ES2895640T3 - Receptores de antígenos quiméricos de BCMA - Google Patents

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Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende los aminoácidos 22-493 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos de BCMA
Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones y métodos mejorados para tratar afecciones relacionadas con las células B. Más particularmente, la invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR) mejorados que comprenden anticuerpos anti-BCMA murinos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente para expresar estos CAR, y el uso de estas composiciones para tratar efectivamente afecciones relacionadas con las células B.
Descripción de la técnica relacionada
Diversas enfermedades importantes implican a los linfocitos B, es decir, las células B. La fisiología anormal de las células B también puede conducir al desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, que incluyen, pero no se limitan a, el lupus eritematoso sistémico (SLE). La transformación maligna de las células B conduce a cánceres que incluyen, pero no se limitan a, linfomas, por ejemplo, mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin.
La gran mayoría de los pacientes que tienen neoplasias malignas de las células B, que incluye el linfoma no Hodgkin (NHL) y el mieloma múltiple (MM), contribuyen significativamente a la mortalidad por cáncer. La respuesta de las neoplasias malignas de las células B a diversas formas de tratamiento es mixta. Los métodos tradicionales de tratamiento de las neoplasias malignas de las células B, que incluye la quimioterapia y la radioterapia, tienen una utilidad limitada debido a los efectos secundarios tóxicos. La inmunoterapia con anticuerpos terapéuticos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD23, anti-CD52, anti-CD80 y anti-HLA-DR ha proporcionado un éxito limitado, debido en parte a perfiles farmacocinéticos deficientes, rápida eliminación de los anticuerpos por las proteasas séricas y la filtración en el glomérulo y la penetración en el sitio del tumor y niveles de expresión limitados del antígeno diana en las células cancerígenas. Los intentos de usar células modificadas genéticamente que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) también han tenido un éxito limitado. Además, la eficacia terapéutica de un dominio de unión a antígeno determinado usado en un CAR es impredecible: si el dominio de unión al antígeno se une con demasiada fuerza, las células T que expresan CAR inducen la liberación masiva de citocinas, lo que da como resultado una reacción inmune potencialmente fatal considerada una "tormenta de citocinas", y si el dominio de unión al antígeno se une demasiado débil, las células T que expresan CAR no muestran una eficacia terapéutica suficiente para eliminar las células cancerígenas.
Los documentos WO 2013/154 760, Carpenter y otros, Clin. Cancer Res., vol. 19, núm. 8, págs. 2048-2060, 2013, Wang y otros, Blood, vol. 124, núm. 21, resumen 1114, 2014 y WO 2014/130635 describen receptores de antígenos quiméricos.
Breve resumen
La invención se define en las reivindicaciones. La información técnica que se establece a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la descripción de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no es parte de la invención. La invención proporciona generalmente vectores mejorados para la generación de terapias de células T y métodos para el uso de las mismas.
Se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende: un dominio extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA (antígeno de maduración de células B) murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a uno o más epítopos de un polipéptido de BCMA humano; un dominio transmembrana, uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y un dominio de señalización primario.
El anticuerpo anti-BCMA murino o el fragmento de unión a antígeno que se une al polipéptido de BCMA humano se selecciona del grupo que consiste en: una Ig de camello, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de un solo dominio (sdAb, Nanocuerpo).
El anticuerpo anti-BCMA murino o el fragmento de unión a antígeno que se une al polipéptido de BCMA humano es un scFv.
El anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3.
El anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6.
El anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 7.
La secuencia de la cadena ligera variable comprende las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 1-3. El anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 8.
La secuencia de la cadena pesada variable comprende las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 4-6. El dominio transmembrana es de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3s, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 y PD1.
El dominio transmembrana es de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD1 y CD154.
En determinadas modalidades, el dominio transmembrana es de CD8a.
El uno o más dominios de señalización coestimuladores son de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70.
El uno o más dominios de señalización coestimuladores se seleccionan de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
El uno o más dominios de señalización coestimuladores se seleccionan de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
El uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD28.
El uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD134.
En otras modalidades, el uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD137.
En determinadas modalidades, un CAR comprende un polipéptido de la región bisagra.
En modalidades adicionales, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
En algunas modalidades, un CAR comprende una región espaciadora.
El polipéptido de la región espaciadora comprende las regiones CH2 y CH3 de la IgG1 o la IgG4.
En modalidades particulares, un CAR comprende un péptido señal.
En modalidades adicionales, el péptido señal comprende un polipéptido señal CD8a.
En una modalidad, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 9. Se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción.
En diversas modalidades particulares, se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR, en donde la secuencia polinucleotídica se establece en la SEQ ID NO: 10.
En diversas determinadas modalidades, se proporciona un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción o como se establece en la SEQ ID NO: 10.
En determinadas modalidades, el vector es un vector de expresión.
En modalidades adicionales, el vector es un vector episomal.
En modalidades particulares, el vector es un vector viral.
En modalidades adicionales, el vector es un vector retroviral.
En otras modalidades, el vector es un vector lentiviral.
Un vector que codifica un CAR de BCMA comprende la secuencia polinucleotídica establecida en la SEQ ID NO: 36. En modalidades adicionales, el vector lentiviral se selecciona del grupo que consiste esencialmente en: virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1); virus de inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS).
En modalidades particulares, un vector comprende una LTR retroviral izquierda (5'), una señal de empaquetamiento Psi (V), un segmento de polipurina central/pliegue de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral; un promotor unido operativamente al polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción; y una LTR retroviral derecha (3').
En otras modalidades, un CAR comprende una secuencia de poliadenilación heteróloga.
Un CAR comprende un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE) o un elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE).
El promotor de la LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo.
En modalidades adicionales, el promotor heterólogo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de los simios 40 (SV40).
En modalidades particulares, la LTR 5' o LTR 3' es una LTR lentiviral.
La LTR 3' comprende una o más modificaciones.
La LTR 3' comprende una o más deleciones.
En determinadas modalidades, la LTR 3' es una LTR autoinactivable (SIN).
En algunas modalidades, la secuencia de poliadenilación es una secuencia señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o de poliadenilación de p-globina de conejo.
Un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción comprende una secuencia de Kozak optimizada.
En modalidades adicionales, el promotor unido operativamente al polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en: un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-a), un promotor de fosfoglicerato quinasa 1 (PGK), un promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), un potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo (CAG), potenciador de polioma/promotor de timidina quinasa del herpes simple (MC1), un promotor de beta actina (p-ACT), un promotor del virus de los simios 40 (SV40) y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor con sitio de unión a cebador dl587rev sustituido (MND).
En diversas modalidades, se proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende un vector contemplado en la presente descripción. En diversas modalidades, la célula efectora inmunitaria se transduce con un vector contemplado en la presente descripción.
En modalidades adicionales, la célula efectora inmunitaria ex vivo o in vitro se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T y una célula asesina natural (NK).
La célula efectora inmunitaria se transduce con un vector y se activa y estimula en presencia de un inhibidor de la vía PI3K, de esta manera se mantiene la proliferación de las células efectoras inmunitarias transducidas en comparación con la proliferación de células efectoras inmunitarias transducidas que se activaron y estimularon en la ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
La célula efectora inmunitaria activada y estimulada en presencia del inhibidor de la vía PI3K tiene una expresión aumentada de i) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) todos los marcadores CD62L, CD127, CD197 y CD38 en comparación con una célula efectora inmunitaria activada y estimulada en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
El inhibidor de PI3K es ZSTK474.
En diversas modalidades, se proporciona una composición que comprende el efector inmunitario ex vivo o in vitro como se reivindica y un excipiente fisiológicamente aceptable.
En diversas modalidades, se proporciona un método in vitro o ex vivo para generar una célula efectora inmunitaria que comprende un CAR contemplado en la presente descripción, que comprende introducir en una célula efectora inmunitaria un vector que comprende un polinucleótido que codifica el CAR como se reivindica.
El método comprende además estimular la célula efectora inmunitaria e inducir la proliferación de la célula al poner en contacto la célula con anticuerpos que se unen a CD3 y anticuerpos que se unen a CD28; lo que genera de esta manera una población de células efectoras inmunitarias.
La célula efectora inmunitaria se estimula e induce a proliferar antes de introducir el vector.
En determinadas modalidades, las células efectoras inmunitarias comprenden linfocitos T.
En modalidades particulares, las células efectoras inmunitarias comprenden células NK.
Entonces, las células se activan y estimulan en presencia de un inhibidor de la vía PI3K, lo que mantiene de esta manera la proliferación de las células efectoras inmunitarias transducidas en comparación con la proliferación de células efectoras inmunitarias que se activan y estimulan en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
Las células efectoras inmunitarias activadas y estimuladas en presencia del inhibidor de la vía PI3K tienen expresión aumentada de i) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) todos los marcadores CD62L, CD127, CD197 y CD38 en comparación con células efectoras inmunitarias activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
El inhibidor de PI3K es ZSTK474.
Se contempla un método para tratar una afección relacionada con las células B en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición que comprende células T con CAR de BCMA contempladas en la presente descripción y opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La afección relacionada con las células B puede ser mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide, trastorno linfoproliferativo postrasplante, un trastorno inmunorregulador, artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome antifosfolípidos, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, esclerodermia, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolípido, vasculitis asociada a ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, anemia hemolítica autoinmunitaria y glomerulonefritis rápidamente progresiva, enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis primaria o asociada a inmunocitos, o gammapatía monoclonal de significado indeterminado.
La afección relacionada con las células B puede ser una neoplasia maligna de las células B.
La neoplasia maligna de células B puede ser mieloma múltiple (MM) o linfoma no Hodgkin (NHL).
El MM se selecciona del grupo que consiste en: mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmocitoma óseo solitario y plasmocitoma extramedular.
El NHL puede seleccionarse del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto.
La afección relacionada con las células B puede ser una neoplasia maligna de células plasmáticas.
La afección relacionada con las células B puede ser una enfermedad autoinmune.
La enfermedad autoinmune puede ser lupus eritematoso sistémico.
La afección relacionada con las células B puede ser artritis reumatoide.
La afección relacionada con las células B es púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave o anemia hemolítica autoinmunitaria.
Breve descripción de diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra un esquema de construcciones de CAR de antígeno de maduración de células B murinas (muBCMA).
La Figura 2a muestra la cantidad de IFNg liberado de células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR19A después de que las células se cocultivaran durante 24 horas con células K562 que expresan BCMA.
La Figura 2b muestra la cantidad de IFNg liberada de las células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR19A después de que las células se cocultivaran durante 24 horas con células K562 que carecen de expresión de BCMA en comparación con las células K562 que expresan BCMA. La Figura 3 muestra la cantidad de citocinas inflamatorias en los medios de crecimiento de células T control no transducidas, células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR19A, estimuladas 10 días antes del ensayo.
La Figura 4 muestra la cantidad de citocinas inflamatorias producidas por células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMAlO y células T con CAR19A en ausencia de estimulación antigénica.
La Figura 5 muestra la expresión de marcadores fenotípicos de activación al final de la fabricación de células T con CAR anti-BCMA. La expresión de HLA-DR y Cd25 se midió en células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CARl9A.
La Figura 6 muestra los niveles de caspasa-3 activada, una etapa necesaria en la apoptosis e importante para AICD en células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR anti-BCMA02 en ausencia de estimulación antigénica.
La Figura 7 muestra la cantidad de citocinas inflamatorias liberadas en células T con CAR anti-BCMA02 y anti-BCMA10 en medios que contienen suero bovino fetal (FBS), suero AB humano (HABS) o BCMA soluble 100 ng/ml.
La Figura 8A muestra el volumen tumoral en ratones NOD scid gamma (NSG) con tumores de mieloma múltiple humano subcutáneo experimental (RPMI-8226) de ~100 mm3. Los ratones se trataron con vehículo, 107 células T con CAR anti-BCMA02, 107 células T con CAR anti-BCMAlO, o Bortezomib (velcade).
La Figuras 8B muestra el volumen tumoral en ratones NOD scid gamma (NSG) con tumores de mieloma múltiple humano subcutáneo experimental (RPMI-8226) de ~100 mm3. Los ratones se trataron con vehículo, 107 células T con CAR anti-BCMA02, 107 células T con CAR anti-BCMAlO, o Bortezomib (velcade).
La Figura 9 muestra el nivel de expresión de BCMA en líneas celulares de linfoma y leucemia (círculos) y la actividad de las células T con CAR anti-BCMA en cada línea celular (liberación de IFNy, cajas). Líneas de células tumorales negativas para BCMA (BCMA-): leucemia mielógena (K562), leucemia linfoblástica aguda (NALM-6 y NALM-16); Linfoma de células del manto (REC-1); o el linfoma de Hodgkin (HDLM-2) mostró poca o ninguna liberación de IFNy. Líneas de células tumorales positivas para BCMA (BCMA+): leucemia linfoblástica crónica de células B (MEC-1), linfoma de células del manto (JeKo-1), linfoma de Hodgkin (RPMI-6666), linfoma de Burkitt (células de Daudi y células de Ramos) y mieloma (RPMI-8226) mostró liberación de IFNy sustancial.
La Figura 10A muestra la actividad in vivo del vehículo, células T con CAR anti-CD19A, células T con CAR anti-CD19 y células T con CAR anti-BCMA a células de linfoma de Burkitt que expresan BCMA (células Daudi) en un modelo de ratón NSG cuando se administran células T con CAR a los ratones 8 días después de la inducción del tumor.
La Figura 10B muestra la actividad in vivo del vehículo, células T con CAR anti-CD19A, células T con CAR anti-CD19 y células T con CAR anti-BCMA a células de linfoma de Burkitt que expresan BCMA (células Daudi) en un modelo de ratón NSG cuando se administran células T con CAR a los ratones 18 días después de la inducción del tumor.
La Figura 11 muestra actividad in vitro potente de las células T con CAR anti-BCMA lograda con una reducción del 50 por ciento de la expresión de CAR anti-BCMA. (A) Las poblaciones de células T se transdujeron con entre 4x108 y 5x107 unidades de transducción de un lentivirus que codifican una molécula de CAR anti-BCMA (MOI de 5 a 40). Las poblaciones de células T resultantes se normalizaron para contener 26 ± 4 % de células T positivas para CAR anti-BCMA. (B) La MFI de las células T con CAR anti-BCMA normalizadas osciló entre 885 y 1875 según se ensayó mediante citometría de flujo. (C) Las células K562 y las células K562-BCMA se cultivaron conjuntamente con células T con CAR anti-BCMA normalizadas en una relación efector 20:1 o 10:1 (E; célula T) para diana (T; mezcla 1:1 de K562 y células K562 BCMA) mostró una actividad citolítica comparable.
