【発明の詳細な説明】
抗体クラススイッチを刺激する組成物及び方法
関連出願
本出願により、1994年9月30日に提出された米国特許出願第08/315,293号、及
び1993年11月10日に提出された米国特許出願第08/150,510号は参照として本明細
書に特別に組み入れられる。
政府の権利
本明細書に開示する本発明は、本発明者らまたは譲受人に実施料を支払うこと
なく、アメリカ合衆国政府の目的のために製造され、認可され、使用されうる。
技術分野
本発明は、Bリンパ球によるIgA抗体への抗体クラススイッチを最適化するのに
有効な組成物及び方法に関する。このような増強は、IgA抗体が粘膜表面で作ら
れる抗体の大部分のクラスであり細菌およびウイルス感染に対する防御作用に寄
与する抗体の主要なクラスであるため、有意である。
発明の背景
ヒトの免疫系には、非常に多くの異なるタイプの細胞が含まれる。それらの細
胞は、重複する機能を有し、協調作用により病気および疾患から人の身体を防御
する。免疫系の細胞は、複雑な複数の機能を有し相互に関連している。これらの
微生物による感染に抵抗して宿主を防御する場合に必須の役割を果たす免疫系の
成分の大部分は、体液性抗体である。
抗体は免疫グロブリンとしても知られており、それらの産生を刺激する外来粒
子に対して精密な特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン(Ig)は
、二対のポリペプチド鎖、すなわち一対の軽鎖(L)[低分子量](κまたはλ)と一
対の重鎖(H)(γ、α、μ、δ、及びε)とを含み、4本全てがジスルフィド結合に
よって一緒に結合しているような一クラスの構造的に関連するタンパク質である
。H鎖およびL鎖は両方とも、抗原の結合性に寄与する領域と、あるIg分子から他
の分子に高度に可変する領域とを持っている。さらにH鎖とL鎖とは、非可変であ
る即ち定常領域も含んでいる。
L鎖には二つのドメインが含まれる。カルボキシ末端側のドメインは、特定の
タ
イプのL鎖では本質的に一定であり、「定常」(C)領域と言われる。アミノ末端側の
ドメインはL鎖毎に可変しており、抗体結合部位として寄与する。このような可
変能力があるためにそれは「可変」(V)領域と言われる。
IgのH鎖には数個のクラス、即ちα、μ、δ、ε、及びγ鎖(これらには数個の
サブクラスがある)が含まれる。集合したIg分子は、二つの同一のH鎖及びL鎖を
含む一個またはそれ以上のユニットで構成され、それが持っているH鎖により名
前が決定される。したがって5つのIgイソタイプ、即ちIgA、IgM、IgD、IgE、及
びIgG(これにはH鎖の違いに基づく4つのサブクラス、即ちIgG1、IgG2、IgG3、及
びIgG4がある)がある。
全ての抗体イソタイプが、抗体の有する数多くの生物学的な役割を遂行する際
に等しいわけではない。例えばIgAは、涙、尿、唾液、初乳、汗、及び粘液(即ち
分泌性のIgA)などの分泌物中に主に存在している。それは主に、気道または胃腸
管のような領域で起こる局所的な感染症に対して免疫学的な防御を行うと考えら
れている。また分泌性のIgAは有効な抗ウイルス性抗体でもあり、効果的に凝集
させる抗体と同様、ウイルスが宿主細胞に入るのを抑制する。
非常に多様な用途を持っていて存続性の長いIgGの活性は、毒性の中和作用か
ら補体及びオプソニン作用の活性化にまで及んでいる。例えばIgGは、そのFab部
分によって微生物にあるエピトープと反応することで、その微生物を最終的に包
み込んで破壊に至らす。それはまた、種々の物質を放出することで標的を破壊さ
せる天然のキラー細胞を活性化することによる抗体依存性、細胞媒介型細胞毒性
(ADCC)でも重要な役割を果たす。またそれは、効果的にウイルスの効力を失わせ
る抗体でもある。
IgGとは対照的にIgMはあまり広い用途を持っておらず、それは効果の低い毒物
中和性抗体であり、またウイルス類の中和作用でもほとんど効果がない。IgMは
血管内の領域に著しく存在しており、T非依存性抗原で免疫感作されたり曝露さ
れたりした後にかなりの量が子供および大人で合成されるイソタイプであり、ま
たそれはT依存性抗原で免疫感作された後で合成される最初のイソタイプでもあ
る。IgM分子は最も効果的な凝集性および補体活性化抗体である。
IgD分子はBリンパ球の表面に存在しており、これらの細胞の分化に関与してい
ることは明白であるが、一般的には防御機能を有することは明らかにされていな
い。
IgEはレアギン抗体とも呼ばれ、過敏感反応、即ちアレルギー反応で最も重要
な抗体である。これらの反応は蚊に刺されたような場合などでは緩和であるが、
気管支喘息の場合では重篤である。この反応は全身性のアナフィラキシーを引き
起こす可能性さえあり、それが起こると数分で死に至る。
このような違いがあるにも関わらず、全ての免疫グロブリンは抗体分泌細胞よ
り誘導される。抗体分泌細胞の前駆体はBリンパ球であり、「B細胞」としても知ら
れている。B細胞は、部分的に解明されているにすぎない分化の段階の複合体セ
ットにより造血幹細胞から誘導されるリンパ球のタイプである。
B細胞は、細胞表面受容体として細胞表面で発現するように特殊化された免疫
グロブリン(Ig)分子を保有している。新しく分化したB細胞は最初に、IgMクラス
の表面Igのみを発現する。B細胞が成熟するにつれて、そのB細胞の表面には他の
免疫グロブリンのイソタイプが出現してくる。
抗体を放出するためには、B細胞をまず活性化されなければならない。B細胞を
活性化するには多くの方法があり、それらには、抗原mIgによる膜(m)Ig分子の架
橋(架橋依存性B細胞活性化)、T細胞(ヘルパーT細胞、もしくは例えばCD40リガン
ドのようなヘルパーT細胞関連分子)との直接的な接触、または分裂促進剤との接
触などが含まれる。このような接触において、抗原はエピトープを提示し、それ
をB細胞の細胞表面Igが認識する。
各B細胞は、同一の可変領域を有する複数の膜Ig分子を有するため、細胞表面
受容体の高レベルな架橋により最適な活性化がもたらされる。この架橋には、抗
原が細胞表面Igにより認識されるエピトープを複数提示する必要がある。多くの
単純なタンパク質抗原はこの能力を持たないが、その必要性は、多糖、ならびに
微生物表面およびDNAのような反復エピトープを有するその他の抗原により満た
される。これらの複数の複合抗原には、ニューモコッカス(pneumococci)、スト
レプトコッカス(streptococci)、およびメニンゴコッカス(meningococci)のよう
な、多くの医学的に重要な微生物の被覆多糖が含まれる。
膜Igの架橋により、B細胞の除去または不活化も引き起こされうるという多く
の
データがある。一般的に、ある型のレセプター架橋過程が、特異的刺激シグナル
非存在下で起こった場合、活性化ではなく不活化が引き起こされると考えられて
いる。多糖に発現した高度に反復性のあるエピトープは、共刺激が存在しなくて
も活性化を引き起こしうる。これはおそらく、そのレセプターを介した刺激が大
きさためである。
表面にIgMおよび／またはIgDを最初に発現するB細胞が、初めに産生される抗
体に一旦活性化される場合、それは主としてIgMイソタイプである。最も興味深
いことに特異的攻撃に応答する場合、T細胞の助けがあればB細胞が特定のV領域
を適当なC領域(即ち、γ、α、及びεに対応する領域)に「クラススイッチ」する
ことが可能となる。このようにIgM及びIgDクラスの受容体を発現する細胞はIgG
、IgA、またはIgE受容体を発現する細胞に分化することが可能であり、そのとき
それらの抗体を分泌する細胞となる。この過程によって、抗体応答を最初に誘導
したのと同じ抗原に対して別個の生物学的機能を有する別々の抗体を産生するこ
とが可能になる。
スイッチ段階の誘導は、分化した一セットのB細胞刺激物の作用に依存してい
る。研究によりイソタイプスイッチの誘導に対して重要な二つの異なる種類の刺
激が確認されている。一つ目の種類の刺激は、イソタイプ-スイッチ過程の特異
性に対して顕著に反応することができる。これらにはサイトカインIL-4、インタ
ーフェロン-γ(IFN-γ)、及びトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)が含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。これらはすべて、スイッチ作用を誘
