JPH09507055A

JPH09507055A - Ｂリンパ球による抗体放出を刺激するための組成物および方法

Info

Publication number: JPH09507055A
Application number: JP7513925A
Authority: JP
Inventors: クリフォードエム．スナッパー; ジェームズジェイ．モンド
Original assignee: ヘンリーエム．ジャクソンファウンデーションフォーザアドバンスメントオブミリタリーメディスン
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1997-07-15
Also published as: AU699913B2; WO1995013089A1; US5932427A; AU1051195A; EP0728013A4; EP0728013A1; CA2176115A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、B細胞による抗体の放出を剌激するために有用な、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン−3(IL-3)、またはそれらの組み合わせを添加することを含む組成物を開示する。該組成物、薬学的組成物、ワクチン、およびワクチンアジュバントの使用方法も開示される。さらに、本発明は、B細胞による抗体放出を刺激することかできる化合物を同定するために有用なアッセイ系も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂリンパ球による抗体放出を刺激するための組成物および方法関連出願の相互参照本出願は、1993年11月10日に出願された出願番号08/150,510の一部継続出願である。該出願は、参照として本明細書に含まれる。政府の利益本明細書に開示された本発明は、発明者または譲受人に実施料を支払うことなく、政府の目的のために製造され、認可され、使用されうる。発明の属する技術分野本発明は、単独または組合せの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM- CSF)およびインターロイキン−3(IL-3)を含む組成物、ならびに単独または組合せのGM-CSFおよびIL-3と、インターフェロン−γ(IFN-γ)とを含む組成物に関する。本組成物は、哺乳類Bリンパ球による抗体の放出を刺激するために有用である。本発明はまた、Bリンパ球による抗体放出を刺激する組成物を同定するためのインビトロアッセイ系にも関する。 Bリンパ球による抗体放出の刺激は、感染および疾患の心身に有害な効果を予防し、治療し、および／または改善するための戦いにおいて有用である。この有用性は、正常な状態および免疫不全や免疫抑制の状態において、哺乳類の免疫反応を増強するためのアジュバントへと拡がる。該新規組成物は、ヒト免疫系を増強するための他の免疫治療と併用することも可能である。発明の背景ヒトの免疫系には、非常に多くの異なるタイプの細胞が含まれる。それらの細胞は、重複する機能を有し、協調作用により病気や疾患から人の身体を防御する。免疫系の細胞は、複雑な複数の機能を有し相互に関連しあっている。 GM-CSF、IL-3、およびIFN-γはすべてサイトカインである。「サイトカイン(c ytokines)」とは、Bリンパ細胞およびTリンパ細胞(「B細胞」および「T細胞」)ならびにナチュラルキラー(「NK」)細胞のような免疫系細胞の反応を調節する化合物の一つのクラスである。「サイトカイン(cytokine)」は、ある細胞集団が誘導物質（インデューサー）と接触したときに放出する、細胞間の伝達物質（メディエーター）として作用する非抗体のタンパク質に対する総称である。「リンホカイン」とは、特異的抗原またはその他の刺激と接触したときに感作リンパ球から放出される可溶性物質であり、効率のよい細胞性または体液性免疫を促進する。「サイトカイン」および「リンホカイン」という用語は、互換的である。これらの化合物の命名を単純化しようと試み、1979年に開催された第二回国際リンホカインワークショップ(the Second International Lymphokine Workshop)における参加者集団が、「インターロイキン」、略して「IL」という用語を提唱し、異なるリンパ球群の間の伝達シグナルとして作用するタンパク質の能力に基づく統一的な命名法を創り出した。現在までに、21の異なるサイトカインが同定されており、それらはすべてではないがほとんどがT細胞から産生される。各々が、区別された分子構造を有し、異なる役割を果たす。数多くの既知のサイトカインが、B細胞に対して明白な活性を有することが示されている。インビトロにおいて、リンホカインIL-1、IL-2 、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ、およびTGF-β(形質転換増殖因子β)が、B 細胞増殖、免疫グロブリン分泌を増強し、または分泌されたIgのサブクラスへの影響において役割を果たすことが示されてきた。研究中の系によると、上記のリンホカインのうちの一つまたは複数を添加することにより、インビボ抗体産生が増加するか、または分泌抗体のアイソタイプ(例えば、IgG、IgM、IgE、IgAなど) が変化することが示されている。B細胞増殖に影響を与えることが報告されているリンホカインには、IL-1、IL-2、IL-4、およびIL-10が含まれ、B細胞分化およびIg分泌に影響を与えるものにはIL-2、IL-5、IL-6、TGF-β、およびIFN-γが含まれる。インビトロのIg分泌を増強することが報告されているサイトカインのうちいずれも、インビボでは顕著な役割を果たさないことが示されている。したがって、 IL-2、IL-5、IL-6、またはIFN-γに特異的なモノクローナル抗体を注入しても、抗原により刺激される抗体産生は有意には抑制されない。このことは、生理的条件下においてはB細胞分化が直接的なT細胞との相互作用にのみ依存するか、またはその他の未知のサイトカインがこの過程を媒介するということを示している。 T細胞活性化を刺激する抗原（いわゆるT依存性抗原、または「TD」抗原）に対する免疫反応は、T細胞がB細胞と直接的に相互作用しIg分泌を引き起こすことによるが、これは、T細胞活性化を誘導することができない抗原には当てはまらない。T細胞非依存性抗原(「TI」抗原)は、直接的に、または間接的にさえT細胞の補助を受けずに、高レベルの抗体産生を誘導する。したがって、B細胞分化およびTI抗原に対する免疫グロブリン分泌を調節する過程は、他の未知の経路によることは間違いない。免疫グロブリン分泌を引き起こすB細胞分化は効果的な体液性抗体系の基礎となる最終段階であり、したがってこの段階を調節する過程またはサイトカインを明らかにすることは、免疫反応を増幅または抑制するための方法を設計するにあたり極めて貴重である。本発明の理解を促進するため、背景として、免疫グロブリン、抗体、リンパ球、B細胞、T細胞、およびNK細胞の主要な既知の機能について簡単な説明を以下に記載する。B細胞増殖または抗体分泌に影響を与えることが報告されているサイトカイン、すなわちIL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TGF-β、およびIFN -γの既知の活性についての簡単な要約も提供する。GM-CSFおよびIL-3の既知の活性についての簡単な要約も提供する。参照文献には、「Fundamental Immunolo gy,Second Edition,William E.Paul,M.D.,ed(Raven Press,New York 1989)」、「Fundamental Immunology,Third Edition,William E.Paul,M.D.,ed(Raven Pres s,New York 1993)」、「Interferon:Principles and Medical Applications,S.B aron et al.,eds.(The University of Texas Medical Branch at Galveston,Gal veston,Texas 1992)」、「The Cytokine Handbook,Angus Thomson,ed.(Academic Press Inc.,San Diego,CA 1992)」、および「The Cytokine Handbook,Second E dition,Angus Thomson,ed.(Academic Press Inc.,San Diego,CA 1994)」が含まれ、これらはすべて参照として特に本明細書に含まれる。ヒトを含め、哺乳類は、日常的に無数の微生物と出会っている。これらの微生物による感染から宿主を防御するために重要な役割を果たす免疫系の主要な成分が、体液性抗体である。抗体は、免疫グロブリンとしても知られるタンパク質分子であり、それらの産生を刺激する外来粒子に対して精妙な特異性を有する。例えば、「細菌A」の全身性の感染により、「細菌A」に高いアビディティで結合するが、「細菌B」には結合しない抗体が誘導される。同様に、「細菌B」は、「細菌A」とは交差反応しない抗「細菌B」抗体を誘導する。免疫グロブリン(Ig)は、構造的に関連したタンパク質の一つのクラスであり、 2対のポリペプチドからなる。1対は軽(L)［低分子量］鎖（κまたはλ）、もう1 対は重(H)鎖（γ、α、μ、δ、およびε）であり、4本はすべてジスルフィド結合で結合している。H、L鎖ともに、抗原の結合に寄与し各々のIg分子により極めて変化する領域を有する。さらに、HおよびL鎖は、一定または定常である領域を有する。H鎖の構造上の性質および抗原性に基づき、Igは、IgG、IgA、IgM、IgD 、およびIgEアイソタイプに分類される。