La Figura 12 muestra la fiabilidad del proceso de fabricación de células T con CAR anti-BCMA. (A) Los productos de células T con CAR anti-BCMA fabricados a partir de PBMC de 11 donantes individuales muestran niveles comparables de expansión en comparación con un cultivo emparejado de células T de donantes no transducidas. (B) Los productos de células T con CAR anti-BCMA fabricados a partir de los 11 donantes mostraron una eficiencia de transducción lentiviral (VCN) comparable. (C) La frecuencia de células T positivas para CAR anti-BCMA se midió mediante citometría de flujo y se encontró que la expresión de BCMA era comparable en todos los donantes. (D) Los productos de células T con CAR anti-BCMA fabricados a partir de los 11 donantes mostraron que liberan niveles de IFNy terapéuticamente relevantes cuando se establecen a células K562 que expresan BCMA.
La Figura 13 muestra diagramas de Venn para la coexpresión de CD127, CD197 y CD38 en células T anti-BCMA02 positivas para CD62L que se han cultivado en presencia de IL-2 o IL-2 y ZSTK474 durante diez días. Las células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con ZSTK474 mostraron un aumento en el porcentaje de células que coexpresan CD127, CD197 y CD38 en comparación con las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 sola.
La Figura 14 muestra un porcentaje aumentado de células T con CAR anti-BCMA02 que expresan CD8 en cultivos tratados con IL-2 y ZSTK474 (n = 7) en comparación con cultivos tratados con iL-2 sola. La expresión de CD8 se determinó mediante el uso de un anticuerpo anti-CD8 marcado con fluorescencia y citometría de flujo.
La Figura 15 muestra la cantidad de IFN-y liberado por células T con CAR anti-BCMA02 de 14 donantes después del cultivo con IL- sola o con IL-2 y ZSTK474. Al final del período de cultivo, se volvió a cultivar un número equivalente de células T con CAR anti-BCMA02 durante 24 horas en medio solo. La cantidad de IFN-Y liberado en 24 horas se cuantificó mediante ELISA. El cultivo en ZSTK474 no aumentó significativamente la liberación de citocinas tónicas de células T con CAR anti-BCMA02 en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con IL-2 sola.
La Figura 16 muestra actividad antitumoral de células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con IL-2, o IL-2 y ZSTK474, o una célula T con CAR anti-BCMA02 (tBCMA02) deficiente en señalización truncada tratada con IL-2 y ZSTK474 en un modelo de tumor de Daudi agresivo. Se observó una regresión tumoral completa en el 50 % de los ratones a los que se les administraron células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con IL-2 y ZSTK474.
La Figura 17 muestra actividad antitumoral de células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con IL-2, o IL-2 y ZSTK474 en un modelo de tumor de mieloma múltiple (RPMI-8226). Los animales tratados con IL-2- o IL-2 y células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con ZSTK474 evitaron completamente el crecimiento tumoral. Breve descripción de los identificadores de secuencia
Las SEQ ID NO: 1-3 establecen secuencias de aminoácidos de secuencias de CDR de la cadena ligera ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NO: 4-6 establecen secuencias de aminoácidos de secuencias de CDR de la cadena pesada ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 7 establece una secuencia de aminoácidos de una secuencia de cadena ligera ilustrativa para los CAR de BCMA contemplados en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 8 establece una secuencia de aminoácidos de secuencias de cadena pesada ilustrativas para los CAR de BCMA contemplados en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 9 establece una secuencia de aminoácidos de un CAR de BCMA ilustrativo contemplado en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 10 establece una secuencia polinucleotídica que codifica un CAR de BCMA ilustrativo contemplado en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 11 establece la secuencia de aminoácidos de BCMA humano.
Las SEQ ID NO: 12-22 establecen la secuencia de aminoácidos de diversos enlazadores.
Las SEQ ID NO: 23-35 establecen la secuencia de aminoácidos de los sitios de escisión de proteasa y los sitios de escisión de polipéptido autoescindible.
La SEQ ID NO: 36 establece la secuencia polinucleotídica de un vector que codifica un CAR de BCMA. Descripción detallada
A. Visión general
La descripción se refiere generalmente a composiciones y métodos mejorados para tratar afecciones relacionadas con las células B. Como se usa en la presente descripción, el término "afecciones relacionadas con las células B" se refiere a afecciones que implican una actividad inadecuada de las células B y neoplasias malignas de las células B. La descripción se refiere a una terapia celular adoptiva mejorada de afecciones relacionadas con células B mediante el uso de células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente. Los enfoques genéticos ofrecen un medio potencial para potenciar el reconocimiento inmunitario y la eliminación de las células cancerígenas. Una estrategia prometedora es modificar genéticamente células efectoras inmunitarias para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) que redirigen la citotoxicidad hacia las células cancerígenas. Sin embargo, las inmunoterapias de células adoptivas existentes para tratar los trastornos de las células B presentan un riesgo grave de comprometer la inmunidad humoral porque las células se dirigen a los antígenos expresados en todas o la mayoría de las células B.
En consecuencia, dichas terapias no son clínicamente convenientes y, por lo tanto, permanece la necesidad en la técnica de terapias más eficientes para las afecciones relacionadas con las células B que respeten la inmunidad humoral.
Las composiciones y los métodos mejorados de terapia celular adoptiva descritos en la presente descripción, proporcionan células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente que pueden expandirse fácilmente, exhiben persistencia a largo plazo in vivo y reducen el deterioro de la inmunidad humoral al dirigirse a la expresión por las células B del antígeno de maduración de células B (BCMA, también conocido como CD269 o superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 17; TNFRSF17).
BCMA es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (ver, por ejemplo, Thompson y otros, J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135, 2000 y Mackay y otros, Annu. Rev. Immunol, 21: 231-264, 2003. BCMA se une al factor de activación de células B (BAFF) y un ligando inductor de la proliferación (APRIL) (ver, por ejemplo, Mackay y otros, 2003 y Kalled y otros, Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005). Entre las células no malignas, se ha informado que el BCMA se expresa principalmente en células plasmáticas y subconjuntos de células B maduras (ver, por ejemplo, Laabi y otros, Em BO J., 77(1): 3897-3904, 1992; Laabi y otros, Nucleic Acids Res., 22(7): 1147­ 1154, 1994; Kalled y otros, 2005; O'Connor y otros, J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004; y Ng y otros, J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004. Los ratones deficientes en BCMA están sanos y tienen un número normal de células B, pero la supervivencia de las células plasmáticas de larga vida está alterada (ver, por ejemplo, O'Connor y otros, 2004; Xu y otros, Mol. Cell. Biol, 21(12): 4067-4074, 2001; y Schiemann y otros, Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001). El ARN de BCMA se ha detectado universalmente en células de mieloma múltiple y en otros linfomas, y diversos investigadores han detectado la proteína BCMA en la superficie de las células plasmáticas de pacientes con mieloma múltiple (ver, por ejemplo, Novak y otros, Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri y otros, Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007; Bellucci y otros, Blood, 105(10): 3945-3950, 2005; y Moreaux y otros, Blood, 703(8): 3148-3157, 2004.
Los CAR que comprenden secuencias de anticuerpos anti-BCMA murinos son altamente eficaces en comparación con los CAR de BCMA que comprenden secuencias de anticuerpos humanos particulares; someten una expansión en vivo robusta; y reconocen las células B humanas que expresan BMCA; muestran actividad citotóxica contra las células B que expresan BCMA; y no muestran signos de inducir una tormenta de citocinas, una afección potencialmente mortal en la que las citocinas liberadas por las células T activadas crean una respuesta inflamatoria repentina en el sistema que desencadena una fiebre no infecciosa.
Se proporciona un CAR que comprende un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular.
Se proporciona una célula efectora inmunitaria genéticamente modificada para expresar un CAR contemplado en la presente descripción. Las células T que expresan un CAR se denominan en la presente descripción células T con CAR o células T modificadas con CAR.
Las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción, se administran a un paciente con una afección relacionada con las células B, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria asociada con las células B o una neoplasia maligna de las células B.
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que están dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen más abajo con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra Edición, 2001); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Edición, 1989); Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; así como también monografías en revistas tales como Advances in Immunology. B. Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la descripción. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente descripción, en la presente descripción se describen modalidades preferidas de composiciones, métodos y materiales. Para los fines de la presente descripción, los siguientes términos se definen más abajo.
Los artículos "un", "una" y "el/la" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno, o a uno o más) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o uno o más elementos.
El uso de la alternativa (por ejemplo, “o") debe entenderse que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
El término "y/o" debe entenderse que significa una o ambas alternativas.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una modalidad, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15 %, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 % o ± 1 % sobre una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud.
A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, se entenderá que las palabras "comprende", "comprenden" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por 10 tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son indispensables u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye todos los elementos mencionados después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren o no contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción de los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son obligatorios u obligatorios, pero que no están presentes otros elementos que afecten materialmente la actividad o acción de los elementos enumerados.
La referencia a lo largo de esta descripción a "una modalidad", "una modalidad particular", "una modalidad relacionada", "una modalidad determinada " o "una modalidad adicional" o combinaciones de las mismas significa que una característica, estructura o rasgo en particular descrita en relación con la modalidad se incluye en al menos una modalidad de la presente descripción. Por lo tanto, las apariciones de las frases anteriores en diversos lugares a lo largo de esta descripción no se refieren todas necesariamente a la misma modalidad. Además, las características, estructuras o rasgos particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más modalidades. También se entiende que la mención positiva de una característica en una modalidad sirve como base para excluir la característica en una modalidad particular.
C. Receptores de antígenos quiméricos
Se proporcionan receptores modificados genéticamente que redirigen la citotoxicidad de las células efectoras inmunitarias hacia las células B. Estos receptores modificados genéticamente se denominan en la presente descripción receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, BCMA) con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmunitaria celular antitumoral anti-BCMA específica. Como se usa en la presente descripción, el término "quimérico" describe estar compuesto de partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio extracelular (también denominado dominio de unión o dominio de unión específico de antígeno) que se une a BCMA, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La activación del dominio de unión a antígeno anti-BCMA del CAR con BCMA en la superficie de una célula diana da como resultado el agrupamiento del CAR y suministra un estímulo de activación a la célula que contiene el CAR. La característica principal de los CAR es su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, lo que desencadena la proliferación, la producción de citocinas, la fagocitosis o la producción de moléculas que pueden mediar la muerte celular de la célula que expresa el antígeno diana de manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), al explotar las capacidades de direccionamiento específico a células de los anticuerpos monoclonales, ligandos solubles o correceptores específicos de células.
Un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un dominio de unión específico de BCMA murino; un dominio transmembrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares; y un dominio de señalización primario.
Un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo; uno o más dominios de bisagra o dominios espaciadores; un dominio transmembrana que incluye; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares; y un dominio de señalización primario.
1. Dominio de unión
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de BCMA humano expresado en una célula B. Como se usa en la presente descripción, los términos "dominio de unión", "dominio extracelular", "dominio de unión extracelular", "dominio de unión específico de antígeno" y "dominio de unión extracelular específico de antígeno" se usan indistintamente y proporcionan un CAR con la capacidad para unirse específicamente al antígeno diana de interés, por ejemplo, BCMA. El dominio de unión puede derivarse tanto de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.
Los términos "afinidad de unión específica" o "se une específicamente" o "unido específicamente" o "unión específica" o "dirigido específicamente" como se usa en la presente descripción, describen la unión de un anticuerpo anti-BCMA o un fragmento de unión a antígeno del mismo (o un CAR que comprende el mismo) a BCMA con una mayor afinidad de unión que la unión de fondo. Un dominio de unión (o un CAR que comprende un dominio de unión o una proteína de fusión que contiene un dominio de unión) "se une específicamente" a un BCMA si se une o se asocia con BCMA con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor o igual que aproximadamente 105 M-1. En determinadas modalidades, un dominio de unión (o una proteína de fusión del mismo) se une a una diana con una Ka mayor o igual que aproximadamente 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 o 1013 M-1. Los dominios de unión de "alta afinidad" (o proteínas de fusión de cadena simple de los mismos) se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1 o mayor.
Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10-5 M a 10-13 M, o menos). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas CAR de acuerdo con la presente descripción pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante ELISA competitivo (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), o mediante asociación de unión, o ensayos de desplazamiento mediante el uso de ligandos marcados, o mediante el uso de un dispositivo de resonancia de plasmones de superficie tal como el Biacore T100, que está disponible de Biacore, Inc., Piscataway, NJ, o tecnología de biosensores ópticos tales como el sistema EPIC o EnSpire que están disponibles de Corning y Perkin Elmer, respectivamente (ver también, por ejemplo, Scatchard y otros, (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las patentes de los Estados Unidos núms. 5 283 173; 5 468614, o el equivalente).
La afinidad de la unión específica es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de fondo o más.
El dominio de unión extracelular de un CAR comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a un agente de unión que es un polipéptido que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera o la cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno, tal como un péptido, lípido, polisacárido o ácido nucleico que contiene un determinante de antígeno, tal como los reconocidos por una célula inmunitaria.
Un "antígeno (Ag)" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, que incluye las composiciones (tal como una que incluye una proteína específica del cáncer) que se inyectan o absorben en un animal. Un antígeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o celular específica, lo que incluye los inducidos por antígenos heterólogos, tales como los antígenos descritos. En modalidades particulares, el antígeno diana es un epítopo de un polipéptido de BCMA. Un "epítopo" o "determinante de antígeno" se refiere a la región de un antígeno al que se une un agente de unión. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente tras la exposición a solventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5, aproximadamente 9 o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
Los anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como Ig de camello, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, proteínas Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, Nanocuerpo) y porciones de anticuerpos de longitud completa responsables de la unión a antígeno. El término también incluye formas modificadas genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno de estos. Ver, además, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3ra Ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Como comprenderá el experto en la técnica y como se describe en otra parte de la presente descripción, un anticuerpo completo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada consiste en una región variable y una primera, segunda y tercera región constante, mientras que cada cadena ligera consiste en una región variable y una región constante. Las cadenas pesadas de los mamíferos se clasifican como a, 8, £, y y H. Las cadenas ligeras de los mamíferos se clasifican como A o k. Las inmunoglobulinas que comprenden las cadenas pesadas a, 8, £, y y H se clasifican como inmunoglobulina (Ig)A, IgD, IgE, IgG e IgM. El anticuerpo completo tiene forma de "Y". El tallo de la Y consiste en las segunda y tercera regiones constantes (y para IgE e IgM, la cuarta región constante) de dos cadenas pesadas unidas entre sí y se forman enlaces disulfuro (intercadena) en la bisagra. Las cadenas pesadas y, a and 8 tienen una región constante compuesta por tres dominios Ig en tándem (en una línea) y una región bisagra para mayor flexibilidad; las cadenas pesadas m y s tienen una región constante compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina. La segunda y tercera regiones constantes se denominan "dominio CH2" y "dominio CH3", respectivamente. Cada brazo de la Y incluye la región variable y la primera región constante de una única cadena pesada unida a las regiones variable y constante de una única cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la unión a antígeno.
Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las CDR se pueden definir o identificar por métodos convencionales, como por la secuencia de acuerdo con Kabat y otros (Wu, TT y Kabat, E.A., J Exp Med. 132 (2): 211-50, (1970); Borden, P. y Kabat E.A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (ver Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991), o por la estructura según Chothia y otros (Choithia, C. y Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. y otros, Nature, 342: 877-883 (1989)).
Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, tales como los seres humanos. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente c DR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N terminal, y también se identifican típicamente por la cadena en la que se ubica la CDR particular. Por lo tanto, las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, mientras que las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2, y CDRL3. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solo un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están directamente implicadas en la unión a antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de la especificidad (SDR). Los ejemplos ilustrativos de las CDR de la cadena ligera que son adecuadas para construir CAR de BCMA humanizados contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 1-3. Los ejemplos ilustrativos de las c Dr de la cadena ligera que son adecuadas para construir CAR de BCMA humanizados contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID No : 4-6.
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Las referencias a "Vl" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la producción de células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Un "anticuerpo quimérico" tiene residuos del marco de una especie, como la humana, y CDR (que generalmente confieren unión a antígeno) de otra especie, como un ratón. En modalidades preferidas particulares, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de unión específica a un antígeno que es un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo "humanizado" es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora".
En modalidades particulares, un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, incluye, pero no se limita a, una Ig de camello (un anticuerpo de camélido (VHH)), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, Nanocuerpo).
"Ig de camello" o "VHH de camélido", como se usa en la presente descripción, se refiere a la unidad de unión a antígeno más pequeña conocida de un anticuerpo de cadena pesada (Koch-Nolte, y otros, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). Un "anticuerpo de cadenas pesadas" o un "anticuerpo de camélido" se refiere a un anticuerpo que contiene dos dominios VH y no contiene cadenas ligeras (Riechmann L. y otros, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); documentos WO94/04678; WO94/25591; patente de los Estados Unidos núm. 6005079).
"IgNAR", de "nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina", se refiere a una clase de anticuerpos del repertorio inmunitario de tiburones que consiste en homodímeros de un dominio variable del nuevo receptor de antígeno (VNAR) y cinco dominios constantes del nuevo receptor de antígeno (CNAR). Los IgNAR representan algunos de los andamios proteicos basados en inmunoglobulinas más pequeños conocidos y son muy estables y poseen características de unión eficientes. La estabilidad inherente puede atribuirse tanto a (i) el andamio de Ig subyacente, que presenta un número considerable de residuos expuestos a la superficie cargados e hidrófilos en comparación con los dominios VH y VL de anticuerpos convencionales que se encuentran en los anticuerpos murinos; y (ii) las características estructurales estabilizantes en los bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR) lo que incluyen puentes disulfuro entre bucles y patrones de enlaces de hidrógeno intrabucles.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión a antígeno. En una modalidad, una especie de Fv de doble cadena consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv de cadena simple (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de manera que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables (HVR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente descripción para el Fab' en el que el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404 097; WO 1993/01 161; Hudson y otros, Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y otros, PNAS USA 90: 6444­ 6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y otros, Nat. Med. 9: 129-134 (2003). "Anticuerpo de dominio único" o "sdAb" o "nanocuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en la región variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o la región variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL) (Holt, L. y otros, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única y en cualquier orientación (por ejemplo, VL-VH o VH-VL). Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.
Un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de unión específico de antígeno que es un scFv murino. Los anticuerpos de cadena simple pueden clonarse a partir de los genes de la región V de una hibridoma específica para una diana deseada. La producción de dichas hibridomas se ha convertido en una rutina. Se ha descrito una técnica que puede usarse para clonar la cadena pesada de la región variable (Vh) y la cadena ligera de la región variable (VL), por ejemplo, en Orlandi y otros, PNAS, 1989; 86: 3833-3837.
El dominio de unión específico de antígeno es un scFv murino que se une a un polipéptido de BCMA humano. Los ejemplos ilustrativos de cadenas pesadas variables que son adecuadas para construir los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 8. Los ejemplos ilustrativos de cadenas ligeras variables que son adecuadas para construir los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 7.
Los dominios de unión específicos de BCMA proporcionados en la presente descripción también comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. Dichas CDR pueden ser CDR no humanas o CDR no humanas alteradas seleccionadas de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la cadena pesada. Un dominio de unión específico de BCMA comprende (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una CDRL1 de la cadena ligera, una CDRL2 de la cadena ligera y una CDRL3 de la cadena ligera, y (b) una región variable de la cadena pesada que comprende una CDRH1 de la cadena pesada, una CDRH2 de la cadena pesada y una CDRH3 de la cadena pesada.
2. Enlazadores
En determinadas modalidades, los CAR contemplados en la presente descripción pueden comprender residuos enlazadores entre los diversos dominios, por ejemplo, añadidos para el espaciado y la conformación apropiados de la molécula. El enlazador es una secuencia de unión de la región variable. Una "secuencia de unión de la región variable" es una secuencia de aminoácidos que conecta los dominios de Vh y Vl y proporciona una función espaciadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión para que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica con la misma molécula diana que un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de la cadena ligera y pesada. Los CAR contemplados en la presente descripción pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o cinco o más enlazadores. La longitud de un enlazador es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, o cualquier longitud intermedia de aminoácidos. El enlazador es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos de longitud.
Los ejemplos ilustrativos de enlazadores incluyen polímeros de glicina (G)n; polímeros de glicina-serina (G1-5S1-5)n, donde n es un número entero de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco; polímeros de glicina-alanina; polímeros de alanina-serina; y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre dominios de proteínas de fusión tales como los CAR descritos en la presente descripción. La glicina accede significativamente más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992)). El experto en la técnica reconocerá que el diseño de un CAR en modalidades particulares puede incluir enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de manera que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como también una o más porciones que confieren una estructura menos flexible para proporcionar una estructura deseada del CAR.
Otros enlazadores ilustrativos incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 12); TGEKP (SEQ ID NO: 13) (ver, por ejemplo, Liu y otros, PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 14) (Pomerantz y otros, 1995, más arriba); (GGGGS)n en donde n = 1, 2, 3, 4 o 5 (SEQ iD NO: 15) (Kim y otros, PNAS 93, 1156-1160 (1996); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 16) (Chaudhary y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 17) (Bird y otros, 1988, Science 242: 423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 18); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 19); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 20); LRQKd (GGGS)2 ERP (SEQ ID NO: 21). Alternativamente, los enlazadores flexibles pueden diseñarse racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar tanto los sitios de unión al ADN como los péptidos mismos (Desjarlais y Berg, PNAS 90: 2256-2260 (1993), PNAS 91: 11099-11103 (1994) o métodos de presentación en fagos. En una modalidad, el enlazador comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 22) (Cooper y otros, Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3. Dominio espaciador
El dominio de unión del CAR está seguido por uno o más "dominios espaciadores", que se refiere a la región que aleja el dominio de unión a antígeno de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión a antígeno y la activación (Patel y otros, Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). El dominio bisagra puede derivarse tanto de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. En determinadas modalidades, un dominio espaciador es una porción de una inmunoglobulina, que incluye, sin limitación, una o más regiones constantes de cadena pesada, por ejemplo, CH2 y CH3. El dominio espaciador puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada. El dominio espaciador comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4.
4. Dominio bisagra
El dominio de unión del CAR generalmente está seguido por uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento del dominio de unión a antígeno lejos de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión a antígeno y la activación. Un CAR generalmente comprende uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio transmembrana (TM). El dominio bisagra puede derivarse tanto de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada. Una "región bisagra alterada" se refiere a (a) una región bisagra de origen natural con hasta 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o deleciones de aminoácidos), (b) una porción de una región de bisagra de origen natural que tiene al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 o 15 aminoácidos) de longitud con hasta 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o deleciones de aminoácidos), o (c) una porción de una región bisagra de origen natural que comprende la región bisagra principal (que puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud). En determinadas modalidades, uno o más residuos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural pueden estar sustituidos por uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, uno o más residuos de serina). Una región bisagra de inmunoglobulina alterada puede tener alternativa o adicionalmente un residuo de prolina de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje sustituido por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina).
Otros dominios bisagra ilustrativos adecuados para su uso en los CAR descritos en la presente descripción incluyen la región bisagra derivada de las regiones extracelulares de proteínas de membrana de tipo 1 tales como CD8a, CD4, CD28 y CD7, que pueden ser regiones bisagra de tipo salvaje de estas moléculas o pueden estar alteradas. En otra modalidad, el dominio bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
5. Dominio transmembrana (tm)
El "dominio transmembrana" es la porción del CAR que fusiona la porción de unión extracelular y el dominio de señalización intracelular y ancla el CAR a la membrana plasmática de la célula efectora inmunitaria. El dominio TM puede derivarse tanto de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio TM puede derivarse (es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana) de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3£, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 y PD1. En una modalidad particular, el dominio TM es sintético y comprende predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina.
En una modalidad, los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio TM derivado de CD8a. En otra modalidad, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio TM derivado de CD8a y un enlazador oligo- o polipeptídico corto, preferentemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM y el dominio de señalización intracelular del CAR. Un enlazador de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.
6. Dominio de señalización intracelular
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de un CAR que participa en la transducción del mensaje de la unión efectiva del CAR anti-BCMA a un polipéptido de BCMA humano en el interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, activación, producción de citocinas, proliferación y actividad citotóxica, lo que incluye la liberación de factores citotóxicos contra la célula diana unida al CAR, u otras respuestas celulares provocadas con la unión del antígeno al dominio extracelular del CAR.
El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula efectora inmunitaria. La función efectora de la célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o ayuda o actividad que incluye la secreción de una citocina. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y que dirige a la célula a realizar una función especializada. Aunque usualmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar todo el dominio. En la medida en que se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede usarse en lugar del dominio completo siempre que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular está destinado a incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.
Se conoce que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de dominios de señalización intracelular: dominios de señalización primaria que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) y dominios de señalización coestimuladora que actúan en una manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. En modalidades preferidas, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de señalización intracelular que comprende uno o más "dominios de señalización coestimuladora" y un "dominio de señalización primaria".
Los dominios de señalización primaria regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimuladora o inhibitoria. Los dominios de señalización primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor o ITAM.
Los ejemplos ilustrativos de ITAM que contienen dominios de señalización primaria que son de uso particular en la descripción incluyen los derivados de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En modalidades preferidas particulares, un CAR comprende un dominio de señalización primaria de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladora. Los dominios de señalización primaria intracelular y de señalización coestimuladora pueden estar unidos en cualquier orden en tándem al extremo terminal carboxilo del dominio transmembrana.
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden uno o más dominios de señalización coestimuladora para mejorar la eficacia y la expansión de las células T que expresan los receptores CAR. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio de señalización coestimuladora" o "dominio de coestimulación" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o receptores de Fc que proporcionan una segunda señal necesaria para la activación y función eficiente de los linfocitos T tras la unión al antígeno. Ejemplos ilustrativos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En una modalidad, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladora seleccionados del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En otra modalidad, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD137 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD28 y CD134 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD137 y CD134 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de BCMA expresado en células B.
Un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1 BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD35, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
Un CAR comprende un scFv anti-BCMA murino que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra seleccionado del grupo que consiste en: bisagra/CH2/CH3 de IgG1, bisagra/CH2/CH3 de IgG4, una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3s, Cd3z, c D4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1 BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
Un CAR comprende un scFv anti-BCMA murino que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio de bisagra seleccionado del grupo que consiste en: bisagra/CH2/CH3 de IgG1, bisagra/CH2/CH3 de IgG4 y una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD 154 y PD1; un enlazador oligo o polipéptido corto, preferentemente, entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA murino que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra/CH2/CH3 de IgG1 y un polipéptido CD8a; un dominio transmembrana CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimuladora intracelular CD137; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD134; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Un CAR comprende un scFv anti-BCMA murino que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD28; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Además, el diseño de los CAR contemplados en la presente descripción permite una expansión mejorada, persistencia a largo plazo y propiedades citotóxicas tolerables en las células T que expresan los CAR en comparación con las células T no modificadas o las células T modificadas para expresar otros CAR.
D. Polipéptidos
La presente descripción contempla, en parte, los polipéptidos de CAR y fragmentos de los mismos, las células y las composiciones que los comprenden, y los vectores que expresan los polipéptidos. En modalidades preferidas, se proporciona un polipéptido que comprende uno o más CAR como se establece en la SEQ ID NO: 9.
"Polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente, a menos que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no están limitados a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína de longitud completa, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. En diversas modalidades, los polipéptidos de CAR contemplados en la presente descripción comprenden una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína de manera cotraduccional o postraduccional. Los ejemplos ilustrativos de secuencias señal adecuadas útiles en las CAR descritas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, la secuencia señal de la cadena pesada de IgG1 y la secuencia señal de CD8a. Los polipéptidos pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas recombinantes y/o sintéticas bien conocidas. Los polipéptidos contemplados en la presente descripción abarcan específicamente los CAR de la presente descripción, o secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un CAR como se describe en la presente descripción.
Un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente descripción, se refieren al aislamiento y/o purificación in vitro de un péptido o molécula de polipéptido a partir de un entorno celular, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociado significativamente con sustancias in vivo. De manera similar, una "célula aislada" se refiere a una célula que se ha obtenido de un tejido u órgano in vivo y está sustancialmente libre de matriz extracelular.
Los polipéptidos incluyen "variantes de polipéptidos". Las variantes de polipéptidos pueden diferir de un polipéptido natural en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, mediante la modificación de una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores. Por ejemplo, en modalidades particulares, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los CAR mediante la introducción de una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones en un dominio de unión, bisagra, dominio TM, dominio de señalización coestimuladora o dominio de señalización primaria de un polipéptido de CAR. Preferentemente, los polipéptidos de la descripción incluyen polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con estos.
Los polipéptidos incluyen "fragmentos de polipéptidos". Los fragmentos de polipéptidos se refieren a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal y/o una deleción o sustitución interna de un polipéptido de origen natural o producido recombinantemente. En determinadas modalidades, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en determinadas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptidos particularmente útiles incluyen dominios funcionales, lo que incluye dominios de unión a antígeno o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-BCMA murino, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a: una región CDR, una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; una región variable de una cadena pesada o ligera; una porción de una cadena de anticuerpo o región variable que incluye dos CDR; y similares.
