibodies and fragments and kits"를 표제로 하는 미국 특허 제6,689,869호(Waldman 등) 및 "Method for making humanized antibodies"를 표제로 하는 미국 특허 제6,639,055호(Carter 등)]. 사람화 항체는 본래 마우스 Mab의 결합 친화성과 보다 밀접하게 일치하도록 재성형될 수 있다[참조: "Re-shaped human anti-HM1.24 antibody"를 표제로 하는 미국 특허 제6,699,974호(Ono 등)].
본 발명은 프로가스트린 샘플, 특히 생물학적 유체 및 세포, 조직, 생검 샘플 및 기관 절편 등과 같은 생물학적 샘플의 검출 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 추가로 질환에 걸린 또는 정상 조직 및 세포내의 프로가스트린의 존재를 측정함으로써 환자에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 진단하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 환자로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린 수준을 측정하고 당해 환자 샘플 중의 프로가스트린 수준을 하나 이상의 대조 개체로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린 수준과 비교함을 포함한다. 대조 개체로부터의 샘플은 건강한 개체로부터 모아진 생물학적 유체일 수 있다. 대안으로, 환자 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 참조 표준과 비교할 수 있다. 참조 표준은 건강한 개체에서의 프로가스트린의 정상 범위내에 있도록 보정된 표준일 수 있다. 이러한 대조 샘플은 과도한 실험 없이 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 또한 하기의 대용 참조 표준을 참조한다.
이러한 검출 및 진단 방법은 본 발명의 항-프로가스트린 MAb을 사용한 생검 표본의 면역조직화학 염색을 사용하여 달성할 수 있다. 조직 샘플에 대한 항-프로가스트린 Mab의 결합은 면역조직화학 방법, 예를 들면, 형광, 면역금(immunogold) 또는 효소-촉진된 염색법에 의해 가시화할 수 있다. 진단 과정에서의 면역조직화학에 대한 일반적 검토를 위해 예를 들면, 문헌[참조: Miller et al., Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl. Immunohistochem. MoI. Morphol. (2000) 8(3): 228-235]을 참조한다.
이러한 방법들을 사용함으로써 당업자는 본 발명의 항-프로가스트린 Mab를 사용하여, 질환에 걸린, 암성 또는 전암성 조직을 포함하는 조직을 프로가스트린의 존재 또는 분포에 대해 평가할 수 있다. 당해 정보는 진단에 유용할 수 있고 또한 진단된 가스트린-촉진된 또는 프로가스트린-촉진된 질환 및 상태에 적절한 치료법을 선택하는데도 도움이 될 수 있다.
대용 참조 표준
항원이 당해 항원에 의해 발현되는 2개의 개별적 에피토프에 대해 유도된 항체의 결합에 의존하는 검정 시스템으로 검출 또는 측정되는, 항원에 대한 항체-이용항체-이용정 상황하에 실제적 유용성이 제한될 수 있다. 이는 시험 샘플 중의 항원이 정량되는 검정용 참조 항원이 용이하게 수득 또는 합성될 수 없는 경우이다. 예를 들면, 본원에 기술된 프로가스트린 샌드위치 ELISA에서 표준 곡선은 공지된 농도의 참조 항원의 용액의 일련의 희석액을 사용하여 생성시킨다.
따라서, 프로가스트린의 희석액 시리즈를 사용하여 표준 곡선을 확립시키기 위해 프로가스트린을 정량하는 검정을 수행할 수 있다. 생성된 시그널에 대한 이러한 프로가스트린 농도의 표준 곡선은 수득된 시그널을 시험 샘플과 비교하고 표준 곡선으로부터 프로가스트린의 농도를 판독함으로써 시험 샘플 중의 프로가스트린을 정량할 수 있도록 한다. 당해 과정의 한계점은 일부 항원이 순수한 형태로 임상용 실제적 검정을 생성하기에 충분한 양으로 수득하기가 곤란하거나 지나치게 비용이 많이 들 수 있다는 것이다. 예를 들면, 정제된 프로가스트린(80개 아미노산의 프로호르몬)은 생산하는데 비용이 많이 들며 정확하게 합성하기가 곤란하다. 이러한 제한들은 당해 분자의 2개의 말단에 대한 항체 결합에 의존하는 프로가스트린용 포획 ELISA의 실용성을 심각하게 제한할 것이다.
이러한 문제에 대한 해결책은 천연의 분자를 대용 참조 표준(SRS)로 대체시키는 것이다. SRS는 면역검정을 위해 요구되는 천연 분자에 의해 발현되는 두 개의 에피토프 모두를 함유하여, 포획 항체 및 검출 항체 둘다가 SRS에 결합할 수 있다. 그러나, 천연 분자의 개재 영역(및/또는 각 에피토프로부터 말단에 이르는 영역)은 SRS내에서 제거, 대체 또는 단축되어, SRS는 천연 분자보다 현저하게 짧으며 따라서 합당한 가격으로 용이하게 합성될 수 있다.
길이가 약 35개 아미노산 이하인 펩타이드는 현행 펩타이드 합성 방법으로 용이하고 경제적으로 합성될 수 있다. 따라서, SRS의 2개 에피토프를 연결시키는 1개 내지 약 20개의 아미노산의 링커가 실용적이다. 특정한 양태에서, 링커는 길이가 약 4개 내지 약 15개 아미노산이거나 길이가 약 8개 내지 약 12개 아미노산일 수 있다. 링커는 SRS가 참조 표준으로서 작용하는 특정 면역검정에서의 최적의 성능을 위해 적절한 길이의 링커 및 특징(예를 들면, 강성 또는 가요성, 친수성 또는 수소성 등)을 선별함으로써 검정 성능을 증진시키도록 고안될 수 있다.
대용 참조 표준의 개념은 보다 단순한 합성 화합물이 보다 복잡한 천연 화합물에 대한 대용물로서 작용할 수 있는 검정에 광범위하게 적용될 수 있다. 따라서, 항원이 한가지 특이성의 항체에 의해 포획되고 제2 특이성의 항체에 의해 검출되는 샌드위치 ELISA의 경우, SRS는 다음의 일반적 구조를 갖는다:
[X-에피토프 1-L-에피토프 2-Y](여기서, 에피토프 1 및 에피토프 2는 천연 분자의 상이한 에피토프의 면역모사체로서, 에피토프 1 또는 에피토프 2에 결합하는 항체는 천연 분자의 상응하는 에피토프도 결합한다). SRS 분자는 길이가 약 10개 내지 약 35개 아미노산이다. 에피토프 1 및 에피토프 2는 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커일 수 있거나 공유 결합일 수 있는 링커, L에 의해 연결된다. X 및 Y는 각각 아미노산, 펩타이드 서열 또는 차단 그룹일 수 있다. 대안으로, X 또는 Y 중 하나 또는 이들 둘다는 각각 SRS의 N-말단 또는 C-말단의 수소원자일 수 있다.
본 발명의 실시에서 유용한 링커에는 임의의 링커 잔기가 포함된다. 이러한 잔기는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 유용한 펩타이드 링커 잔기에는 미국 특허 제5,759,551호(Ladd 등에게 허여)의 컬럼 9, 64행에 기술된 gly-gly; 미국 특허 제6,613,530호(Wienhues 등)의 컬럼 3, 38행 내지 47행의 불활성 펩타이드; 및 미국 특허 제5,683,695호(Shen 등에게 허여)에 기술된 프롤린 풍부 유연성 힌지 스페이서가 포함된다. 추가로, 비-펩타이드 스페이서 잔기도 또한 유용하며 일반적으로 프로테아제 내성이라는 부가적 특징을 갖는다. 이러한 잔기에는 예를 들면, 미국 특허 제5,736,146호 및 제5,869,058호(둘다 Cohen 등에게 허여)에 개시된 -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-R-NH-, -0-R-NH- 또는 -NH-R-CH2-(여기서, R은 하나 이상의 방향족 라디칼 또는 헤테로원자, 예를 들면, 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자에 의해 임의로 치환되고/되거나 차단된 포화 또는 불포화 탄화수소 쇄이다)가 포함된다. 미국 특허 제6,780,969호(Wang)에 기술된 비-펩타이드 화학적 링커도 또한 본 발명의 실시에서 유용하다.
프로가스트린은 대량으로 정제하기가 곤란하고 비용이 많이 드는 80개 아미노산의 거대 펩타이드이다. 프로가스트린 N 말단 에피토프(예: 프로가스트린 아미노산 1-9)와 임의로 후속하는 프로가스트린 C 말단 에피토프(예: 아미노산 72-80)에 부착된 짧은 링커로 이루어진 SRS은 고체상 펩타이드 합성법과 같은 통상의 방법으로 합성할 수 있다. 링커는 임의의 링커, 예를 들면, 아미노산,펩타이드 또는 비-펩타이드 링커일 수 있다. SRS는 프로가스트린 면역검정을 표준화시키는데 유용하다.
특정한 양태에서, 프로가스트린 SRS는 임의로 2개의 펩타이드 간의 링커에 의해 연결된 9개의 아미노산의 에피토프-함유 펩타이드를 포함한다. 길이가 보다 짧거나 긴 에피토프-함유 펩타이드 서열은 치환될 수 있는데, 단 SRS의 전체 길이가 약 35개 아미노산 잔기의 길이를 초과하지 않으며, 검정의 적절한 성능을 위해 개개의 동족 에피토프에 대한 항체의 충분한 결합이 유지되어야 한다.
