JPS5896029A - 抗原特異性ｂ細胞の製造法 - Google Patents
抗原特異性ｂ細胞の製造法Info
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- JPS5896029A JPS5896029A JP56194886A JP19488681A JPS5896029A JP S5896029 A JPS5896029 A JP S5896029A JP 56194886 A JP56194886 A JP 56194886A JP 19488681 A JP19488681 A JP 19488681A JP S5896029 A JPS5896029 A JP S5896029A
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- Japan
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- antigen
- cells
- specific
- cell
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発ヴ３は、目的とする抗原に対し特異的なＢ細胞（
ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ
） 、すなわち抗麿特異性Ｂ細肘の製造法に関する。
ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ
） 、すなわち抗麿特異性Ｂ細肘の製造法に関する。
更に詳細には、不均一で多様な感作Ｂ細胞から、物足の
抗原を認識したＢ細胞を選択的に増殖ぜしめて、これを
採取する抗原特異性Ｂ細胞の新規な製造法に関する。
抗原を認識したＢ細胞を選択的に増殖ぜしめて、これを
採取する抗原特異性Ｂ細胞の新規な製造法に関する。
今日の免疫学の技術水準からすれは、抗原特異性Ｂ細胞
を入手できれば、これより細胞融合法によりこれに対応
する抗体を大量に生産することは容易であるＬ Ｋ；ｈ
ｌｅｒら： Ｎａｔｕｒｅ， ２ ５ ６巻，４９５−
４ ９ ７ （１ ９ ７ ５） ； Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏ．、 ６巻。
を入手できれば、これより細胞融合法によりこれに対応
する抗体を大量に生産することは容易であるＬ Ｋ；ｈ
ｌｅｒら： Ｎａｔｕｒｅ， ２ ５ ６巻，４９５−
４ ９ ７ （１ ９ ７ ５） ； Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏ．、 ６巻。
５１ １−５１９ （１９７６） ；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
ら：Ｎａｔｕｒｅ， ２ （５ ＜Ｓ巻，５５０−５５
２ （１９７７）；及びＷａｌｓｈ ： Ｎａｔｕｒｅ
， ２ ６ ６巻，４９５（１９７７））。
ら：Ｎａｔｕｒｅ， ２ （５ ＜Ｓ巻，５５０−５５
２ （１９７７）；及びＷａｌｓｈ ： Ｎａｔｕｒｅ
， ２ ６ ６巻，４９５（１９７７））。
しかしながら、感作動物の牌細胞から得られる感作Ｂ細
胞は、連泡１００力クローン程度の雑多さを有し、目的
の抗体を産生するＢ細胞の送別に多大の労力を費してい
るのが実情である。特に抗原性の弱い少量の免疫原で動
物を免疫［一で抗体を得る場合には、上記細胞融合法を
使用しなけれは抗体の採取は困難であるとされているが
、この場合には尚一層抗原特異性Ｂ細胞の選別が問題と
なっていた。
胞は、連泡１００力クローン程度の雑多さを有し、目的
の抗体を産生するＢ細胞の送別に多大の労力を費してい
るのが実情である。特に抗原性の弱い少量の免疫原で動
物を免疫［一で抗体を得る場合には、上記細胞融合法を
使用しなけれは抗体の採取は困難であるとされているが
、この場合には尚一層抗原特異性Ｂ細胞の選別が問題と
なっていた。
斯かる実情において、本発明者は、かねてよシ抗体産生
機構について神々研究を重ねていたところ、その過程に
おいて、感作Ｂ細胞を抗原特異的に増殖させる因子（以
下「増殖因子」と称する）、史にこれを抗体産生細胞（
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍｉｎｇＣ−ｅｌｌＳ：
ＡＦＣ）に分化させる因子（以下「分化因子」と称する
）が存在すること、そして当該増殖困子仁ｒＴ細胞（Ｔ
ｈｙｍｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ）に由来す
るヘルパー因子（ｂｅ］、ｐｅｒ ｆａｃｔ、ｏｒ ）
から調製できることを見出した。
機構について神々研究を重ねていたところ、その過程に
おいて、感作Ｂ細胞を抗原特異的に増殖させる因子（以
下「増殖因子」と称する）、史にこれを抗体産生細胞（
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍｉｎｇＣ−ｅｌｌＳ：