El polipéptido también puede fusionarse en marco o conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido.
Como se señaló anteriormente, los polipéptidos de la descripción pueden alterarse de diversas maneras, que incluye sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel y otros, (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), la patente de los Estados Unidos núm. 4873 192, Watson, J.D. y otros, (Molecular Biology of the Gene, cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias citadas allí. Se puede encontrar orientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff y otros, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
Una variante contendrá sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y todavía obtener una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características deseadas. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante de polipéptido equivalente, o incluso mejorada, de la descripción, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla 1.
TABLA 1-Codones de Aminoácidos
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Puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin abolir la actividad biológica mediante el uso de programas informáticos bien conocidos en la técnica, tales como el software DNASTAR™. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas descritas en la presente descripción son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados similarmente o no cargados. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), apolares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En un péptido o proteína, los expertos en esta técnica conocen sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos y, generalmente, pueden realizarse sin alterar la actividad biológica de una molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson y otros, Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224). Las sustituciones conservadoras ilustrativas se describen en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos núm. 61/241 647.
Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (­ 0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se conoce en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtienen una proteína funcionalmente biológica equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma efectiva sobre la base de la hidrofilicidad.
Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos núm. 4 554 101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos pueden basarse en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares.
Las variantes de polipéptidos incluyen además formas glucosiladas, conjugados agregativos con otras moléculas y conjugados covalentes con restos químicos no relacionados (por ejemplo, moléculas pegiladas). Las variantes covalentes pueden prepararse mediante la unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos o en el residuo N o C-terminal, como se conoce en la técnica. Las variantes incluyen además variantes alélicas, variantes de especies y muteínas. Los truncamientos o deleciones de regiones que no afectan la actividad funcional de las proteínas también son variantes.
Cuando se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias polinucleotídicas que los codifican pueden separarse mediante una secuencia IRES como se analiza en otra parte de la presente descripción. Dos o más polipéptidos pueden expresarse como una proteína de fusión que comprende una o más secuencias de polipéptidos autoescindibles.
Los polipéptidos de la presente descripción incluyen polipéptidos de fusión. Se proporcionan polipéptidos de fusión y polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión, por ejemplo, CAR. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más segmentos de polipéptidos. Los polipéptidos de fusión están típicamente unidos del extremo C-terminal al extremo N-terminal, aunque también pueden estar unidos del extremo C-terminal al extremo C-terminal, del extremo N-terminal al extremo N-terminal o del extremo N-terminal al extremo C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden o en un orden específico. Los polipéptidos de fusión o las proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos entre especies, siempre que se mantenga la actividad transcripcional deseada del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión pueden producirse por métodos químicos sintéticos o por enlace químico entre los dos restos o generalmente pueden prepararse mediante el uso de otras técnicas estándar. Las secuencias de ADN ligadas que comprenden el polipéptido de fusión están operativamente unidas a elementos de control transcripcionales o traduccionales adecuados como se analiza en otra parte de la presente descripción. Una pareja de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados o para facilitar el transporte de la proteína de fusión a través de la membrana celular.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender además una señal de escisión de polipéptidos entre cada uno de los dominios de polipéptidos descritos en la presente descripción. Además, el sitio del polipéptido puede ponerse en cualquier secuencia peptídica enlazadora. Las señales de escisión de polipéptidos ilustrativas incluyen sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos tales como sitios de escisión de proteasas, sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raras, sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y oligopéptidos virales autoescindibles (ver deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26). Los sitios de escisión de proteasas adecuados y los péptidos de autoescisión son conocidos por el experto (ver, por ejemplo, en Ryan y otros, 1997. J. Gener. Virol 78, 699-722; Scymczak y otros, (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasa ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas HC de potyvirus, proteasas PI de potyvirus (P35), proteasas NIa de byovirus, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picornavirus, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C del RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3C del PYVF (virus de la mancha amarilla de la chirivía), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, se prefieren los sitios de escisión de proteasas del TEV (virus del grabado del tabaco) en una modalidad, por ejemplo, EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 23), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO: 24) y ENLYFQS (SEQ ID NO: 25), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV se produce entre Q y G o Q y S).
Los péptidos autoescindibles incluyen aquellas secuencias de polipéptidos obtenidas a partir de péptidos 2A de potyvirus y cardiovirus, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus de la rinitis equina A, virus de Thosea asigna y teschovirus porcino.
El sitio del polipéptido autoescindible comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y otros, 2001. J. Gen. Virol. 82: 1027-1041).
TABLA 2 L ii 2A il r i in l n l i i n n i
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Un polipéptido contemplado en la presente descripción comprende un polipéptido de CAR.
E. Polinucleótidos
En modalidades preferidas, se proporciona un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos de CAR, es decir, la SEQ ID NO: 10. Como se usa en la presente descripción, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a ARN mensajero (ARNm), Ar N, ARN genómico (ARNg), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)), ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc) o ADN recombinante. Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos monocatenarios y bicatenarios. Preferentemente, los polinucleótidos de la descripción incluyen polinucleótidos o variantes que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción (ver, por ejemplo, el Listado de Secuencias), típicamente donde la variante mantiene al menos una actividad biológica de la secuencia de referencia. En diversos ejemplos ilustrativos, la presente descripción contempla, en parte, polinucleótidos que comprenden vectores de expresión, vectores virales y plásmidos de transferencia, y composiciones, y células que los comprenden.
Esta descripción proporciona polinucleótidos que codifican al menos aproximadamente 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 o más residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido de la descripción, así como también todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201,202, 203, etc.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante polinucleotídica" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia polinucleotídica de referencia o polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas que se definen más adelante. Estos términos incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con diferentes nucleótidos en comparación con un polinucleótido de referencia. A este respecto, se entiende bien en la técnica que pueden realizarse determinadas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones a un polinucleótido de referencia de manera que el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia.
Las frases "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia 50 % idéntica a", como se usa en la presente descripción, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas sobre la base nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido a lo largo de una ventana de comparación. Por lo tanto, puede calcularse un "porcentaje de identidad de secuencia" mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción, típicamente donde la variante de polipéptido mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.
Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero con frecuencia 15 a 18 y a menudo, al menos 25 unidades monoméricas, incluidos nucleótidos y residuos de aminoácidos. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia completa de polinucleótidos) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias están alineadas de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, Estados Unidos) o por inspección y el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) es generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como se describe por ejemplo por Altschul y otros, 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Puede encontrarse una discusión detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
Como se usa en la presente descripción, “polinucleótido aislado” se refiere a un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Un "polinucleótido aislado" también se refiere a un ADN complementario (ADNc), un ADN recombinante u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que se ha elaborado por la mano del hombre.
Los términos que describen la orientación de los polinucleótidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo hidroxilo (OH) libre). Las secuencias polinucleotídicas pueden anotarse en la orientación 5' a 3' o en la orientación 3' a 5'. Para el ADN y el ARNm, la cadena 5' a 3' se denomina cadena "sentido", "positiva" o "codificante" porque su secuencia es idéntica a la secuencia del premensajero (ARNprem) [excepto para uracilo (U) en el ARN, en lugar de timina (T) en el ADN]. Para el ADN y el ARNm, la cadena complementaria 3' a 5' que es la cadena transcrita por la ARN polimerasa se designa como cadena "molde", "antisentido", "negativa" o "no codificante". Como se usa en la presente descripción, el término "orientación inversa" se refiere a una secuencia 5' a 3' escrita en la orientación 3' a 5' o una secuencia 3' a 5' escrita en la orientación 5' a 3'.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la cadena complementaria de la secuencia de ADN 5' A G T C A T G 3' es 3' T C A G T A C 5'. La última secuencia a menudo se escribe como complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' C A T G A C T 3'. Se dice que una secuencia que es igual a su complemento inverso es una secuencia palindrómica. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.
Además, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, o fragmento de variante del mismo, como se describe en la presente descripción. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente descripción contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en humanos y/o primates. Además, también pueden usarse los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos.
El término "casete de ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias genéticas dentro de un vector que puede expresar un ARN, y posteriormente una proteína. El casete de ácido nucleico contiene el gen de interés, por ejemplo, un CAR. El casete de ácido nucleico está orientado posicionalmente y secuencialmente dentro del vector de manera que el ácido nucleico en el casete pueda transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, traducirse en una proteína o polipéptido, experimentar las modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la célula transformada, y se trasladará al compartimento apropiado para la actividad biológica mediante el direccionamiento a compartimentos intracelulares apropiados o la secreción hacia compartimentos extracelulares. Preferentemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para una fácil inserción en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restricción en cada extremo. En una modalidad preferida de la descripción, el casete de ácido nucleico contiene la secuencia de un receptor de antígeno quimérico usado para tratar una neoplasia maligna de las células B. El casete puede extraerse e insertarse en un plásmido o vector viral como una sola unidad.
En aspectos particulares, los polinucleótidos incluyen al menos un polinucleótido de interés. Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido de interés" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido (es decir, un polipéptido de interés), insertado en un vector de expresión que se desea expresar. Un vector puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polinucleótidos de interés. En determinadas modalidades, el polinucleótido de interés codifica un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. Los polinucleótidos de interés y los polipéptidos codificados a partir de ellos incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de tipo salvaje, así como también variantes funcionales y fragmentos de los mismos. Una variante funcional tiene al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad respecto a un polinucleótido de referencia o secuencia de polipéptido de tipo salvaje correspondiente. Una variante o fragmento funcional tiene al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 % de una actividad biológica de un polipéptido de tipo salvaje correspondiente.
El polinucleótido de interés no codifica un polipéptido, pero sirve como molde para transcribir ARNmi, ARNip o ARNhc, ribozima u otro ARN inhibidor. Un polinucleótido comprende un polinucleótido de interés que codifica un CAR y uno o más polinucleótidos de interés adicionales, que incluye, pero no se limita a, una secuencia inhibidora de ácido nucleico que incluye, pero no se limita a: un ARNip, un ARNmi, un ARNhc y una ribozima.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNip" o "ARN de interferencia corto" se refieren a una secuencia polinucleotídica corta que media en un proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia, inhibición de la traducción, inhibición de la transcripción o ARNi epigenético en animales (Zamore y otros, 2000, Cell, 101, 25-33; Fire y otros, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton y otros, 1999, Science, 286, 950-951; Lin y otros, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes y Dev., 13, 139-141; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). Un ARNip comprende una primera hebra y una segunda hebra que tienen el mismo número de nucleósidos; sin embargo, la primera y la segunda hebras están desplazadas de manera que los dos nucleósidos terminales de la primera y la segunda hebras no se emparejan con un residuo en la hebra complementaria. En determinados casos, los dos nucleósidos que no están emparejados son residuos de timidina. El ARNip debe incluir una región de suficiente homología con el gen diana, y tener una longitud suficiente en términos de nucleótidos, de modo que el ARNip, o un fragmento del mismo, pueda mediar la regulación negativa del gen diana. Por lo tanto, un ARNip incluye una región que es al menos parcialmente complementaria al ARN diana. No es necesario que exista una complementariedad perfecta entre el ARNip y la diana, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARNip, o un producto de escisión del mismo, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, tal como por escisión del ARNi del ARN diana. La complementariedad, o el grado de homología con la hebra diana, es más crítica en la hebra antisentido. Aunque a menudo se desea una complementariedad perfecta, particularmente en la hebra antisentido, algunas modalidades incluyen uno o más, pero preferentemente 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o menos emparejamientos erróneos con respecto al ARN diana. Los emparejamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, se encuentran preferentemente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4 o 3 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'. La hebra sentida sólo necesita ser suficientemente complementaria con la hebra antisentido para mantener el carácter global de doble hebra de la molécula.
Además, un ARNip puede modificarse o incluir análogos de nucleósidos. Las regiones monocatenarias de un ARNip pueden modificarse o incluir análogos de nucleósidos, por ejemplo, la región o regiones no apareadas de una estructura en horquilla, por ejemplo, una región que une dos regiones complementarias, puede tener modificaciones o análogos de nucleósidos. También es útil la modificación para estabilizar uno o más extremos 3' o 5' de un ARNip, por ejemplo, contra exonucleasas, o para favorecer que el agente ARNip antisentido entre en RISC. Las modificaciones pueden incluir enlazadores amino C3 (o C6, C7, C12), enlazadores tiol, enlazadores carboxilo, espaciadores no nucleotídicos (C3, C6, C9, C12, abásico, trietilenglicol, hexaetilenglicol), reactivos especiales de biotina o fluoresceína que vienen como fosforamiditas y que tienen otro grupo hidroxilo protegido por DMT, lo que permite múltiples acoplamientos durante la síntesis de ARN. Cada hebra de un ARNip puede tener una longitud igual o menor que 30, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 nucleótidos. La hebra tiene, preferentemente, al menos 19 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 21 y 25 nucleótidos de longitud. Los ARNip preferidos tienen una región dúplex de 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos, y uno o más salientes de 2-3 nucleótidos, preferentemente, uno o dos salientes 3', de 2-3 nucleótidos.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNmi" o "microARN" se refieren a pequeños ARN no codificantes de 20-22 nucleótidos, típicamente escindidos a partir de estructuras precursoras de ARN replegado de ~70 nucleótidos conocidas como pre-ARNmi. Los ARNmi regulan negativamente sus dianas en una de dos formas en dependencia del grado de complementariedad entre el ARNmi y la diana. En primer lugar, los ARNmi que se unen con una complementariedad perfecta o casi perfecta a las secuencias de ARNm que codifican proteínas inducen la vía de interferencia mediada por ARN (ARNi). Los ARNmi que ejercen sus efectos reguladores al unirse a sitios complementarios imperfectos dentro de las regiones no traducidas (UTR) 3' de sus dianas de ARNm, reprimen la expresión del gen diana postranscripcionalmente, aparentemente a nivel de traducción, a través de un complejo RISC que es similar a, o posiblemente idéntico al que se usa para la vía del ARNi. De acuerdo con el control de la traducción, los ARNmi que usan este mecanismo reducen los niveles de proteína de sus genes diana, pero los niveles de ARNm de estos genes solo se ven afectados mínimamente. Los ARNmi abarcan tanto ARNmi de origen natural como ARNmi diseñados artificialmente que pueden dirigirse específicamente a cualquier secuencia de ARNm. Por ejemplo, en una modalidad, el experto en la técnica puede diseñar construcciones de ARN de horquilla corta expresados como transcritos primarios de ARNmi humano (por ejemplo, miR-30 o miR-21). Este diseño añade un sitio de procesamiento de Drosha a la construcción de horquilla y se ha demostrado que aumenta en gran medida la eficiencia de la inactivación (Pusch y otros, 2004). El tallo en horquilla consiste en 22 nt de ARNds (por ejemplo, el antisentido tiene una complementariedad perfecta con la diana deseada) y un bucle de 15-19 nt de un miR humano. La adición del bucle miR y las secuencias flanqueantes de miR30 en uno o ambos lados de la horquilla da como resultado un aumento de más de 10 veces en el procesamiento de Drosha y Dicer de las horquillas expresadas en comparación con los diseños convencionales de ARNhc sin microARN. Un mayor procesamiento de Drosha y Dicer se traduce en una mayor producción de ARNip/ARNmi y una mayor potencia para las horquillas expresadas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNsh" o "ARN de horquilla corta" se refieren a una estructura de doble hebra que está formada por una única hebra de ARN autocomplementaria. Se prefieren para la inhibición las construcciones de ARNhc que contienen una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción, de secuencia codificante o no codificante, del gen diana. También se ha encontrado que las secuencias de ARN con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales con respecto a la secuencia diana son eficaces para la inhibición. Se prefiere una identidad de secuencia superior al 90 %, o incluso una identidad de secuencia del 100 %, entre el ARN inhibidor y la porción del gen diana. En determinadas modalidades preferidas, la longitud de la porción de formación de dúplex de un ARNhc es de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos de longitud, por ejemplo, correspondiente en tamaño a los productos de ARN producidos por escisión dependiente de Dicer. La construcción de ARNhc tiene una longitud de al menos 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases. La construcción de ARNhc tiene una longitud de 400-800 bases. Las construcciones de ARNhc son altamente tolerantes a la variación en la secuencia del bucle y el tamaño del bucle.\
Como se usa en la presente descripción, el término "ribozima" se refiere a una molécula de ARN catalíticamente activa capaz de escisión específica de sitio del ARNm diana. Se han descrito diversos subtipos, por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo y de horquilla. La actividad catalítica y la estabilidad de las ribozimas pueden mejorarse al sustituir desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en bases no catalíticas. Aunque pueden usarse ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio para destruir ARNm particulares, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden los ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm diana. El único requisito es que el ARNm diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo se conoce bien en la técnica.