H鎖における違いに基づくIgGのサブクラスは、IgG1などと呼ばれる。リンパ球は、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃、パイエル板（小腸組織）のような体中のリンパ組織、そして時には骨髄で形成される白血球である。個々のリンパ球は、構造が関連した抗原からなる限定された一群に反応することを委任されているという点で、専門化されている。この委任(commitment)は、免疫系がある抗原に最初に接触する前に存在し、リンパ球の細胞膜上の抗原特異的レセプター（すなわち、免疫グロブリン）の存在により発現されている。生物が実際にいかなる抗原にも反応できるのは、極めて多くの異なるリンパ球のクローンが存在し、その各々が異なる抗原に特異的なレセプターを有するためである。したがって、リンパ球は極めて不均一な細胞の集合である。リンパ球は、互いにそのレセプターの特異性が異なるだけでなく、機能面の性質も異なる。二つの広いクラスのリンパ球、Bリンパ球およびTリンパ球が知られている。この二つのクラスに加え、ある「非特異的な」細胞毒性反応を媒介するリンパ球も知られている。これらには、ナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。「B細胞」としても知られるBリンパ球は、一連の複雑な分化過程を経て造血幹細胞から由来するリンパ球の一つの型であるが、その分化過程は、部分的にしか解明されていない。B細胞は抗体分泌細胞の前駆体であり、したがって免疫グロブリンの産生を担っている。B細胞の細胞表面レセプターは、細胞表面に発現するための特別な抗体または免疫グロブリン(Ig)分子である。新たに分化したB細胞は、始めはIgMクラスの表面Igのみを発現する。B細胞の成熟と関連して、B細胞表面に他の免疫グロブリンアイソタイプが出現する。サイトカインに反応して抗体を放出するためには、B細胞はまず活性化されなければならない。B細胞を活性化するには多くの方法があり、それらには、抗原による膜Ig分子の架橋(架橋依存性B細胞活性化)、T細胞(ヘルパーT細胞、もしくは例えばCD40リガンドのようなヘルパーT細胞関連分子)との直接的な接触、またはマイトーゲンとの接触などが含まれる。このような接触において、抗原はエピトープを提示し、それをB細胞の細胞表面Igが認識する。各B細胞は、同一の可変領域を有する複数の膜Ig分子を有するため、細胞表面レセプターの高レベルの架橋により、最適な膜Igによる架橋活性化が達成されるが、これには抗原が細胞表面Igにより認識されるエピトープを複数提示する必要がある。多くの単純なタンパク質抗原はこの能力を持たないが、その必要性は、多糖や、微生物表面やDNAのような、繰り返しエピトープを有するその他の抗原により満たされる。これらの抗原には、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス(streptococci)、およびメニンゴコッカス(meningococci)のような、多くの医学的に重要な微生物の被覆多糖が含まれる。膜Igの架橋は、B細胞の除去または不活化も引き起こしうるという多くのデータがある。一般的に、ある型のレセプター架橋過程が、特異的刺激シグナル非存在下で起こった場合、活性化ではなく不活化が引き起こされると考えられている。多糖に発現した高度に反復性のあるエピトープは、共刺激が存在しなくても活性化を引き起こしうる。これはおそらく、そのレセプターを介した刺激が大きさためである。 Tリンパ球、または「T細胞」は、寿命が長い（数ヶ月から数年）、免疫学的に重要な胸腺細胞由来の細胞であり、細胞性免疫を担う。T細胞は、「ヘルパーT細胞」、「サプレッサーT細胞」および「キラーT細胞」として知られる機能が異なる集団からなる。遅延型過敏症やそれに関連した免疫現象に関与するT細胞もまた知られている。ナチュラルキラー細胞、または「NK細胞」は、ある種の「非特異的な」細胞毒性反応を媒介するリンパ球である。このような非特異的な細胞毒性は、TまたはB細胞により用いられるのとは異なる認識系を用いて、ある形態の腫瘍細胞を殺傷する。接触相互作用を通したある細胞型による別の細胞型の殺傷は、免疫系の自己防衛の主要なエフェクター兵器(effector arm)となる。これらの細胞に加えて、その他の成分、サイトカインが、宿主を防御するために重要な役割を果たす。サイトカインのうちの一つのグループが、インターロイキンである。 IL-1は主に炎症性サイトカインであり、IL-2およびその他のサイトカインは主にリンパ球に対する成長因子である。IL-1は、単球により合成されるポリペプチドホルモンである。炎症、損傷、抗原投与、または感染の間、IL-1は合成され、そしてその複数の生物学的性質により、該サイトカインは病気の病原に影響を与えるようである。IL-1は、動物における低血圧およびショックの強力な誘導因子である。IL-1は視床下部に作用して発熱を誘導し、骨格筋に直接作用してタンパク質の代謝を促進する。 IL-2は、T細胞増殖因子としても知られ、Tヘルパーリンパ球およびTサプレッサーリンパ球両方により産生されるリンホカインでありポリペプチドホルモンである。該サイトカインは、T細胞、B細胞、NK細胞、リンホカイン活性化キラー(L AK)細胞、単球、マクロファージ、および乏突起膠細胞に直接効果を及ぼす。 IL-3は、マルチコロニー刺激因子として知られ、造血系の数多くの標的細胞に作用する。このサイトカインは、造血系増殖因子(HPGFs/Hematopoietic growth factors)のうちで最も広い特異性を有し、造血幹細胞（すなわち、血球の前駆体）の発生および分化を刺激し、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、巨核球、および赤血球を生成させることができる。 IL-3とB細胞との関係は、本発明前には明らかでなかった。実際、1994年には、IL-3の標的細胞の範囲に、T-およびB-リンパ球系列に委任された細胞は含まれず、IL-3がB細胞の分化に重要な直接的な効果を有するという確かな証拠は存在しないと考えられていた。「J.W.Schrader,"Chapter 5:Interleukin-3,"The Cyt okine Handbook,2nd Ed.,Angus Thomson,ed.,page 84(Academic Press,New York ,1994)」参照。 IL-3はT細胞および肥満細胞により合成されるが、B細胞によるIL-3の分泌は報告されていない。いくつかの報告により、IL-3が、SAC（ポリクローナル活性化因子）およびIL-2で活性化されたヒトB細胞によるIg分泌をわずかに強化しうることが示された。例えば、「Xia et al.,"Human Recombinant IL-3 is a Growth Factor for Normal B Cells",J.of Immunology,148,491-497(1992)」は、IL-3 がB細胞を多く含む細胞群の増殖を増加させることを報告している。同様に、「T admori et al.,"Human Recombinant IL-3 Stimulates B Cell Differentiation" ,J.of Immunol.,142,1950-1955(1989)」は、IL-3が、B細胞を含む扁桃細胞からのIgG分泌、または細菌性抗原により活性化された末梢血由来の濃縮B細胞群中の IgG分泌を刺激することを報告している。さらに、「Matsumoto et al.,"Inducti on of IgE Synthesis in Anti-IgM-Activated Nonatoic Human B Cells by Reco mbinant Interleukin-3",Int.Arch.Allergy Appln.Immunol.,89,24-30(1989)」は、ヒト組換え体IL-3が、正常B細胞、またはTリンパ球とBリンパ球の混合物によるIgE合成を増加させ、そしてIL-1、IL-2、IL-5、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CS F、およびIFN-γがIgE合成を誘導できないことを報告した。松本(Matsumoto)らはまた、IgE合成の誘導を担うT細胞上清中の因子として決定的にIL-3を同定することはできないということも述べている。なぜなら、その活性が、抗IL-3抗体の添加により抑制されないからである。上記の結果のように、IL-3を介した細胞増殖の増強は説明されている。これらの実験において、B細胞は電子工学的に分類されておらず、したがって高度には精製されていない。したがって、Ig増加効果は、群中の多くの混入した非B、非T 細胞に対するIL-3の作用を反映したものである可能性があり、IL-3が直接B細胞に作用するのか否かはこれらの実験からは決定できない。さらに、以前の研究において、B細胞は、大きさによって分画されていない。したがって、B細胞の活性化前の状態に対する可能性が、不明である。さらに本発明と対照的に、「Kimoto et al.,"Recombinant Murine IL-3 Fails to Stimulate T or B Lymphopoiesis In Vivo,But Enhances Immune Responses To T Cell-Dependent Antigens"J.of immunology,140,1889-1894(1988)」は、ネズミ組換え体IL-3を含む浸透性ミニポンプを有するマウスでは、リンパ組織中の B細胞およびT細胞の総数が増加しないことを報告した。さらにキモト(Kimoto)らは、IL-3はリンパ球やその前駆体には直接作用しないが、おそらくアクセサリー細胞に作用することにより、T細胞依存性抗原に対する体液性免疫反応を起こすことができると示唆している。 