導することのできるH鎖のイソタイプに対するRNAの未成熟(生殖系列)な形態の転
写を誘導する能力を有することに特徴がある。あるイソタイプへのスイッチ作用
を誘導する刺激はしばしば、さらなるイソタイプへのスイッチを刺激したり他の
イソタイプへのスイッチを阻害したりする。
二つ目の種類の刺激または刺激の組合せによりB細胞が活性化され、イソタイ
プスイッチが行われないB細胞の増殖およびIgの分泌がそれら自体によって引き
起こされることがしばしばある。これらの刺激により、特殊な刺激の存在に依存
してたくさんの異なるイソタイプのうちのいずれかになるスイッチ作用を起こす
ことが可能となるが、刺激のいくつかはあるイソタイプへのスイッチを遮断する
こと
がわかっている。これらの認められている刺激には細菌性リポ多糖類(LPS)、サ
イトカインIL-5、細胞表面Igの架橋、活性化されたT細胞(マウスのB細胞に対す
る)の細胞膜にある分子によって示されるシグナル、Epstein-Barrウイルス(EBV)
による感染、CD40リガンド(T細胞の特殊化された群で一般的に見られる細胞表面
タンパク質)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)受容体、及び活性化されたT細胞の細胞
膜にある分子によって示されたシグナルが含まれるが、これらに限定されるわけ
ではない。これらのなかで最も広範に研究されているのはLPS(マウスでは作用す
るがヒトでは作用しない)であり、またCD40リガンドの相互作用に指向されてい
る。
こうした情報があるにも関わらず、高い割合のIgAクラススイッチを誘導する
のに必要なパラメーターは、本発明より以前には未知であった。IgA抗体は感染
症および疾患に対する防御を行う重要な経路であるため、当技術分野においてそ
の知識が必要とされる。このような知識により免疫疾患を治療する別の優れた方
法が容易に提供できる。
本発明の開示
本発明により、当技術分野における新規の改良された免疫治療の必要性が満た
される。新規の組成物および方法により、改良された新規の免疫系疾患の治療、
および現在の免疫治療のためのアジュバントが可能となる。
本発明は、TGF-βとして知られているサイトカインとともに二つのB細胞アク
チベーターを含むことを特徴とするB細胞によって最適のIgA抗体クラススイッチ
を刺激するための組成物及び方法に向けられている。他のサイトカインも用いる
ことができる。
好ましい態様において、B細胞アクチベーターの一つは多価Ig受容体架橋剤で
ある。もう一つのB細胞アクチベーターは他の受容体を介して作用するものであ
って、宿主に応じてCD40リガンドまたはLPSのいずれかであることが好ましい。
ヒトではCD40リガンドのみが用いられる。別のサイトカインのうち好ましいサイ
トカインは、IL-5またはIL-2のいずれかと組み合わせたIL-4である。当然のこと
であるが、サイトカインの活性を保有するTGF-β、IL-4、IL-5、及びIL-2の分子
操作されたフラグメントも本発明において利用することができる。
B細胞による抗体の放出を促進したり抑制したりする方法は、例えば通常の条
件
または免疫化されうる条件の下でのワクチン接種によるような哺乳動物の免疫応
答を抗原刺激するために用いることができる。
本発明のもう一つの目的は、新規組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬
学的組成物である。
本発明のさらにもう一つの目的は、ワクチンのためのアジュバントとしての新
規の方法および組成物の使用である。例えば、現在、多くのワクチンが、血液系
に存在する免疫系細胞を迅速に刺激するために、静脈注射または筋肉内注射によ
り投与されている。担体分子と共有結合した融合タンパク質として、混合してま
たはその他の組合せの形態で、新規組成物を投与されるワクチンと併用すること
により、IgG抗体の反応の大きさを、全身レベルおよび局所レベルのいずれにお
いても増加させることができる。
本発明のその他の目的および利点は、一部は以下の説明で開示され、一部は上
記の説明から明らかとなり、または本発明の実施により明らかになると思われる
。本明細書に含まれその一部を構成する添付の図面および表は、例示であり、本
説明と共に、本発明の原理を説明するために役立つと思われる。
図面の簡単な説明 図1
:TGF-βの存在下または非存在下において、多価の架橋された抗原(デキスト
ラン-複合化抗-Ig抗体、即ちαδ-dex)、CD40、及び/またはLPSに、IL-4+IL-5を
加えた二つの組合せを用いて行う活性化に応答して起こるIgAクラススイッチを
評価するための膜(m)IgA+細胞のフローサイトメトリック分析。図2
:TGF-βの存在下または非存在下において、αδ-dex、IL-4、及び/またはIL-
5を用いたときまたは用いないときにLPSまたはCD40Lに応答して発生するIgA+細
胞のパーセント割合を、最適なIgAクラススイッチを進行させるための種々の刺
激の相対的な必要性について調べるために測定した。図3
:種々の刺激の組合せに応答する3H-Tdr導入が、DNA合成のレベルに対してこ
の系における個々の成分によってなされる寄与を調べるために測定された。図4
:IgAクラススイッチを抑制しているか否かを測定するために、この系におけ
るmIgA+細胞の生成の抑制についてIFN-γを試験した。IFN-γにより、αδ-dex
、IL-4、IL-5及びTGF-βが存在するときにLPSまたはCD40Lのいずれかを用いて活
性化
させた場合に発生するmIgA+細胞のパーセント割合が強く阻害された。図5
:CD40L/αδ-dexではなくLPS/αδ-dexによって活性化されるB細胞によりIgA
クラススイッチを刺激する場合に、IL-2をIL-5と置換してもよい。
本発明を実施するための最良の形態
本発明は抗体クラススイッチを刺激するための組成物及び方法について記載し
ている。上記に列挙したように、抗体クラスはH鎖クラス、即ちα、μ、δ、ε
、及びγ(4つのサブクラスを有する)によって決定され、それらはIgA、IgM、IgD
、IgE、及びIgG(4つのサブクラスがある)に対応している。当技術分野において
理解されるようにクラススイッチは、最初にIgMとIgDのいずれかあるいは両方を
発現するB細胞がIgE、IgA、または4つのIgGサブクラスのうちの一つを発現する
ようにスイッチすることによって進行する。その際これらのB細胞は、それらが
発現するIgを分泌する。クラススイッチは発現の増加および減少、ならびに対応
する分泌の両方に関与しうる。
インビトロでの先行の研究により、ほんの1〜2％までの膜IgA+細胞しか生じな
いパラメーターが決定された。対照的に、インビボでのIgAクラススイッチにつ
いてのプライマリー部位であるパイエル板(Peyer's patches)は全B細胞群の10〜
20%の割合で起こるスイッチ作用を示すが、これが起こるメカニズムは明らかで
はない。本発明により、全B細胞群の15〜20%にIgAスイッチを起こさせるインビ
トロでのパラメーターのセットが明らかにされる。このような増加は、刺激され
たクラススイッチの非限定的な例である。
本明細書で用いられるようにB細胞はリンパ球の一タイプであって、Bリンパ球
としても知られており、それは抗体分泌細胞の前駆体である。それは少なくとも
二つのタイプの細胞表面受容体を保有しており、そこにアクチベーターがB細胞
を活性化するために結合すると考えられている。当業者に理解されているように
、細胞表面の受容体は特異的なリガンドに対する既知の結合親和性を備えた巨大
分子である。B細胞表面受容体の一つは、細胞表面に発現するように分化された
免疫グロブリン分子であり、本明細書では簡単にIg受容体と呼ぶ。他の受容体に
はFc受容体、補体受容体、及び他の受容体が含まれ、本明細書では簡単に非Ig受
容体と言うこととする。
有効なIg受容体アクチベーターの第1番目の例は、モノクローナル抗IgDを複合
化したデキストランまたはαδ-dexとして知られており、それは多価のIg受容体
架橋を媒介する。αδ-dexを調製するためには、「モンド(Nond)らのJ ．Immunol .