상기한 바와 같은 2개의 프로가스트린 에피토프 사이에 펩타이드 링커가 포함되는 경우, 프로가스트린 SRS 펩타이드의 길이는 링커의 길이만큼 증가된다. 예를 들면, -Pro- Pro- 또는 -Gly-Gly-의 링커는 전체 펩타이드 길이를 18개 아미노산에서 20개 아미노산으로 증가시킨다. 보다 긴 아미노산 링커가 치환될 수 있다; 프로가스트린 SRS로서 사용하기 위해 최적의 서열이 선별된다. 바람직한 양태에서, 링커는 프롤린과 글리신의 배합물, 예를 들면, -Pro-Pro-Gly-Gly-Pro-Pro-(서열번호 9)을 포함한다. 약 35개 이하의 아미노산 길이의 이러한 펩타이드는 표준 방법에 의해 합당한 가격에서 높은 순도 수준으로 대량으로 용이하게 합성될 수 있다[참조: Merrifield, Methods in Enzymology (1997), 289: 3-13; Also, Wade & Tragear, Solid Phase Peptide Synthesis, Australas. Biotechnol. (1993) 3(6):332-6].
프로가스트린 SRS은 다음과 같이 진성(眞性) 프로가스트린 참조 표준 대신에 사용될 수 있다. 프로가스트린 SRS의 용액은 프로가스트린이 참조 표준인 경우에 사용될 수 있는 동일한 몰농도의 펩타이드에서 제조될 수 있다. 상기 용액의 일련의 희석액을 제조한 다음, 검정에서 사용하여 표준 곡선(몰농도 대 시그널, 예를 들면, 흡광도)을 확립시킨다.
프로가스트린 SRS 용액은 몰 기준으로 제조되어, 프로가스트린 자체의 용액과 동일한 면역측정 반응을 제공할 수 있다; 프로가스트린 SRS를 사용하는 경우에 진성 프로가스트린을 사용하는 경우와 유사하거나 동일한 표준 곡선이 수득된다. 그 다음, 프로가스트린을 함유하는 실제 시험 샘플, 예를 들면, 사람 혈장으로부터 수득된 흡광도 값을 SRS 표준 곡선과 비교하여 시험 샘플 중의 프로가스트린의 농도를 측정할 수 있다. 프로가스트린 표준에 대한 프로가스트린 SRS 표준의 비교는 1회만 수행하고 후속적으로 단지 정확성을 검사하는 것을 필요로 한다.
대안으로, SRS를 사용하여, 진성 참조 표준 분자에 대해 보정될 필요가 없는 임의의 표준 곡선을 생성시킬 수 있다. 이어서, 모든 결과를 SRS의 적절한 표준 농도와의 비교에 근거하여 임의의 단위로 표현한다.
SRS가 적용될 특정 검정 방법에서 바람직한 SRS의 특징에 따라서, 링커 요소가 요구되거나 요구되지 않을 수 있다. 프로가스트린 ELISA에서 사용하기에 적합한 프로가스트린 SRS 펩타이드는 다음을 포함한다:
[프로가스트린 1-9]-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPGRRSAEDEN, 서열번호 10).
[프로가스트린 6-14]-[프로가스트린 72-80](SQQPDAPLGGRRSAEDEN, 서열번호 11).
[프로가스트린 1-9]-Gly-Gly-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPGGGRRSAEDEN, 서열번호 12).
[프로가스트린 1-9] -Pro-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPPGRRSAEDEN, 서열번호 13).
[프로가스트린 1-9]-Pro-Gly-Gly-Pro-Pro-[프로가스트린 72-80] (SWKPRSQQPPGGPPGRRSAEDEN, 서열번호 14).
[프로가스트린 6-14]-Pro-Pro-Gly-Gly-Pro-Pro-[프로가스트린 72-80] (SQQPDAPLGPPGGPPGRRSAEDEN, 서열번호 15).
프로가스트린 SRS 펩타이드의 부가적인 잠재적 서열은 당업자에 의해서 과도한 실험 없이 용이하게 결정될 수 있다. 임의의 특정 면역검정을 위한 최적의 프로가스트린 SRS 펩타이드는 면역검정 시스템에서 후보 SRS 펩타이드를 시험하고 검정의 조건(예를 들면, 온도 및 이온 강도 및 이가 양이온 농도 등)하에 목적하는 농도 범위에서 진성 프로가스트린을 모사하는 SRS 펩타이드를 선택함으로써 선별할 수 있다.
항-프로가스트린 모노클로날 항체의 패널
본 발명은 샘플 중에서 프로가스트린 및 가스트린의 명백한 동정 및 정량을 가능하게 하는 항-프로가스트린 및 항-가스트린 MAb의 패널을 최초로 제공한다. 본 발명의 MAb가 사용될 수 있는 통상의 면역검정에는 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 표면 플라즈몬 저항형 검정(예: BiacoreR형 검정), 면역형광 검정(IF), 면역조직화학 검정(IHC), 면역확산 검정 등이 포함된다. 통상의 진단 검정 방법에 대해서 "Synthetic peptides in human papilloma virus 1, 5, 6, 8, 11, 16, 18, 31, 33 and 56 useful in immunoassay for diagnostic purposes"를 표제로 하는 미국 특허 제5,932,412호(Dillner 등)를 참조한다.
MAb의 패널에 특정 가스트린 호르몬 종에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 부가적 MAb를 보충하는 것은 샘플 중의 프로가스트린 이외에 하나 이상의 가스트린 호르몬 종(프로가스트린의 프로세싱에 의해 생산된)의 특이적 동정 및 정량 능력을 제공한다. 예를 들면, 성숙한 G17 형태의 N-말단에 선택적인 MAb를 상기한 항체의 패널에 부가하면, 본 발명의 항-프로가스트린 MAb에 의한 프로가스트린의 동정 및 정량 이외에 샘플 중의 성숙한 G17 호르몬을 특이적으로 동정 및 정량할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 항-프로가스트린 MAb를 포함하는 MAb의 패널 및 G34의 N-말단에 선택적인 MAb는 또한 샘플 중의 G34의 특이적 동정 및 정량을 가능하게 한다. 따라서, 상기 설명한 바와 같이, 임의의 특정 가스트린 호르몬 형태에 선택적인 MAb의 패널에 대한 부가는, 본 발명의 항-프로가스트린 MAb로 수득된 프로가스트린과 관련된 정보 이외에 샘플 중의 특정 가스트린 호르몬 형태의 성질 및 양에 관한 추가의 정보를 제공하는데 사용할 수 있다.
다른 가스트린 호르몬 형태의 동정, 정량 및 모니터를 위해 MAb의 패널에서 유용한 MAb의 다른 배합물은 당업자라면 즉시 알 수 있을 것이다. 본 발명은 본 발명의 이러한 모든 MAb 쌍 및 본 발명의 MAb 2개 이상의 배합물을 포함한다.
본 발명의 MAb는 가스트린 호르몬-촉진된 질환 및 상태에 대한 소질의 평가 및 이러한 질환 및 상태를 앓는 환자에서 당해 질환 및 상태의 검출 및 진단을 위해 프로가스트린/가스트린 호르몬 형태의 양 및 비율을 정확하게 측정하는 수단을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항-가스트린 MAb는 프로가스트린 및 G17, G34 및 G17-Gly 및 G34-Gly 가스트린 호르몬 형태 중 어느 하나 또는 모두에 대한 환자 혈청 또는 기타 생물학적 유체의 대규모 스크리닝을 위한 ELISA 검정에 도입될 수 있다.
본 발명의 MAb, 본 발명의 MAb로부터 선택된 MAb 쌍들의 배합물 및 본 발명의 MAb의 패널은 고처리량 방법에 적용되는 경우에 특히 유용하다. 이러한 방법에는 많은 샘플이 마이크로플레이트 또는 슬라이드 또는 기타 검정 기판, 예를 들면, 실질상의 웰을 갖는 플레이트(예를 들면, 미국 특허 제6,565,813호(Garyantes 등)에 기술된 것)에서 시험될 수 있도록 하는 가스트린 호르몬 항원 검출의 마이크로칩 및 마이크로어레이 방법이 포함된다. 결합의 검출은 많은 현재 입수가능한 당해 기술분야의 검출 시스템 중 어느 하나에 의해 이루어질 수 있다. 결합의 검출은 예를 들면, 항원-항체 결합과 같은 특이적 생물분자 반응에 의해 일어나는 표면 플라즈몬 저항(SPR) 변화에 의한 것일 수 있다. 이러한 기술의 효소적 검정에의 적용에 대해서는 미국 특허 제5,981,167호(Taremi 등)을 참조한다. 당해 기술은 연속류 모드로 적용될 수 있으며 가스트린 호르몬과 같은 표면-고정된 펩타이드 또는 단백질에 대한 항체 결합의 검출 또는 가스트린-항체 복합체의 검출에 동일하게 적용될 수 있다. 가스트린-항체 복합체는 가스트린 호르몬 형태(G17, G34, G17-Gly or G34-Gly)의 에피토프에 특이적인 표면 고정화된 항체에 대한 결합에 의해 검출될 수 있으며, 이러한 결합은 당해 복합체의 항체에 의해 입체적으로 장애되지 않는다. 게다가, 이러한 기술은 방사성 표지를 필요로 하지 않고 고처리량 적용성 및 고 민감성의 이점을 갖는다.
본 발명의 MAb는 조직 샘플, 예를 들면, 생검 물질로부터의 샘플에 대한 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF) 검정에서도 유용하다. 이러한 분석을 사용하여 개별적 가스트린-호르몬 형태의 비정상적 수준을 검출하고 이에 따라 가스트린-호르몬-촉진된 질환 및 상태를 진단할 수 있다.