ＡＦＣ）に分化させる因子（以下「分化因子」と称する
）が存在すること、そして当該増殖困子仁ｒＴ細胞（Ｔ
ｈｙｍｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ）に由来す
るヘルパー因子（ｂｅ］、ｐｅｒ ｆａｃｔ、ｏｒ ）
から調製できることを見出した。
本発明は斯かる新知見に基いて完成されたもので、感作
Ｂ細胞をＴ細胞由来の抗原特異的増殖因子の存在下に培
養することを特徴とする特許性Ｂ 、１４１＋胞の製造
法である。
Ｂ細胞をＴ細胞由来の抗原特異的増殖因子の存在下に培
養することを特徴とする特許性Ｂ 、１４１＋胞の製造
法である。
本発明方法において、増殖因子としては、Ｔ細胞に由来
するヘルパー因子のうち、抗原特異的なものが使用でき
、これは当該分野において知られている方法［ Ｆｅｌ
ｄｍｓｎｎ，Ｍ；Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（｝ｅｒ＋＋・ｎｅＣρｐｔｏｒ ＳｉｇｎａｌＳ，
ｐ４ ９ ７ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（
１ ９７４ ） ：ＭｏｚｔΔｓ， Ｆ；Ｔｈｅ Ｒ
ｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｒｌｄｕｃｔｎｆ ｔｈｅＨｉｓｔ
ｒ）ｃｏｍｐａ Ｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍ
ｐｌｅｘ ｉｎＩｍｍ＋＋ｎｅＳｙｓｔ．ｅｍ， ｐ４
８５ （１ ９７６） ）によって調整することかでき
る。具体的には、例えは次の如くして調整さ才１る。
するヘルパー因子のうち、抗原特異的なものが使用でき
、これは当該分野において知られている方法［ Ｆｅｌ
ｄｍｓｎｎ，Ｍ；Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（｝ｅｒ＋＋・ｎｅＣρｐｔｏｒ ＳｉｇｎａｌＳ，
ｐ４ ９ ７ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（
１ ９７４ ） ：ＭｏｚｔΔｓ， Ｆ；Ｔｈｅ Ｒ
ｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｒｌｄｕｃｔｎｆ ｔｈｅＨｉｓｔ
ｒ）ｃｏｍｐａ Ｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍ
ｐｌｅｘ ｉｎＩｍｍ＋＋ｎｅＳｙｓｔ．ｅｍ， ｐ４
８５ （１ ９７６） ）によって調整することかでき
る。具体的には、例えは次の如くして調整さ才１る。
すなわち、放射線処理（２００〜６００ラド程度）した
マウスに、同土中％ｌ ＩＩ泉疼１１＋ ｌＩＩ］＋を
約２ Ｘ １０′″〜２ Ｘ １０９個及ひ辿帛の免投
都の抗原を援゛与し、投与４〜１０日後に牌細胞，を捕
ｌ出ｌ７、その削胞浮遊准の遠心上滑あるいはＨκ浮遊
液をホモジネートした後の遠心上ｍを採取することによ
って得られる。
マウスに、同土中％ｌ ＩＩ泉疼１１＋ ｌＩＩ］＋を
約２ Ｘ １０′″〜２ Ｘ １０９個及ひ辿帛の免投
都の抗原を援゛与し、投与４〜１０日後に牌細胞，を捕
ｌ出ｌ７、その削胞浮遊准の遠心上滑あるいはＨκ浮遊
液をホモジネートした後の遠心上ｍを採取することによ
って得られる。
更に該和１胞をＴ組ｋ ｔＷ ’ｉ＋ｔｉ因−ｆ （
ＴＣＧＦ ； ＩＬ−ＴＩ ）の存在下に２〜３日間培
養仲上記の如くして得られる遠心上ｆｌｌｔ ｋ使用す
ることもできる。
ＴＣＧＦ ； ＩＬ−ＴＩ ）の存在下に２〜３日間培
養仲上記の如くして得られる遠心上ｆｌｌｔ ｋ使用す
ることもできる。
このようにして得られる増殖因子は史に稍製丁ることが
でき、精製法としては、１タ１１オに：ゲルＰ ｉＭｊ
法、等市４点集束汰、イオン交換タロマト〃゛ラフイー
、特異抗原（和製する増殖因子を餡蔵する抗原）と担体
との７り合体をＵｌｋ’Ｍ体とするアフイニテイークロ
マトｉ′ラフイー宿．が芋けられるか、就中特にアフイ
ニテイークロマト〃゛ラフイーが好１しい。
でき、精製法としては、１タ１１オに：ゲルＰ ｉＭｊ
法、等市４点集束汰、イオン交換タロマト〃゛ラフイー
、特異抗原（和製する増殖因子を餡蔵する抗原）と担体
との７り合体をＵｌｋ’Ｍ体とするアフイニテイークロ
マトｉ′ラフイー宿．が芋けられるか、就中特にアフイ
ニテイークロマト〃゛ラフイーが好１しい。
上記アフイニテイークロマトｊ゛ラフイー用の吸着体は
、特異抗原を辿濱の不溶性支持体上に１ｒ！！１定化す
ることにより得られる。向だ化には従米公知の固定化方
法をいすわも使用できるが、これらのうちでも臭化シア
ン活性化多糖体性あるいはポリ− Ｌ − ＩＪジン（
ＰＬＬ）等の架橋試薬による和体結合法を１４用する
のが好適である。臭化シアン活性化多糖体性は、不溶性
支持体を臭化シアンで処理し、次いで得られる活性化物
を抗原物質と緩和な条件下にカップリン〃゛させ、固定
化する方法である。不溶性支持体を臭化シアンで処理す
るに当っては、ｈえは水酸化ナトリウム、炭酸水素ナト