140: 3346(1988)」及び「モンド(Mond)らのJ ．Immunol. 146: 833(1991)(なお
参照としてこの明細書に組み入れられる)」に記載されたようにHδa/1(モノクロ
ーナルのマウスIgG2b(bアロタイプ))及び抗マウスIgD(aアロタイプ)を高分子量
のデキストラン(2×106kd)に複合化する。抗IgD抗体は9:1の比率でデキストラン
に複合化されているとよい。もちろん他の多価Ig受容体アクチベーターも本発明
の範囲に含まれる。
当業者は非常に多くの既知の非Ig受容体アクチベーターに慣れていると思われ
るが、請求の範囲に記載された発明にとっては二つのアクチベーター、即ちCD40
リガンドおよび細菌性のリポ多糖類(LPS)が特に好ましい。当然のことであるが
宿主がヒトの場合にはLPSは好ましいアクチベーターではない。当業者はまた、
二つのこれらの受容体のアクチベーターの起源についても、適当量についても充
分に理解していると思われる。CD40リガンドは好ましくは約10μg/mlで存在して
おり、またLPSは20μg/mlで存在している。このB細胞受容体アクチベーターの量
は、多価の抗原受容体架橋剤の好ましい量に影響を与える。例えば多価抗原受容
体架橋剤は、インビトロにおけるLPSとの共刺激の際には約3ng/mlで存在してお
り、またインビトロにおけるCD40リガンドとの共刺激の際には約0.3ng/mlで存在
している。
当業者はまた、これらの受容体を架橋するための方法にも精通している。例え
ば、高度に架橋された構築物を形成するために昆虫の細胞膜のような膜に受容体
を挿入してもよい。好ましい構築物は、CD40リガンド/昆虫細胞膜である。膜結
合性CD40リガンドは、組換えCD40リガンド、即ち組換えバキュロウイルスベクタ
ーを含んでいるものを用いて感染させたSf9挿入細胞から得られる。
本明細書で用いられるように、「サイトカイン」は、Bリンパ球細胞およびTリン
パ球細胞(「B細胞」及び「T細胞」)ならびに天然のキラー細胞(「NK」)などの免疫系の
細胞の応答を調節するクラスの化合物の一つである。「サイトカイン」は、誘導物
質と接触してある細胞群から放出される非抗体タンパク質についての属を表す用
語であり、それは細胞間の媒体として作用する。「リンホカイン」は、特定の抗原
または他の刺激物に接触して敏感にされたリンパ球によって放出される可溶性の
物質であり、その介助は細胞性免疫または体液性免疫に影響を与える。「サイト
カイン」及び「リンホカイン」という語は互換可能である。これらの化合物の名称
を簡略化しようとする試みで、1979年に開かれた「第２回国際リンホカイン研究
集会(the Second International Lymphokine Workshop)」における関係者らは「イ
ンターロイキン」、略して「IL」という用語を提唱することによって、異なる白血
球群の間の連結シグナルとして作用するタンパク質の能力に基づく統一したシス
テムの名称を開発した。
これまでに、T細胞によって産生されるすべてではないものの大部分である21
個の異なるサイトカインが同定されている。それぞれは異なる分子配置を持って
おり異なる役割を果たす。多くの既知のサイトカインは、B細胞に対して明らか
にできる活性を持っていることが示されている。インビトロにおいてIL-1、IL-2
、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ、及びTGF-β(トランスフォーミング増殖因
子β)は、B細胞の増殖、免疫グロブリンの分泌を促進すること、また分泌したIg
のサブクラスに影響を及ぼす点で別の役割を果たすことがわかっている。研究さ
れている系によると、上記のリンホカインのうちの一つまたは多数を添加した場
合、インビボで抗体産生が増強すること、あるいは分泌された抗体のイソタイプ
(即ち、IgG、IgM、IgE、IgAなど)が変わることがわかっている。これらのサイト
カインは通常、両方の段階に影響を与える。
TGF-βはT細胞、単核球、及び血小板によって支配的に合成される。この因子
はIgAの産生を増強するだけでなくT細胞及び単核球の活性化を阻害することがわ
かっている。培養物中では免疫系のほとんどの細胞、例えばリンパ球および単核
球がTGF-βを合成する。リンパ球及び単核球をTGF-βで処理すると、細胞タイプ
およびその分化段階に応じて広範な系列の生物学的応答が引き起こされる。例え
ばTGF-βはBリンパ球の増殖を阻害し、更に膜免疫グロブリンの活性化されたBリ
ンパ球による発現を抑制するとともに免疫グロブリンG及びMの分泌を抑制する。
また、TGF-βが存在するとIgAへのイソタイプスイッチが行われるようにリポ多
糖類で刺激されたマウスのB細胞が促進され、その一方でTGF-βが持続的に存在
すると
IgAの分泌が抑制されることもわかっている。
宿主の防御作用で役割を果たす他のサイトカインにはIL-2、IL-4及びIL-5が含
まれる。IL-2はT細胞増殖因子としても知られており、Tヘルパーおよびサプレッ
サーリンパ球の両方によって産生されるポリペプチドホルモンである。このサイ
トカインは、T細胞、B細胞、NK細胞、リンホカイン-活性化キラー(LAK)細胞、単
核球、マクロファージ、及びオリゴデンドロサイトの増殖および分化を刺激する
。
IL-4は、B細胞刺激因子1(BSF-1)及びB細胞分化因子としても知られている糖タ
ンパク質である。それは、B細胞の増殖、Igのクラススイッチ、T細胞の増殖およ
び分化、マクロファージの活性化、マスト細胞の増殖調節を共刺激する機能、な
らびに造血系前駆細胞を共刺激する機能がある。
IL-5は、B細胞増殖因子II(BSF-II)、T細胞置換因子、IgA-増強因子、及び好酸
球コロニー刺激因子としても知られており、Tリンパ球及びマスト細胞によって
産生される糖タンパク質である。このサイトカインは、骨髄における好酸球コロ
ニーの分化を促進するだけでなく、コロニーを刺激する因子という二重の機能を
持っている。IL-5はインビボで抗原を用いて刺激したB細胞によって、インビト
ロで特異的な抗体産生を誘導する。IL-5はインビトロでは分化因子として機能す
るものの、インビボにおける分化因子としての作用は明らかではない。
当業者であればサイトカインの適切量を決定することができるが、インビトロ
でIgA抗体クラススイッチを最適に行うためのTGF-βの好ましい量は約10ng/mlで
あり、IL-4の好ましい量は約1000U/mlであり、そしてIL-5の好ましい量は約150U
/mlである。従ってインビボでの量は、当業者によく知られているとおりにスケ
ールアップされる。
本発明の基本的な構成要素を本明細書に記載したが、本出願人らは以下に、支
持情報を提示する。
A.高率のIgAクラススイッチを行うのに必要なパラメーターの同定
IgAへの生理的なクラススイッチの基礎となるメカニズムを解明する一つの大
きな障害により、高率のIgAクラススイッチを行うためのインビトロの系を確立
することが不可能になっている。TGF-βは、生殖系αRNAを選択的に刺激する能
力に基
づいてマウスのIgAクラスに対するスイッチ因子として確立されており(コフマン
(Coffman)らのJ ．Exp．Med. 7: 1039(1989)、ソノダ(Sonoda)らのJ ．Exp．Med.