본 발명의 MAb는 또한 프로가스트린-호르몬-촉진된 질환 및 상태의 예방, 진단 및 치료법에도 유용하다. 본 발명의 항-프로가스트린 MAb는 특정 가스트린 호르몬 형태에 대한 수동 면역을 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다[참조: "Anti-factor IX/IXa antibodies"를 표제로 하는 미국 특허 제6,391,299호(이하 '299 특허라 지칭함)(Blackburn 등)]. 지시되는 가스트린 호르몬 형태에 결합하는 능력을 보유하는 본 발명의 MAb의 기능적 단편, 예를 들면, 가스트린 호르몬 형태 Fab 단편, F(ab')2 단편 및 임의의 단편(단편 설명에 대해 '299 특허 참조)도 또한 약제학적 조성물내로 혼입되어 치료법에 적용될 수 있다(유용한 약제학적 조성물에 대해 '299 특허를 참조). 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여 경로에는 비경구 투여 경로, 예를 들면, 피하, 근육내 및 정맥내 투여가 포함된다. 추가로, 경구 투여 경로는 특정 질환, 특히 식도 또는 위의 궤양성 질환과 같은 위장관의 질환의 치료법을 위해 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 비강내로 전달될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 가스트린-호르몬 촉진된 질환 또는 상태일 가능성이 높은 것으로 진단된 환자에서 이러한 질환 또는 상태의 예방 또는 치료법, 이러한 질환 또는 상태를 이미 앓고 있는 환자의 치료에 유효한 양으로 투여되는 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 프로가스트린-촉진된 질환 및 상태의 증상 완화 및 진행 중단을 위해 유용하다.
가스트린-촉진된 질환 또는 상태의 치료를 위한 본 발명의 항-가스트린 MAb, 특히 사람화 항-가스트린 MAb의 온전한 또는 기능적 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량은 당해 질환 또는 상태의 개시를 예방하거나 진행율을 감소시키는 양으로서 정의되며, 보다 바람직하게는, 유효량은 당해 질환 또는 상태를 안정화시키는 양이고, 보다 더욱 바람직하게는 유효량은 당해 질환 또는 상태의 퇴행을 유발하는 양이다. 가장 바람직하게는, 유효량은 당해 질환 또는 상태를 완전히 치유하는 양이다.
추가로, 본 발명의 MAb는 가스트린-호르몬-촉진된 질환 및 상태의 진행을 모니터하기 위한 면역검정에 적용될 수 있으며, 여기서 프로가스트린의 수준 또는 양은 당해 질환 또는 상태의 치료 또는 치료법의 성공 또는 당해 질환 또는 상태의 진행을 지시해준다.
또한, 본 발명의 MAb는 가스트린-호르몬-촉진된 질환 및 상태를 앓는 환자의 프로가스트린 호르몬 차단 치료를 평가하는 방법에서 유용하다. 당해 방법은 a) 치료 전 또는 치료의 초기 단계에서 환자로부터 생물학적 유체의 제1 샘플을 수득하는 단계; b) 면역검정 방법에 의해 제1 샘플 중의 프로가스트린 수준을 측정하는 단계; c) 치료가 효과를 나타낼 수 있는 적합한 시간 후에 환자로부터 생물학적 유체의 제2 샘플을 수득하는 단계; d) 면역검정 방법에 의해 제2 샘플 중의 프로가스트린 수준을 측정하는 단계; e) 제1 샘플 중에서 측정된 프로가스트린의 양을 제2 샘플 중의 프로가스트린의 양과 비교하여 프로가스트린 결합 또는 차단 치료의 효능을 측정하는 단계를 포함한다.
환자에서 프로가스트린 결합 치료 또는 차단 치료를 평가하는데 적용되는 상기한 방법은 한가지 치료학적 방식 또는 기타 방식으로 진행할지를 결정하는 시기가 환자의 결과에 결정적일 수 있는 임상 실시에서 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 이러한 결정적 결정에 기초가 되는 정보를 제공한다. 당해 방법은 치료 전 또는 치료의 초기 단계에서의 프로가스트린 양의 척도를 제공하며, 치료를 개시하고 하나 이상의 기간 후, 특히 치료가 효과적이기 시작한 것으로 예상되는 때의 프로가스트린의 하나 이상의 척도를 제공한다.
프로가스트린 차단 치료는 환자에 대한 항-프로가스트린 항체의 수동 투여일 수 있다. 프로가스트린 차단 물질은 항-프로가스트린 항체, 특히 키메라 사람/비-사람 항체, 사람화 또는 완전 사람 모노클로날 항-프로가스트린 항체 또는 프로가스트린에 결합하는 기능을 하는 임의의 기타 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 프로가스트린 차단 물질일 수 있다.
본 발명은 또한 프로가스트린을 함유하는 것으로 추측되는 샘플을 스크리닝하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 이러한 스크리닝은 이러한 폴리펩타이드를 함유하거나 생산하는 것으로 추측되는 환자 샘플 또는 실험실 샘플에 대해 수행할 수 있다. 키트는 본 발명의 항체를 함유할 수 있다. 키트는 샘플과 본 발명의 항체 간의 상호작용을 검출하기에 적합한 완충액 및 시약을 함유할 수 있다. 제공된 시약은 본 발명의 항체와 결합하거나 상호작용할 수 있는 방사선 표지된, 형광성-표지된 또는 효소-표지된 제제일 수 있다.
키트의 시약은 고체 지지체에 부착된 액체 용액 또는 건조된 분말로서 제공될 수 있다. 시약이 액체 용액으로서 제공되는 경우, 바람직하게는 액체 용액은 수용액이다. 바람직하게는, 제공된 시약이 고체 지지체에 부착되는 경우, 고체 지지체는 크로마토그래피 매질, 다수의 웰을 갖는 시험 플레이트 또는 현미경 슬라이드일 수 있다. 제공된 시약이 건조 분말인 경우, 분말은 제공될 수 있는 적합한 용매를 부가하여 재구성할 수 있다.
본 발명의 키트는 일반적으로 항체, 항원 또는 검출 시약이 놓일 수 있고 바람직하게는 등분될 수 있는 바이알을 포함하는 용기내에 제공된다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 항체, 항원 및 시판용 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 보유되어 있는 플라스틱 용기와 하나 이상의 필수적 화학물질, 예를 들면, 크로마토그래피 물질, 용매 및 용출제, 시험관, 세제, 항체 및 검출 반응용 화학물질을 포함할 수 있다.
다른 추가의 양태에서, 본 발명은 면역검출 방법 및 관련 키트에 관한 것이다. 프로가스트린 또는 이의 펩타이드 단편을 사용하여 이들과의 반응성을 갖는 항체를 검출할 수 있거나, 또는 본 발명에 따라서 제조된 항체를 사용하여 프로가스트린, 프로가스트린-모사 분자 또는 프로가스트린 에피토프-함유 펩타이드를 검출할 수 있음이 제안된다. 일반적으로, 이들 방법은 먼저 이러한 전구체, 펩타이드 또는 항체를 함유하는 것으로 추측되는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 면역복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에 본 발명에 따른 항체 또는 펩타이드와 접촉시킨 다음, 면역복합체의 존재를 검출함을 포함할 것이다.
면역복합체 형성의 광범위한 검출 방법은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예로는 ELISA, RIA, 면역블롯(예: 돗트 블롯, 슬롯 블롯, 웨스턴 블롯 등), 간접 면역형광 기술, 및 물리적 매개변수(예를 들면, 표면 플라즈몬 저항 등)에서의 변화의 검출에 의존하는 방법이 있다. 널리 사용되는 한 방법에서, 면역복합체 형성은 방사선 표지 또는 효소 태그(예를 들면, 알칼리성 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제)와 같은 표지의 사용을 통해 검출된다. 당업계에 익히 공지된 방법에 따라서 바이오티닐화 리간드에 결합시키기 위한 위한 2차 항체 또는 아비딘-커플링된 분자와 같은 2차 결합 리간드의 사용을 통해 부가적 이점이 생길 수 있다.
실시예 1. 사람 프로가스트린의 N-말단에 대한 MAb 의 생산
사람 프로가스트린의 N-말단 에피토프를 형성하는 사람 프로가스트린의 아미노산 서열 1-9: SWKPRSQQP(서열번호 17)을 함유하고 후속적으로 링커 서열 -Pro-Cys-이 있는 펩타이드, SWKPRSQQPPC("h프로가스트린 (1-9)-PC", 서열번호 16)을 표준 고체 상 펩타이드 합성 방법에 의해 상업적으로 합성하였다.
상기 펩타이드를 다음과 같이 면역원내로 혼입시켜 사람 프로가스트린의 N-말단에 대한 항체를 유도하였다: 상기 펩타이드를 먼저 디프테리아 변성독소("DT")에 공유결합시켜 펩타이드-운반체 접합체를 제조하였다. 각 DT 운반체상에서 치환된 펩타이드 단위의 수를 측정하고, 마지막으로 접합체를 면역원으로서 제형화하였다. 사용된 기술은 미국 특허 제5,622,702호(Gevas 등)에 기술된 바와 같다.
간략하게 언급하면, 펩타이드를 헤테로이작용성 가교-링커인 ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시석신이미드(ε-MCS)을 이용하여 운반체에 화학적으로 접합시켰다. 당해 접합체를 0.1M 인산나트륨 완충된 식염수(pH 7.3)(PBS)에 대해 투석하여 정제하고, 단백질 농도를 로우리(Lowry) 방법으로 측정하였다. DT상의 펩타이드의 치환 수준(DT의 100,000 Da 분자 중량당 14.7개 펩타이드)을 접합체의 아미노산 분석으로 몰 기준으로 측정하였다. 그 다음, 용해된 접합체를 보조제로서 Montanide ISA 703 (SEPPIC, France)를 이용하여 접합체 용액과 Montanide ISA 703 오일을 30/70 비(접합체 용액/보조제의 wt/wt)로 혼합함으로써 면역원으로서 제형화하였다. 혼합은 각 액체의 적절한 용적을 주사기내로 빨아들인 다음, 용액을 연동 허브(inter-locking hub)를 통해서 상기 주사기와 제2 주사 사이를 오락가락하며 신속하게 전달함으로써 달성하였다. .