IL-4は、B細胞刺激因子1(BSF-1)およびB細胞分化因子としても知られる糖タンパク質である。その機能は、B細胞増殖、Igクラススイッチ、T細胞の増殖と分化、およびマクロファージ活性化の共刺激、肥満細胞増殖の調節、ならびに造血系前駆細胞の共刺激である。 IL-5は、B細胞増殖因子II(BGF-II)、T細胞置換因子、IgA-増強因子、および好酸球コロニー刺激因子としても知られ、Tリンパ球および肥満細胞により産生される糖タンパク質である。該サイトカインは、コロニー刺激因子の機能および骨髄における好酸球コロニー分化の促進という二重の機能を有する。IL-5は、インビボで抗原でプライムしたB細胞による特異的なインビトロ抗体産生を誘導する。IL-5はインビトロで分化因子として働くが、インビボでは分化因子として作用しないようである。 IL-6は、BSF-II、インターフェロンβ2、ハイブリドーマ／骨髄腫増殖因子、および肝細胞刺激因子としても知られ、リンパ球と非リンパ球の両方で産生される糖タンパク質である。該サイトカインは、免疫反応、急性期反応、および造血を調節する。IL-6は、mRNAのレベルでB細胞系に作用し、分泌型Igの生合成を誘導する。IL-5に加えて、IL-6もまた、非常に制限された条件下で分化因子として機能することが示されている。これまでに試験されているその他のT細胞またはマクロファージ由来因子はいずれも、増殖因子を添加しなければ、活性化B細胞を誘導してIgを分泌させることができない。 IL-10は、サイトカイン合成阻害因子としても知られ、T細胞、マクロファージ、およびその他の細胞型により産生される。該サイトカインは、いくつかのマクロファージ機能を阻害する。そのマクロファージ機能には、サイトカイン合成、いくつかの微生物に対する活性、さらに肥満細胞およびB細胞の増強または刺激が含まれる。IL-10は、抗CD40抗体または抗原レセプターの架橋により活性化されたヒトB細胞の強力な増殖を引き起こす。インターロイキンに加え、他のサイトカインも特徴が決定されている。コロニー刺激因子(CSFs)は、主に造血に関わる因子群である。それらは、インビトロの骨髄細胞のクローン増殖を刺激するタンパク質と定義されている。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、糖タンパク質増殖因子であり、造血系細胞の増殖または分化を調節する。この増殖因子は、異なる環境において、多くの異なる細胞により産生される。それらの細胞には、T細胞、マクロファージ、内皮細胞、ストローマ細胞、繊維芽細胞、肥満細胞などが含まれる。GM-CSFの主要な作用には、顆粒球−マクロファージ群における生存、分化、および増殖や機能の活性の調節が含まれる。本発明前には、GM-CSFがB細胞による抗体の放出を刺激しうるということを示す報告はなされていない。最後に、体内の免疫系で機能するサイトカインのもう一つのクラスが、インターフェロン(IFNs)である。IFNsは、ウイルス複製を阻害し、さらに他の多くの重要な効果を細胞に及ぼすことにより、抗ウイルス防御の最初の系に対して大きく寄与する。IFNsは、直接的に作用して細胞を感染から防御するのではない。むしろそれらは、近傍の細胞において、ウイルスの増殖を停止させるタンパク質の産生を刺激し、それにより細胞を感染から防御する。 IFNsは、由来する細胞および誘導の方法により、α、β、およびγという3つの群に分類される。IFN-αおよびIFN-βの産生は特別な細胞機能ではなく、おそらく生体の全ての細胞がこれらのIFNsを産生することができる。いかなる細胞においても行われるIFN-αおよびIFN-βの合成と対照的に、IFN- γの産生はT細胞およびNK細胞の機能である。全てのIFN-γ誘導因子が、ポリクローナルな方法（マイトーゲンまたは抗体）、またはクローンにより制限された抗原特異的な方法のいずれかで、T細胞を活性化する。ヒトIFN-γは、活性化されたヒトB細胞の増殖を促進し、そしてヒトB細胞の培養液中において、IL-2との共同作用により免疫グロブリン軽鎖の合成を増加させる。様々なヒト免疫系細胞の機能、ならびにIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6 、IL-10、GM-CSF、およびIFN-γの既知の活性について簡単な説明を記載したが、それはヒト免疫系の著しい多様性を例示している。しかし、この程度の情報が存在するにも関わらず、免疫系の複雑さは完全には理解されていない。非常に大きな隙間が残っている。例えば、サイトカインは免疫系細胞の反応を調節することにより細胞間伝達物質（メディエーター）として作用するということ以外に、サイトカインの性質を一般的に説明することは不可能である。したがって、該技術分野では依然として、免疫系のより深い理解、およびさらなる特別な免疫系疾患の治療方法の提供が必要とされている。発明の概要本発明は、当業界における、新規の改良された免疫治療の必要性に応えるものである。IL-3、GM-CSF、およびIFN-γを用いた新規の組成物および方法により、改良された新規の免疫系疾患の治療、および現在の免疫治療のためのアジュバントが可能となる。本発明は、B細胞による抗体放出の刺激のために有効な量で存在する、単独または組合せのGM-CSFおよびIL-3の組成物に関する。GM-CSFまたはIL-3の分子工学的な断片もまた、本発明において用いられうる。本発明のもう一つの目的は、すべてがB細胞による抗体放出の刺激のために有効な量で存在する、IFN-γと共に用いる、単独または組み合わせいずれかのGM-C SFおよびIL-3の組成物である。本発明のさらにもう一つの目的は、新規組成物と薬剤学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。 B細胞による抗体放出の刺激のための、GM-CSF、IL-3、およびIFN-γを含む新規組成物の使用もまた、本発明に含まれる。B細胞による抗体放出を刺激する方法は、正常または免疫不全の状態において、例えば予防接種などに対する哺乳類の免疫反応を改善するために用いることができる。本発明のさらにもう一つの目的は、ワクチンのためのアジュバントとしての新規組成物の使用である。例えば、現在、多くのワクチンが、血液系に存在する免疫系細胞を迅速に刺激するために、静脈注射または筋肉内注射により投与されている。担体分子と共有結合した融合タンパク質として、混合して、またはその他の組合せの形態で、新規組成物を投与されるワクチンと併用することにより、抗体の反応の大きさを、全身レベルおよび局所レベルいずれにおいても増加させることができる。本発明のもう一つの目的は、自己免疫疾患のように、抗体の産生が病原性である状態における、GM-CSF、IL-3、およびIFN-γの中和である。本組成物はまた、インビトロまたはインビボのモノクローナル抗体産生の最適化にも用いることができる。例えば、動物をインビボで抗原と組成物とで感作することができる。また、インビトロにおける抗体を産生させるためのリンパ球の刺激または感作は、新規組成物の存在下で強化されうる。これは、ヒトモノクローナル抗体の産生にとって特に有用である。本発明はまた、B細胞による抗体放出を刺激するために有用な組成物の同定を可能にする、新規のアッセイ系に関する。インビボの抗体刺激を模倣する本アッセイ系は、デキストラン−結合抗Ig抗体、および高度に精製されたB細胞を含む。抗Ig-デキストラン結合体は、インビボの抗原により誘導されるB細胞の活性化に匹敵する機構で、膜Igを介して効率的に、かつポリクローナルにB細胞を活性化する。本発明のその他の目的および利点は、一部は以下の説明で開示され、一部は上記の説明から明らかとなり、または本発明の実施により明らかになるであろう。本明細書に含まれ、その一部を構成する添付の図面および表は、例を示し、本説明と共に、本発明の原理を説明するために役立つであろう。図面の簡単な説明図１：様々な培地におけるB細胞によるIgM分泌(ng/mg)を測定した。培地は、図の左側に挙げた。試験した組成物は、デキストラン−結合抗IgD抗体、IL-1、およびIL-2を含む培地において、最高のIgM分泌を示した。この培地に、親出願に開示した細胞培養上清、RA5-SN、およびGM-CSFまたはIL-3を添加した。対照の組成物もまた、測定した。GM-CSFとIL-3の両方を有するRA5-SN上清が、その他の被験組成物と比較して、B細胞による有意なIgM分泌を示した。図2 ：様々な濃度のIL-3またはGM-CSFの存在下または非存在下で、デキストラン −結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で、B細胞を活性化した。IgM分泌は、培養開始から6日後にELIZAにより測定した。図3 ：様々な濃度のGM-CSFおよびIL-3を添加して、活性化B細胞によるIgM分泌(ng /mg)を測定した。10U/mlのGM-CSFおよび約3U/mlのIL-3を添加した場合に、約465 0ng/mlという最高のIgM分泌が得られた。図4 ：IL-3(10U/ml)またはGM-CSF(10U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン−結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で、B細胞を活性化した。さらに、抗IL-3抗体(10μg/ml)および／または抗GM-CSF抗体(10μg /ml)を添加した。抗IL-3または抗GM-CSFを添加しない対照も調製した。IgM濃度は、培養開始から6日後にELIZAで測定した。図5 ：AF7上清におけるデキストラン−結合抗IgD抗体により活性化されたB細胞について、活性化B細胞によるIgM分泌(ng/ml)を測定した。IgM分泌は、IL-1、IL-2 、αIL-3、およびαGM-CSFのうちの二つまたはそれ以上を含む様々な培地で測定した。