170: 1415(1989)参照)、特にIL-2またはIL-5と関連して機能する場合においてLP
S-活性化細胞によるIgA分泌の大幅な増加を誘導する(コフマン(Coffman)らのJ ． Exp．Med.
170: 1415(1989)参照)。しかしながらこれらの条件の下でのIgAの分
泌は、ほんの数パーセントの膜(m)IgA+細胞の生成に関わっているにすぎなかっ
た。このことから、パイエル板(ブッチャー(Butcher)，E.，C.，R．V．ラウス(R
ouse)，R．L.コフマン(Coffman)，C．N.ノッテンブルグ(Nottenburg)，R．R．ハ
ーディ(Hardy)およびI．L．ウェイスマン(Weissman)，1982,パイエル板胚中心細
胞の表面表現型；B細胞分化における胚中心の役割への関与(Surface phenotype
of Peyer's patch germinal center cells; implications for the role of ger
minal centers in B cell differenriarion.)J ．Immunol. 129; 2698参照)、即
ちインビボでのIgAクラススイッチのためのプライマリー部位で実質的に高い(即
ち、10〜20%)パーセント割合のmIgA+細胞を計測するためには追加刺激が必要で
あることが示されていた。
1.CD40L-またはLPS-活性化B細胞の架橋している多価抗原受容体にIL-4、IL-5
、及びTGF-βを加えると、かなりのパーセント割合のmIgA+細胞が誘導される。
高率のIgAクラススイッチを行うインビトロでの系を確立するためにTGF-βを
、クラススイッチを調節する際に活性化されることがわかっている多くのサイト
カインおよびB細胞アクチベーターを種々に組み合わせたものを用いて試験した
。
mIgA+細胞のフローサイトメトリック分析を、TGF-βの存在下または非存在下
において、実験モデルにおけるデキストラン複合化抗Ig抗体(αδ-dex)によって
媒介されている多価の架橋された抗原受容体、CD40、及び/またはLPSに、IL-4+I
L-5を加えた二つの組合せを用いて行う活性化に応答して起こるIgAクラススイッ
チを評価するために行った(図1参照)。TGF-βの非存在下では、活性化の方法に
関係なくmIgA+の有意な誘導は見られなかった。TGF-β、IL-4+IL-5が存在し、α
δ-dexとLPSまたはCD40Lのいずれかを用いて活性化した場合、10%及び12%のmIgA+
細胞がそれぞれ発生した。これは、TGF-βの非存在下で認められたよりもmIgA+
細胞のパーセント割合で100倍以上増加している。
多価抗原受容体架橋剤(α-dex)を存在させたときの共刺激とは対照的に、CD40
L+LPSを用いて二重の活性化を行うと、比較的低レベルのmIgA+細胞が生じた。
TGF-βは、続いてLPS、多価抗原受容体架橋剤(αδ-dex)、IL-4、及びIL-5を
用いて共刺激を行うことによりmIgA+細胞を誘導させるために選択されるが、こ
の場合TGF-βはmIgG2b+またはmIgG3+細胞を誘導せず、またIL-4の存在で誘導さ
れたmIgG1+細胞のパーセントに影響を与えなかった。
2.LPS活性化またはCD40L活性化された細胞のいずれかによってIgAクラススイ
ッチを最適に誘導するには、多価抗原受容体架橋剤、IL-4,IL-5、及びTGF-βの
独立した作用を必要とする。
最適のIgAクラススイッチを生じさせるための種々の刺激の相対的な必要性を
調べるために、TGF-βの存在下または非存在下で、多価抗原受容体架橋剤(αδ-
dex)、IL-4、及び/またはIL-5を用いたときまたは用いないときのLPSまたはCD40
Lによる刺激に応答して発生するmIgA+細胞のパーセント割合を測定した(図2参照
)。
TGF-βは刺激の最高の組合せを用いて活性化させた培養物においてmIgA+細胞
の適度の上昇を刺激したが、これらのパーセント割合は2%を越えなかった。多価
の架橋された抗原受容体(αδ-dex)、IL-4、IL-5、及びTGF-βが組合されて存在
する場合にのみ、LPSまたはCD40Lのいずれかで活性化させることにより生じたmI
gA+細胞は比較的大きなパーセント割合を示した(それぞれ11.0%および12.3%)。
3.mIgA+細胞のTGF-β誘導は、IgA分泌の選択的刺激と関連している。
LPS+多価抗原受容体架橋剤(αδ-dex)またはCD40L+αδdexのいずれかを用い
て、IL-4、IL-5、及びTGF-βの存在下でB細胞の共刺激を行うと、TGF-βの非存
在下で得られたIgA分泌の誘導と比較して、それぞれ34倍以上の大きさ、及び176
倍以上の大きさでIgA分泌の誘導が刺激された(表1参照)。
IgA分泌についてのこの増強は、大部分の他のIgイソタイプの濃度が有意に抑
制される点で選択的である。この系でIgG3及びIgG2の分泌が適度に誘導されるこ
とは、TGF-βの存在によって実質的に影響されなかった。
4.多価抗原受容体架橋剤はLPS-またはCD40L-活性化細胞の増殖を強く増強し、
かつ高濃度のTGF-βの存在で活発な細胞増殖を可能にする。
クラススイッチ組換えの誘導は、活性なDNA合成を必要とするらしい(ダニック
(Dunnick)，W.およびJ．シュタブニーザー(Stavnezer)1990、免疫グロブリンH鎖
スイッチ組換えのコピー選択メカニズム(Copy choice mechanizm of immunoglob
ulin heavy-chain switch recombination.)Mol．Cell．Biol．10: 397参照)。し
たがってTGF-βは、CHα生殖系RNAの誘導によって証明されているとおり、組換
えのためのCHα遺伝子を標的にするが、その抗増殖効果は結果として起こるCHα
遺伝子転移のレベルを低下させる可能性がある。
DNA合成のレベルについて記載されたこの系における個々の成分による関与に
ついて調べるために、種々の刺激の組合せに応答する3H-Tdr導入を測定した。
TGF-βの非存在下では、多価抗原受容体架橋剤(αδ-dex)はLPS-活性化細胞に
よる3H-Tdr導入が非常に増強された(図3参照)。IL-4+IL-5の組合せでは、LPSま
たはLPS+αδ-dexのいずれかに応答する増殖に対してほとんど効果がなかった。
高濃度のTGF-βの存在下では、TGF-βの非存在下で見られるのと比較して全ての
条件の下でDNA合成はさまざまに阻害されたが、二つのアクチベーターLPS+αδ-
dexが存在する場合にのみ、IL-4+IL-5が存在していようと存在していなかろうと
比較的高いレベルのDNA合成が維持されていた。同様の結果は、CD40LをLPSの代
わりに用いた場合においても得られた。またCD40LとLPSとを組み合わせると、TG
F-βの存在下ではIL-4+IL-5に関わらず比較的高レベルの増殖が認められたが、m
IgA+細胞のパーセント割合の増加は引き起こされなかった(図1参照)。したがっ
て増殖が増強されることは、この系における多価抗原受容体架橋剤の役割につい
ての部分的な説明にすぎない。
5.IL-2はIL-5に置き換えることができる。
CD40L/αδ-dexではなくLPS/αδ-dexによって活性化されたB細胞でIgAクラス
スイッチを刺激する場合にIL-2をIL-5と置換することが可能である。増殖してい
ないDBA/2脾臓B細胞は、IL-4及び/またはIL-5、TGF-β、及びIL-2(150U/ml)の存
在下または非存在下で、LPS/αδ-dexまたはCD40L/αδ-dexを用いて共刺激した
。LPS、CD40L、αδ-dex、IL-4、IL-5、及びTGF-βは、図1に記載された用量で
用いた。細胞はフローサイトメトリック分析によってmIgA+B細胞の量を正確に計
るために培養を始めてから5日後に採取した。それぞれの群から15,000個の細胞