リウム等の塩基性化合物を用いてｐＨ １ １〜１２に
保ち、室温１、水、アセトニトリル等の溶媒中にて約１
〜１２分開栓度処理すれはよい。不溶性支持体に対する
臭化シアンの使用量は一般には等重量とするのがよい。
、特異抗原を辿濱の不溶性支持体上に１ｒ！！１定化す
ることにより得られる。向だ化には従米公知の固定化方
法をいすわも使用できるが、これらのうちでも臭化シア
ン活性化多糖体性あるいはポリ− Ｌ − ＩＪジン（
ＰＬＬ）等の架橋試薬による和体結合法を１４用する
のが好適である。臭化シアン活性化多糖体性は、不溶性
支持体を臭化シアンで処理し、次いで得られる活性化物
を抗原物質と緩和な条件下にカップリン〃゛させ、固定
化する方法である。不溶性支持体を臭化シアンで処理す
るに当っては、ｈえは水酸化ナトリウム、炭酸水素ナト
リウム等の塩基性化合物を用いてｐＨ １ １〜１２に
保ち、室温１、水、アセトニトリル等の溶媒中にて約１
〜１２分開栓度処理すれはよい。不溶性支持体に対する
臭化シアンの使用量は一般には等重量とするのがよい。
ここで不溶性支持体としては、生体物側一般に対する非
特異的ｇ！ｊＬ沼が低く、＾い多孔性を有［−、緩和条
件下に抗原物知を固定化［〜得る官能基を有し、しかも
化学的・物理的に十分安定なものであれば従米公知の不
溶性支持体をいずれも使用できる。
特異的ｇ！ｊＬ沼が低く、＾い多孔性を有［−、緩和条
件下に抗原物知を固定化［〜得る官能基を有し、しかも
化学的・物理的に十分安定なものであれば従米公知の不
溶性支持体をいずれも使用できる。
具体的には、例えはアミノエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース、プロモアセチルセルロース、ｐ−
アニリノセルロース等のセルロース系支持体；セファデ
ックス、ＣＭ−セファデックス（ファルマシア社製）笠
の架橋デキストラン系支持体；セファロース２Ｂ，セフ
ァロース４Ｂ、セファロース６Ｂ （ファルマシア社製
）等のアガロース系支持体等を挙けることができる。
シメチルセルロース、プロモアセチルセルロース、ｐ−
アニリノセルロース等のセルロース系支持体；セファデ
ックス、ＣＭ−セファデックス（ファルマシア社製）笠
の架橋デキストラン系支持体；セファロース２Ｂ，セフ
ァロース４Ｂ、セファロース６Ｂ （ファルマシア社製
）等のアガロース系支持体等を挙けることができる。
臭化シアン活性化支持体を特異抗原とカップリングさせ
るには、ψ１ｊえは特異抗原に対して臭化シアン活性化
支持体を５０〜８ ０倍１ｆ量程度用い、適当な溶媒、
例えは０．１モル炭酸水素す｝ ＩＪウム（０．５モル
塩化ナトリウム含イイ、ｍ−８．４）水溶液中、０〜４
０°Ｃ１好ましくは２〜８℃にて約１０−２０時間反応
させれはよい。勘くして得られるアフィニティークロマ
トグラフィー用吸着体は、適当な溶媒、例えは生理食塩
水中にて保存できる。
るには、ψ１ｊえは特異抗原に対して臭化シアン活性化
支持体を５０〜８ ０倍１ｆ量程度用い、適当な溶媒、
例えは０．１モル炭酸水素す｝ ＩＪウム（０．５モル
塩化ナトリウム含イイ、ｍ−８．４）水溶液中、０〜４
０°Ｃ１好ましくは２〜８℃にて約１０−２０時間反応
させれはよい。勘くして得られるアフィニティークロマ
トグラフィー用吸着体は、適当な溶媒、例えは生理食塩
水中にて保存できる。
このアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を利用
１２たカラムクロマトグラフィーによれば８的とする抗
原特異的なヘルパー因子が上記担体中の抗原と結合して
カラムに吸着補集される。次いで該カラムに菌濃度の塩
又はチオシアン酸カリウム水溶液、硼酸緩衝液、セーレ
ンセン緩簀液（ｐＨ２〜８８度）等の吸着分離剤（＃出
液）を通すことにより、カラムに吸潰された抗原特異的
垢殆因子を分離回収することができる。
１２たカラムクロマトグラフィーによれば８的とする抗
原特異的なヘルパー因子が上記担体中の抗原と結合して
カラムに吸着補集される。次いで該カラムに菌濃度の塩
又はチオシアン酸カリウム水溶液、硼酸緩衝液、セーレ
ンセン緩簀液（ｐＨ２〜８８度）等の吸着分離剤（＃出
液）を通すことにより、カラムに吸潰された抗原特異的
垢殆因子を分離回収することができる。
また、感作Ｂ１１１Ｉｌ胞としては、増加因子を調製し
たときと同じ抗原によって感作させた動物から得られる
Ｂ細胞の倒れをも使用できる。例えは、感作させた動物
の牌細胞を摘出し、宿性に従って、物理的、化学的ある
いは表面膜法等によシ感作Ｂ細胞を分離する。また、未
感作の動物から分離したＢ細胞をイン・ビトロで当該抗
原と共存せしめて感作Ｂ細胞を得ることもできる。
たときと同じ抗原によって感作させた動物から得られる
Ｂ細胞の倒れをも使用できる。例えは、感作させた動物
の牌細胞を摘出し、宿性に従って、物理的、化学的ある
いは表面膜法等によシ感作Ｂ細胞を分離する。また、未
感作の動物から分離したＢ細胞をイン・ビトロで当該抗
原と共存せしめて感作Ｂ細胞を得ることもできる。
本発明方法によれば、抗原特異性Ｂ細胞は、上記のごと