図6 ：IL-3(100U/ml)および／またはGM-CSF(100U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン−結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml) で、B細胞を活性化した。培養開始から4日目に、血球計数器を用いて生存細胞（トリパンブルーを排除する細胞）を計数した。複製培地中のIgM濃度は、培養開始から6日後にELIZAで測定した。データは、一対の培地の平均の平均＋/−標準誤差として表した。図7 ：IL-3(100U/ml)およびGM-CSF(100U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン−結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で、B細胞を活性化した。複製培地中のIgM濃度は、対照の組成物、0hにIFN-γを添加した組成物、および24hにIFN-γを添加した組成物について、ELIZAで測定した。データは、一対の培地の平均の平均＋/−標準誤差として表した。好ましい態様の説明本発明は、単独または組合せで、B細胞による抗体分泌を100倍増強する、サイトカインの組成物を開示する。本組成物は、B細胞による抗体放出を刺激するために有効な量で存在する、単独または組合せのIL-3およびGM-CSFを含む。また、いずれもB細胞による抗体放出を刺激するために有効な量で存在する、単独または組合せのIL-3およびGM-CSF、ならびにIFN-γを含む組成物も、本発明に含まれる。より好ましくは、本組成物はさらに、CD40リガンド(CD40L)もしくは少なくとも一つのその他のサイトカイン、またはそれらの組合せを含む。もっとも好ましくは、本組成物は、GM-CSF、IL-3、またはそれらの組合せ、IFN-γ、CD40L、およびIL1＋IL2を含む。 IL-3またはGM-CSFを介したIg分泌の増加は、典型的には10〜50倍の間の範囲であり、IL-3およびGM-CSFの組合せは、100倍までの増加を誘導する。好ましくは、GM-CSFおよびIL-3は、インビトロで約1から約10U/mlで存在する。当業界でよく知られているように、インビボの量は適当に引き上げられる。より好ましくは、GM-CSFおよびIL-3は、約10から約100U/mlで存在し、特に約100U/mlで存在する。B細胞刺激剤としてのIL-3、GM-CSF、およびIFN-γの同定本発明前には、GM-CSFまたはIL-3が、直接B細胞に作用して抗体の放出を刺激するということ、またはGM-CSFおよびIL-3が共同で直接B細胞に作用して抗体の放出を刺激するということは知られていなかった。さらに、GM-CSFは、成熟B細胞の機能を直接調節することに関与しているとはされていなかった。刺激の24時間後にIFN-γを添加することにより、それ自体が最適な抗体分泌を刺激しうるということも、またそれにより単独または組合せのIL-3およびGM-CSFの活性が増強されるということも知られていなかった。親出願第08/150,410号に開示した組成物は、IL-3およびGM-CSFを含んでいた。初期実験で、電子工学的に分類し高度に精製したB細胞のIg分泌反応が、少数の「非T、非B」細胞を含有するB細胞を濃縮した群よりも、有意に低いということを決定した。これらの発見に基づき、最初の出願は、NK細胞および／またはNK細胞由来サイトカインが、抗Ig−デキストラン刺激B細胞におけるIg分泌を増加させうるということを示した。親出願はまた、B細胞によるIg分泌を増加させるT細胞クローン(TH1またはTH2) 由来の上清を開示した。実験で、この増加が、IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、または IL-10によるものではないことを決定した。驚くべきことに、分化誘導活性が、G M-CSFおよびIL-3の存在によることが見出された。GM-CSFおよびIL-3を抗Ig−デキストラン刺激細胞に添加した場合、Ig分泌が誘導された。逆に、抗GM-CSFおよび／または抗IL-3を添加した場合は、T細胞上清の刺激活性が消失した。 Ig分泌が、IL-2の添加により、培養の24時間後のIFN-γの添加により、または IFN-γとIL2の添加により、さらに増加することもまた見出された。Ig分泌の最大レベルは、培養開始時にIL-2、IL-3、およびGM-CSFを抗Ig−デキストラン刺激細胞に添加した場合、およびIFN-γを1日後（抗Ig−デキストランによる刺激から24時間後）に添加した場合に誘導された。B細胞活性化の直後にIFN-γを添加した場合は、IL-3またはGM-CSFの刺激効果は、全く、または極めて僅かにしか増強されなかった。このように、IFN-γを添加するタイミングは、B細胞による抗体放出のさらなる増加にとって重要である。この発見は、本発明前には報告されていなかった。 IL-3もしくはGM-CSF、またはIL-3とGM-CSFの組合せの活性が、TH1またはTH2由来上清の分化活性の原因であるか否かを決定するため、中和を起こす量の抗IL-3 抗体または抗GM-CSF抗体を添加し、Ig分泌に対する効果を解析した。各抗体がIg 分泌を有意に抑制したが、抗IL-3および抗GM-CSFの組合せは、TH1-またはTH2-由来上清の存在下における抗Ig−デキストラン刺激細胞のIg分泌を80％以上抑制した。 IL-3およびGM-CSFが、B細胞によるIg分泌を増加させることができ、抗IL-3と抗IL-GM-CSFの組合せがIg分泌を抑制しうるという発見は、全く予想外のものであった。さらに、培養開始から24時間後に添加したIFN-γが、IL-3およびGM-CSF の刺激効果を増強するということも、驚くべきことであった。これらの発見は、以前には報告されていなかった。薬学的組成物薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。そのような組成物は、単独または組合せの、有効量のIL-3およびGM-CSFを、薬剤学的に許容される担体とともに含む。単独または組合せの、有効量のIL-3およびGM-CSF、さらに有効量のIFN-γを、薬剤学的に許容される担体とともに含む薬学的組成物も、本発明に含まれる。治療は、薬学的組成物を静脈注射、腹腔内注射、皮内注射、関節内、心室内(i ntraventricular)、包膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、膣内、経口、またはその他の適当な投与方法によって投与することを含む。本組成物は、特定の部位への筋肉内注射または皮下注射などにより、局所適用することもできる。いかなる薬剤学的に許容される担体も、GM-CSF、IL-3、およびIFN-γに対して用いることができる。担体は、水、油のような無菌的な液体でありうる。油には、石油、動物油、植物油、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。静脈注射には、水が好ましい担体である。生理食塩水、水溶性デキストロース、およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための水性担体として用いられる。適当な薬剤学的担体は、「Remington's Pharmaceutical Sciences,18th E dition(A.Gennaro,ed.,Mack Pub.,Easton,Pa.,1990)」に記載されており、これは参照として本発明に含まれる。本組成物を含むワクチンアジュバント本発明はまた、本発明の組成物を含有するワクチンアジュバントを含む。多くのワクチンが、現在、血液系に存在する免疫細胞を急速に刺激するために、静脈注射または筋肉内注射により投与されている。本新規組成物を薬剤と組み合わせて投与することにより、局所的にも、全身的にも、抗体反応の大きさが増加する。インビトロアッセイにおいて、抗IgM抗体または抗IgD抗体が、デキストランのように多価の状態で存在するとき、効率よく作用しすべてのB細胞を活性化する。この高レベルの活性化を、高度に精製されたB細胞の使用と結びつけることにより、B細胞による抗体放出を刺激する化合物の同定が可能となる。しかし、この反応はインビボでは望ましくない。患者にとって、目的は、抗原に対して特異的なレセプターを有する少量のB細胞のみを活性化することである。ワクチンの特異的な抗原は、架橋特異的B細胞レセプターに対して作用する。対照的に、抗I g−デキストランを用いたインビトロのモデルは、全ての抗原レセプターを架橋するように作用する。好ましくは、ワクチンアジュバントとして用いるとき、本発明の組成物は、デキストランまたは細菌の被覆多糖のような多価担体分子に結合させられる。ニューモコッカス、ストレプトコッカス、およびメニンゴコッカスの被覆多糖が好ましい。GM-CSF、IL-3、GM-CSFまたはIL-3の活性を保持しているGM-CSFまたはIL-3 の分子工学的断片、またはそれらの組合せを、独立に多価の担体に結合させることができる。また、GM-CSFおよびIL-3は互いに融合させるか、または他のタンパク質と融合させ、融合タンパク質を形成させることができ、それをさらに多価の担体に結合させることができる。他のワクチンの変型は、当業者にとって明らかであろう。本出願は、サイトカインをゆっくりと、しかし持続的に輸送することができる、抗サイトカイン−サイトカイン複合体の使用を含む。複合体は、ワクチンの抗原との混合物として、またはワクチンの抗原に結合させて、投与することができる。さらにもう一つの態様において、ワクチンアジュバントは、CD40L、またはGM- CSF、IL-3、もしくはIFN-γ以外の一つまたは複数のサイトカイン、またはそれらの組合せを含みうる。