먼저, 마우스를 0.1 mL 용적 중의 0.1mg의 펩타이드-DT 접합체 면역원/Montanide ISA 703을 복강내 주사하여 면역화시켰다. 첫번째 주사한지 3주 후에 동일한 용량을 두번째 주사하였다.
사람 프로가스트린의 N-말단에 선택적인 MAb를 생산하는 하이브리도마를 생 성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 표준 마우스 골수종 융합 파트너 세포주와 융합시켰다[참조: 미국 특허 제4,196,265호, Method of producing antibodies(Kaprowski 등); "Selected Methods in Cellular Immunology" (Chapter 17: Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines, B. Mishell and S. Shiigi, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 1980); Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1987]. 면역화된 마우스를 세포 융합용 비장 세포를 선택하기 4일 전에 PBS 중의 상기한 펩타이드-DT 접합체 0.1mg를 복강내 주사하여 부스팅시켰다. 하이브리드 세포의 초기 선별은 문헌[참조: Mishell and Shiigi]에 기술된 하이포크산틴-티미딘 보충된 배지를 사용하여 수행하였다. 당해 융합체는 F490으로 지정되었다.
사람 프로가스트린의 N-말단에 대한 MAb를 생산하는 하이브리도마를 분리하기 위한 제1 선별 단계는 표적 펩타이드에 대한 항체의 생산 및 하이브리드 세포주의 안정성에 대한 세포의 선별이었다. 항체를 생산하는 세포의 선별은 단일 클론을 함유하는 조직 배양 웰로부터 수득된 세포 배양 배지를 사람 프로가스트린의 N-말단에 대한 항체에 대해 스크리닝함으로써 달성하였다. 스크리닝은 말단 시스테인-11을 통해 면역학적 운반체인 소 혈청 알부민(BSA)에 연결된 합성 펩타이드 h프로가스트린(1-9)-PC의 접합체를 표적 항원으로서 사용한 ELISA에 의해 이루어졌다. 적합한 ELISA 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 이중 몇가지는 하기에 기재되어 있다. ELISA 시험에서 h프로가스트린(1-9)-PC-BSA 접합체에 결합된 항체를 생산한 각 하이브리드를 2회 클로닝하여 안정한 세포주를 수득하였다. 이러한 방법에 의해서 사람 프로가스트린의 N-말단에 대한 MAb를 생산하는 8개의 하이브리드 세포주가 수득되었다. 이들 하이브리드 세포주는 490-1; 490-2, 490-3; 490-4, 490-5; 490-6, 490-7 및 490-8로 지정되었다.
실시예 2. 사람 프로가스트린의 N-말단 영역에 대한 MAb 의 생산
사람 프로가스트린의 N-말단 영역 에피토프를 형성하는 사람 프로가스트린의 아미노산 서열 6-14: SQQPDAPLG(서열번호 19)을 함유하고 후속적으로 링커 서열 -PPC가 있는 펩타이드, SQQPDAPLGPPC ("h프로가스트린(6-14)-PPC". 서열번호 18)을 표준 고체 상 펩타이드 합성 방법에 의해 상업적으로 합성하였다.
SQQPDAPLGPPC 펩타이드(서열번호 18)를 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이 면역원내로 혼입시켜 사람 프로가스트린의 N-말단 영역에 대한 항체를 유도하였다. 면역화 및 F491로 지정된 융합체의 분리를 상기 기술한 바와 같이 수행하였다.
사람 프로가스트린의 N-말단 영역에 대한 MAb를 생산하는 하이브리도마의 선별을, 단일 클론을 함유하는 조직 배양 웰로부터 수득된 세포 배양 배지를 사람 프로가스트린의 N-말단 영역에 대한 항체에 대해 스크리닝함으로써 달성하였다. 스크리닝은 말단 시스테인-12를 통해 면역학적 운반체인 소 혈청 알부민(BSA)에 연결된 합성 펩타이드 h프로가스트린(6-14)-PPC를 포함하는 접합체를 표적 항원으로서 사용한 ELISA에 의해 이루어졌다. ELISA 시험에서 h프로가스트린(6- 14)-PPC-BSA 접합체에 결합된 항체를 생산한 각 하이브리드를 2회 클로닝하여 안정한 세포주를 수득하였다. 사람 프로가스트린의 N-말단 영역에 대한 MAb를 생산하는 3개의 하이브리드 세포주가 수득되었다. 이들 하이브리드 세포주는 491-1, 491-2 및 491-3로 지정되었다.
실시예 3. 사람 프로가스트린의 C-말단에 대한 MAb 의 생산 .
링커 서열 CPP-이 선행하는 C-말단에 사람 프로가스트린의 아미노산 서열 72-80, GRRSAEDEN(서열번호 21)을 갖는 펩타이드, CPPGRRSAEDEN ("h프로가스트린(72-80)-PPC", 서열번호 20)를 표준 고체 상 펩타이드 합성 방법에 의해 상업적으로 합성하였다. 당해 펩타이드를 상기 실시예 1 및 2에 기술한 바와 같이 면역원내로 혼입시켜 사람 프로가스트린의 C-말단에 대한 항체를 유도하였다.
먼저, 마우스를 0.1 mL 용적 중의 0.1mg의 펩타이드-DT 접합체 면역원/Montanide ISA 703을 복강내 주사하여 면역화시켰다. 첫번째 주사한지 3주 후에 동일한 용량을 두번째 주사하였다.
사람 프로가스트린의 C-말단에 대해 선택적인 MAb를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 상기한 표준 기술에 의해 표준 마우스 골수종 융합 파트너 세포주와 융합시켜, F495로 지정된 융합체를 생산하였다.
사람 프로가스트린의 C-말단 단부에 대한 MAb를 생산하는 하이브리도마를 분리하기 위한 제1 선별 단계는 표적 펩타이드에 대한 항체의 생산 및 하이브리드 세 포주의 안정성에 대한 세포의 선별이었다. 항체를 생산하는 세포의 선별은 단일 클론을 함유하는 조직 배양 웰로부터 수득된 세포 배양 배지를 사람 프로가스트린의 C-말단 단부에 대한 항체에 대해 스크리닝함으로써 달성하였다. 스크리닝은 시스테인-1을 통해 면역학적 운반체인 소 혈청 알부민(BSA)에 연결된 합성 펩타이드 h프로가스트린(72-80)-PPC를 포함하는 접합체를 표적 항원으로서 사용한 ELISA에 의해 이루어졌다. ELISA 시험에서 h프로가스트린(72-80)-PPC-BSA 접합체에 결합된 항체를 생산하는 각 하이브리드를 2회 클로닝하여 안정한 세포주를 수득하였다. 사람 프로가스트린의 C-말단 단부에 대한 MAb를 생산하는 4개의 하이브리드 세포주가 수득되었다. 이들 하이브리드 세포주는 495-1; 495-2, 495-3 및 495-4로 지정되었다.
실시예 4. 프로가스트린의 특정 영역에 대한 항체의 ELISA 역가
당해 분석 방법의 목적은 ELSIA에 의해 시험 샘플 중에서 항-프로가스트린 항체를 검출하고 이의 역가를 측정하는 것이다. 본 발명의 항-프로가스트린 항체 ELISA는 프로가스트린 펩타이드-BSA 접합체에 대한 항체(이는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다)의 특이적 결합에 기초한다. ELISA에서 펩타이드의 결합은 당해 항체가 접합체의 프로가스트린 펩타이드 서열내의 프로가스트린 에피토프에 특이적으로 결합함을 확인시킨다.
시험된 프로가스트린-BSA 접합체는 실시예 1, 2 및 3에 기재된 3개의 접합체: h프로가스트린(1-9)-PC-BSA; h프로가스트린(6-14)-PPC-BSA; 및 h프로가스트 린(72-80)-PPC-BSA를 (각각) 포함한다. 접합체들은 상기한 바와 같은 가교-연결 시약 ε-MCS을 사용하여, DT-연결된 면역원을 제조하는데 사용되는 동일한 프로가스트린 펩타이드를 사용하여 제조하였다.
ELISA의 제1 단계에서, 접합체를 96웰 ELISA 플레이트의 웰에 결합시켰다. 96웰 플레이트 세척기를 사용하여 세척 단계에 의해 유리 접합체를 제거하였다. 그 다음, 시험(또는 대조군) 항혈청을 부가하였다. 시험 혈청 중에 존재하는 항-프로가스트린 Ab는 항원상에 존재하는 프로가스트린 펩타이드 에피토프에 의해 접합체에 결합되었다. 그 다음, 결합된 항체를 항-IgG-알칼리성 포스파타제 시약(이는 검출하고자 하는 항-프로가스트린 항체에 특이적인 화학종이다)을 부가하여 검출하였다. 예를 들면, Ab 검출 시약으로서 마우스 항-프로가스트린 Ab에 결합하는토끼 항-마우스 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체("RAM-AP")를 사용하여 마우스 항-프로가스트린 항체를 검출하였다. 항-Ig-AP 접합체의 AP 잔기는 기질로부터 착색된 생성물(p-니트로페놀)로의 전환을 후속적으로 촉매한다. 발색을 ELISA 플레이트 판독기에서 405nm에서의 흡광도로서 측정하였다.
모아진 마우스 항-프로가스트린 혈청(항-프로가스트린 하이브리도마의 생산을 위해 면역화된 마우스로부터 수거됨) 또는 마우스 항-프로가스트린 MAb를 함유하는 복수액을 ELISA에 대한 양성 대조군으로서 사용하였으며, 이는 항체를 유도하는데 사용된 프로가스트린 에피토프를 표적으로 한다. 시험 샘플로서의 동일한 동물 종으로부터의 혈청을 음성 대조군(예를 들면, 정상 혈청 또는 면역전 혈청 등)으로서 사용하였다.