Un método preferido de administración de un polinucleótido de interés que comprende un ARNip, un ARNmi, un ARNhc o una ribozima comprende una o más secuencias reguladoras, tales como, por ejemplo, una pol III constitutiva fuerte, por ejemplo, el promotor U6 de ARNpn humano, el promotor U6 de ARNpn de ratón, el promotor HI de ARN humano y de ratón y el promotor val de ARNt humano, o un promotor de pol II constitutivo fuerte, como se describe en otra parte de la presente descripción.
Los polinucleótidos de la presente descripción, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias señal, secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasas (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, como se describe en otra parte de la presente descripción o como se conoce en la técnica, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, de manera que la longitud total preferentemente está limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo previsto de ADN recombinante.
Los polinucleótidos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido puede insertarse en el vector apropiado. Ejemplos de vectores son plásmidos, secuencias de replicación autónoma y elementos transponibles. Los vectores ilustrativos adicionales incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales tales como el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma artificial derivado de PI (PAC), bacteriófagos tales como el fago lambda o el fago M13 y virus animales. Los ejemplos de categorías de virus animales útiles como vectores incluyen, sin limitación, retrovirus (incluidos los lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40). Ejemplos de vectores de expresión son los vectores pClneo (Promega) para la expresión en células de mamíferos; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y expresión génica mediada por lentivirus en células de mamíferos. Las secuencias codificantes de las proteínas quiméricas descritas en la presente descripción pueden ligarse en dichos vectores de expresión para la expresión de la proteína quimérica en células de mamífero.
Un vector que codifica un CAR contemplado en la presente descripción comprende la secuencia polinucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 36.
El vector es un vector episomal o un vector que se mantiene extracromosómicamente. Como se usa en la presente descripción, el término "episomal" se refiere a un vector que es capaz de replicarse sin integración en el ADN cromosómico del hospedero y sin pérdida gradual de una célula hospedera en división, lo que también significa que dicho vector se replica extracromosómicamente o episómicamente. El vector se modifica genéticamente para albergar la secuencia que codifica el origen de la replicación del ADN u "ori" de un virus del herpes linfotrófico o un virus del herpes gamma, un adenovirus, SV40, un virus del papiloma bovino, o una levadura, específicamente un origen de replicación de un virus del herpes linfotrófico o un herpesvirus gamma correspondiente al oriP del EBV. En un aspecto particular, el virus del herpes linfotrófico puede ser el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), el virus del herpes saimiri (HS) o el virus de la enfermedad de Marek (MDV). El virus de Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV) también son ejemplos de un herpesvirus gamma. Típicamente, la célula hospedera comprende la proteína transactivadora de replicación viral que activa la replicación.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector: origen de replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, señales de iniciación de traducción (secuencia de Shine Dalgarno o secuencia de Kozak) intrones, una secuencia de poliadenilación, regiones no traducidas 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares del hospedero para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su resistencia y especificidad. En dependencia del sistema de vectores y del hospedero utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores ubicuos y promotores inducibles.
Un vector para su uso en la práctica de la invención lo que incluye, pero no se limita a vectores de expresión y vectores virales, incluirá secuencias control exógenas, endógenas o heterólogas tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control "endógena" es aquella que está naturalmente ligada a un gen dado en el genoma. Una secuencia de control "exógena" es aquella que se coloca en yuxtaposición a un gen mediante manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de manera que la transcripción de ese gen es dirigida por el potenciador/promotor vinculado. Una secuencia control "heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que se manipula genéticamente.
El término "promotor", como se usa en la presente descripción, se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. Una ARN polimerasa inicia y transcribe polinucleótidos unidos operativamente al promotor. En modalidades particulares, los promotores operativos en células de mamífero comprenden una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción y/u otra secuencia encontrada 70 a 80 bases aguas arriba del inicio de la transcripción, una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido.
El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción potenciada y en algunos casos puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de forma cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto de promotor como de potenciador.
El término "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En una modalidad, el término se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor y/o potenciador) y una segunda secuencia de polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de control de expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite constantemente y continuamente la transcripción de una secuencia unida operativamente. Una secuencia de control de expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuos" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de célula", "específico de un tipo de célula", "específico de un linaje celular" o "específico de tejido" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente.
Las secuencias control de la expresión ubicuas ilustrativas adecuadas para su uso en modalidades particulares de la descripción incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un virus de los simios 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), una LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor (timidina quinasa) del virus del herpes simple (HSV), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de alargamiento 1 -alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína beta de choque térmico de 90 kDa, miembro 1 (HSP90B 1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), p-kinesina (p-KIN), el locus ROSA 26 humano (Irions y otros, Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)), un promotor de Ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un potenciador de citomegalovirus/promotor de p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido con sitio de unión a cebador de dl587rev (MND) (Challita y otros, J Virol. 69(2): 748-55 (1995)).
En una modalidad, un vector de la descripción comprende un promotor de MND.
Un vector de la descripción comprende un promotor de EF1a que comprende el primer intrón del gen EF1a humano. El vector de la descripción comprende un promotor de EF1a que carece del primer intrón del gen EF1a humano. Puede desearse expresar un polinucleótido que comprenda un CAR a partir de un promotor específico de células T. Como se usa en la presente descripción, "expresión condicional" puede referirse a cualquier tipo de expresión condicional que incluye, pero no se limita a, expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o patológico particulares, etc. Esta definición no pretende excluir la expresión específica de tejido o del tipo de célula. Determinados aspectos de la descripción proporcionan la expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla al someter a una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que provoque que el polinucleótido se exprese o que provoque un aumento o disminución en la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
Los ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles con esteroides tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles por tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible por tratamiento con diversos metales pesados), promotor de MX-1 (inducible por interferón), el sistema regulable de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin y otros, 2003, Gene, 323:67), el interruptor génico inducible por cumato (documento WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
La expresión condicional también puede lograrse mediante el uso de una recombinasa de ADN específica de sitio. De acuerdo con determinadas modalidades de la descripción, el vector comprende al menos un (típicamente dos) sitio(s) para la recombinación mediada por una recombinasa específica de sitio. Como se usa en la presente descripción, los términos "recombinasa" o "recombinasa específica de sitio" incluyen proteínas, enzimas, cofactores o proteínas asociadas de escisión o integradoras que están implicadas en reacciones de recombinación que implican uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser proteínas de tipo salvaje (ver Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de las mismas), fragmentos y variantes de los mismos. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en modalidades particulares de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, $C31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCEl y ParA.
Los vectores pueden comprender uno o más sitios de recombinación para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas específicas de sitio. Debe entenderse que el sitio diana para una recombinasa específica de sitio es además de cualquier sitio(s) requerido(s) para la integración de un vector, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral. Como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de recombinación", "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específica de sitio" se refieren a una secuencia de ácido nucleico particular a la que una recombinasa reconoce y se une.
Por ejemplo, un sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de recombinasa) que flanquean una secuencia de núcleo de 8 pares de bases (ver la Figura 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527 (1994)). Otros sitios loxP ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoess y otros, 1996; Bethke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langer y otros, 2O02), lox71 (Albert y otros, 1995) y lox66 (Albert y otros, 1995).
Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod y otros, 1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff y otros, 1988), FRT(RE) (Senecoff y otros, 1988).
Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que son reconocidas por la enzima recombinasa A Integrasa, por ejemplo, phi-c31. El qC31 SSR media la recombinación sólo entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth y otros, 2000). attB y attP, llamados así por los sitios de unión de la integrasa del fago en los genomas bacterianos y de fago, respectivamente, contienen repeticiones invertidas imperfectas que probablemente estén unidas por homodímeros 0C31 (Groth y otros, 2000). Los sitios del producto, attL y attR, son efectivamente inertes para la recombinación adicional mediada por 0C31 (Belteki y otros, 2003), lo que hace que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha encontrado que el ADN que lleva attB se inserta en un sitio attP genómico más fácilmente que un sitio attP en un sitio attB genómico (Thyagarajan y otros, 2001; Belteki y otros, 2003). Por lo tanto, las estrategias típicas posicionan mediante recombinación homóloga un "sitio de acoplamiento" que porta attP en un locus definido, que después se asocia con una secuencia entrante que porta attB para la inserción.
Como se usa en la presente descripción, un "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" se refiere a un elemento que promueve la entrada de ribosoma interno directo al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región que codifica una proteína), que conduce de esta manera a la traducción independiente de cap del gen. Ver, por ejemplo, Jackson y otros, 1990. Trends Biochem Sci 15(12): 477-83) y Jackson y Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. Los vectores contemplados por la descripción incluyen uno o más polinucleótidos de interés que codifican uno o más polipéptidos. En modalidades particulares, para lograr una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias polinucleotídicas pueden separarse mediante una o más secuencias de IRES o secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos autoescindibles.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de Kozak" se refiere a una secuencia de nucleótidos corta que facilita en gran medida la unión inicial de ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia consenso de Kozak es (GCC)RCCATGG, donde R es una purina (A o G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2): 283-92, y Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20): 8125-48). Los vectores contemplados por la descripción, comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia consenso de Kozak y que codifican un polipéptido deseado, por ejemplo, un CAR.
En algunos aspectos de la invención, un polinucleótido o una célula que alberga el polinucleótido utiliza un gen suicida, que incluye un gen suicida inducible para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o proliferación incontrolada. En aspectos específicos, el gen suicida no es inmunogénico para el hospedero que alberga el polinucleótido o la célula. Un determinado ejemplo de un gen suicida que puede usarse es caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 puede activarse mediante el uso de un inductor químico específico de dimerización (CID).
Los vectores comprenden segmentos de genes que provocan que las células efectoras inmunitarias de la invención, por ejemplo, las células T, sean susceptibles a la selección negativa in vivo. Por "selección negativa" se entiende que la célula infundida puede eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del individuo. El fenotipo seleccionable negativo puede ser el resultado de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, los siguientes: el gen de timidina quinasa de tipo I del virus de1Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler y otros, Cell 11: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT) y la citosina desaminasa bacteriana, (Mullen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 33 (1992)).
En algunos aspectos, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente, tales como las células T, comprenden un polinucleótido que comprende además un marcador positivo que permite la selección de células del fenotipo seleccionable negativo in vitro. El marcador seleccionable positivo puede ser un gen que, al introducirse en la célula hospedera, expresa un fenotipo dominante que permite la selección positiva de células portadoras del gen. Los genes de este tipo se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, el gen de la higromicina-B fosfotransferasa (hph) que confiere resistencia a la higromicina B, el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (neo o aph) de Tn5 que codifica la resistencia al antibiótico G418, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la adenosina desaminasa (ADA) y el gen de la resistencia a múltiples fármacos (MDR).
Preferentemente, el marcador seleccionable positivo y el elemento seleccionable negativo están enlazados de manera que la pérdida del elemento seleccionable negativo también necesariamente va acompañada por la pérdida del marcador seleccionable positivo. Aún con mayor preferencia, los marcadores seleccionables positivos y negativos se fusionan de modo que la pérdida de uno conduce obligatoriamente a la pérdida del otro. Un ejemplo de un polinucleótido fusionado que produce como un producto de expresión un polipéptido que confiere las características de selección tanto positivas como negativas deseadas descritas anteriormente es un gen de fusión de higromicina fosfotransferasa timidina quinasa (HyTK). La expresión de este gen produce un polipéptido que confiere resistencia a higromicina B para la selección positiva in vitro y sensibilidad a ganciclovir para la selección negativa in vivo. Ver Lupton S.D. y otros, Mol. and Cell. Biology 11: 3374-3378, 1991. Además, los polinucleótidos de la descripción que codifican los receptores quiméricos están en vectores retrovirales que contienen el gen fusionado, particularmente aquellos que confieren resistencia a higromicina B para la selección positiva in vitro, y sensibilidad a ganciclovir para la selección negativa in vivo, por ejemplo, el vector retrovira1HyTK descrito en Lupton, S. D. y otros, (1991), más arriba. Ver también las publicaciones de PCT US91/08442 y PCT/US94/05601, por S. D. Lupton, que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de marcadores seleccionables positivos dominantes con marcadores seleccionables negativos.
Los marcadores seleccionables positivos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en hph, nco y gpt, y los marcadores seleccionables negativos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en citosina desaminasa, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT y gpt. Los marcadores especialmente preferidos son genes de fusión seleccionables bifuncionales en los que el marcador seleccionable positivo se deriva de hph o neo, y el marcador seleccionable negativo se deriva de citosina desaminasa o un gen TK o marcador seleccionable.