が分析された。図5のデータは、二つの同じ実験を表している。
6.IFN-γはIgAクラススイッチを抑制する。
IFN-γがマウスのB細胞におけるほとんどのIL-4媒介効果を阻害するため、ま
たIL-4がIgAクラススイッチを誘導する主要な成分であったため、IFN-γがこの
系でmIgA+細胞の発生を抑制できるか否かを調べる目的でIFN-γを試験した(図4
参照)。
IFN-γにより、多価の架橋された抗原受容体(αδ-dex)、IL-4、IL-5、及びTG
F-βの存在下でLPSまたはCD40Lのいずれかを用いて行う活性化に応答して発生す
るmIgA+細胞のパーセント割合が強く阻害された。IgAクラススイッチの最適の阻
害は100U/mlのIFN-γで起こり、CD40L活性化細胞及びLPS活性化細胞ではそれぞ
れ〜4倍及び〜6倍の抑制が示された。mIgA+細胞の有意な減少は、IFN-γ 1〜3U/
ml程わずかに観察された。
7.CD40リガンドの活性。
公表されたデータから、CD40リガンドの活性が細胞表面に現れたこのタンパク
質の絶対量に依存しているらしいことが示唆される。この観点において本発明者
らは、可溶性CD40リガンド(sCD40L)およびsCD40Lよりも高密度のCD40Lを示す膜C
D40L(mCD40L)を、Ig分泌を刺激する能力について比較した。分類精製したB細胞
を、以前の実験[細胞を平底の96穴プレートにて完全培地とともに2×105/mlで培
養した。CD40Lの濃度は指示されたとおりであり、また抗Igデキストランは.3ng/
mlであった。上清を6日目に採集し、Ig濃度をELISAによって測定した。]で、抗I
gデキストラン及びsCD40LまたはmCD40Lを用いるように改変した。後者ではIgM及
びIgG1を分泌するようにかなり刺激されていたのに対し、IgEの分泌については
顕著に刺激されたsCD40Lに比べると顕著に阻害されていた。このことは、有効な
Ig異性体は極端に刺激するが、アレルギー反応を助長する可能性のあるIgEは阻
害するようなmCD40Lまたはそれと類似のアゴニストを利用することを支持してい
る。
＊＊＊＊
比較的高率のIgAを誘導するためにサイトカインIL-4、IL-5、及びTGF-βを、
多価抗原受容体架橋剤のB細胞アクチベーター、及びLPSまたはCD40Lと組み合わ
せた作用に対する必要条件の基礎となるメカニズムは明らかにされていない。
そのメカニズムに関わらずこれらのデータから、生理的条件下で高いパーセン
ト割合のmIgA+細胞を誘導するためのかなり厳密で複雑な必要条件が示唆される
。これらの研究で用いられているような脾臓のB細胞が活発なIgAクラススイッチ
を行うことができるという事実により、内在するB細胞の内因性の性質ではない
刺激のパターンがこの現象の説明となることが示唆される。本発明で確認された
IgA-誘導性刺激のうちのいずれかは、免疫学的なある方面において明白となって
いるが、パイエル板でIgAクラススイッチがなくなることは、胃腸管の複雑な細
菌環境と抗原環境とにきわめて近接し関連した結果として、内在のB細胞で高レ
ベルの多くの刺激の作用が構造的にかつ同時に起こることを部分的に反映してい
ると考えられる。したがって、有糸分裂促進物質を含むT非依存性抗原、及び多
価抗原受容体媒介シグナルを供給できる多糖類だけでなく、T細胞ヘルプの結果
として生じる補充物を用いて多数のタンパク質に同時に曝露することにより、TG
F-βに応答して起こる活発なIgAクラススイッチが可能となる。
B.請求の範囲の組成物の使用
1994年9月30日に提出された特許出願第08/315,293号には、B細胞によって抗体
の放出を刺激するための組成物及び方法が教示されている。その特許出願の組成
物及び方法は、新規の改良された免疫治療のために本発明と組み合わせることが
可能である。
１．この組成物に基づく治療
治療には、静脈内、腹膜腔内、肉体内注入、関節内、消化器管内、脊髄内、筋
肉内、皮下、腹腔内、膣内、経口、または他の何らかの好適な投与方法によって
薬学的組成物を投与する段階が含まれる。またこの組成物は、例えば筋肉内また
は皮下のいずれかで特定の領域に注入することによって、局所的に投与すること
もできる。
治療するにふさわしい宿主には適当な哺乳動物が含まれる。好適な宿主は、新
生児、成人、及び免疫不全の患者などのヒトである。
用いられる化合物の用量は年齢、個人差、症状、投与形態などに応じて変化し
、それは当業者によって容易に決定することができる。サイトカインTGF-β、IL
-4、IL-5、及びIL-2の典型的な用量は、「マッキンチル(McIntyre)，T．M.,ケー
リー(Kehry)およびスナッパー(Snapper)，C．M.，1995,高率IgAクラススイッチ
の
ための新規なインビトロモデル(A novel in vitro model for high-rate IgA cl
ass switching)，J ．Immunol.(In press)」に記載されている。CD40リガンドの典
型的な用量は、「マッキンチル(McIntyre)，T．M.,ケーリー(Kehry)およびスナッ
パー(Snapper)，C．M.，1995,高率IgAクラススイッチのための新規なインビトロ
モデル(A novel in vitro model for high-rate IgA class switching)，J ．Imm unol
.」に記載されており、また多価抗原受容体架橋剤の典型的な用量は、「マッ
キンチル(McIntyre)，T．M.,ケーリー(Kehry)およびスナッパー(Snapper)，C．M
.，1995,高率IgAクラススイッチのための新規なインビトロモデル(A novel in v
itro model for high-rate IgA class switching)，J ．Immunol.」に記載されて
いる。
薬学的に許容されるいかなる担体も、多価高原受容体架橋、CD40、リガンド、
TGF-β、IL-4、およびIL-5もしくはIL-2のいずれかに対して用いることができる
。担体は、水、油のような無菌的な液体でありうる。油には、石油、動物油、植
物油、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。静脈注射には、水が
好ましい担体である。生理食塩水、水溶性デキストロース、およびグリセロール
溶液もまた、特に注射用溶液のための水性担体として用いられる。適当な薬学的
担体は、「レミントンの製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18
版(A.Gennaroら、Mack Pub.,Easton,Pa.,1990)」に記載されており、これは参照
として本明細書に組み入れられる。
２．本組成物を含むワクチンアジュバント
また本発明には、本発明の組成物を含有するワクチンアジュバントが含まれる
。血液系に存在する免疫細胞を急速に刺激するために、現在多くのワクチンが静
脈注射または筋肉内注射により投与されている。本新規組成物を薬剤と組み合わ
せて投与することにより、局所的にも、全身的にも、IgA抗体反応の大きさが増
加する。
インビトロアッセイにおいて、抗IgM抗体または抗IgD抗体が、デキストランの
ように多価の状態で存在する場合、効果的に作用しすべてのB細胞を活性化する
。従って、抗Igデキストランを用いるインビトロモデルは、すべての抗原受容体
を架橋するように作用する。しかし、この反応はインビボでは望ましくない。患
者
にとって、目的は、抗原に対して特異的なレセプターを有する少量のB細胞のみ
を活性化することである。従って、多価抗原受容体架橋にはワクチンの抗原が用
いられる。
ワクチンアジュバントとして用いる場合、本発明の組成物を好ましくは、デキ
ストランまたは細菌の被覆多糖のような多価担体分子に結合させる。ニューモコ
ッカス(Pneumococci)、ストレプトコッカス(Streptococci)、およびメニンゴコ