くして得た増殖因子の存在下感作Ｂ細胞を培養すること
により製造される。
くして得た増殖因子の存在下感作Ｂ細胞を培養すること
により製造される。
ここで使用される培地は特に制限はなく、一般にこの種
の培養に使用されている栄養培地、例えばクリマウス（
ｃｌｉｃｋ’ ｓ ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０殖因子
を１単位とする）を使用するのが好ましい。
の培養に使用されている栄養培地、例えばクリマウス（
ｃｌｉｃｋ’ ｓ ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０殖因子
を１単位とする）を使用するのが好ましい。
培養はｐｌ（７，２付近で、約３７°Ｃの温度にて１〜
７日行うのが好ましい。勘くすると、特異抗原によって
感作された１考細胞のみが選択的に増殖するので、抗原
特異性Ｂ細胞を有利に製造できる。
７日行うのが好ましい。勘くすると、特異抗原によって
感作された１考細胞のみが選択的に増殖するので、抗原
特異性Ｂ細胞を有利に製造できる。
本発明方法で得られる抗原特異性Ｂ細胞は、将来特定の
抗体を産生するＡＦＣに分化することを決定ずけられた
細胞であり、例えはこれは分化因子の存在下にＡ Ｆ
Ｃとすることができる。分化因子は、例えば感作Ｂ＃１
胞を得る過程でＢ細胞を分離した後の牌細胞から放射線
抵抗性、ガラス付着性細胞（ａｄｈｅｒｅｈｔ ｃｅｌ
ｌｒ、 ）を選択採取することによって得ることができ
る。
抗体を産生するＡＦＣに分化することを決定ずけられた
細胞であり、例えはこれは分化因子の存在下にＡ Ｆ
Ｃとすることができる。分化因子は、例えば感作Ｂ＃１
胞を得る過程でＢ細胞を分離した後の牌細胞から放射線
抵抗性、ガラス付着性細胞（ａｄｈｅｒｅｈｔ ｃｅｌ
ｌｒ、 ）を選択採取することによって得ることができ
る。
斜上の如く、通潜動物に抗原を投与して特異抗体を作ら
せる場合、抗原はできる限り純粋なものを用いるという
のが免疫学の技術帛識であるところ、本発明方法によれ
ば、不純な抗原によって感作された感作Ｂ細胞から抗原
特異性Ｂ細胞を得るととができるので、不純な抗原を使
用できるという優れた利点を有する。
せる場合、抗原はできる限り純粋なものを用いるという
のが免疫学の技術帛識であるところ、本発明方法によれ
ば、不純な抗原によって感作された感作Ｂ細胞から抗原
特異性Ｂ細胞を得るととができるので、不純な抗原を使
用できるという優れた利点を有する。
次に参考例及び実施例を挙けて説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。
れらに限定されるものではない。
参考例 １
（増加因子の製造〕
■ ラビット免役〃゛ロブリン（ＲＧＣ） ）抗ＪＪ＜
（ＲＧＧ）感作ＴセルをＨａｒｔｎ＋Ｐ＋ｎｎの方法に
準じて調製した （Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｋ、０．１９７
０． Ｊ。
（ＲＧＧ）感作ＴセルをＨａｒｔｎ＋Ｐ＋ｎｎの方法に
準じて調製した （Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｋ、０．１９７
０． Ｊ。
Ｅｙｐ、Ｍｅ＋ｊ、 １３２ 、１２６７ ） 。すな
わち、ＣＢＡ ／ｃａＪマウス（♀＋ ６〜７ Ｗ ：
Ｅ］、ｌｅｒｓｌｉｅＡｎｉｍａｌＦ’ａｒｒｔ＋、
Ｕｎｉｖｐｒｓｊｔｙ ｏｆ Ａｌｈｅｒｔａ ）を放
射線処理（５００ｒａｄｐ ： １３７Ｃｓ ５ｏｕｒ
ｃｅ、Ｇａｍｍａ ｃｅ］１４０：Ａｔ、ｏｍｉｃ Ｅ
ｎｐｒｇｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ ） した
後、常法により採取し７た同種マウスの胸腺細胞１．５
×１０″″個を静脈注射［、た。（ａ Ｍアンモニウム
沈殿？ｉｌびＤＢＡＥ−セルロース・イオン交換カラム
クロマト法により渚法通シ処理し、で得たＲＧＧ５０μ
ｇをフロイントの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｆｒｅｕｎｃ］ｓ’ ａｄｊｕｖａｎｔ ） ｈ
［１１ｄｌと共に上記マウスの後足に皮下投与した。投
与７日後に牌細胞を摘出してＣｔ＝”、 Ｍｇ＋を含ま
ない５％ＦＣ８のリン酸緩衝液に懸濁させ、これを、ガ
ラスウールカラムに付し、Ｎ液で溶出後杓、び同数で３
５Ｘ１０ｂ個／ ｍｔの＠度に調製する。
わち、ＣＢＡ ／ｃａＪマウス（♀＋ ６〜７ Ｗ ：
Ｅ］、ｌｅｒｓｌｉｅＡｎｉｍａｌＦ’ａｒｒｔ＋、
Ｕｎｉｖｐｒｓｊｔｙ ｏｆ Ａｌｈｅｒｔａ ）を放
射線処理（５００ｒａｄｐ ： １３７Ｃｓ ５ｏｕｒ
ｃｅ、Ｇａｍｍａ ｃｅ］１４０：Ａｔ、ｏｍｉｃ Ｅ
ｎｐｒｇｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ ） した
後、常法により採取し７た同種マウスの胸腺細胞１．５
×１０″″個を静脈注射［、た。（ａ Ｍアンモニウム
沈殿？ｉｌびＤＢＡＥ−セルロース・イオン交換カラム