선형 범위에서의 발색 정도는 표적 항원에 결합된 항-프로가스트린 Ab의 양에 직접적으로 비례하였다. 양성 표준(항-프로가스트린) 혈청의 희석 시리즈 대 흡광도 값의 플롯을 사용하여 결합 곡선을 생성시켰다. 그 다음, 시험 샘플의 항-프로가스트린 Ab 역가를 음성 대조군의 동일한 희석율로 수득된 흡광도와 구별될 수 있는 흡광도를 산출하는 가장 큰 희석율로부터 측정하였다(한계 희석 분석)
시약 용액: 당해 분석 방법에서 제조용으로 규정된 시약 및 용액의 양은 오직 편의를 위해 선택하였으며 예시로서 제공되며, 제한하는 것으로 고려되지 않는다. 실제 양은 요건에 따라서 조절할 수 있다.
1. 1.59g Na2CO3 및 2.93g NaHCO3를 약 750ml의 증류수에 용해시키고 자기 교반기를 이용하여 교반하여 0.02% NaN3을 함유한 탄산염 완충액("탄산염 완충액")을 제조하였다. 4ml의 5% NaN3 용액을 부가하고 교반하였다. 용액을 물을 이용하여 1.0리터로 조정하였다. pH를 측정하였다(이는 9.6±0.2여야하고, 필요에 따라 1.0M NaOH 또는 1.0M HCl를 이용하여 조정하였다). 완충액을 필요할 때까지 냉동고에서 저장하였다.
2. 9.23g FTA를 약 750ml의 정제수에 용해시켜 0.05% Tween-20 및 0.02% NaN3를 함유한 FTA(PBS)("FTA/Tween")를 제조하였다. 0.5ml Tween-20 및 4ml 5% NaN3를 부가하고 물을 이용하여 1.000리터로 조정하였다.
3. 10g BSA를 1000ml의 FTA/Tween에 용해시켜 FTA/Tween ("BSA/FTA/Tween") 중의 1% BSA를 제조하였다.
4. 기질 완충액: 50mg MgCl2·6H2O를 448ml의 정제수에 용해시켰다. 50ml의 DEA 및 2ml의 5% NaN3를 부가하고, pH를 진한 황산을 이용하여 9.8로 조정하였다. 완충액을 실온에서 광으로부터 보호되도록 하여 저장하였다.
5. PBS(pH 7.2)를 고체 FTA(FTA 적혈구응집 완충액("FTA")(제조원: Becton Dickenson Microbiology Systems, Cockeysville, MD))로부터 제조하였다.
ELISA 과정: 항원으로의 피복: 탄산염 완충액 중의 1㎍/ml 프로가스트린-BSA 접합체 표적 항원(상기 기술함)를 제조하였다. 피복될 각 플레이트마다 최소 5.2ml의 항원 용액이 필요하다. 항원 용액은 탄산염 완충액으로 1mg/ml 접합체 스톡 용액의 1:1000 희석액을 만들어 제조한다. 플레이트는 MicrotiterR 면역검정 플레이트, 강성 스티렌(예: ImmulonR 2 "U" 바닥 96웰 플레이트, 제조원: Dynatech Laboratories, Inc., VA; 또는 평저 96웰 플레이트, 폴리스티렌: 예를 들면, Microwell Plates, NUNC, 판매원 VWR)와 같은 ELISA 검정에 적합한 임의의 플레이트일 수 있다. 50㎕/웰의 항원 용액을 부가하여 ImmulonR 2 "U" 바닥 96웰 플레이트를 항원으로 피복시킨다. 플레이트를 습윤한 챔버(예를 들면, 습윤한 종이 타월로 밀폐된 용기)에서 저장하여 수분 손실을 방지하고 냉동고(2℃ 내지 8℃)에서 밤새 항온처리하였다.
혈청 희석액의 제조: 임의의 통상적 희석액 시리즈가 허용될 수 있다. 예를 들면, 양성 표준 및 음성 대조군 및 시험 혈청의 1/100.5 일련의 희석액 시리즈를 표 1에 제시한 바와 같이 사용하였다. 샘플을 평저 96웰 플레이트(최대 12개의 혈청을 동시에 희석시킬 수 있는 12-채널 멀티피펫터)내 BSA/FTA/Tween 용액에 희석시켰다.
Figure 112007030236443-PCT00001
1. 각 희석액의 역가는 희석율의 역수로서 계산된다.
200㎕의 최소 작업 용적(working volume)을 제공하기에 충분한 용적의 각 샘플의 희석액을 제조하였다. 샘플 역가에 따라서, 1/100(낮은 역가 샘플의 경우) 또는 1/1000(높은 역가 샘플의 경우)에서 시작하는 각 샘플의 희석액을 횡렬 A에서 제조한 다음, 한 종렬씩 아래로 횡렬 H까지 연속적으로 희석시켜(표 9 참조) 각 샘플의 총 8가지 희석액을 산출하였다. 음성 대조군의 희석액 시리즈를 1/100에서 출발하여 제조하였다. 양성 표준 항체 및 사전채혈/음성 대조군 항체의 희석액 시리즈의 샘플을 각 플레이트에서 이중으로 전개시켰다.
플레이트 세척: 플레이트 세척기(예를 들면, Ultrawash Plus; 또는 DynaWasher II (Dynatech Laboratories, Inc., VA) 또는 등가물)를 사용하여, 피복된 플레이트를 각각 FTA/Tween로 4회 세척한 다음, 플레이트를 종이 타월 위에 대고 "두들겨서(slapped)" 잔류 용액을 제거한다.
항체 결합: 하기 표 2에 제시한 바와 같이 샘플 플레이트 희석액 시리즈를 제조한 후에, 50㎕/웰의 희석된 샘플을 항원 피복된 "U" 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 이 플레이트를 습윤한 챔버에서 1시간 동안 실온으로 항온처리하였다.
Figure 112007030236443-PCT00002
약어:
Pos. = 양성 표준 샘플;
Neg. = 사전채혈/음성 대조군 샘플;
TS1 내지 TS8 = 시험 샘플
항체 검출 시약: 항-Ig-알칼리성 포스파타제 접합체의 적절한 희석액을 FTA/Tween 중에서 제조하였다. 검정에서는 플레이트당 최소 5.2ml가 요구되었다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 50㎕/웰의 RAM-AP 용액(예를 들면, 마우스 항-프로가스트린 항체, 토끼 항-마우스 IgG (H+L)-알칼리성 포스파타제(Zymed)를 시험하기 위한 항-Ig-알칼리성 포스파타제 접합체)를 "U" 플레이트내의 모든 웰에 부가하고 습윤한 챔버에서 1시간 동안 실온으로 항온처리하였다.
마우스 이외의 종으로부터 수득된 혈청 중에서 항-프로가스트린 항체를 검출하기 위해서는 시험 혈청을 생산한 종에 대해 특이적인 시험 혈청을 사용해야 한다(예를 들면, 사람 항-프로가스트린 항체는 항-사람 IgG-AP 시약으로 검출되고, 각각의 시약 롯트(lot)에 대해 확립된 희석율로 사용된다). 양성 표준 및 음성 대조군 혈청은 시험 혈청과 동일한 종으로부터 수득되어야 한다.
기질 용액: p-NPP 정제(p-니트로페닐포스페이트, Phosphatase Substrate Tablets, Sigma 104 ("p-NPP")로서 공급됨(제조원:Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))를 냉동기로부터 꺼내어 실온으로 가온시켰다. 사용 직전에, 1개의 p-NPP 정제를 실온에서 5ml의 DEA 기질 완충액에 부가하여 p-NPP의 1mg/ml 용액을 제조하였다. 기질 용액의 각 5ml 분취량은 1개의 검정 플레이트용으로 충분하였다. 기질 용액을 사용할 때까지 암실에서 저장하였다.
기질 부가: 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 모든 웰에, 종렬 1에서 출발하여 50㎕/웰의 p-NPP 용액을 횡렬 A로 출발하는 8(또는 12) 채널 멀티피펫터를 이용하여 동시에 부가하였다.
반응 모니터: 기질 용액의 발색을 10 내지 15분 후에 중단시켰다.
반응 중단: 8(또는 12) 채널 피펫터를 이용하여 각 웰에 50㎕의 1.0M NaOH를 부가하여 반응을 중단시켰다. NaOH 용액을 기질 용액을 부가했을 때와 동일한 순서와 동일한 시기에서 웰에 부가하였다. 카운터 탑(counter top) 위의 플레이트를 조심스럽게 진탕시켜 시약을 서서히 혼합하였다.
흡광도 측정: 전체 플레이트를 ELISA 판독기로 판독하였다. ELISA 판독기를 p-니트로페놀에 대해 405nm에서 측정하도록 설정하였다.
데이타 분석: 각 혈청의 항체 역가를 다음과 같이 측정하였다: 각 샘플에 대해 수득된 흡광도를 반-로그(semi-log) 그래프 스케일상에서, 양성 표준을 포함하는 각 혈청마다 횡좌표(로그 스케일)의 (1/희석율)에 대해 종좌표(선형 스케일)에 플롯팅하였다. 희석율의 역수를 플롯팅함으로써 역가를 X-축에서 직접 판독할 수 있다. 경우에 따라, 흡광도 값은 특정 혈청에 대한 결합 곡선을 명백히 벗어났다(이상점((outlier points)); 이러한 값은 곡선에서 제외시켰다. 각 혈청의 역가는 흡광도 값에 근거하여, 음성 대조군의 동일한 희석액과 구별될 수 있는 시험 항체의 최종 희석액으로서 측정된다. 일반적으로, 두 결과 간의 차이의 한계치는 0.25 흡광도 단위 이상(검정에서 샘플 간의 가변성에 의존함)의 흡광도이다.