ッカス(Meningococci)の被覆多糖が好ましい。また、CD40リガンド並びにサイト
カインTGF-β、IL-4、及びIL-5またはIL-2のいずれか、これらのサイトカインを
分子操作したフラグメントであってサイトカインの活性を維持しているものは、
単独であってもよいし、あるいは多価の担体に複合化した組合せであってもよい
。またサイトカインは、互いに融合していてもよいしあるいは融合タンパク質を
形成するように他のタンパク質に融合していてもよく、それらは多価の担体に結
合していてもよい。また多価の架橋された抗原受容体を、CD40リガンド並びにTG
F-β、IL-4、及びIL-5またはIL-2のいずれかに対する担体分子として作用させる
ことも可能である。他のワクチンの変型は、当業者には明らかであると思われる
。
本出願は、サイトカインをゆっくりと、しかし持続的に輸送することができる
、抗サイトカイン−サイトカイン複合体の使用を含む。複合体は、ワクチンの抗
原との混合物として、またはワクチンの抗原に結合させて、投与することができ
る。
さらにもう一つの態様において、ワクチンアジュバントには、CD40リガンド、
またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ以外の一つまたは複数のサイトカイン、ま
たはそれらの組合せが含まれうる。CD40L、および一つまたは複数のサイトカイ
ンは、多価の担体に結合させることもできる。
３．共役ワクチンに用いられる組成物
ワクチンの抗原と本発明の組成物を、デキストランまたは細菌の被覆多糖など
の多価の担体分子に結合させて、共役ワクチンを形成することができる。ニュー
モコッカス、ストレプトコッカス、およびメニンゴコッカス被覆多糖が好ましい
。
抗原は、ワクチン接種すべき疾患に特異的なペプチドまたはタンパク質である
。
ワクチンを投与した際の体液性免疫反応をさらに最適化するために、CD40また
は少なくとも一つのその他のサイトカイン、またはそれらの組合せを多価の担体
に結合させることができる。
表IIは、本発明の組成物を例示している。表に示されている通り、ワクチンの
いくつかは共役ワクチンである。共役の方法は、当業者に周知であり、「ブラン
スウィック(Brunswick)ら、J.Immunol.140:3364(1988)」、「ウォング(Wong),S.S.
、蛋白質の共役および架橋の化学(Chemistry of Protein Conjugates and Cross
linking),CRC Press,Boston(1991)」、および「ブレンケリー(Brenkeley)ら、染
料、ハプテンおよび架橋剤を用いる蛋白質共益物の調製のための方法の簡単な概
説(Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes,Ha
ptens and Cross-Linling Agents)、Bioconjugate Chemistry,3,No.1(Jan.1992)
」に記載のヘテロライゲーション技術を含む。これらは、参照として、特に本明
細書に含まれる。
本発明の予想外の効果を、以下の実施例で実証し、図1〜4に図示する。
本発明を一般的に開示してきたが、特異的な実施例を参照することにより、よ
り完全な理解が得られると思われる。実施例は、例示のためだけに本明細書に含
まれ、本発明を限定するものではない。
実施例1
この実施例は、CD40L-またはLPS-活性化B細胞の多価抗原受容体架橋体にIL-4
、IL-5、及びTGF-βを加えると、大きなパーセント割合のmIgA＋細胞が誘導され
ることを示している。材料及び方法
マウス：国立癌研究所(National Cancer Institute)(Frederick,MD)から入手
した雌DBA/2マウスを、8〜12週齢で用いた。
培地：RPMI1640(Biofluids,Rockville,MD)に、10％ウシ胎児血清(Sigma,St.Lo
uis,MO)、L-グルタミン(2ml)、2-メルカプトエタノール(0.05mM)、ペニシリン(5
0μg/ml)、およびストレプトマイシン(50μg/ml)を添加したものを、細胞を培養
するのに用いた。
試薬：デキストラン結合抗IgD(Hδa/1)(αδ-dex)は、Hδa/1（モノクローナ
ルマウスIgG2b(bアロタイプ)）抗マウスIgD（aアロタイプ）を高分子量デキスト
ラン(2X106kd)へと結合させることにより調製した。抗IgD抗体は、9:1の比率で
デキストランに結合させた。
組換えCD8-CD40リガンド(L)融合タンパク質は、「レーン(Lane),P.，T.ブロッ
カー(Brocker)，S.ハブル(Hubele)，E.パドバン(Padovan)，A.ランツアベッキア
(Lanzavecchia)およびF.マッコンネル(McConnell)，1993,可溶性CD-40リガンド
は、T細胞依存性活性化においてB細胞への正常T細胞由来CD40リガンドシグナル
を置換できる(Soluble CD40 ligand can replace the normal T cell-derived C
D40 ligand signal to B cells in Tcell-dependent activation)，L ．Exp．Med .
177: 1209」に記載されたように構築して発現させ、そして硫酸アンモニウム
を用いて沈澱させてCMセファロースカラム上でクロマトグラフィーを行うことに
よって培養物上清より精製した。精製されたCD8-CD40Lの内毒素レベルは<0.02ng
/mlであった。
大腸菌(Escherichia coli)0111:B4から抽出したLPS Wは、ディフコラボラトリ
ー社(Difco Laboratories，Inc．(Detroit，MI))より入手した。それは全ての実
験において20μg/mlで用いた。
組換えヒトTGF-β2及び精製された天然のウシTGF-β1は、ウェンディワーゲル
(Wendy Waegell(Celtrix Pharmaceuticals，Santa Clara，CA))の厚意により寄
贈された。
バキュロウイルス系で合成されたマウスのrIL-5は、リチャードホデス博士(Dr
．Richard Hodes(National Institutes of Health，Bethesda，MD))の厚意によ
り寄贈された。
E．coliで産生されたマウスのrIL-4(12pg/U)は、A.D.レビン博士(Dr．A．D．L
evine(Monsanto Corporate Research，St．Louis，MO))より寛大にも寄贈された
。
その後FITC標識したモノクローナル抗体を、フローサイトメトリック分析のた
めの染色試薬として用いた。即ちラットIgG1抗マウスIgA、ラットIgG2a抗マウス
IgG2b、ラットIgG2a抗マウスIgG3(Pharmingen，San Diego，CA)、及びラットIgG
1抗マウスIgG1(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)である。モノク
ローナルのラットIgG2b抗マウスFcγRII(2.4G2)(cite:例証)は、腹水より精製し
た。
B細胞の調製及び培養: 小さくて休止期にあるT涸渇B細胞の豊富な群は「スナ
ッパー(Snapper),C．M.およびW．E.ポウル(Paul)，1987，「B細胞刺激因子-1(イ
ンターロイキン4)は細菌のリポ多糖類で続いて刺激することでIgG1を分泌するよ
うに増殖していないマウスのB細胞を調製する。(B cell stimulatory factor-1
（interleukin 4）prepares resting murine B cells to secrete IgG1 upon su
bse quent stimulation with bacterial Iipopolysaccharide)」，J ．Immunol.