CD40L、および一つまたは複数のサイトカインは、多価の担体に結合させることもできる。共役ワクチンに用いられる組成物ワクチンの抗原と本発明の組成物を、デキストランまたは細菌の被覆多糖などの多価の担体分子に結合させて、共役ワクチンを形成することができる。ニューモコッカス、ストレプトコッカス、およびメニンゴコッカス被覆多糖が好ましい。抗原は、種痘しようとする疾患に特異的なペプチドまたはタンパク質である。ワクチンを投与した際の体液性免疫反応をさらに最適化するために、CD40または少なくとも一つのその他のサイトカイン、またはそれらの組合せを多価の担体に結合させることができる。表IIIは、本発明の組成物を使用したワクチンを例示している。表中に示されている通り、ワクチンのいくつかは共役ワクチンである。共役の方法は、当業者に周知であり、それは「Brunswick et al.,J.Immunol.140:3364(1988)」、「Won g,S.S.,Chemistry of Protein Conjugates and Crosslinking,CRC Press,Boston (1991)」、および「Brenkeley et al.,"Brief Survey of Methods for Preparin g Protein Conjugates With Dyes,Haptens and Cross-Linling Agents,"Bioconj ugate Chemistry,3,No.1(Jan.1992)」のヘテロライゲーション技術を含む。これらは、参照として、特に本明細書に含まれる。本組成物を用いる方法本発明のさらにもう一つの目的は、B細胞による抗体の放出を刺激するための、単独または組合せのIL-3およびGM-CSFを、IFN-γと共に含む組成物の使用である。治療に適した宿主には、いかなる適当な哺乳類も含まれる。好ましい宿主は、新生児、成人、および免疫不全患者を含むヒトである。本組成物は、いかなる適当な投与方法を使用しても投与されうる。好ましい本組成物の投与方法には、皮下、静脈、鼻腔内、粘膜経路、経日、筋肉内、またはそれらの組合せが含まれる。用いられる化合物の投与量は、年齢、個人差、症状、投与方法などにより様々に変化し、そしてそれは当業者により容易に決定されうる。GM-CSFおよびIL3の投与量の例は、「J.Nemunaitis,"Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor:a review from preclinical development to clinical application,"Tr ansfusion,33,70-83(1993)」、「Lieschke et al.,"Granulocyte Colony-Stimul ating Factor and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor(First of Two Parts),"The N.Eng.J.of Med.,327,28-35(1992)」、「Lieschke et al., "Granulocyte Colony-Stimulating Factor and Granulocyte-Macrophage Colony -Stimulating Factor(Second of Two Parts),"The N.Eng.J.of Med.,327,99-106 (1992)」、「Schulz et al.,"Adjuvant Therapy with Recombinant Interleukin -3 and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,"Pharmac.Ther.,5 2,85-94(1992)」、および「Hoelzer et al.,"Interleukin 3 Alone and in Comb ination with GM-CSF in the Treatment of Patients with Neoplastic Disease ,"Seminars in Hematology,28,suppl.2(April),17-24(1991)」に示されている。本組成物を用いる中和の方法本発明のもう一つの目的は、抗体の産生が病原性であるような状態のGM-CSF、 IL-3、およびIFN-γの活性を中和する方法である。そのような状態には、ループス、全身性エリテマトーデス(SLE)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血管炎、グレーブス病、アレルギー反応などのような、自己免疫疾患がある。中和用ワクチンを作成するためには、サイトカインに対する抗体を作成する。当業者は、特異的な抗体を得るためのよく確立された方法に精通している。それから、抗体を患者に投与する。抗体は、抗体の半減期を延長させるために担体に結合させることもできる。モノクローナル抗体産生を最適化するための組成物の使用法本組成物はまた、インビトロまたはインビボのモノクローナル抗休産生を最適化するために用いることができる。例えば、問題としている抗原および組成物を含む溶液をインビボで注入することにより、動物を感作させることができる。本組成物は、B細胞による抗体放出を刺激するため、特異的抗原と共に本組成物を投与すれば、特異的抗原に対する抗体の産生が最適化される。このような免疫のための技術、ならびに本明細書の開示に照らして抗体を出現させその放出を刺激するために必要な抗原および組成物の投与量は、当業者によく知られている。また、抗体を産生させるためのリンパ球のインビトロの刺激または感作が、本新規組成物の存在下で強化されうる。そのような刺激および感作の手法は当業者の通常の技術に含まれ、本明細書における開示に照らして適用される抗原および組成物の適当な量の決定も同様である。本方法は、ヒトモノクローナル抗体の産生に特に有用である。B細胞による抗体放出を刺激するために有用な組成物を同定するためのアッセイ系本発明のさらにもう一つの態様は、インビボ抗体刺激を模倣した新規インビトロアッセイ系の開発である。本アッセイ系により、B細胞による抗体の放出を刺激する組成物の同定が可能となる。非活性化B細胞は、抗体を放出しないため、抗体放出を測定するためにはまずそれらを活性化させなければならない。本発明において、多糖担体上の多価抗原を作成するために、抗IgM抗体または抗IgD抗体を高分子量デキストラン（すなわち、MW=2.0X10⁶）に結合させる。それは、「Snapper et al.,"Comparative In V itro Analysis of Proliferation,Ig Secretion,and Ig Class Switching by Mu rine Marginal Zone and Follicular B Cells,"J.of Immunology,150,2737-2745 (1993)」の記述のように行い、これは、特に参照として本明細書に含まれる。この方法により、二価の抗Ig分子が、ピコモル単位ですらB細胞膜Igを介した持続的で反復的なシグナルを誘導することができる、極めて刺激活性の高い多価結合体へと変換される。抗Ig−デキストラン結合体は、非結合抗Igにより刺激されるよりも10,000倍低い濃度である、1pg/mlという低い濃度で、高レベルのB細胞増殖を刺激する。B細胞の活性化は、抗原特異性に無関係に起こる。抗Ig−デキストランは、サイトカインの非存在下では非活性化B細胞による抗体放出を刺激しない。B細胞による抗体放出を刺激するサイトカインを添加すると、高レベルのIg分泌が観察される。既に、抗原レセプターを介したB細胞の活性化が、高分子量の多糖、例えばデキストランと結合させた抗免疫グロブリン（Ig）抗体を用いることにより最適に行われうるということが知られていた。しかし、B細胞による抗体放出を刺激する組成物をスクリーニングすることは不可能であった。その理由は、以前は、アッセイに用いられるB細胞が高度に精製されていなかったためである。B細胞上清中に混入した細胞は、しばしば、B細胞による抗体放出を刺激しうる十分量のサイトカインを分泌する。したがって、被験組成物の刺激活性が添加された組成物によるのか、混入物質によるのかを決定することが不可能であった。対照的に、本発明は、アッセイ系に高度に精製されたB細胞を用いる。好ましくは、B細胞を電子工学的に分類して、高度に精製されたB細胞を得る。高度に精製されたB細胞を用いれば、多価のmIg架橋を介して活性化されたB細胞による抗体放出に対する物質の刺激活性を測定することが可能である。このような系は、本発明前には開示されていなかった。実際、本アッセイ系の発明の前には、B細胞による抗体放出に対する刺激活性の特徴のみに関して組成物を試験することは不可能であった。本発明の予想外の効果を、以下の実施例で例示し、そして図1〜6で図示する。本発明を一般的に開示したが、特別な実施例を参照することにより、より完全な理解が得られるであろう。実施例は、例を示すためだけに本明細書に含まれ、本発明を限定するものではない。実施例1 本実施例は、親出願で報告された細胞上清のB細胞抗体刺激活性が、一つの既知のサイトカインによるものではないことを示す。材料および方法：国立癌研究所(National Cancer Institute)(Frederick,MD) から入手した雌DBA/2マウスを、7〜10週令で用いた。培地は、PRMI1640(Bioflui ds,Rockville,MD)に、10％胎児ウシ血清(Sigma,St.Louis,MO)、L-グルタミン(2m l)、 2-メルカプトエタノール(0.05mM)、ペニシリン(50μg/ml)、およびストレプトマイシン(50μg/ml)を追加したものを用いた。