クロマト法により渚法通シ処理し、で得たＲＧＧ５０μ
ｇをフロイントの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｆｒｅｕｎｃ］ｓ’ ａｄｊｕｖａｎｔ ） ｈ
［１１ｄｌと共に上記マウスの後足に皮下投与した。投
与７日後に牌細胞を摘出してＣｔ＝”、 Ｍｇ＋を含ま
ない５％ＦＣ８のリン酸緩衝液に懸濁させ、これを、ガ
ラスウールカラムに付し、Ｎ液で溶出後杓、び同数で３
５Ｘ１０ｂ個／ ｍｔの＠度に調製する。
この２縦をナイロン・ウールカラム（ＬＰ−１；Ｌｅｕ
ｋｏ Ｐａｋ、 Ｌｅｕｋｏｃｙｔｐ ｆｊｌｔｅｒ、
ＦｅｎｗＦＸＩＬａｋ）Ｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、 Ｍ
ｏｒ ｔｏｎ （）ｒｏｖｅ、 ｎｌ ）に付し、Ｃ０
２インキユベーター内で４５分インキュベーションした
後、非吸着細胞を同数で溶出し、これを４００ Ｆ／
Ｘ ７．５分で遠心処理し、水冷した１ ０−”Ｍ−Ｅ
Ｄ’ｒＡの０．０５ Ｍ−リン＃緩衝液 （…＝７．４
）で５Ｘ１０’個／１に調製する。この１１を氷冷した
ガラス−テフロンホモジナイザーにて、８０ ｒｐｍ、
６ストロ一ク／分で２０分間均一化した後生理食塩水
を加える。
ｋｏ Ｐａｋ、 Ｌｅｕｋｏｃｙｔｐ ｆｊｌｔｅｒ、
ＦｅｎｗＦＸＩＬａｋ）Ｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、 Ｍ
ｏｒ ｔｏｎ （）ｒｏｖｅ、 ｎｌ ）に付し、Ｃ０
２インキユベーター内で４５分インキュベーションした
後、非吸着細胞を同数で溶出し、これを４００ Ｆ／
Ｘ ７．５分で遠心処理し、水冷した１ ０−”Ｍ−Ｅ
Ｄ’ｒＡの０．０５ Ｍ−リン＃緩衝液 （…＝７．４
）で５Ｘ１０’個／１に調製する。この１１を氷冷した
ガラス−テフロンホモジナイザーにて、８０ ｒｐｍ、
６ストロ一ク／分で２０分間均一化した後生理食塩水
を加える。
このホモジネートを３５．０００．？Ｘ３０分で遠心処
理して上清を採取し、ミリポアフィルタ−（０，４５μ
二ミリボア社）に付し、ｐ液として増殖因子５Ｑ単位を
得る。このＦ液を生理食塩水で適当に稀釈し、ＲＧｔ４
異的増殖因子として以下使用する。
理して上清を採取し、ミリポアフィルタ−（０，４５μ
二ミリボア社）に付し、ｐ液として増殖因子５Ｑ単位を
得る。このＦ液を生理食塩水で適当に稀釈し、ＲＧｔ４
異的増殖因子として以下使用する。
■ ニワトリ赤血球（ＣＦｔＢＣ）
■のＲＧＧの替わシにＣＲＢＣ（ｔｌｎｍｏｚｙｇＯｕ
Ｓ Ｂ２；Ｂｉｏｓｃｊｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ、
５ｅｒｖｉｃｅ ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＡｌｂ
ｅｒｔａより入手したものを、惰性に従い分離・した）
５×１０７個を静脈内投与すること以外は同様にして、
ＣＲＢＣ（Ｂり％異的増殖因子を得る。以下■と同じ換
算値にて示す。
Ｓ Ｂ２；Ｂｉｏｓｃｊｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ、
５ｅｒｖｉｃｅ ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＡｌｂ
ｅｒｔａより入手したものを、惰性に従い分離・した）
５×１０７個を静脈内投与すること以外は同様にして、
ＣＲＢＣ（Ｂり％異的増殖因子を得る。以下■と同じ換
算値にて示す。
参考例 ２
〔アフィニティークロマトダラフィー用吸着体〕■ Ｃ
ＮＢｒ −活性化セファロース４Ｂ （ファルマシア社
製）１５．９（乾燥重量）を６１の［１，００１Ｎ＠酸
に懸濁１．６０分間静置後、ガラスフィルター上で０．
１Ｍ−炭酸水素ナトリウム＜ＰＩ−４＝８．５）１Ａ！
により洗浄して約５０”＠量の活性化セファロースを得
る。゛これを０．１ Ｍ−炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝
８．５ ） ２００縦に懸濁し、Ｒ（）Ｇ ５０舅ｇ
を含むｏ、ｏ Ｉ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ−７，７）
５１ｄを加えて、室温で攪拌しながら、１ ２時間反応させた。反応終了後、反応液をガラスフィル
ター上でｔ本洗浄１〜、反応物をＩＭ−モノエタノール
アミン溶液（ｐＨ＝ ３．５ ） ２００ｍｌに加え
、室温にて２時間反応させる。ガラスフィルター上で０
．１Ｍ−酢酸緩衝液（０，５Ｍ−ＮａＣ１を含む）１ｘ
と０．１Ｍ−ホウ酸緩衝液（０，５Ｍ −’ ＮａＣ１
を含む）１／（で交互に６回洗浄してＲＧＧ結合セファ
ロース４Ｂを得る。
ＮＢｒ −活性化セファロース４Ｂ （ファルマシア社
製）１５．９（乾燥重量）を６１の［１，００１Ｎ＠酸
に懸濁１．６０分間静置後、ガラスフィルター上で０．
１Ｍ−炭酸水素ナトリウム＜ＰＩ−４＝８．５）１Ａ！
により洗浄して約５０”＠量の活性化セファロースを得