139: 10」の記載に従い脾臓より得られた。機能分析は96穴と24穴の平底コース
タープレート(Costar，Cambridge，MA)で行った。細胞は1.25×105細胞/mlの最
終濃度で培養し、6%のCO2を含む加湿大気中において37℃でインキュベートした
。
分泌されたIgイソタイプの計量: Igイソタイプの濃度は「スナッパー(Snapper
)，C．M.およびW．E.ポウル(Paul)，1987，「B細胞刺激因子-1(インターロイキン
4)は細菌のリポ多糖類で追加刺激することでIgG1を分泌するようにマウスの休止
期B細胞を調製する。(B cell stimulatory factor-1（interleukin 4）prepares
resting murine B cells to secrete IgG1 upon subsequent stimulation with
bacterial lipopolysaccharide)」，J ．Immnunol. 139: 10」に記載されている
ようにELISAによって測定した。
＊＊＊＊
膜(m)IgA+細胞のフローサイトメトリック分析は、TGF-βの存在下または非存
在下において、多価抗原受容体架橋剤、αδ-dex及びCD40リガンド、αδ-dex及
びLPS、またはCD40リガンド及びLPSを用いての活性化に応答するIgAクラススイ
ッチを評価するために行った(図1参照)。IL-4及びIL-5も被験組成物のすべてに
添加した。
フローサイトメトリック分析は、「スナッパー(Snapper)，C．M.，F．D．フィ
ンケルマン(Finkelman)，D.ステファニー(Stefany)，D．H.コンラッド(Conrad)
およびW．E.ポウル(Paul)，1988，「IL-4は、リポ多糖類で刺激されたマウスB細
胞によって、内在性の膜IgG1およびIgEの共発現を誘導する。(IL-4 induces co-
expr
ession of intrinsic membrane IgG1 and IgE by murine B cells stimulated w
ith lipopolysaccharide．)」J ．Immunol. 141: 489」に記載されたように行った
。簡単に説明すると、細胞をまずラットIgG2b抗FcγRII mAb(2.4G2)の最終濃度
が5μg/mlになるように20分間インキュベートすることによってFITC標識したモ
ノクローナル抗体の細胞親和性の結合を抑制し、続いて最終濃度が10μg/mlにな
るようにさらに30分間追加した。全ての段階は40℃で行った。蛍光分析は、対数
増幅を用いるFACScan(Becton Dickinson，Mountain View，CA)で行った。生存し
ている細胞が示す特徴的な前方及び側方への分散図と、それらの細胞がヨー化プ
ロピジウム(シグマ社(Sigma))を排除することとに基づいて確認した生存してい
る細胞のみを分析した。
TGF-βの非存在下では、用いた活性化の方法に関わらずmIgA+細胞の有意の誘
導は見られなかった。TGF-β、IL-4、及びIL-5が存在する場合には、B細胞を多
価抗原架橋剤αδ-dexとLPSまたはCD40Lのいずれかとを用いて活性化すると、そ
れぞれ10%及び12%のmIgA+細胞が生成された。このことは、TGF-βの非存在下で
観察されたのに比べてmIgA+細胞のパーセント割合が100倍以上増加したことを示
している。αδ-dexの存在下での共刺激とは対照的に、CD40L+LPSを用いる二重
活性化では比較的低レベルのmIgA+細胞しか生じなかった。
実施例2
この実施例は、LPS活性化されたB細胞またはCD40L活性化されたB細胞のいずれ
かによってIgAクラススイッチが最適に誘導されるためには、多価抗原架橋剤、I
L-4、IL-5、及びTGF-βの非依存性の作用が必要であることを示している。
材料及び方法は実施例1で説明したとおりである。
分泌された膜IgA細胞のパーセント割合は、サイトカインと多価抗原架橋剤α
δ-dexとのさまざまな組合せ、即ち、IL-4、IL-5、IL-4+IL-5、αδ-dex、αδ-
dex+IL-4、αδ-dex+IL-5、及びαδ-dex+IL-4+IL-5(LPS活性化B細胞については
図2Aに、またCD40リガンド活性化B細胞については図2Bに示されている。)を用い
て処理したLPS活性化B細胞及びCD40リガンド活性化B細胞について測定した。
TGF-βはほとんどの組合せの刺激を用いて活性化した培養物でmIgA+細胞の適
度な増加を刺激したが、これらのパーセントは2%を越えなかった。多価抗原架橋
剤
αδ-dex、IL-4、IL-5、及びTGF-βを含む組み合わせが存在する場合のみ、LPS
またはCD40Lのいずれかを用いて活性化することで発生したmIgA+細胞はかなり大
きなパーセント割合であった(それぞれ11.0%及び12.3%)。
実施例3
この実施例は、膜IgA細胞(mIg+)のTGF-β誘導がIgA分泌の選択的な刺激と関連
していることを示している。
材料及び方法は実施例1で説明したとおりである。
B細胞は、IL-4、IL-5、及びTGF-βの存在下で、LPS+αδ-dexまたはCD40L+α
δ-dexのいずれかを用いて共刺激した。抗体のイソタイプ分泌はng/mlで、IgM、
IgG3、IgG1、IgG2b、IgG2a、IgE、及びIgAについて測定した。LPS刺激したB細胞
では、IgAはTGF-βの非存在下では25ng/ml以下しか分泌されず、またTGF-βの存
在下では852ng/ml分泌され、それはIgAの分泌で34倍の増加であった。CD40リガ
ンド活性化B細胞を用いて観察した結果は、より劇的なものであった。TGF-βの
非存在下ではIgAは、25ng/ml以下で分泌した。しかしながらTGF-βを加えるとIg
Aは4,4000ng/mlで分泌され、それはIgA分泌で176倍の増加であった(表1参照)。
IgA分泌がこのように増加することは、ほとんどの他のIgイソタイプの濃度が
有意に抑制される点において選択的であった。この系におけるIgG3およびIgG2b
の分泌の適度な誘導は、TGF-βの存在によって実質的に影響されなかった。
実施例4
この実施例は、多価抗原架橋剤がLPSまたはCD40L活性化細胞の増殖を強く増強
すること、また高濃度のTGF-βの存在下では活発な細胞成長が可能であることを
明らかにしている。
材料及び方法は実施例1で説明したとおりである。
クラススイッチ組換えの誘導は、活性なDNA合成が必要であると思われる（ダ
ニック(Dunnick)，W.およびJ.シュタブニーザー(Stavnezer)，1990,免疫グロブ
リンH鎖スイッチ組換えのコピー選択メカニズム(Copy choice mechanism of imm
unoglobulin heavy-chain switch recombination)，Mol ．Cell．Biol. 10: 397
参照）。したがってTGF-βは、CHα生殖系RNAの誘導によって証明されている(レ
ブマン(Lebman)，D．A.，D．Y.ノムラ(Nomura)，R．L.コフマン(Coffman)および
F．D.リー(Lee),1990,トランスフォーミング増殖因子型β誘導性イソタイプスイ
ッチの間に産生される胚系統免疫グロブリンA転写産物の分子特性(Molecular Ch
aracterization of germ-line immunoglobulin A transcripts produced during
transforming growth factor type β-induced isotype switching)，Proc ．Na tl．Acad ．Sci.