デキストラン−結合抗IgD抗体は、Hδ^a/1（モノクローナルマウスIgG2b(bアロタイプ)）抗マウスIgD（ａアロタイプ）を高分子量デキストラン(2X10⁶MW)へと結合させることにより調製した。約9デキストラン−結合抗IgD抗体が各デキストラン分子に結合した。FITC-抗CD3εmAb(2C11)は、ファーミンゲン社(Pharmingen )(SanDiego,CA)より購入した。 PE標識アフィニティ精製ポリクローナルヤギ抗マウスIgM抗体は、サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社(Southern Biotechnology Associates)(Birmingh am,AL)より購入した。ネズミ組換え体IL-1、IL-2は、それぞれStephanie Vogel 博士(USUHS,Bethesda,MD)およびMaurice Gately博士(Hoffman-La Roche,Nutley, NJ)より寄贈された。マウスIL-3およびGM-CSFは、ファーミンゲン社より購入した。ポリクローナルヤギ抗マウスIL-3抗血清およびポリクローナルヤギ抗マウス GM-CSF抗血清は、いずれもR＆Dシステム社(R&D Systems)(Minneapolis,MN)より入手した。機能のアッセイは、96穴平底コスタープレート(Costar,Cambridge,MA)で行った。6％二酸化炭素を含む加湿環境下で、37℃で、200μLの総容量で、約1X10⁵細胞/mlで、培養細胞をインキュベートした。ポリクローナルIgM濃度を、ELIZAで測定した。定量は、アッセイごとに用いた IgM標準曲線との比較により行った。 B細胞の調製および培養：濃縮したB細胞群を脾臓から得た。ラット抗Thy-1、抗CD4、および抗CD8モノクローナル抗体で処理し、次にモノクローナルマウス抗ラットIgkおよび補体で処理することにより、T細胞を除去した。細胞を、75、65 、60、および50％パーコール溶液（各々1.086、1.081、1.074、および1.062g/ml ）を含む不連続パーコール勾配(Pharmacia,Piscataway,NJ)で、その密度に基づいて分画した。高密度（小型、非活性化）の細胞を、70から65％の中間層から捕集し、それは〜90％のB細胞を含有していた。それから、FITC-抗CD3ε抗体およびPE-抗IgM抗体で染色した後、EPICS Eliteサイトメーターで、膜(m)IgM+CD3-細胞を電子工学的細胞ソーティングをすることにより、高度に精製されたB細胞を得た。分類された細胞は、直ちに再分析して、99％より多くB細胞を含むことを確認した。これらの細胞を全ての実験に用いた。 TH1マウス細胞株をクローニングして、実験に用いた。親出願に開示したように、B細胞による抗体放出を刺激した組成物を単離した。組成物の成分を同定するため、IL-1、IL-2、IL-3などに対して特異的なモノクローナル抗体を組成物に添加し、活性を測定することにより、あらゆる既知のサイトカインの活性を組織的に抑制した。本組成物は、二つの独立のB細胞抗体放出刺激因子、IL-3およびGM-CSFを含むため、各々の既知のサイトカインを一つずつ抑制していくことにより、測定される活性が完全に抑制されることはない。実施例2 本実施例では、親出願で同定したT細胞培養上清、GM-CSF、およびIL-3の相対的な刺激活性を決定した。様々な培地でのB細胞によるIgM分泌(ng/ml)を測定した。培地は、図1の左側に挙げた。培地は、抗IgD-デキストランおよびIL-1＋IL-2、抗IgD-デキストランおよびIL-4、可溶型CD40リガンドおよびIL-1＋IL-2、可溶型CD40リガンドおよびIL -4、膜結合型CD40リガンド、膜結合型CD40リガンドおよびIL-1＋IL-2、ならびに膜結合型CD40およびIL-4である。被験組成物は、親出願に開示した細胞培養上清、RA5-S、GM-CSF、およびIL-3である。各培地について、対照の組成物も試験した。図1に記載したように、被験組成物は、デキストラン結合抗IgD抗体、IL-1、およびIL-2を含有する培地で、最も高いIgM分泌を示した。GM-CSFとIL-3の両方を含むRA5-SN上清が、その他の被験組成物と比較して有意なB細胞によるIgM分泌を示した。実施例3 本実施例では、IL-3およびGM-CSFが、活性化B細胞によるIg分泌を刺激することを示した。 B細胞を、様々な濃度のIL-3またはGM-CSFの存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で活性化した。IgM分泌を、培養開始から6日目にELIZAで測定した。電子工学的に分類精製した非活性化B細胞は、増殖はしたが、デキストラン結合抗IgD抗体、またはデキストラン結合抗IgD抗体およびIL-1＋IL-2による活性化に反応してIg分泌は行わなかった。親出願に開示したように、抗CD3-活性化CD4⁺TH 1およびTH2クローンから得られた上清は、デキストラン結合IgD抗体およびIL-1 ＋IL-2で刺激されたB細胞によるIg分泌を強力に誘導する。この刺激は、IL-4およびIL-5とは無関係である。 TH1およびTH2クローンは、活性化された際にIL-3、GM-CSF、およびTNF-αを分泌する能力を共に有するため、これらのサイトカインのIg分泌能力について試験した。サイトカインを、0.1から1000U/mlの最終濃度の対数増分(log increment)で滴定した。TNF-αは、Ig合成に全く影響を与えなかった。対照的に、IL-3およびGM -CSFは、デキストラン結合抗IgD抗体およびIL-1＋IL-2のみの場合と比較して、有意にIg分泌増加を刺激した（図2）。IL-3とGM-CSFはともに100U/mlで最適なIg 分泌反応を刺激し、それぞれ19倍、9倍の増加をもたらした。IL-3またはGM-CSF に反応して、低いが有意なレベルのIg合成の誘導が、1〜10U/mlで観察された。複数の実験で、IL-3およびGM-CSFを介したIg分泌の増加の程度は、典型的には 10〜50倍の範囲であった（図3）。IL-3とGM-CSFの間に、Ig分泌の用量反応または最適レベルについて有意な差は見られなかった。実施例4 本実施例では、抗IL-3および抗GM-CSF抗体が、それぞれIL-3およびGM-CSFに反応して起こるIg分泌の誘導を特異的に阻害することを示した。 B細胞を、IL-3(10U/ml)またはGM-CSF(10U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で活性化した。さらに、抗IL-3抗体(10μg/ml)および／または抗GM-CSF抗体(10μg/ml) を添加した。抗IL-3または抗GM-CSFを添加しない対照も同様に調製した。IgM濃度を、培養開始から6日目にELIZAで測定した。抗IL-3中和抗体および抗GM-CSF中和抗体は、それぞれIL-3およびGM-CSFのIg誘導活性を特異的かつ完全に阻害した（図4）。単独または組合せのこれらの抗体は、デキストラン結合抗IgD抗体＋IL-5による活性化に反応して起こるIg分泌に影響を与えなかった（データは示していない）。抗IL-3抗体および抗GM-CSF抗体の組合せは、CD4⁺TH1またはTH2クローン由来の上清のIL-4＋IL-5依存性Ig誘導活性を有意に減少させることができた。IL-3およびGM-CSFは、CD40を介したシグナル経路で活性化されたB細胞によるIgは誘導しえないことも示された。実施例5 本実施例では、IL-3およびGM-CSFが、デキストラン結合抗IgD抗体で活性化されたB細胞によるIg分泌を誘導するが、デキストラン非結合抗IgD抗体の場合には誘導しないことを示す。本実施例はまた、IL-3およびGM-CSFが、IL-1およびIL-2 と協同作用するということも示す。二価以外の多価のmIg架橋は、サイトカインを介したIg分泌およびクラススイッチを共刺激する。本実施例において、IL-3またはGM-CSFに反応して起こるIg分泌の共刺激について、デキストラン結合抗IgD(Hδ^a/1mAb)を、非結合抗IgD(Hδ^a /1mAb)と比較した。 B細胞をまず、AF7上清、αIL-4、およびαIL-5と共に培養した。標準的な方法により、AF7上清で、C57BL/6マウス由来のKLH特異的、la^b限定、CD4⁺T細胞クローンを樹立し維持した。AF7は、IL-4を産生するがIL-2およびIFN-γを産生しないことに基づくTH2クローンである。サイトカイン含有上清を、以下のようにしてAF7細胞の培養液から得た。組織培養ウェルを、10μg/mlの抗CD3 mAb(2C11)と共に、PBS中で37℃で3時間インキュベートし、それから新しいPBSで3回洗浄した。AF7細胞を非活性化状態に戻し、抗原APCsおよびIL-2で刺激した7日後に、1x10⁶細胞/mlで、抗CD3でコーティングしたプレートに加えた。様々な時間の後、細胞を含まない上清を調整し、そして-20℃または4℃で保存した。後者の場合、上清は、捕集してから1〜2週間以内に細胞アッセイで用いた。それから、B細胞を、IL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体(Hδ^a/1-dex,3ng/ml)または非結合抗IgD抗体(H δ^a/1,30μg/ml)と共に培養した。対照の組成物には、結合または非結合デキストランを加えなかった。IL-3(100ml)および／またはGM-CSF(100U/ml)を添加し、 IL-3またはGM-CSFを添加しない対照の組成物を調製した（図5）。IgM濃度を、培養6日後にELIZAで測定した。結合デキストラン(Hδ^a/1-dex)と対照的に、非結合デキストラン(Hδ^a/1)は、 IL-3またはGM-CSFの存在下で、Ig分泌の共刺激因子としての効果を有しなかった（表1）。