F. Vectores virales
Una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) se transduce con un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral, que codifica un CAR. Por ejemplo, una célula efectora inmunitaria se transduce con un vector que codifica un CAR que comprende un anticuerpo anti-BCMA murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un polipéptido de BCMA, con un dominio de señalización intracelular CD3Z, CD28, 4-1BB, Ox40, o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, estas células transducidas pueden provocar una respuesta citotóxica mediada por CAR.
Los retrovirus son una herramienta común para el suministro de genes (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). En aspectos particulares, se usa un retrovirus para administrar un polinucleótido que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) a una célula. Como se usa en la presente descripción, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe inversamente su ARN genómico en una copia lineal de ADN de doble cadena y posteriormente integra covalentemente su ADN genómico en un genoma del hospedero. Una vez que el virus se integra en el genoma del hospedero, se denomina "provirus". El provirus sirve como un molde para la ARN polimerasa II y dirige la expresión de moléculas de a Rn que codifican las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para producir nuevas partículas virales.
Los retrovirus ilustrativos adecuados para su uso en modalidades particulares incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), espumavirus, virus de la leucemia murina de Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV) y lentivirus.
Como se usa en la presente descripción, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia en simios (SIV). Se prefieren cadenas principales de vectores basados en VIH (es decir, elementos de secuencia del VIH que actúan en cis). En aspectos particulares, se usa un lentivirus para administrar un polinucleótido que comprende un CAR a una célula.
Pueden usarse vectores retrovirales y más particularmente vectores lentivirales en la práctica de la presente descripción. En consecuencia, el término "retrovirus" o "vector retroviral", como se usa en la presente descripción, pretende incluir "lentivirus" y "vectores lentivirales", respectivamente.
El término "vector" se usa en la presente descripción para referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido está generalmente unido a, por ejemplo, insertado en, la molécula del vector de ácido nucleico. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula, o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula hospedera. Los vectores útiles incluyen, por ejemplo, plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN o plásmidos de ARN), transposones, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos y vectores virales. Los vectores virales útiles incluyen, por ejemplo, retrovirus y lentivirus defectuosos en la replicación.
Como será evidente para un experto en la técnica, el término "vector viral" se usa ampliamente para referirse a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido de transferencia) que incluye elementos de ácido nucleico derivados de virus que típicamente facilitan la transferencia de la molécula de ácido nucleico o integración en el genoma de una célula o en una partícula viral que media la transferencia de ácido nucleico. Las partículas virales típicamente incluirán diversos componentes virales y, a veces, también componentes de la célula hospedera además del (de los) ácido(s) nucleico(s).
El término vector viral puede referirse a un virus o partícula viral que puede transferir un ácido nucleico a una célula o al propio ácido nucleico transferido. Los vectores virales y los plásmidos de transferencia contienen elementos genéticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El término "vector retroviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, que se derivan principalmente de un retrovirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, que incluyen LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El término "vector híbrido" se refiere a un vector, LTR u otro ácido nucleico que contiene tanto secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, como secuencias virales no lentivirales. Un vector híbrido se refiere a un vector o plásmido de transferencia que comprende secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, para la transcripción inversa, replicación, integración y/o empaquetamiento. Los términos "vector lentiviral", "vector de expresión lentiviral" pueden usarse para referirse a plásmidos de transferencia lentivirales y/o partículas lentivirales infecciosas. Cuando se hace referencia en la presente descripción a elementos tales como sitios de clonación, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., debe entenderse que las secuencias de estos elementos están presentes en forma de ARN en las partículas lentivirales de la descripción y están presentes en forma de ADN en los plásmidos de ADN de la descripción.
En cada extremo del provirus hay estructuras llamadas "repeticiones terminales largas" o "LTR". El término "repetición terminal larga (LTR)" se refiere a dominios de pares de bases ubicados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan funciones fundamentales para la expresión de genes retrovirales (por ejemplo, promoción, iniciación y poliadenilación de transcritos génicos) y para la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación e integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 es la secuencia entre el sitio de unión del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR se compone de regiones U3, R y U5 y aparece tanto en los extremos 5' como 3' del genoma viral. Adyacente a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en partículas (el sitio Psi).
Como se usa en la presente descripción, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral, ver, por ejemplo, Clever y otros, 1995. J. of Virology, vol. 69, núm. 4; págs. 2101-2109. Diversos vectores retrovirales usan la señal de empaquetamiento mínima (también conocida como la secuencia psi [V]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de empaquetamiento", "señal de empaquetamiento", "psi" y el símbolo "V" se usan en referencia a la secuencia no codificante requerida para la encapsidación de cadenas de ARN retroviral durante la formación de la partícula viral.
En diversos aspectos, los vectores comprenden LTR 5' y/o LTR 3' modificadas. Cualquiera o ambas de las LTR pueden comprender una o más modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las modificaciones de la LTR 3' a menudo se realizan para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales al hacer que los virus sean deficientes para la replicación. Como se usa en la presente descripción, el término "defectuoso en la replicación" se refiere a un virus que no puede llevar a cabo una replicación completa y efectiva de modo que no se produzcan viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral deficientes para la replicación). El término "competente en la replicación" se refiere a un virus de tipo salvaje o un virus mutante que puede replicarse, de modo que la replicación viral del virus puede producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral competente para la replicación).
Los vectores "autoinactivadores" (SIN) se refieren a vectores deficientes para la replicación, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que la región promotora potenciadora de LTR (3') derecha, conocida como región U3, se ha modificado (por ejemplo, mediante deleción o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. Esto se debe a que la región U3 de LTR (3') derecha se usa como un molde para la región U3 de LTR (5') izquierda durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no puede llevarse a cabo sin el promotor potenciador de U3. En un aspecto adicional de la descripción, la LTR 3' se modifica de manera que la región U5 se reemplaza, por ejemplo, con una secuencia de poli(A) ideal. Debe señalarse que las modificaciones a las LTR, tales como modificaciones a la LTR 3', la LTR 5', o tanto a la LTR 3' como 5', también se incluyen en la descripción.
Se proporciona una mejora de seguridad adicional al reemplazar la región U3 de la LTR 5' con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores del virus de los simios 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), de citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), del virus del sarcoma de Rous (RSV) y del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa). Los promotores típicos pueden conducir a altos niveles de transcripción de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de recombinación para generar virus competentes en replicación porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción de virus. El promotor heterólogo tiene ventajas adicionales para controlar la manera en que se transcribe el genoma viral. Por ejemplo, el promotor heterólogo puede ser inducible, de manera que la transcripción de todo o parte del genoma viral ocurrirá solo cuando los factores de inducción estén presentes. Los factores de inducción incluyen, pero no se limitan a, uno o más compuestos químicos o las condiciones fisiológicas como la temperatura o el pH, en las que se cultivan las células hospederas.
En algunos aspectos, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El término "TAR" se refiere al elemento genético de "respuesta de transactivación" ubicado en la región R de las LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético transactivador lentiviral (tat) para potenciar la replicación viral. Sin embargo, este elemento no se requiere en modalidades en donde la región U3 de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
La "región R" se refiere a la región dentro de las LTR retrovirales que comienzan al inicio del grupo de protección (es decir, el inicio de la transcripción) y terminan inmediatamente antes del inicio del segmento de poli A. La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R desempeña un papel durante la transcripción inversa al permitir la transferencia del ADN naciente de un extremo del genoma al otro.
Como se usa en la presente descripción, el término "elemento FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el segmento central de polipurinas y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Los elementos FLAP adecuados se describen en la patente de los Estados Unidos núm.
6 682 907 y en Zennou y otros, 2000, Cell, 101: 173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en el segmento central de polipurinas (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN de tres cadenas: el pliegue (flap) de ADN central del VIH-1. Sin desear estar atados por ninguna teoría, el pliegue de ADN puede actuar como un determinante cis-activo de la importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. En aspectos particulares, las cadenas principales de vectores retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos FLAP aguas arriba o aguas abajo de los genes heterólogos de interés en los vectores. Por ejemplo, un plásmido de transferencia incluye un elemento FLAP. En un aspecto, un vector de la descripción comprende un elemento FLAP aislado de VIH-1.
Los vectores de transferencia retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos de exportación. El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador post-transcripcional, que actúa en cis, que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo al citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan al elemento de respuesta rev (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (ver, por ejemplo, Cullen y otros, 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen y otros, 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). En general, el elemento de exportación de ARN se coloca dentro de la UTR 3' de un gen, y puede insertarse como una o múltiples copias.
La expresión de secuencias heterólogas en vectores virales se incrementa mediante la incorporación de elementos reguladores postranscripcionales, sitios de poliadenilación eficientes y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales puede aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo a la proteína, por ejemplo, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE; Zufferey y otros, 1999, J. Virol., 73: 2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang y otros, Mol. Cell. Biol., 5: 3864); y similares (Liu y otros, 1995, Genes Dev., 9: 1766). En aspectos particulares, los vectores de la descripción comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE
En aspectos particulares, los vectores de la descripción carecen o no comprenden un elemento regulador postranscripcional (PTE) tal como un WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformación celular y/o no aumentan sustancial o significativamente la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, los vectores de la descripción carecen o no comprenden un PTE. En otros aspectos, los vectores de la descripción carecen o no comprenden un WPRE o HPRE como una medida de seguridad adicional.
Los elementos que dirigen la terminación eficiente y la poliadenilación de los transcritos del ácido nucleico heterólogo aumentan la expresión génica heteróloga. Las señales de terminación de la transcripción se encuentran generalmente aguas abajo de la señal de poliadenilación. En modalidades particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilación 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido a expresar. El término "sitio de poliA" o "secuencia de poliA" como se usa en la presente descripción denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola de poliA al extremo 3' de la secuencia de codificación y, por lo tanto, contribuir a una mayor eficiencia traduccional. La poliadenilación eficiente del transcrito recombinante es conveniente ya que los transcritos que carecen de una cola de poliA son inestables y se degradan rápidamente. Los ejemplos ilustrativos de señales de poliA que pueden usarse en un vector de la descripción, incluyen una secuencia de poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), una secuencia de poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA), u otra secuencia de poliA heteróloga o endógena adecuada conocida en la técnica.
En determinados aspectos, un vector retroviral o lentiviral comprende además uno o más elementos aislantes. Los elementos aislantes pueden contribuir a proteger las secuencias expresadas por lentivirus, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos, de los efectos del sitio de integración, que pueden estar mediados por elementos que actúan en cis presentes en el ADN genómico y conducir a la expresión desregulada de secuencias transferidas (es decir, efecto de posición; ver, por ejemplo, Burgess-Beusse y otros, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99: 16433; y Zhan y otros, 2001, Hum. Genet., 109: 471). En algunos aspectos, los vectores de transferencia comprenden uno o más elementos aislantes, la LTR 3' y tras la integración del provirus en el genoma del hospedero, el provirus comprende el uno o más aislantes tanto en la LTR 5' como en la LTR 3', en virtud de la duplicación de la LTR 3'. Los aislantes adecuados para su uso en la descripción incluyen, pero no se limitan a, el aislante de p-globina de pollo (ver Chung y otros, 1993. Cell 74: 505; Chung y otros, 1997. p Na S 94: 575; y Bell y otros, 1999. Cell 98: 387). Los ejemplos de elementos aislantes incluyen, pero no se limitan a, un aislante de un locus de p-globina, tal como HS4 de pollo. De acuerdo con determinadas modalidades específicas de la descripción, la mayoría o todas las secuencias de la cadena principal del vector viral derivan de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse o combinarse muchas fuentes diferentes de secuencias retrovirales y/o lentivirales y pueden acomodarse numerosas sustituciones y alteraciones en determinadas secuencias lentivirales sin afectar la capacidad de un vector de transferencia para realizar las funciones descritas en la presente descripción. Además, se conocen en la técnica una variedad de vectores lentivirales, ver Naldini y otros, (1996a, 1996b y 1998); Zufferey y otros, (1997); Dull y otros, 1998, las patentes de los Estados Unidos núms. 6013 516; y 5,994,136, muchos de los cuales pueden adaptarse para producir un vector viral o un plásmido de transferencia de la presente descripción. En diversos aspectos, los vectores de la descripción comprenden un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido CAR. Los vectores pueden tener una o más LTR, en donde cualquiera de las LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno de más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de la transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una señal de empaquetamiento Psi (V), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresión del gen terapéutico (por ejemplo, secuencias de poli (A)), y opcionalmente pueden comprender un WPRE o HPRE.
En unos aspectos particulares, el vector de transferencia de la descripción comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un segmento de polipurina central/pliegue de ADN (cPPT/FLAp); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una LTR retroviral derecha (3'); y opcionalmente un WPRE o HPRE. En un aspecto particular, el vector de transferencia de la descripción comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR retroviral derecha (3'); y una secuencia poli (A); y opcionalmente un WPRE o HPRE. En otro aspecto particular, la descripción proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR izquierda (5'); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido de CAR contemplado en la presente descripción; una LTR derecha (3'); y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un determinado aspecto, la descripción proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR de VIH-1 izquierda (5'); una señal de empaquetamiento Psi (y ); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR de VIH-1 derecha (3') autoinactivable (SIN); y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En otro aspecto, la descripción proporciona un vector que comprende: al menos una LTR; un segmento de polipurina central/pliegue de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; y un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un aspecto particular, la presente descripción proporciona un vector que comprende al menos una LTR; un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un determinado aspecto, la descripción proporciona al menos una LTR de VIH-1 SIN; una señal de empaquetamiento Psi (y ); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En diversos aspectos, el vector es un vector viral integrador.
En otros diversos aspectos, el vector es un vector viral episomal o no integrante.
En diversos aspectos, los vectores contemplados en la presente descripción comprenden retrovirus no integradores o defectuosos en la integración. En un aspecto, un retrovirus o lentivirus "de integración defectuosa" se refiere a retrovirus o lentivirus que tienen una integrasa que carece de la capacidad de integrar el genoma viral en el genoma de las células hospederas. En diversos aspectos, la proteína integrasa se muta para disminuir específicamente su actividad integrasa. Los vectores lentivirales incompetentes para la integración se obtienen mediante la modificación del gen pol que codifica la proteína integrasa, lo que da como resultado un gen pol mutado que codifica una integrasa deficiente integrativa. Tales vectores virales incompetentes para la integración se han descrito en la solicitud de patente WO 2006/010834.
Las mutaciones ilustrativas en el gen pol del VIH-1 adecuadas para reducir la actividad integrasa incluyen, pero no se limitan a:
H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H. Las mutaciones ilustrativas en el gen pol del VIH-1 adecuadas para reducir la actividad de la integrasa incluyen, pero no se limitan a: D64E, D64V, E92K, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, W235F y W235E.