る。゛これを０．１ Ｍ−炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝
８．５ ） ２００縦に懸濁し、Ｒ（）Ｇ ５０舅ｇ
を含むｏ、ｏ Ｉ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ−７，７）
５１ｄを加えて、室温で攪拌しながら、１ ２時間反応させた。反応終了後、反応液をガラスフィル
ター上でｔ本洗浄１〜、反応物をＩＭ−モノエタノール
アミン溶液（ｐＨ＝ ３．５ ） ２００ｍｌに加え
、室温にて２時間反応させる。ガラスフィルター上で０
．１Ｍ−酢酸緩衝液（０，５Ｍ−ＮａＣ１を含む）１ｘ
と０．１Ｍ−ホウ酸緩衝液（０，５Ｍ −’ ＮａＣ１
を含む）１／（で交互に６回洗浄してＲＧＧ結合セファ
ロース４Ｂを得る。
■ ＣＮＢｒ −活性化セファロース４Ｂビーズ（ファ
ルマシア社）とホリーＬ−リジン（ＰＬＬ、；シ〃゛マ
社）より■と一１様にして］”ＬＬ結合セファロース４
Ｂを得る。これを２．２ ｘ １１’、−１’ Ｍシュ
ークロースの９Ｘ１０−”Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７
．４）で洗浄後、参考例１■で使用したと同一のＣＲ，
ＢＣと同級＠袷中で混合する（ピース″：ＣＲＰＣ＝
２ ｍｅ ： ０．５ ｍｌ） ｃ、室温で３０分放散
後、ｌ゛ルタルアルデヒドフイシャー・サイエンテイフ
イク社）を最終濃度０．２５％となる様に滴加し、緩か
に攪拌しながら３７℃で９０分かけて固定する。次いで
、リン酸緩衝液で３同洗浄２ 後ｊリシル〃゛リシン（６０ｍｇ／ｌ ００＋＋＋ＩＶ
リン酸緩衝液）を加え、室温で３０分放置後、リン酸Ｍ
両液で洗浄してＣＲＢＣ結合セファロース４Ｂを得る。
ルマシア社）とホリーＬ−リジン（ＰＬＬ、；シ〃゛マ
社）より■と一１様にして］”ＬＬ結合セファロース４
Ｂを得る。これを２．２ ｘ １１’、−１’ Ｍシュ
ークロースの９Ｘ１０−”Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７
．４）で洗浄後、参考例１■で使用したと同一のＣＲ，
ＢＣと同級＠袷中で混合する（ピース″：ＣＲＰＣ＝
２ ｍｅ ： ０．５ ｍｌ） ｃ、室温で３０分放散
後、ｌ゛ルタルアルデヒドフイシャー・サイエンテイフ
イク社）を最終濃度０．２５％となる様に滴加し、緩か
に攪拌しながら３７℃で９０分かけて固定する。次いで
、リン酸緩衝液で３同洗浄２ 後ｊリシル〃゛リシン（６０ｍｇ／ｌ ００＋＋＋ＩＶ
リン酸緩衝液）を加え、室温で３０分放置後、リン酸Ｍ
両液で洗浄してＣＲＢＣ結合セファロース４Ｂを得る。
参考例 ６
〔増殖因子の精製〕
■ 参考例２．■で得た吸着体のカラム（１，５Ｘ４
Ｑｃｍ）を２ Ｍ −ＮａＣ１で洗浄後、生理食塩水で
平価化する。参考例１．０に準じて得た１０００単位の
増殖因子をこのカラムに付し、室温下１００ ＃−／ｈ
ｒの流速で流した。カラムを４℃に冷却した後、生理食
塩水にて溶出液の２８３ｎｍの吸光度が生理食塩水とＮ
じになるのが確認できるまで十分洗浄する。次いで２
Ｍ −ＮａＣ１（ｐｔｉ＝６．５）にて溶出してフラク
ションＭ２〜２ （２ｇ ’／ ’ｒｕｂｅ ）を採
取１〜で精製しＲＧ（）特異的増殖因子を得る。（第１
図参照） ■ ■と同様にして参考例２■で得た吸着体のカラム（
０，９×３３）を使用して、参考例１■に準じて得た増
殖因子５００単位を２ Ｍ −ＮａＣ１（ｐ）ｌ ＝
／）、５ ）にて溶出精製ｊてＣＲＰＣ（Ｂ２）％異的
増殖因子を得る。
Ｑｃｍ）を２ Ｍ −ＮａＣ１で洗浄後、生理食塩水で
平価化する。参考例１．０に準じて得た１０００単位の
増殖因子をこのカラムに付し、室温下１００ ＃−／ｈ
ｒの流速で流した。カラムを４℃に冷却した後、生理食
塩水にて溶出液の２８３ｎｍの吸光度が生理食塩水とＮ
じになるのが確認できるまで十分洗浄する。次いで２
Ｍ −ＮａＣ１（ｐｔｉ＝６．５）にて溶出してフラク
ションＭ２〜２ （２ｇ ’／ ’ｒｕｂｅ ）を採
取１〜で精製しＲＧ（）特異的増殖因子を得る。（第１
図参照） ■ ■と同様にして参考例２■で得た吸着体のカラム（
０，９×３３）を使用して、参考例１■に準じて得た増
殖因子５００単位を２ Ｍ −ＮａＣ１（ｐ）ｌ ＝
／）、５ ）にて溶出精製ｊてＣＲＰＣ（Ｂ２）％異的
増殖因子を得る。
実施例 １
■ 未感作のＣＢＡ／ｃａＪマウス（♀、８〜１２Ｗ）
よシ常法に従い牌細胞を摘出し、５％Ｆｃｓのリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ：Ｄｕ １ｂｅｃｃｏ社）に懸濁する。
よシ常法に従い牌細胞を摘出し、５％Ｆｃｓのリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ：Ｄｕ １ｂｅｃｃｏ社）に懸濁する。
イソバーク・フィコール（ファルマシア社）にて２００
０ｙＸ３０分、２０℃でリンパ球を分離しＰＢＳで洗浄
後、同ＰＴ−３８で１０Ｊ６＋／ｒＩＬＩＶに調整する
。前記参考例１（ａ）で使用したと同じＣＲＢＣ（Ｂ２