실시예 5. 억제 ELISA에 의한 항체 특이성의 측정
하기한 것을 제외하고 상기 실시예와 동일한 방법을 펩타이드 ELISA에 대해 수행한다.
억제제의 제조: 적절한 표적 호르몬 펩타이드, 당해 경우에는 프로가스트린 에피토프(들)을 발현하는 펩타이드(들)을 1μmol/ml(1000μM)의 작업 스톡으로서 제조하였다. 억제 희석액 시리즈를 1:2 내지 1:10의 희석율에서 상기 작업 스톡 용액으로부터 제조하여, 플레이트상의 배치에 따라서 총 8 내지 12개의 희석액을 산출하였다.
샘플 희석액의 제조: 억제 검정 전에 샘플의 일련의 역가 측정을 수행하여 50% 최대 결합에서의 항체 샘플의 희석액을 확립하였다. 그 다음, 억제 검정에서 동일 용적의 펩타이드 억제제 및 대조군으로서의 완충액과 혼합하기 위해 샘플을 2X 50% 결합 농도로 제조하였다. 샘플 혼합물을 습윤한 챔버에서 약 30분 동안 항온처리한 다음, 세척된 피복된 ELISA 플레이트에 부가하고 습윤한 챔버에서 약 1시간 동안 항온처리하였다. 억제제를 함유한 샘플로부터 수득된 흡광도를 억제제를 함유하지 않는 샘플 대조군으로부터 수득된 흡광도로 나누고 이 값에 100을 곱하여, 흡광도 판독치(배경값으로부터 공제된)로부터 결합%를 측정하였다. 마지막으로, 100%에서 결합%를 공제하여 억제%를 측정하였다.
당해 검정에서 사용하기 위한 시험 샘플은 혈청, 세포 배양물 상청액 중의 MAb, 복수액 또는 친화성-정제된 항체(Ab)일 수 있다. 프로가스트린의 아미노 말단 이외의 표적 항원에 대한 Ab의 경우, 적절한 표적 호르몬 항원 및 억제제가 사용된다. 비관련 펩타이드 억제제는 음성 대조군으로서 포함된다.
실시예 6. ELISA에 의한 동종형 및 특이성에 대한 항-프로가스트린 MAb
실시예 1에 기술된 항-프로가스트린 MAb(F490), 실시예 2에 기술된 항-프로가스트린 MAb(F491) 및 실시예 3에 기술된 항-프로가스트린 MAb(F495)를 ELISA에 의해 동종형 및 특이성에 대해 특성화하였다. 각각의 MAb에 대한 표적 항원은 실시예 1 내지 3에 기술한 바와 동일하였다. 따라서, 융합체 490으로부터의 MAb를 h프로가스트린(1-9)-PC-BSA에 대해 시험하고; 융합체 491로부터의 MAb를 h프로가스트린(6-14)-PPC-BSA에 대해 시험하고; 융합체 495로부터의 MAb를 h프로가스트린(72-80)-PPC-BSA에 대해 시험하였다. 실시예 4의 방법으로 동종형을 측정하였으며, 이때 2차 토끼 항-마우스 Ig 시약이 마우스 항체 동종형에 대해 특이적이었다. 특이성을 억제제로서 다음의 펩타이드를 사용하여 실시예 5의 방법으로 측정하였다: h프로가스트린(1-9)-PC, h프로가스트린(6-14)-PPC, h프로가스트린(72-80)-PPC, 사람 G17, 사람 G34, 글리신 연장된-사람 G17 및 음성 대조군으로서 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH).
이들 시험의 결과는 표 3에 제공된다. 표에서 보여지는 바와 같이, 항체 491-2 및 495-2를 제외한 모든 MAb는 IgG1 아부류(subclass)였으며, 상기 두 항체는 모두 IgG2a 아부류였다. 표는 또한 개별적 MAb 각각이 면역화를 위해 사용된 에피토프에 대해 특이적이였음을 보여준다. 따라서, 모든 490 시리즈 MAb는 프로가스트린 에피토프 서열 1-9에 특이적이였으며; 모든 491 시리즈 MAb는 프로가스트린 에피토프 서열 6-14에 특이적이였으며; 모든 495 시리즈 MAb는 프로가스트린 에피토프 서열 72-80에 특이적이였다. 이들 MAb는 유체로 이루어진 생물학적 시험 샘플(예: 혈장, 림프, 복수, 타액 등) 및 조직 표본(예: 정상 조직 또는 종양 기원 또는 이러한 조직으로부터 유래한 세포의 생검 표본 등) 중에서 프로가스트린을 검출 및 측정하기 위해 고안된 시험에 적합한 것으로 간주된다.
Figure 112007030236443-PCT00003
실시예 7. 면역검정에 의한 프로가스트린 측정용 프로가스트린 대용 참조 표준(SRS)의 합성
SRS의 유용성을 입증하기 위해, 2개의 프로가스트린 SRS 펩타이드를 고체 상 펩타이드 합성으로 합성하였다. 사용된 합성 방법은 통상의 상업적 용도의 방법이며 당업자에게 널리 공지되어 있다.
프로가스트린 SRS 1을 사람 프로가스트린 1-80을 검출 및 정량하는 검정에서 사용하기 위해 합성하였다. 프로가스트린 SRS 1 펩타이드는 다음의 구조를 갖는다: [프로가스트린 1-9 -(PGGPP) - 프로가스트린 72-80]. 당해 펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같다: SWKPRSQQPPGGPPGRRSAEDEN(서열번호 14). 당해 펩타이드의 질량은 2535.1이고, 당해 펩타이드의 순도는 HPLC로 시험한 경우 90%를 초과하였다.
프로가스트린 SRS 2를 사람 프로가스트린 6-80을 검출 및 정량하는 검정에서 사용하기 위해 합성하였다. 프로가스트린 SRS 2 펩타이드는 다음의 구조를 갖는다: [프로가스트린 6-14 - (PPGGPP) - 프로가스트린 72-80]. 당해 펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같다: SQQPDAPLGPPGGPPGRRSAEDEN (서열번호 15). 당해 펩타이드의 질량은 2432.4이고, 당해 펩타이드의 순도는 HPLC로 시험한 경우에 90%를 초과하였다.
실시예 8. 프로가스트린을 측정하기 위한 항-프로가스트린 MAb 및 프로가스트린 SRS 펩타이드를 사용한 면역효소측정 검정
다음의 분석 방법(면역효소측정 검정)을 사용하여, 검정할 프로가스트린의 특정 분자 형태의 N-말단 또는 C-말단에 대해 유도된 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체를 사용하여 사람 혈장과 같은 생물학적 유체 중에 존재하는 유리(비-복합체화된) 사람 프로가스트린 1-80 또는 사람 프로가스트린 6-80을 측정하였다. 대안으로, 분자의 N-말단 또는 C-말단에 대해 유도된 폴리클로날 항체의 배합물을 각각 분자의 N-말단 또는 C-말단에 대해 유도된 모노클로날 항체와 함께 사용할 수 있다.
1. 플레이트 피복: 시험할 특정 사람 프로가스트린 분자 형태의 N-말단에 선택적인 항체를 시험 플레이트의 마이크로 웰의 표면에 최적의 농도로 피복하였다. NUNC Maxisorp, F 96 ELISA 플레이트(카탈로그 번호 439454) 시험 플레이트를 사용하고, 항체 피복 용액을 붕산나트륨 완충액(2OmM, pH 8.0, 0.1% 나트륨 아지드를 함유) 중에서 제조하였다. 피복 용액 중의 친화성 정제된 MAb의 농도는 바람직하게는 약 5㎍/mL이었다. 100㎕의 Mab 용액을 웰마다 부가하고, 습윤한 밀봉된 박스내에서 4℃에서 밤새 피복을 진행시켰다. 플레이트를 검정에서의 표준 곡선을 확립하기 위해 SRS 1을 사용하여 프로가스트린 1-80 검출용의 친화성 정제된 490-1 Mab로 피복하였다. 플레이트를 검정에서의 표준 곡선을 확립하기 위해 SRS 2를 사용하여 프로가스트린 6-80 검출용의 친화성 정제된 491-1 Mab로 피복하였다.
2. 플레이트 세척: 피복 용액을 제거하고 세척 완충액(웰당 약 400㎕)을 부가한 다음 제거하였다. 이러한 세척 사이클을 필요에 따라 수차례 반복하였다: 일반적으로 총 3회 또는 4회 세척. 세척 완충액은 0.010M 인산염 완충액(0.0027M 염화인산 및 0.137M 염화나트륨, pH 7.4, 0.01% w/v Triton X-100를 함유)이었다. 플레이트 세척은 자동화될 수 있다.
3. 플레이트 차단: 단백질과 세제를 함유하는 차단 완충액(피복 완충액 중의 1% BSA/0.1% Triton X-100)을 마이크로 웰(200㎕/웰)에 부가하고, 플레이트를 습윤한 박스내에서 1시간 동안 실온으로 항온처리하였다. 플레이트를 이러한 형태로 4℃에서 냉동 저장하였다.
4. 샘플 및 표준 부가: 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 참조 표준(예를 들면, SRS 1, SRS 2 또는 진성 프로가스트린 형태; 또는 가스트린 17과 같은 음성 대조군 펩타이드)을 희석액 시리즈로서 제조하여 표준 곡선을 작성하였다. 당해 실시예의 시험에서는, SRS 1 및 2를 10μM의 농도로 제조하고 1:10 희석액 시리즈 중에 100 fM으로 희석시켰다. 표준 및 시험 샘플을 검정 완충액(1% BSA, 세척 완충액에서 제조된 0.1% 소 γ-글로불린)에서 제조하였다. 그 다음, 용액을 각 웰에 부가하였다(100㎕/웰). 반응을 습윤한 박스내에서 2시간 동안 실온에서 진행시켰다.