En un aspecto particular, una integrasa comprende una mutación en uno o más de los aminoácidos, D64, D116 o E152. En un aspecto, una integrasa comprende una mutación en los aminoácidos D64, D116 y E152. En un aspecto particular, una integrasa de VIH-1 defectuosa comprende una mutación D64V.
Una "célula hospedera" incluye células electroporadas, transfectadas, infectadas o transducidas in vivo, ex vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la descripción. Las células hospederas pueden incluir células de empaquetamiento, células productoras y células infectadas con vectores virales. En modalidades particulares, las células hospederas infectadas con un vector viral de la descripción se administran a un sujeto que necesita de la terapia. En determinados aspectos, el término "célula diana" se usa indistintamente con célula hospedera y se refiere a células transfectadas, infectadas o transducidas de un tipo de célula deseado. En aspectos preferidos, la célula diana es una célula T.
La producción de partículas virales a gran escala es a menudo necesaria para lograr un título viral razonable. Las partículas virales se producen al transfectar un vector de transferencia en una línea celular de empaquetamiento que comprende genes virales estructurales y/o accesorios, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector de empaquetamiento" se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinucleótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes virales estructurales y/o accesorios. Típicamente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento, y se introducen en la célula mediante transfección, transducción o infección. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de transfección, transducción o infección. Se puede introducir un vector de transferencia retroviral/lentiviral de la presente descripción en una línea celular de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula o línea celular productora. Los vectores de empaquetamiento de la presente descripción pueden introducirse en células o líneas celulares humanas mediante métodos estándar que incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. En algunos aspectos, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador de selección dominante, tal como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de la selección en presencia del fármaco apropiado y el aislamiento de clones. Un gen marcador de selección puede unirse físicamente a genes codificados por el vector de empaquetamiento, por ejemplo, por IRES o péptidos virales autoescindibles.
Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan la variedad de células hospederas que finalmente pueden ser infectadas y transformadas por los retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de los lentivirus, como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por las células de empaquetamiento de la descripción están codificadas en un vector separado de los genes gag y pol virales, como se ha descrito previamente.
Los ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que se pueden emplear en la descripción incluyen, sin limitación: envolturas de MLV, envoltura 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste de las aves), y envolturas de virus de la gripe. De manera similar, pueden utilizarse genes que codifican las envolturas de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) así como también de virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y EIAV.
Las proteínas de la envoltura para pseudotipar un virus de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes virus: Influenza A tales como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), Influenza B, virus de Influenza C, virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis D, virus de la Hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo del virus Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, mononegavirales, Lyssavirus como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus de Mokola, virus de Duvenhage, virus de murciélago europeo 1 y 2 y virus de murciélago australiano, efemerovirus, vesiculovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV), virus del herpes como el virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV), virus del herpes humano (HHV), virus del herpes humano tipo 6 y 8, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, virus del gammaherpes murino, arenavirus como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, Virus de la fiebre hemorrágica asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus de Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Hantavirus, virus causante de fiebre hemorrágica con síndrome renal, virus de la fiebre del Valle del Rift, Filoviridae (filovirus), incluida la fiebre hemorrágica del Ébola y la fiebre hemorrágica de Marburgo, Flaviviridae, incluido el virus de la enfermedad del bosque de Kaysanur, el virus de la fiebre hemorrágica Omsk, el virus causante de la encefalitis transmitida por garrapatas y el Paramyxoviridae, como el virus Hendra y el virus Nipah, la variola mayor y la variola menor (viruela), alfavirus como el virus de la encefalitis equina venezolana, el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina del oeste, el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), el virus del Nilo Occidental, cualquier virus causante de encefalitis.
La descripción proporciona células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glucoproteína VSV-G.
Los términos "pseudotipo" o "pseudotipado", como se usan en la presente descripción, se refieren a un virus cuyas proteínas de la envoltura viral se han sustituido con las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede pseudotiparse con proteínas de la envoltura, proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite que el VIH infecte una variedad más amplia de células porque las proteínas de la envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a las células presentadoras CD4+. En un aspecto preferido de la descripción, las proteínas de la envoltura lentivirales se pseudotipifican con VSV-G. La descripción proporciona células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glicoproteína de la envoltura VSV-G.
Como se usa en la presente descripción, el término "líneas celulares de empaquetamiento" se usa en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, pero que expresan de manera estable o transitoria proteínas estructurales virales y enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el correcto empaquetamiento de partículas virales. Se puede emplear cualquier línea celular adecuada para preparar las células de empaquetamiento de la descripción. En general, las células son células de mamífero. En una modalidad particular, las células usadas para producir la línea celular de empaquetamiento son células humanas. Las líneas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células bOsC 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, Células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 y células 211A. En aspectos preferidos, las células de empaquetamiento son células 293, células 293T o células A549. En otro aspecto preferido, las células son células A549.
Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular productora" se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas retrovirales recombinantes, que comprende una línea celular de empaquetamiento y una construcción de vector de transferencia que comprende una señal de empaquetamiento. La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre virales puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas convencionales. Los métodos para preparar soluciones madre virales se conocen en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka y otros, (1995) Nucl. Acids Res. 23: 628-633, y N. R. Landau y otros, (1992) J. Virol.
66: 5110-5113. Las partículas virales infecciosas pueden recogerse de las células de empaquetamiento mediante el uso de técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recolectarse mediante lisis celular, o la recolección del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas virales recolectadas pueden purificarse si se desea. Las técnicas de purificación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica.
El suministro de un(os) gen(es) u otra secuencia polinucleotídica mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral mediante infección viral en lugar de mediante transfección se denomina "transducción". Los vectores retrovirales se transducen a una célula a través de la infección y la integración de provirus. Una célula diana, por ejemplo, una célula T, es "transducida" si comprende un gen u otra secuencia polinucleotídica suministrados a la célula por infección mediante el uso de un vector viral o retroviral. En aspectos particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias polinucleotídicas suministradas por un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.
Las células hospederas transducidas con un vector viral de la descripción que expresa uno o más polipéptidos, se administran a un sujeto para tratar y/o prevenir una neoplasia maligna de las células B. Pueden encontrarse otros métodos relacionados con el uso de vectores virales en la terapia génica, que pueden utilizarse de acuerdo con determinadas modalidades de la presente descripción, por ejemplo, en Kay, M.A. (1997) Chest 111 (Sup. 6): 138S-142S; Ferry, N. y Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 1975-81; Shiratory, Y. y otros (1999) Liver 19: 265-74; Oka, K. y otros (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11: 179-86; Thule, P. M. y Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7: 1744-52; Yang, N.S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12: 335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23: 746-58; Brody, S. L. y Crystal, R.G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716: 90-101; Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8: 2159-2172; Smith-Arica, J.R. y Bartlett, J.S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3: 43-49; y Lee, H.C. y otros, (2000) Nature 408: 483-8.
G. Células modificadas genéticamente
La presente descripción contempla, en modalidades particulares, células modificadas genéticamente para expresar los CAR contemplados en la presente descripción, para su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con las células B. Como se usa en la presente descripción, el término "diseñado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a la adición de material genético adicional en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula. Los términos "células modificadas genéticamente", "células modificadas" y "células redirigidas" se usan indistintamente. Como se usa en la presente descripción, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de material genético extra en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula que restaura, corrige o modifica la expresión de un gen, o con el propósito de expresar un polipéptido terapéutico, por ejemplo, un CAR
Los CAR contemplados en la presente descripción se introducen y expresan en células efectoras inmunitarias para redirigir su especificidad a un antígeno diana de interés, por ejemplo, un polipéptido de BCMA. Una "célula efectora inmunitaria" es cualquier célula del sistema inmunitario que tiene una o más funciones efectoras (por ejemplo, actividad citotóxica para matar células, secreción de citocinas, inducción de ADCC y/o CDC).
Las células efectoras inmunitarias de la invención pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas).
"Autólogas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células del mismo sujeto.
"Alogénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de la misma especie que difieren genéticamente de la célula en comparación.
"Singénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de un sujeto diferente que son genéticamente idénticas a la célula en comparación.
"Xenogénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de una especie diferente a la célula en comparación. En modalidades preferidas, las células de la descripción son alogénicas.
Las células efectoras inmunitarias ilustrativas usadas con los CAR contemplados en la presente descripción incluyen los linfocitos T. Los términos "células T" o "linfocitos T" se reconocen en la técnica y están destinados a incluir timocitos, linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T en reposo o linfocitos T activados. Una célula T puede ser una célula T auxiliar (Th), por ejemplo, una célula T auxiliar 1 (Th1) o una célula T auxiliar 2 (Th2). La célula T puede ser una célula T auxiliar (HTL; célula T CD4+) célula T CD4+, una célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), célula T CD4+CD8+, célula T CD4-CD8- o cualquier otro subconjunto de células T. Otras poblaciones ilustrativas de células T adecuadas para su uso en modalidades particulares incluyen las células T vírgenes y células T de memoria.
Como entenderá un experto, también pueden usarse otras células como células efectoras inmunitarias con los CAR como se describe en la presente descripción. En particular, las células efectoras inmunitarias incluyen además células NK, células NKT, neutrófilos y macrófagos. Las células efectoras inmunitarias incluyen además progenitoras de células efectoras en donde dichas células progenitoras pueden inducirse para diferenciarse en células efectoras inmunitarias in vivo o in vitro. Por lo tanto, la célula efectora inmunitaria incluye progenitoras de células efectoras inmunitarias tales como células madre hematopoyéticas (HSC) contenidas dentro de la población CD34+ de células derivadas de sangre de cordón umbilical, la médula ósea o de sangre periférica movilizada que tras la administración en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras, o que pueden inducirse in vitro a que se diferencien en células efectoras inmunitarias maduras.
Como se usa en la presente descripción, las células efectoras inmunitarias diseñadas genéticamente para contener CAR específico de BCMA pueden denominarse "células efectoras inmunitarias redirigidas específicas de BCMA."
El término "célula CD34+", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa la proteína CD34 en su superficie celular. "CD34", como se usa en la presente descripción, se refiere a una glicoproteína de la superficie celular (por ejemplo, proteína de sialomucina) que a menudo actúa como un factor de adhesión célulacélula y está implicada en la entrada de células T en los ganglios linfáticos. La población de células CD34+ contiene células madre hematopoyéticas (HSC), que tras la administración a un paciente se diferencian y contribuyen a todos los linajes hematopoyéticos, lo que incluye células T, células NK, células NKT, neutrófilos y células del linaje de monocitos/macrófagos.
La presente descripción proporciona métodos para preparar las células efectoras inmunitarias que expresan el CAR contemplado en la presente descripción. El método comprende transfectar o transducir células efectoras inmunitarias aisladas de un individuo de manera que las células efectoras inmunitarias expresen uno o más CAR como se describe en la presente descripción. En determinados aspectos, las células efectoras inmunitarias se aíslan de un individuo y se modifican genéticamente sin manipulación adicional in vitro. Después dichas células pueden volver a administrarse directamente al individuo. En aspectos adicionales, las células efectoras inmunitarias primero se activan y estimulan para que proliferen in vitro antes de modificarse genéticamente para expresar un CAR. A este respecto, las células efectoras inmunitarias pueden cultivarse antes y/o después de modificarse genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas para expresar un CAR contemplado en la presente descripción).
En modalidades particulares, antes de la manipulación in vitro o la modificación genética de las células efectoras inmunitarias descritas en la presente descripción, la fuente de células se obtiene de un sujeto. En aspectos particulares, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR comprenden las células T. Las células T pueden obtenerse a partir de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tales como sedimentación, por ejemplo, separación con FICOLL™. Las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, que incluye células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recolectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para el procesamiento subsecuente. Las células pueden lavarse con PBS o con otra solución adecuada que carezca de calcio, de magnesio y de la mayoría, o de todos los demás, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la técnica, una etapa de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada. Por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o similares. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. Los componentes no deseados de la muestra de aféresis pueden eliminarse en el medio de cultivo resuspendido directamente de la célula.
En determinados aspectos, las células T se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante lisis de los glóbulos rojos y al depletar los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. Puede aislarse adicionalmente una subpoblación específica de células T, que expresa uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO, mediante técnicas de selección positiva o negativa. En una modalidad, una subpoblación específica de células T, que expresan CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO se aísla adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método para su uso en la presente descripción es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. La citometría de flujo y la clasificación celular también pueden usarse para aislar poblaciones celulares de interés para su uso en la presente descripción.
Las PBMC pueden modificarse genéticamente directamente para expresar CAR mediante el uso de métodos contemplados en la presente descripción. Después del aislamiento de las PBMC, los linfocitos T se aíslan adicionalmente y tanto los linfocitos T citotóxicos como los auxiliares pueden clasificarse en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y efectoras antes o después de la modificación y/o expansión genética.
Las células CD8+ pueden obtenerse mediante el uso de métodos estándar. En algunas modalidades, las células CD8+ se clasifican además en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de antígenos de la superficie celular que están asociados con cada uno de esos tipos de células CD8+. Los linfocitos T CD8+ vírgenes se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos de células T vírgenes lo que incluye CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 y CD45RA.
En aspectos particulares, las células T de memoria están presentes tanto en los subconjuntos CD62L+ como en los CD62L' de los linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC se clasifican en fracciones CD62L'CD8+ y CD62L+CD8+ después de la tinción con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L. La expresión de marcadores fenotípicos de células T de memoria central incluyen CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y CD127 y son negativas para granzima B. En algunos aspectos, las células T de memoria central son células T CD45RO+, CD62L+, CD8+.
En algunos aspectos, las células T efectoras son negativas para CD62L, CCR7, CD28 y CD127, y positivas para granzima B y perforina.
En determinados aspectos, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células auxiliares T CD4+ pueden clasificarse en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos aspectos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD4+ CD45RO-, CD45RA+, CD62L+. En algunos aspectos, las células de memoria central CD4+ son positivas para CD62L y positivas para CD45RO. En algunos aspectos, las células efectoras CD4+ son negativas para CD62L y CD45RO.
Las células efectoras inmunitarias, tales como las células T, pueden modificarse genéticamente después del aislamiento mediante el uso de métodos conocidos, o las células efectoras inmunitarias pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de progenitores) in vitro antes de modificarse genéticamente. En una modalidad particular, las células efectoras inmunitarias, tales como las células T, se modifican genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos contemplados en la presente descripción (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR) y después se activan y expanden in vitro. Las células T pueden activarse y expandirse antes o después de la modificación genética para expresar un CAR, mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos núms.
6 352694; 6534 055; 6 905 680; 6692 964; 5858 358; 6887 466; 6 905 681; 7 144 575; 7067 318; 7 172869; 7 232566; 7175843; 5883223; 6905 874; 6797514; 6867041; y en la Publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20060121005.