） ５Ｘ １０フイ固／ｍ１ＰＢＳをカロえ４°Ｃに
て１時間静置する。これを再ひイソバーク・フィコール
にて上記と同様に分離すれば下層にＣＲＢＣにロセ゛ッ
ト形成したＢ細胞３ Ｘ １０５個を得る。これを５％
ＦＣ３のＰＢＳにて３回洗浄する。
０ｙＸ３０分、２０℃でリンパ球を分離しＰＢＳで洗浄
後、同ＰＴ−３８で１０Ｊ６＋／ｒＩＬＩＶに調整する
。前記参考例１（ａ）で使用したと同じＣＲＢＣ（Ｂ２
） ５Ｘ １０フイ固／ｍ１ＰＢＳをカロえ４°Ｃに
て１時間静置する。これを再ひイソバーク・フィコール
にて上記と同様に分離すれば下層にＣＲＢＣにロセ゛ッ
ト形成したＢ細胞３ Ｘ １０５個を得る。これを５％
ＦＣ３のＰＢＳにて３回洗浄する。
これは９０％以上が表面免疫〃゛ロブリン陽性あった。
■ ■で得たＣＲＢＣ（ｉ、 ）感作Ｂ細胞を１０％Ｌ
／・ジインＦＣ８（Ｒｐ＋ｈＰｉｓ Ｃｂｅ＋ｎ、ｃｏ
） ５ Ｘ １０ ”ＩＭ ２−メルカプトエタノー
ルのクリックス培地を用いリンプロマイクロカルチャー
プレート （フロー社製）上で２Ｘ Ｉ １３個／ Ｑ
、２ ｍｌ Ｋ調製する。
／・ジインＦＣ８（Ｒｐ＋ｈＰｉｓ Ｃｂｅ＋ｎ、ｃｏ
） ５ Ｘ １０ ”ＩＭ ２−メルカプトエタノー
ルのクリックス培地を用いリンプロマイクロカルチャー
プレート （フロー社製）上で２Ｘ Ｉ １３個／ Ｑ
、２ ｍｌ Ｋ調製する。
これに参考例１■で得たＣＲＢＣ（Ｂ、 ）特異的増殖
因子を［，１又は５単位加え１０％Ｃ０２インキユベー
ター内で４日間培養した。
因子を［，１又は５単位加え１０％Ｃ０２インキユベー
ター内で４日間培養した。
４日目に５μＣ１／１の３Ｈ−チミンｙ（２（’ｉ／ｎ
ｍｏｌ） （ＡｍｅｓｈａｍＲａｄｉｏｃｂｅｍｉｃ
ａｌ、ｓ、）を加え１８時間後の取り込みをペックマン
・シンチレーションカウンターにて測定した。
ｍｏｌ） （ＡｍｅｓｈａｍＲａｄｉｏｃｂｅｍｉｃ
ａｌ、ｓ、）を加え１８時間後の取り込みをペックマン
・シンチレーションカウンターにて測定した。
更に前記ＣＨＢＣ（Ｂ２） ｂ ×１０７個の替わ如に
ＣＲＢＣ（Ｂ１３） ５ ｘ １０７個を使用すること
以外は同様にして針側を行つ′ｋＤ この結果を第１表に示す。
ＣＲＢＣ（Ｂ１３） ５ ｘ １０７個を使用すること
以外は同様にして針側を行つ′ｋＤ この結果を第１表に示す。
第１表
５
第１表よりＣＲＢＣ（Ｂ２）％異的増殖因子の存在下で
は特定の抗原［ＣＲＢＣ（Ｂ２） 〕を認識するＢ細胞
のみが増殖することが明らかである。
は特定の抗原［ＣＲＢＣ（Ｂ２） 〕を認識するＢ細胞
のみが増殖することが明らかである。
■ ■において参考例１■で得たＣＲＢＣ（Ｂ２ ）特
異的増殖因子の替わりに参考例３■で得た精製ＣＲＢＣ
（Ｂ ２ ）特異的増殖因子を種々の濃度で使用して、
同様に試験した。
異的増殖因子の替わりに参考例３■で得た精製ＣＲＢＣ
（Ｂ ２ ）特異的増殖因子を種々の濃度で使用して、
同様に試験した。
この結果を第２図に示す。
第２図より本発明方法に従えは特定の抗原を認識したＢ
細胞のみの増殖が得られ、これを選別できることが解る
。
細胞のみの増殖が得られ、これを選別できることが解る
。
■ 上記■において牌細胞よシＢ細胞を除いた残りの細
胞（非ロゼツト形成細胞）を放射線処理（１５００ラド
）後５チＦＣ８のＰＢＳで３回洗浄し分化因子とした。
胞（非ロゼツト形成細胞）を放射線処理（１５００ラド
）後５チＦＣ８のＰＢＳで３回洗浄し分化因子とした。
上記■において得られたＣＲＢＣ（Ｂ２）％異的Ｂ細胞
を上記分化因子２×１０”個の存在１にＡＦＣに分化し
た結果第１衣のＯにおいて４０６個／Ｃｕ１ｔｕｒｅの
ＣＲ，ＢＣ（Ｂ２）抗体を産生ずるＡＦＣが得られるこ
とを確認した。［Ａ、ＦＣの算定は６ Ｃｕｎｎｉｎｇｋｌａｍらの方法に従った（、 ： Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌ ４；５９９．１ ９６Ｂ
〕 ■ ＣＢＡ／ｃａＪ ？ウス（♀、８〜１２Ｗ）にＲＧ
Ｇ２５μｇをフロイント゛の完全アジュパン）′２５μ
ｇと共に皮下投与し、２週間毎に６回同量投与した。
を上記分化因子２×１０”個の存在１にＡＦＣに分化し
た結果第１衣のＯにおいて４０６個／Ｃｕ１ｔｕｒｅの
ＣＲ，ＢＣ（Ｂ２）抗体を産生ずるＡＦＣが得られるこ
とを確認した。［Ａ、ＦＣの算定は６ Ｃｕｎｎｉｎｇｋｌａｍらの方法に従った（、 ： Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌ ４；５９９．１ ９６Ｂ
〕 ■ ＣＢＡ／ｃａＪ ？ウス（♀、８〜１２Ｗ）にＲＧ
Ｇ２５μｇをフロイント゛の完全アジュパン）′２５μ
ｇと共に皮下投与し、２週間毎に６回同量投与した。
更にその後１カ月毎に３回、同量投与し、最終投与後５
日目に牌細胞を摘出して５％ＦＣ”ＳのｐＢｓＫＭ′Ｐ
Ａ＆イソバーク・フィコールにて２０００．９Ｘろ０７
）、２０°Ｃにてリンパ球を分離後、１ ｔ１’／ １
ａｔ、 ＰＢＳ Ｋ調製する。 Ｃ：ＲＢＣ５Ｘｌ
０７／１ ｍ１ＰＢＳを加え４°Ｃにて１時間放置後、