검정할 형태의 프로가스트린 SRS의 공지된 농도를 사용하여 표준 곡선을 작성하여 최적의 항원 농도를 측정하였으며, 당해 표준 곡선은 요구되는 유용한 농도 범위에 걸쳐서 요구되는 민감성 및 정확성을 갖는다. 프로가스트린(1-80 또는 6-80)에 있어, 검정의 유용한 프로가스트린 농도 범위는 일반적으로 배경값(약 1pM 이하) 내지 약 100nM이다. 1:2 희석액 시리즈과 같은 참조 표준의 보다 소폭의 희석액 시리즈를 사용하여 보다 큰 정확성을 달성할 수 있다.
검정 민감성 및 정확성은 웰 피복 또는 효소 표지, 시약의 농도, 완충액의 조성, 효소-기질 시스템의 선별, 항온처리 시간과 같은 다른 검정 파라메터 및 검정의 요건에 적합하도록 변형될 수 있는 다른 파라메터를 변경함으로써 용이하게 변형되거나 증강될 수 있음이 쉽게 인지될 것이다. 요구되는 범위에 따른 적절한 민감성 및 정확성은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
5. 접합체의 부가: 세척 후, 검정할 프로가스트린 형태(효소 표지와 접합된)의 C-말단에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 함유하는 검정 완충액을 각 웰에 부가하였다. 당해 실시예의 경우, 프로가스트린의 C-말단 단부에 대한 MAb를 친화성 정제한 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 커플링시켰다. MAb는 프로가스트린의 C-말단 단부에 대한 결합을 유지하고 HRP 활성을 갖는 것으로 나타났다. 4개의 Mab 458-1 내지 458-4 각각으로 개별적 접합체를 제조하였다. 이러한 시험 목적을 위해, 접합체를 개별적으로 사용하고 혼합하지 않았다. 접합체들은 630㎍/mL의 스톡 용액의 1:2000 희석율로 사용하였으며, 웰당 100μ를 부가하였다. 실온(통상 +22℃)에서 1시간 이상 동안 반응을 진행시켰다.
6. 기질의 부가: 웰을 상기한 바와 같이 세척하고, 100㎕의 TMB 용액(Pierce) 기질을 각 웰에 부가하였다. 반응을 30분 동안 진행시킨 다음, 0.2M H2SO4의 중단 용액 100㎕을 각 웰에 부가하였다. 검출 화합물의 발색에서 사용하기에 적합한 효소 기질의 예에는 알칼리성 포스파타에 대한 니트로-페닐포스페이트 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 대한 테트라메틸벤지딘 설포네이트(TMBS)가 포함된다. 흡광도 단위(AU, TNBS의 경우 450nm에서 판독하거나 p-니트로페놀의 경우 405nm에서 판독함)로서 판독되는 발색 정도는 시험 샘플 중에 존재하는 프로가스트린의 양의 지표가 되며, 실제 농도는 SRS의 공지된 농도로 생성된 표준 곡선에 대해 또는 진성 프로가스트린으로 생성된 표준 곡선에 대해 시험 샘플의 흡광도를 판독하여 측정할 수 있다.
7. 판독: 충분한 검정 시그널이 수득되었을 때, 이 시그널을 마이크로플레이트 판독기/분광광도계를 사용하여 측정하였다.
8. 데이타 처리: SRS(또는 프로가스트린) 형태의 공지된 표준 용액으로 수득된 검정 시그널을 사용하여 보정 곡선(시그널 대 농도)을 작성하였다. 보정 곡선을 사용하여 시험 샘플중의 가스트린 호르몬 형태의 농도를 보간(補間)하였다.
실시예 9. 프로가스트린 1-80을 측정하기 위해 고안된 면역효소측정 검정
프로가스트린 1-80에 대한 검정의 결과는 하기 표 4에 제시한다. 당해 검정의 일반적 방법은 실시예 8에 기술되어 있다. 당해 시험에서는, 웰을 프로가스트린의 N-말단 단부에 특이적인 친화성 정제된 Mab 490-1로 피복하였다. 사용된 검출 접합체는 Mab 495-1-HRP 접합체였다. 데이타에서 보여지는 바와 같이, SRS 1은 100pM의 농도까지 검출되었다; 반면에, 밀접하게 관련된 SRS 2는 오직 100nM까지만 검출되었다. 따라서, 프로가스트린 1-80에 대한 당해 검정의 작업 범위는 100nM 미만 및 10 pM 초과일 것이다. 음성 대조군 펩타이드 가스트린 17은 검출되지 않았다. 당해 실시예는 프로가스트린 Mab를 사용하여 프로가스트린 1-80을 검출할 수 있음을 입증한다. 당해 실시예는 또한 ELISA에 의해 프로가스트린 1-80을 검출하기 위한 표준 분자로서의 SRS 1 의 유용성을 입증한다.
Figure 112007030236443-PCT00004
실시예 10. 프로가스트린 6-80을 측정하기 위해 고안된 면역효소측정 검정
프로가스트린 6-80에 대한 검정의 결과는 하기 표 5에 제시한다. 당해 검정의 일반적 방법은 실시예 8에 기술한다. 당해 시험에서는, 웰을 프로가스트린의 N 말단 영역(아미노산 6-14)에 특이적인 친화성 정제된 Mab 491-1로 피복시켰다. 사용된 검출 접합체는 Mab 495-1-HRP 접합체였다. 데이타에서 보여지는 바와 같이, SRS 2는 100pM까지의 농도에서 검출되었다(이 농도에서의 흡광도는 기준선 이상이였기 때문에, 검정은 100pM 미만을 검출할 수 있다); 반면에, 밀접하게 관련된 SRS 1은 오직 100μM까지만 검출되었다. 따라서, 프로가스트린 6-80에 대한 당해 검정의 작업 범위는 100μM 미만 및 10 pM 이상일 것이다. 음성 대조군 펩타이드 가스트린 17은 검출되지 않았다. 당해 실시예는 프로가스트린 Mab를 사용하여 프로가스트린 6-80을 검출할 수 있음을 입증한다. 당해 실시예는 또한 프로가스트린 6-80을 검출하기 위한 표준 분자로서의 SRS 2 의 유용성을 입증한다.
Figure 112007030236443-PCT00005
NT: 시험되지 않음.
실시예 11. 특정한 적용을 위한 최적의 Mab 의 선별
소정의 에피토프에 대한 특이성을 공유함에도 불구하고, 소정의 에피토프에 대한 상이한 Mab는 특정한 적용시에 이들의 성능면에서 상이할 수 있다. 따라서, 특정한 적용에서 사용하기 위한 최적의 성능을 갖는 MAb가 선별하기 위해서는 Mab를 각각의 상황에서 이의 활성에 대해 비교해야만 한다. 당해 실시예는 프로가스트린의 C-말단에 특이적인 MAb가 프로가스트린에 대한 면역효소측정 검정에서 프로가스트린 검출 항체로서 작용하는 능력에 있어 어느 정도로 상이하고 어떻게 최적의 제형을 제공하는가를 입증한다.
프로가스트린에 대한 정량적 검정에서의 검출 항체 시약(실시예 8에 기술됨)은 HRP에 연결된 프로가스트린의 C-말단 에피토프에 대해 유도된 Mab이다. 프로가스트린의 C-말단 에피토프에 특이적인 4개의 MAb를 상기한 융합체 번호 495를 클로닝하여 분리시켰다. 이들은 Mab 495-1, 495-2, 495-3 및 495-4였다. 이들 MAb의 HRP 접합체를 제조하기 위해, 본 발명자들은 주요 단계에서 시판되는 키트와 함께 본 발명자들의 고유한 성분들을 사용하여 당업자에게 친숙한 방법을 수행하였다. 따라서, 각각의 MAb 495-1 내지 495-4를 마우스내에서 복수 MAb로서 개별적으로 생산하였다[참조: Mishell and Shiigi, chapter 17]. 복수액 중의 MAb의 존재는 상기한 바와 같은 표적 항원 h프로가스트린(72-80)-PPC-BSA에 대한 직접 결합 ELISA로 확인하였다.
MAb를 Pierce Sulfolink Kit와 함께 제공된 지침서에 따라서 설포링크 겔(Pierce)에 연결된 h프로가스트린(72-80)-PPC에 대해서 글리신 완충액으로 용출시키면서 컬럼 크로마토그래피하여 복수액으로부터 친화성 정제하였다. Mab를 Amicon 여과 단위에서 정용여과하여 추가로 정제하고, 최종 단백질 농도를 A280 측정으로 측정하였다. 4개의 정제된 MAb 제제를 각각 Pierce EZ-Link(TM) Plus 키트를 사용하여 HRP에 접합시켰다. 정제 후, HRP 및 각 Mab-HRP 접합체의 항원 결합 활성을 h프로가스트린(72-80)-PPC-BSA 표적 항원에 대한 직접 결합 ELISA로 점검하였으며, 모두 활성인 것으로 밝혀졌다. 4개의 접합체의 최종 농도는 0.63 내지 0.68 mg/mL로 설정되었다.