非結合デキストランは、細胞の大きさの増大およびMHCクラスIIの誘導のような初期B細胞活性化過程を誘導できるにも関わらず、上記のような結果が得られた。IL-3またはGM-CSFの一方だけでは、非活性化B細胞を、検出可能な程度のIgを分泌するように誘導することができなかった（表1）。しかし、外因性のIL-1＋IL-2の非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体活性化細胞の培養液にI L-3およびGM-CSFを添加すると、デキストラン結合抗IgD抗体のみによる刺激と比較してIg分泌がそれぞれ7.4倍、5.4倍誘導される。デキストラン結合抗IgD抗体のみで活性化した細胞に、IL-1＋IL-2を添加しても、Ig分泌はそれ以上増加しなかった。 IL-3またはGM-CSFをIL-1＋IL-2と組み合わせることにより、デキストラン結合抗IgD抗体およびIL-1＋IL-2のみで活性化したB細胞培養液で観察されるものと比較して、Ig分泌が48倍、75倍増加する。したがって、IL-1＋IL-2は、デキストラン結合抗IgD抗体で活性化された非活性化B細胞によるIg分泌の誘導に関して、IL -3またはGM-CSFと強く協調する。実施例6 本実施例は、IL-3およびGM-CSFの両方が、主にB細胞分化の刺激を通してIg分泌に対して作用するということを示す。 IL-3およびGM-CSFがIg分泌を強化する機構を決定するために、IL-3およびGM-C SFの細胞増殖に対する効果を、Ig分泌に対する効果と比較して決定した。 B細胞を、IL-3(100U/ml)および／またはGM-CSF(100U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ ml)で活性化した。培養開始から4日目に、血球計数器を用いて生存細胞（トリパンブルーを排除する細胞）を計数した。複製培地中のIgM濃度は、培養開始から6 日後にELIZAで測定した。データは、一対の培地の平均の平均＋/−標準誤差として表した。 IL-3は有意に生存細胞の増殖の増加を刺激したがそれは2倍以下であり、一方G M-CSFは細胞増殖の程度に有意な影響を及ぼさなかった（図6）。³H-チミジン取り込みに基づきDNA合成を検討した結果は、これらの観察と一致した。 IL-3およびGM-CSFに反応して起こる複製培地のIg分泌の誘導は、それぞれ13.8 倍、13.6倍であった。これらの結果は、IL-3およびGM-CSFの主な効果が、培養液中に存在する細胞の総数ではなく、一細胞当たりで分泌される平均Ig量の強い増加の刺激であることを示している。したがって、これらのデータより、IL-3およびGM-CSFが、多価抗原レセプター架橋を通して活性化される非活性化B細胞に対する分化因子であることが強く示唆される。各サイトカインの至適用量を用いて、IL-3およびGM-CSFの作用を組み合わせると、必ず合計のIg分泌反応以上のものが引き起こされる（図6）。これらのデータは、IL-3およびGM-CSFが協同作用することを示している。IL-1＋IL-2の非存在下でデキストラン結合抗IgD抗体で活性化した細胞に対して、IL-3およびGM-CSFを組み合わせて用いた場合、同程度の相乗作用が観察された（データは示していない）。実施例7 本実施例は、B細胞組成物にCD40Lを添加した場合のB細胞の抗体分泌に対する刺激効果を示す。 B細胞を、デキストラン結合抗IgD抗体(3ng/mlまたは0.3ng/ml)およびIL-1(150 U/ml)＋IL-2(150U/ml)で活性化した。複製培地中のIgM濃度を、対照組成物、IL- 3＋GM-CSFを含む組成物、およびIL-3＋GM-CSF＋CD40リガンド（CD40L）について ELIZAで測定した（表II）。IL-3およびGM-CSFは、100U/mlで存在した。CD40Lは、組換え体可溶型CD8-CD40リガンド融合タンパク質として、最終濃度10μg/mlで添加した。融合タンパク質は、M.Kehry博士(Boehringer Ingelheim Pharmaceuti cals,Inc.,Ridgefield,CT)から寄贈された。最も大きい結果(61,250ng/ml)は、3ng/mlの抗IgD-dex、およびIL-3+GM-CSF+CD 40Lを含む組成物で得られた。しかし、多価活性化因子が低レベルであっても（0 .3ng/mlの抗IgD-dex）、有意なIgM分泌が得られた(42,125ng/ml)。したがって、結合体が低レベルであっても、担体上のCD40Lを含有することにより、極めて強力な抗体放出反応が得られる。実施例8 本実施例は、B細胞を刺激してから24時間後にIFN-γを添加した場合の、B細胞の抗体分泌に対する刺激効果を示す。 B細胞を、IL-3(100U/ml)＋GM-CSF(100U/ml)の存在下または非存在下で、デキストラン結合抗IgD抗体(3ng/ml)およびIL-1(150U/ml)＋IL-2(150U/ml)で活性化した。複製培地中のIgM濃度を、対照組成物、0時間後にIFN-γを添加した組成物、および24時間後にIFN-γを添加した組成物についてELIZAで測定した。データは、一対の培地の平均の平均＋/−標準誤差として表した（図7）。抗IgD-dex活性化B細胞およびIL-1＋IL-2を含む組成物は、INF-γを添加しなかったとき(885ng/ml)、およびIFN-γを0時間後に添加したとき(975ng/ml)に最少のIgM分泌を示した。IFN-γをB細胞刺激の24時間後に添加したとき、抗体分泌は 11,250ng/mlにまで激増した。抗IgD-dex活性化B細胞、IL-1＋IL-2、およびIL-3＋GM-CSFを含む組成物で、さらにより重要な結果が得られた。IFN-γを含まない培地では、抗体分泌は21,250 ng/mlと測定された。驚くべくことに、IFN-γを0時間後に添加すると、抗体分泌が7,250ng/mlにまで抑制された。しかし、B細胞の刺激の24時間後にIFN-γを添加すると、協調的な反応が起こり、およそ200,000ng/mlの抗体分泌がもたらされた。実施例9 本実施例では、本発明の組成物を用いたワクチンおよびワクチンアジュバントの具体例を提供する。表IIIは、本発明の組成物を用いたワクチンの具体例を示している。表に示したように、いくつかのワクチンが共役ワクチンである。共役の方法は、当業者によく知られており、「Brunswick et al.,J.Immunol.140:3364(1988)」、「Wong, S.S.,Chemistry of Protein Conjugates and Crosslinking,CRC Press,Boston(1 991)」、および「Brenkeley et al.,"Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes,Haptens and Cross-Linling Agents,"Bioconjug ate Chemistry,3,No.1(Jan.1992)」のヘテロライゲーション技術を含む。これらは、特に参照として本明細書に含まれる。多価担体が、インビトロで用いられる多価結合体（すなわち、抗IgD-dex）と置き換えられる。このような担体は、例えば、デキストラン、またはニューモコッカス、ストレプトコッカス、もしくはメニンゴコッカスなどの細菌由来の被覆多糖のような多糖でありうる。多糖は、目的とする使用により、ワクチンと医学的に関連したものである場合とそうでない場合がある。サイトカインは、GM-CSF、IL-3、IFN-γ、またはそれらの組合せである。本実施例は、限定することを目的とするものではない。本発明の明細書の考慮、および実施により、その他のタイプのワクチンが当業者に明らかとなるであろう。要するに、実験結果より、IL-3および／またはGM-CSFがB細胞による抗体の放出を刺激すること、およびこれらのサイトカインが組み合わされると協調的に作用しB細胞による抗体放出を刺激することが明らかとなった。この誘導は、抗IL- 3および抗GM-CSF抗体によりそれぞれ特異的に阻害される。培養の24時間後に添加されたIFN-γの刺激効果もまた、示された。 IL-3およびGM-CSFの効果は、実験モデルにおいてデキストラン結合抗Ig抗体により媒介されるとき、多価抗原レセプター架橋により増強される。IL-3およびGM -CSFの効果は、高レベルの膜結合型Ig架橋を誘導しない抗原によっても増強される。デキストラン結合抗Ig抗体とIL-1＋IL-2の両方が、最適なIL-3またはGM-CSF を介したIg分泌にとって必要であるが、IL-3およびGM-CSFはいずれも、デキストラン結合抗Ig抗体のみで活性化された細胞によるIg分泌反応も穏やかに刺激する。これは、IL-3およびGM-CSFが、B細胞に対する分化因子として直接的に作用しうることを示した初めての報告である。さらに、最大の抗体分泌は、GM-CSF、IL-3、IL-1＋IL-3、および培養の24時間後に添加されたIFN-γを用いた場合に得られる。培養の24時間後にIFN-γのみを添加した場合にも、抗体放出の穏やかな増加が得られる。本発明を完全に開示したが、本明細書に記載された本発明の本旨および範囲の中で多くの変更や修飾がなされうることは当業者にとって明らかである。添付の請求の範囲は、本発明を限定するためのものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/39 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＫＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/66 ＡＢＨＧ 37/02 ＡＥＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者モンドジェームズジェイ. アメリカ合衆国メリーランド州ポトマックグリーンリーフアベニュー 11804