再びイソパーク・フィコールにて、上記と同様に分離し
てロゼツト形成細胞を得る。これを５％ＦＣ８のＰＢＳ
中３７℃２時間インキュベーションしてロセ゛ット解
離１．、Ｂ細胞３Ｘ１Ｌｌ’個を得る。
日目に牌細胞を摘出して５％ＦＣ”ＳのｐＢｓＫＭ′Ｐ
Ａ＆イソバーク・フィコールにて２０００．９Ｘろ０７
）、２０°Ｃにてリンパ球を分離後、１ ｔ１’／ １
ａｔ、 ＰＢＳ Ｋ調製する。 Ｃ：ＲＢＣ５Ｘｌ
０７／１ ｍ１ＰＢＳを加え４°Ｃにて１時間放置後、
再びイソパーク・フィコールにて、上記と同様に分離し
てロゼツト形成細胞を得る。これを５％ＦＣ８のＰＢＳ
中３７℃２時間インキュベーションしてロセ゛ット解
離１．、Ｂ細胞３Ｘ１Ｌｌ’個を得る。
これを１０％ＦＣ８、５ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプ
トエタノールのクリックス培地で、リンプロマイクロカ
ルチャープレートに２ Ｘ １０”１０．２１１１１に
調製する。
トエタノールのクリックス培地で、リンプロマイクロカ
ルチャープレートに２ Ｘ １０”１０．２１１１１に
調製する。
これに参考例３（１）で得たＲＧ（）特異的増殖因子を
夫々、０．０．ろ及びろ単位加え、１０ ％ ｃｏ２イ
ンキュベーター内で４日間培養した。
夫々、０．０．ろ及びろ単位加え、１０ ％ ｃｏ２イ
ンキュベーター内で４日間培養した。
得られたＢ細胞ケ前記の■と同様にしてＡＦＣに分化さ
せた結果を第２表に示す。
せた結果を第２表に示す。
第 ２ 表
第２表より、本発明方法によりＲＧＧを認識するＢ細胞
が特異的に増殖・選別されることが解る。
が特異的に増殖・選別されることが解る。
第１図はＲＧＧ特異的増殖因子の２ Ｍ −ＮａＣ１（
ｐＨ＝、’＋、５）による溶出曲線を示す図面である。
ｐＨ＝、’＋、５）による溶出曲線を示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 感作Ｂ細胞をＴ細胞由来の抗原特異的増殖因子の
存在下に培養することを特徴とする特許異性Ｂ細胞の製
造法。 ２、抗原特異的増殖因子が、Ｔ細胞由来の増殖因子を、
特異抗原と担体との複合体を吸着体とするアフィニティ
ークロマトグラフィーで精義したものである特許請求の
範囲第１項記載の抗原特異性Ｂ細胞の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56194886A JPS5896029A (ja) | 1981-12-03 | 1981-12-03 | 抗原特異性ｂ細胞の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56194886A JPS5896029A (ja) | 1981-12-03 | 1981-12-03 | 抗原特異性ｂ細胞の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5896029A true JPS5896029A (ja) | 1983-06-07 |
Family
ID=16331953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56194886A Pending JPS5896029A (ja) | 1981-12-03 | 1981-12-03 | 抗原特異性ｂ細胞の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5896029A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62163686A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 抗体産生細胞株の樹立方法 |
| WO1996031224A1 (fr) * | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Chugai Seiyaku Kabusiki Kaisha | Immunodepresseur |
-
1981
- 1981-12-03 JP JP56194886A patent/JPS5896029A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| IMMUNOBIOL=1979 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62163686A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 抗体産生細胞株の樹立方法 |
| WO1996031224A1 (fr) * | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Chugai Seiyaku Kabusiki Kaisha | Immunodepresseur |
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