USA．87: 3962参照)とおり、組換えのためのCHα遺伝子を標的にするが
、その抗増殖効果(ケール(Kehrl)，J.H.，A．B.ロバーツ(Roberts)，L．M.ウェ
イクフィールド(Wakefield)，S.ジャコウリュウ(Jakowlew)，M．B.スポーン(Spo
rn)およびA．Sファウチ(Fauci)，1986，「トランスフォーミング増殖因子βは、
ヒトBリンパ球の重要な免疫調節タンパク質である。(Transforming growth fact
or β is an important immunomodulatory protein for human B lymphocytes)」
J ．Immunol. 137: 3855参照)は結果として起こるCHα遺伝子転移のレベルを低
下させる可能性がある。DNA合成のレベルについて記載されたこの系における個
々の成分による関与を調べるために、TGF-βの存在下および非存在下において種
々の組合せの刺激、即ちLPS、LPS+IL-4+IL-5、αδ-dex+IL-4+IL-5、LPS+αδ-d
ex、及びLPS+αδ-dex+IL-4+IL-5に応答する3H-Tdr導入が測定された(図3参照)
。
DNA合成は、4時間以上での[3H]TdRの取り込み(2μCi/ウェル、6.7Ci/nmol、1m
Ci=37GBq、ICN、Irvine、CA)によって測定した。細胞をガラスファイバーフィル
ター上に採集し(PHD細胞採集器、Cambtidge Technology，Watertown，MA)、[3H]
TdRの導入を液相シンチレーションスペクトロメトリーで測定した。
TGF-βの非存在下では、多価抗原受容体架橋剤αδ-dexはLPS活性化細胞によ
る3H-Tdr導入が非常に増強された(図3参照)。IL-4+IL-5の組合せでは、LPSまた
はLPS+αδ-dexのいずれかに応答する増殖に対してほとんど効果がなかった。高
濃度のTGF-βの存在下では、二つのアクチベーターLPS+αδ-dexが存在する場合
にのみ、IL-4+IL-5が存在していようと存在していなかろうと比較的高いレベル
のDNA合成が維持されていた。同様の結果は、CD40LをB細胞アクチベーターとし
てLPSの代わりに用いた場合においても得られた。またCD40LとLPSとを組み合わ
せるとTGF-βの存在下ではIL-4+IL-5に関わらず比較的高レベルの増殖が認めら
れるが、mIgA+細胞のパーセント割合の増加は引き起こされなかった(図1参照)。
したがって増殖が増強されることは、この系における例えばαδ-dexのような多
価抗原受容体架橋剤の役割についての部分的な説明にすぎない。
この系でIgAクラススイッチの高率の誘導をもたらすために多価抗原架橋剤が
必要なことから、これらの培養物でmIgA+細胞の前駆体が培養の開始時にはmIgD+
であること、そのためそれまでにIgAへのスイッチが起こらなかったことが強く
示唆
された。さらにフローサイトメトリックの研究によって、IL-4、IL-5、及びTGF-
βの存在下でαδ-dexとともにCD40リガンドまたはLPSのいずれかを用いて共刺
激を行うと、TGF-βを受け入れていない培養物と比較してmIgA+細胞が100倍以上
増加するに至ることが示されたため、また、培養の4日後までの細胞の全体の拡
張が最良で5倍にすぎなかった(データは示されていない)ため、この系で生じたm
IgA+細胞のパーセント割合をmIgA+細胞の選択的な拡張に基づいて単に評価する
ことは不可能であると思われる。
実施例5
この実施例は、IFN-γがIgAクラススイッチを抑制することを明らかにしてい
る。
材料及び方法は実施例1で説明したとおりである。さらに、チャイニーズハム
スターの卵巣から調製されたマウスのrIFN-γ(77pg/U)は、ゲネンテック社(Gene
ntech(South San Francisco，CA))より親切にも寄贈された。
IFN-γはマウスのB細胞におけるほとんどのIL-4媒介効果を阻害し、そしてIL-
4はIgAクラススイッチを誘導する主要な成分である。したがってIFN-γがこのIg
Aスイッチ系でmIgA+細胞の発生を抑制できるか否かについて調べた(図4参照)。
IFN-γにより、αδ-dex、IL-4、IL-5、及びTGF-βの存在下でLPSまたはCD40
リガンドのいずれかを用いて行う活性化に応答して発生するmIgA+細胞のパーセ
ント割合が強く阻害された。IgAクラススイッチの最適の阻害は100U/mlのIFN-γ
で起こり、CD40L活性化細胞及びLPS活性化細胞ではそれぞれ〜4倍及び〜6倍の抑
制が示された。mIgA+細胞の有意の減少は、IFN-γ 1〜3U/ml程わずかに観察され
た。
実施例6
この実施例において、本発明の組成物を用いたワクチンおよびワクチンアジュ
バントの具体例を提供する。
表IIは、本発明の組成物を用いたワクチンの具体例を示している。表に示した
ように、いくつかのワクチンが共役ワクチンである。共役の方法は、当業者によ
く知られており、「ブランスウィック(Brunswick)ら、J.Immunol.140:3364(1988)」
、「ウォング(Wong),S.S.、蛋白質の共役および架橋の化学(Chemistry of Prote
in Conjugates and Crosslinking),CRC Press,Boston(1991)」、および「ブレ
ンケリー(Brenkeley)ら、染料、ハプテンおよび架橋剤を用いる蛋白質共役物の
調製のための方法の簡単な概説(Brief Survey of Methods for Preparing Prote
in Conjugates With Dyes,Haptens and Cross-Linling Agents)Bioconjugate Ch
emistry,3,No.1(Jan.1992)」のヘテロライゲーション技術を含む。これらは、特
に参照として本明細書に含まれる。
多価担体が、インビトロで用いられる多価結合体（すなわち、抗IgD-dex）と
置き換えられる。このような担体は、例えば、デキストラン、またはニューモコ
ッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス(streptococci)、もしくはメニンゴ
コッカス(meningococci)などの細菌由来の被覆多糖のような多糖でありうる。多
糖は、目的とする使用により、ワクチンと医学的に関連したものである場合とそ
うでない場合がある。
サイトカインは、GM-CSF、IL-3、IFN-γ、またはそれらの組合せである。
本実施例は、限定することを目的とするものではなく、本発明の明細書を考慮
し本発明を実施することにより、その他のタイプのワクチンが当業者には明らか
になると思われる。
＊＊＊＊＊＊
要約すると上記に記載した実験結果は、サイトカインTGF-β、IL-4、及びIL-5
またはIL-2のいずれかの存在下で、この実験モデルにおける例えばデキストラン
複合化抗Ig抗体のような多価抗原受容体架橋剤とCD40リガンドまたはLPSのいず
れかとを用いて活性化したB細胞が高率のIgAクラススイッチを誘導することを示
している。この誘導はIFN-γによって特異的に阻害される。
本発明を完全に開示してきたが、本明細書に記載された本発明の本旨および範
囲から逸脱せずに多くの変更および修飾がなされうることは当業者には明らかで
あると思われる。添付の請求の範囲は、本発明を制限するためのものではない。
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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