Claims

【特許請求の範囲】 1．有効量の顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン−3（IL-3）、またはそれらの組合せを含む、B細胞による抗体放出を刺激するために有効な組成物。 2．GM-CSFおよびIL-3が、互いに融合するか、または別々に他のタンパク質と融合して融合タンパク質を形成している、請求の範囲1記載の組成物。 3．インターフェロン−γ（IFN-γ）をさらに含む請求の範囲1記載の組成物。 4．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求の範囲1記載の組成物。 5．少なくとも一つのサイトカインが、インターロイキン−1（IL-1）およびインターロイキン−2（IL-2）の組合せである、請求の範囲4記載の組成物。 6．薬剤学的に許容される担体をさらに含む請求の範囲1、2、3、4、または5のいずれかに記載の組成物。 7．薬剤学的に許容される担体が、水、油、生理的食塩水、水溶性デキストロース、およびグリセロール溶液からなる群より選ばれる、請求の範囲6記載の組成物。 8．多価担体に共有結合している、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM -CSF)、インターロイキン−3（IL-3)、またはそれらの組合せを含むワクチンアジュバント。 9．GM-CSFおよびIL-3が、互いに融合するか、または別々に他の適当なタンパク質と融合して融合タンパク質を形成し、それから多価担体へと結合している、請求の範囲8記載のアジュバント。 10．インターフェロン−γ（IFN-γ）をさらに含む請求の範囲8記載のアジュバント。 11．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求の範囲8記載のアジュバント。 12．少なくとも一つのサイトカインが、インターロイキン−1（IL-1）およびインターロイキン−2（IL-2）の組合せである、請求の範囲11記載のアジュバント。 13．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインが、多価担体に共有結合している、請求の範囲11記載のアジュバント。 14．多価担体が、細菌性被覆多糖、デキストラン、および遺伝子工学的に構築されたベクターからなる群より選ばれる、請求の範囲8、9、10、11、12、または13 のいずれかに記載のアジュバント。 15．細菌性被覆多糖が、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス( streptococci)、またはメニンゴコッカス(meningococci)由来である、請求の範囲14記載のアジュバント。 16．a)多価担体に共有結合している、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン−3（IL-3）、またはそれらの組合せ、 b)ワクチンの、多価担体に共有結合している抗原、を含む共役ワクチン。 17．GM-CSFおよびIL-3が、互いに融合するか、または別々に他のタンパク質と融合して融合タンパク質を形成し、それから多価担体へと結合している、請求の範囲16記載のワクチン。 18．インターフェロン−γ（IFN-γ）をさらに含む請求の範囲16記載のワクチン。 19．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求の範囲16記載のワクチン。 20．少なくとも一つのサイトカインが、インターロイキン−1（IL-1）およびインターロイキン−2（IL-2）の組合せである、請求の範囲19記載のアジュバント。 21．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインが、多価担体に共有結合している、請求の範囲19記載のアジュバント。 22．多価担体が、細菌性被覆多糖、デキストラン、および遺伝子工学的に構築されたベクターからなる群より選ばれる、請求の範囲16、17、18、19、20、または 21のいずれかに記載のアジュバント。 23．細菌性被覆多糖が、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス( streptococci)、またはメニンゴコッカス(meningococci)由来である、請求の範囲22記載のアジュバント。 24．a)顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）に対する抗体、 b)インターロイキン−3（IL-3）に対する抗体、および c)インターフェロン−γ（IFN-γ）に対する抗体、からなる群より選ばれる一つまたは複数の抗体を含む中和用ワクチンアジュバント。 25．一つまたは複数の抗体のうちの少なくとも一つが多価担体に結合している、請求の範囲24記載のアジュバント。 26．多価担体が、細菌性被覆多糖、デキストラン、および遺伝子工学的に構築されたベクターからなる群より選ばれる、請求の範囲25記載のアジュバント。 27．細菌性被覆多糖が、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス( streptococci)、またはメニンゴコッカス(meningococci)由来である、請求の範囲26記載のアジュバント。 28．a)顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン −3（IL-3）、またはそれらの組合せを動物に投与し、 b)抗原を投与することを含む、抗原に対するモノクローナル抗体の産生を最適化するためのインビボの方法。 29．GM-CSFおよびIL-3が、互いに融合するか、または他の適当なタンパク質と融合して融合タンパク質を形成している、請求の範囲28記載の方法。 30．GM-CSF、IL-3、またはそれらの組合せを投与した約24時間後に、インターフェロン−γ（IFN-γ）を投与することをさらに含む請求の範囲29記載の方法。 31．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインを投与することをさらに含む請求の範囲28記載の方法。 32．少なくとも一つのサイトカインが、インターロイキン−1（IL-1）およびインターロイキン−2（IL-2）の組合せである、請求の範囲31記載の方法。 33．IL-3、GM-CSF、融合タンパク質、CD40リガンド、ならびにIL-3、GM-CSF、およびIFN-γ以外の少なくとも一つのサイトカインが多価担体に共有結合している、請求の範囲28、29、30、31、または32のいずれかに記載の方法。 34．多価担体が、細菌性被覆多糖、デキストラン、および遺伝子工学的に構築されたベクターからなる群より選ばれる、請求の範囲33記載の方法。 35．細菌性被覆多糖が、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス( streptococci)、またはメニンゴコッカス(meningococci)由来である、請求の範囲34記載の方法。 36．a)培養したリンパ球を抗原で感作し、 b)顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン −3（IL-3）、またはそれらの組合せを培養液に添加することを含む、抗原に対するモノクローナル抗体の産生を最適化するためのインビトロの方法。 37．GM-CSFおよびIL-3が、互いに融合するか、または他の適当なタンパク質と融合して融合タンパク質を形成している、請求の範囲36記載の方法。 38．GM-CSF、IL-3、またはそれらの組合せを投与した約24時間後に、インターフェロン−γ（IFN-γ）を投与することをさらに含む請求の範囲36記載の方法。 39．CD40リガンド、またはGM-CSF、IL-3、もしくはIFN-γ、もしくはそれらの組合せ以外の少なくとも一つのサイトカインを投与することをさらに含む、請求の範囲36記載の方法。 40．少なくとも一つのサイトカインが、インターロイキン−1（IL-1）およびインターロイキン−2（IL-2）の組合せである、請求の範囲39記載の方法。 41．IL-3、GM-CSF、融合タンパク質、CD40リガンド、ならびにIL-3、GM-CSF、およびIFN-γ以外の少なくとも一つのサイトカインが多価担体に共有結合している、請求の範囲36、37、38、39、または40のいずれかに記載の方法。 42．多価担体が、細菌性被覆多糖、デキストラン、および遺伝子工学的に構築されたベクターからなる群より選ばれる、請求の範囲41記載の方法。 43．細菌性被覆多糖が、ニューモコッカス(pneumococci)、ストレプトコッカス( streptococci)、またはメニンゴコッカス(meningococci)由来である、請求の範囲42記載の方法。 44．a)IgがIgDまたはIgMである、抗Ig−デキストラン結合体、および b)高度に精製されたB細胞を含むB細胞による抗体放出を刺激するために有用な組成物を同定するためのインビトロアッセイ系。 45．B細胞が、電子工学的に分類されたものである、請求の範囲44記載のアッセイ系。 46．分泌を、B細胞による抗体の放出の刺激因子としての被験組成物の有用性の指標とする、 a)1)IgがIgDまたはIgMである、抗Ig−デキストラン結合体、および 2)高度に精製されたB細胞を含むアッセイ系を提供し、 b)被験試料組成物を添加し、そして c)B細胞によるIg分泌を検出することを含む、 B細胞による抗体放出を刺激するために有用な組成物を同定するためのインビトロの方法。 47．B細胞が、電子工学的に分類されたものである、請求の範囲46記載の方法。