프로가스트린에 대한 면역효소측정 검정에서 4개의 MAb-HRP 접합체의 성능을 비교하기 위해, 실시예 9에 기술한 바와 같이 SR 1을 사용하고 실시예 10에 기술한 바와 같이 SRS 2를 사용하여 검정을 수행하였다. 각각의 495 MAb-HRP 접합체를 각각의 개별적 검정에서 포획된 SRS 1 및 2에 대한 검출 시약으로서 개별적으로 시험하였다. MAb-HRP 접합체를 스톡 용액으로부터 1:2000 희석율로 사용하였다. 플레이트를 MAb 491-1로 피복하였고 이에 따라 SRS 2가 포획된, SRS 2(프로가스트린 6-80의 경우)를 검출하기 위한 검정에서, 포획된 SRS 1의 검출을 위한 최적의 접합체는 495-1-HRP였다. 이는 표 6에서 알 수 있으며, 여기서 458-1-HRP는 100 pM의 농도에서 SRS 2를 검출하였다. 나머지 3개의 접합체는 덜 효과적이었으며, SRS2는 1nM까지 검출되었다. 따라서, 495-1-HRP 접합체는 당해 실시예의 조건하에 수행된 바와 같이 SRS 2를 사용한 프로가스트린 6-80에 대한 면역효소측정 검정에서 검출 시약으로 사용될 수 있다.
Figure 112007030236443-PCT00006
4개의 495-HRP MAb 접합체를 프로가스트린 1-80에 대한 SRS1 검정에서 시험한 경우 유사한 결과가 수득되었으며, 이는 이들 검정에서의 495-1-HRP 접합체의 우수성을 입증한다.
하이브리도마 세포주의 기탁
다음의 하이브리도마는 2004년 9월 1일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA))에 기탁되었다:
1. MAb 490-1을 생산하는 하이브리도마 490-1은 수탁번호 PTA-6189를 부여받았다.
2. MAb 491-1을 생산하는 하이브리도마 491-1은 수탁번호 PTA-6190을 부여받았다.
3. MAb 495-1을 생산하는 하이브리도마 495-1은 수탁번호 PTA-6191을 부여받았다.
참조문헌 원용
미국 특허의 명세서 및 본원에서 인용된 각 참조문헌의 원문은 전문이 본원에서 참조로 원용된다.
Figure 112007030236443-PCT00007
Figure 112007030236443-PCT00008
Figure 112007030236443-PCT00009
Figure 112007030236443-PCT00010

Claims (40)

  1. 프로가스트린에 선택적으로 결합하고 가스트린-17(G17), 가스트린-34 (G34), 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신 연장된 가스트린-34 (G34-Gly)에는 결합하지 않는 프로가스트린-결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항체 결합 영역을 포함하는 프로가스트린-결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체인 프로가스트린-결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 프로가스트린-결합 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 일본쇄 항체인 프로가스트린-결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 포유동물 항체인 프로가스트린-결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 항체가 쥐 항체인 프 로가스트린-결합 분자.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 항체가 키메라 사람/마우스 항체, 사람 항체 또는 사람화 항체인 프로가스트린-결합 분자.
  9. 아미노산 서열 SWKPRSQQP(서열번호 6)내의 에피토프에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  10. 제9항에 있어서, 하이브리도마 490-1에 의해 생산되는 모노클로날 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  11. 아미노산 서열 SQQPDAPLG(서열번호 7)내의 에피토프에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  12. 제11항에 있어서, 하이브리도마 491-1에 의해 생산되는 모노클로날 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  13. 아미노산 서열 GRRSAEDEN(서열번호 8)내의 에피토프에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  14. 제13항에 있어서, 하이브리도마 495-1에 의해 생산되는 모노클로날 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
  15. 서열번호 6의 아미노산 서열내의 에피토프에서 프로가스트린의 N-말단에 선택적으로 결합하는 항체, 서열번호 7의 아미노산 서열내의 에피토프에서 프로가스트린의 N-말단에 선택적으로 결합하는 항체 및 서열번호 8의 아미노산 서열내의 에피토프에서 프로가스트린의 C-말단에 선택적으로 결합하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항체를 포함하는 모노클로날 항체의 패널.
  16. 하이브리도마 490-1(ATCC 수탁번호 PTA-6189).
  17. 하이브리도마 491-1(ATCC 수탁번호 PTA-6190).
  18. 하이브리도마 495-1(ATCC 수탁번호 PTA-6191).
  19. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 모노클로날 항체가 키메라 사람/마우스 항체, 사람 항체 또는 사람화 항체인 약제학적 조성물.
  21. a) 프로가스트린에 대해 검정할 샘플을 수득하는 단계;
    b) 항체 결합에 적합하고 존재하는 임의의 프로가스트린이 프로가스트린-모노클로날 항체 복합체를 형성할 수 있는 조건하에, 상기 샘플을 프로가스트린에 특이적으로 결합하지만 가스트린-17(G17), 가스트린-34 (G34), 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신 연장된 가스트린-34 (G34-Gly)에는 결합하지 않는 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 프로가스트린-모노클로날 항체 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및/또는 면역검출 방법에 의해 샘플 중의 프로가스트린-모노클로날 항체 복합체의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 프로가스트린 면역검정법.
  22. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체가 아미노산 서열 SWKPRSQQP(서열번호 6)내의 에피토프, 아미노산 서열 SQQPDAPLG(서열번호 7)내의 에피토프 또는 아미노산 서열 GRRSAEDEN(서열번호 8)내의 에피토프에 선택적으로 결합하는 프로가스트린 면역검정법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 모노클로날 항체가 490-1, 491-1 및 495-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 프로가스트린 면역검정법.
  24. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역검출 방법이 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역조직화학(IHC) 검정, 면역형광(IF) 검정, 응집 검정, 웨스턴 블롯 검정, 돗트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정 또는 표면 플라즈몬 저항 검출 방법인 프로가스트린 면역검정법.
  25. 환자로부터의 생물학적 유체 샘플 중에서 프로가스트린의 수준을 측정하는 단계 및
    상기 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 하나 이상의 대조군 개체로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린 수준 또는 참조 표준과 비교하는 단계
    를 포함하여, 환자에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 진단하는 방법.
  26. 제19항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 가스트린-촉진된 질환 또는 상태의 예방 또는 치료 방법.
  27. 제1 시점에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 앓고 있거나 이러한 위험이 있는 환자로부터의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 측정하는 단계;
    상이한 시점에서 상기 환자로부터의 하나 이상의 생물학적 유체 샘플 중의 프로가스트린의 수준을 측정하는 단계 및
    가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 모니터하는 단계
    를 포함하여, 환자에서 가스트린-촉진된 질환 또는 상태를 모니터하는 방법.
  28. 프로가스트린에 선택적으로 결합하고 가스트린-17(G17), 가스트린-34 (G34), 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는글리신 연장된 가스트린-34 (G34-Gly)에는 결합하지 않는 모노클로날 항체와 적합한 용기를 포함하는, 면역검정을 수행하기 위한 키트.
  29. 본질적으로 약 10 내지 약 35개의 아미노산의 펩타이드 쇄로 이루어지고, 약 50개 초과의 아미노산의 관심대상 단백질에 존재하는 2개 이상의 에피토프 각각의 면역모사체를 포함하는 대용 참조 표준(surrogate reference standard; SRS) 분자.
  30. 제29항에 있어서, 관심대상 단백질이 펩타이드 호르몬 또는 펩타이드 호르몬 전구체인 대용 참조 표준(SRS) 분자.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 합성 펩타이드인 대용 참조 표준(SRS) 분자.
  32. 제29항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합 펩타이드인 대용 참조 표준(SRS) 분자.
  33. 제29항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 호르몬 전구체가 프로가스트린인 대용 참조 표준(SRS) 분자.
  34. 본질적으로 약 10 내지 약 35개의 아미노산의 펩타이드 쇄로 이루어지고 관심대상 단백질의 제1 및 제2 에피토프의 면역모사체를 포함하는 대용 참조 표준(SRS) 분자의 표준 양을 이용하는 면역검정에서 생성된 시그널을 검출 또는 측정함을 포함하는, 제1 및 제2 에피토프를 포함하는 약 50개 초과의 아미노산의 관심대상 단백질에 대한 샌드위치 면역검정을 표준화시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 대용 참조 표준(SRS) 분자의 표준 양을 이용하는 면역검정에서 생성된 시그널을 미지의 양의 관심대상 단백질을 포함하는 샘플을 이용하는 면역검정에서 생성된 시그널과 비교하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 대용 참조 표준(SRS) 분자의 표준 양을 이용하는 면역검정에서 생성된 시그널이 공지된 양의 관심대상 단백질을 포함하는 샘플을 이용하는 면역검정에서 생성된 시그널과 비교되는 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역검정이 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역조직화학(IHC) 검정, 면역형광(IF) 검정, 응집 검정, 웨스턴 블롯 검정, 돗트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정 또는 표면 플라즈몬 저항 검출 방법인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 관심대상 단백질이 펩타이드 호르몬 또는 펩타이드 호르몬 전구체인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 호르몬 전구체가 프로가스트린인 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, SRS 분자가 [프로가스트린 1-9]-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPGRRSAEDEN, 서열번호 10); [프로가스트린 6-14]-[프로가스트린 72-80](SQQPDAPLGGRRSAEDEN, 서열번호 11); [프로가스트린 1-9]-Gly-Gly-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPGGGRRSAEDEN, 서열번호 12); [프로가스트린 1-9]-Pro-[프로가스트린 72-80](SWKPRSQQPPGRRSAEDEN, 서열번호 13); [프로가스트린 1-9]-Pro-Gly-Gly-Pro-Pro-[프로가스트린 72-80] (SWKPRSQQPPGGPPGRRSAEDEN, 서열번호 14); 및 [프로가스트린 6-14]-Pro-Pro-Gly-Gly-Pro-Pro-[프로가스트린 72-80](SQQPDAPLGPPGGPPGRRSAEDEN, 서열번호 15)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
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