En general, las células T se expanden por contacto con una superficie que tiene unido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. Las poblaciones de células T pueden estimularse por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. También se contempla la coestimulación de moléculas accesorias en la superficie de las células T.
En aspectos particulares, las PBMC o las células T aisladas se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como IL-2, IL-7 e/o IL-15. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diacione, Besancon, Francia) pueden usarse como otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg y otros, Transplant Proc. 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen y otros, J. Exp. Med. 190(9): 1319-1328, 1999; Garland y otros, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999). Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno "sustituta" (APC). Las células T pueden activarse y estimularse para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiados mediante el uso de métodos tales como los descritos en los documentos US6040 177; US 5827642; y WO 2012129514.
Las APC artificiales (aAPC) pueden obtenerse mediante ingeniería genética de las células K562, U937, 721.221, T2 y C1R para dirigir la expresión y secreción estables de una variedad de moléculas coestimuladoras y citocinas. En un aspecto particular, las aAPC K32 o U32 se usan para dirigir la expresión de una o más moléculas estimuladoras basadas en anticuerpos en la superficie celular de las AAPC. La expresión de diversas combinaciones de genes en la aAPC permite la determinación precisa de los requisitos de activación de las células T humanas, de manera que las aAPC pueden adaptarse para la propagación óptima de subconjuntos de células T con requisitos de crecimiento específicos y funciones distintas. Las aAPC apoyan el crecimiento ex vivo y la expansión a largo plazo de células T CD8 humanas funcionales sin requerir la adición de citocinas exógenas, en contraste con el uso de APC naturales. Las poblaciones de células T pueden expandirse mediante aAPC que expresan una variedad de moléculas coestimuladoras que incluyen, pero no se limitan a, CD137L (4-1BBL), c D134L (OX40L) y/o CD80 o CD86. Finalmente, las aAPC proporcionan una plataforma eficiente para expandir las células T modificadas genéticamente y para mantener la expresión de CD28 en las células T CD8. Las aAPC se proporcionan en los documentos WO 03/057171 y US2003/0147869.
En un aspecto, las células CD34+ se transducen con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la descripción. Las células CD34+ transducidas se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras in vivo después de la administración a un sujeto, generalmente el sujeto del que se aislaron originalmente las células. Las células CD34+ pueden estimularse in vitro antes de la exposición o después de modificarse genéticamente con un CAR como se describe en la presente descripción, con una o más de las siguientes citocinas: ligando Flt-3 (FLT3), factor de células madre (SCF), factor de crecimiento y diferenciación de megacariocitos (TPO), IL-3 e IL-6 de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Asheuer y otros, 2004; Imren, y otros, 2004).
La descripción proporciona una población de células efectoras inmunitarias modificadas para el tratamiento del cáncer, donde las células efectoras inmunitarias modificadas comprenden un CAR como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, se prepara una población de células efectoras inmunitarias modificadas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un paciente diagnosticado con una neoplasia maligna de las células B descrita en la presente descripción (donantes autólogos). Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, CD8+ o CD4+ y CD8+.
Las PBMC también pueden incluir otros linfocitos citotóxicos tales como células NK o células NKT. Un vector de expresión que porta la secuencia codificante de un CAR contemplado en la presente descripción puede introducirse en una población de células T, células NK o células NKT de donantes humanos. Las células T transducidas exitosamente que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante citometría de flujo para aislar células T CD3 positivas y después propagarse para aumentar el número de células T que expresan la proteína CAR además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y/o anticuerpos anti-CD28 e IL-2 o cualesquiera otros métodos conocidos en la técnica como se describe en otra parte de la presente descripción. Se usan procedimientos estándar para la criopreservación de células T que expresan la proteína CAR para el almacenamiento y/o preparación para su uso en un sujeto humano. En un aspecto, la transducción, cultivo y/o expansión in vitro de células T se realizan en ausencia de productos derivados de animales no humanos tales como suero de ternero fetal y suero bovino fetal. Dado que una población heterogénea de PBMC está genéticamente modificada, las células transducidas resultantes son una población heterogénea de células modificadas que comprenden un CAR que se dirige al BCMA como se contempla en la presente descripción.
Puede usarse una mezcla de, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más vectores de expresión diferentes para modificar genéticamente una población donante de células efectoras inmunitarias, en donde cada vector codifica una proteína receptora de antígeno quimérico diferente como se contempla en la presente descripción. Las células efectoras inmunitarias modificadas resultantes forman una población mixta de células modificadas, con una proporción de células modificadas que expresan más de una proteína CAR diferente.
La descripción proporciona un método para almacenar células efectoras inmunitarias que expresan proteína CAR murina, humana o humanizada modificada genéticamente que se dirigen a una proteína del BCMA, que comprende criopreservar las células efectoras inmunitarias de manera que las células permanezcan viables tras la descongelación. Una fracción de las células efectoras inmunitarias que expresan las proteínas CAR puede criopreservarse mediante métodos conocidos en la técnica para proporcionar una fuente permanente de dichas células para el tratamiento futuro de pacientes afectados por la afección relacionada con las células B. Cuando sea necesario, las células efectoras inmunitarias transformadas criopreservadas pueden descongelarse, cultivarse y expandirse para obtener más de dichas células.
Como se usa en la presente descripción, "criopreservación" se refiere a la conservación de las células mediante el enfriamiento a temperaturas bajo cero, tales como (típicamente) 77 K o -196 °C. (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores se usan a menudo a temperaturas bajo cero para impedir que las células que se conservan se dañen debido al congelamiento a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente.
Los agentes criopreservantes y las tasas de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). La tasa de enfriamiento preferida es de 1 °C a 3 °C/minuto. Después de al menos dos horas, las células T han alcanzado una temperatura de -80 °C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento permanente, como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.
H. Métodos de producción de células T
Las células T fabricadas mediante los métodos contemplados en la presente descripción proporcionan composiciones mejoradas de inmunoterapia adoptiva. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que las composiciones de células T fabricadas por los métodos contemplados en la presente descripción están imbuidas de propiedades superiores, que incluyen una mayor supervivencia, expansión en la relativa ausencia de diferenciación y persistencia in vivo. El método de fabricación de células T comprende poner en contacto las células con uno o más agentes que modulan una vía de señalización de células PI3K. El método de fabricación de células T comprende poner en contacto las células con uno o más agentes que modulan una vía de señalización de células PI3K/Akt/mTOR. Las células T pueden obtenerse de cualquier fuente y ponerse en contacto con el agente durante las fases de activación y/o expansión del proceso de fabricación. Las composiciones de células T resultantes están enriquecidas en células T potentes para el desarrollo que tienen la capacidad de proliferar y expresar uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 y c D38. Las poblaciones de células que comprenden células T, que han sido tratadas con uno o más inhibidores de PI3K están enriquecidas para una población de células T CD8+ que coexpresan uno o más o, o todos, los siguientes biomarcadores: CD62L, CD127, CD197 y CD38.
Se fabrican las células T modificadas que comprenden niveles mantenidos de proliferación y diferenciación disminuida. En un aspecto particular, las células T se fabrican mediante la estimulación de las células T para que se activen y proliferen en presencia de una o más señales estimulantes y un agente que es un inhibidor de una vía de señalización de células PI3K.
A continuación, las células T pueden modificarse para expresar un CAR anti-BCMA. En una modalidad, las células T se modifican mediante la transducción de las células T con un vector viral que comprende un CAR anti-BCMA contemplado en la presente descripción. En un determinado aspecto, las células T se modifican antes de la estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización de células PI3K. En otro aspecto, las células T se modifican después de la estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización de células PI3K. En un aspecto particular, las células T se modifican dentro de las 12 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas de estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización de células PI3K.
Una vez que se activan las células T, las células se cultivan para que proliferen. Las células T pueden cultivarse durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión.
Las composiciones de células T se fabrican en presencia de uno o más inhibidores de la vía de PI3K. Los inhibidores pueden dirigirse a una o más actividades en la vía o una sola actividad. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se contempla que el tratamiento o el contacto de las células T con uno o más inhibidores de la vía PI3K durante las fases de estimulación, activación y/o expansión del proceso de fabricación aumenta preferentemente las células T jóvenes, por lo que se producen de esta manera composiciones superiores de células T terapéuticas. Se proporciona un método para aumentar la proliferación de células T que expresan un receptor de células T diseñado. Tales métodos pueden comprender, por ejemplo, recolectar una fuente de células T de un sujeto, estimular y activar las células T en presencia de uno o más inhibidores de la vía PI3K, modificar las células T para expresar un CAR anti-BCMA, por ejemplo, CAR anti-BCMA02m, y expandir las células T en cultivo.
En un determinado aspecto, un método para producir poblaciones de células T enriquecidas para la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 y CD38. Las células T jóvenes comprenden uno o más de, o todos, los siguientes marcadores biológicos: CD62L, CD127, CD197 y CD38. En una modalidad, se proporcionan las células T jóvenes que carecen de expresión de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3. Como se discutió en otra parte de la presente descripción, los niveles de expresión de biomarcadores de células T jóvenes son relativos a los niveles de expresión de tales marcadores en células T más diferenciadas o poblaciones de células efectoras inmunitarias.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se usan como fuente de células T en los métodos de fabricación de células T contemplados en la presente descripción. Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, CD8+ o CD4+ y CD8+ y pueden incluir otras células mononucleares como monocitos, células B, células NK y células NKT. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un TCR modificado genéticamente o un CAR contemplado en la presente descripción puede introducirse en una población de células T, células NK o células NKT de donantes humanos. Las células T transducidas exitosamente que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante el uso de citometría de flujo para aislar células T CD3 positivas y después propagarse para aumentar el número de células T modificadas además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y/o anticuerpos anti-CD28 e IL-2, IL-7 e/o IL-15 o cualquier otro método conocido en la técnica como se describe en otra parte de la presente descripción.
Los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción pueden comprender además la crioconservación de células T modificadas para almacenamiento y/o preparación para su uso en un sujeto humano. Las células T se criopreservan de modo que las células permanezcan viables tras la descongelación. Cuando sea necesario, las células efectoras inmunitarias transformadas criopreservadas pueden descongelarse, cultivarse y expandirse para obtener más de dichas células. Como se usa en la presente descripción, "criopreservación" se refiere a la conservación de las células mediante el enfriamiento a temperaturas bajo cero, tales como (típicamente) 77 K o -196 °C. (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores se usan a menudo a temperaturas bajo cero para prevenir el daño de las células que se conservan debido al congelamiento a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes criopreservantes y las tasas de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). La tasa de enfriamiento preferida es de 1 °C a 3 °C/minuto. Después de al menos dos horas, las células T han alcanzado una temperatura de -80 °C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento permanente, como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.
1. Células T
La presente descripción contempla la fabricación de composiciones mejoradas de células T con CAR. Las células T usadas para la producción de células T con CAR pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas). En aspectos preferidos, las células T se obtienen de un sujeto mamífero. En una modalidad más preferida, las células T se obtienen de un sujeto primate. En el aspecto más preferido, las células T se obtienen de un sujeto humano.
Las células T pueden obtenerse a partir de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tales como sedimentación, por ejemplo, separación con FICOLL™. Las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, lo que incluye células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una modalidad, las células recolectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para el procesamiento posterior. Las células pueden lavarse con PBS o con otra solución adecuada que carezca de calcio, de magnesio y de la mayoría, o de todos los demás, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la técnica, una etapa de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada. Por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o similares. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. Los componentes no deseados de la muestra de aféresis pueden eliminarse en el medio de cultivo resuspendido directamente de la célula.
Una población de células que comprenden células T, por ejemplo, las PBMC, se usan en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. Se usa una población aislada o purificada de células T en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. Las células T se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante lisis de los glóbulos rojos y al depletar los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. En algunos aspectos, después del aislamiento de PBMC, los linfocitos T citotóxicos y auxiliares pueden clasificarse en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y efectoras antes o después de la activación, expansión y/o modificación genética.
Puede aislarse adicionalmente una subpoblación específica de células T, que expresa uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA CD45rO, CD62, CD127 y HLA-DR, mediante técnicas de selección positiva o negativa. En un aspecto, una subpoblación específica de células T, que expresa uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; o ii) CD38 o CD62L, CD127, CD197 y CD38 se aíslan adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En diversos aspectos, las composiciones de células T fabricadas no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, Ct La 4, TIM3 y LAG3.
La expresión de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD62L, CD127, CD197 y CD38 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K.
La expresión de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3 se reduce al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas con un inhibidor de PI3K.
Los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción aumentan el número de células T con CAR que comprenden uno o más marcadores de células T vírgenes o potentes para el desarrollo. Sin desear estar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que el tratamiento de una población de células que comprenden células T con uno o más inhibidores de PI3K da como resultado un aumento de la expansión de las células T potentes para el desarrollo y proporciona inmunoterapia con células T con CAR adoptiva más robusta y efectiva en comparación con las terapias de células T con CAR existentes.
Los ejemplos ilustrativos de marcadores de células T vírgenes o potentes para el desarrollo aumentadas en células T fabricadas mediante el uso de los métodos contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, CD62L, CD127, CD197 y CD38. En aspectos particulares, las células T vírgenes no expresan, no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 y LAG3.
Respecto a las células T, las poblaciones de células T resultantes de las diversas metodologías de expansión contempladas en la presente descripción pueden tener una variedad de propiedades fenotípicas específicas, en dependencia de las condiciones empleadas. En diversos aspectos, las poblaciones de células T expandidas comprenden uno o más de los siguientes marcadores fenotípicos: CD62L, CD127, CD197, CD38 y HLA-DR.
En un aspecto, tales marcadores fenotípicos incluyen una expresión mejorada de uno o más de, o todos, CD62L, CD127, CD197 y CD38. En aspectos particulares, se expanden los linfocitos T CD8+ caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de células T vírgenes que incluyen CD62L, CD127, CD197 y CD38.
En aspectos particulares, se expanden las células T caracterizadas por la expresión de marcadores fenotípicos de células T de memoria central que incluyen CD45RO, CD62L, CD127, CD197 y CD38 y negativas para granzima B. En algunos aspectos, las células T de memoria central son células T CD8+ CD45RO+, CD62L+.
En determinados aspectos, se expanden los linfocitos T CD4+ caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de células CD4+ vírgenes que incluyen CD62L y negativos para la expresión de CD45RA y/o CD45RO. En algunas modalidades, las células CD4+ se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos de células CD4+ de memoria central que incluyen CD62L y CD45RO positivas. En algunas modalidades, las células efectoras CD4+ son positivas para CD62L y negativas para CD45RO.
En determinados aspectos, las células T se aíslan de un individuo y se activan y estimulan para que proliferen in vitro antes de ser modificado genéticamente para expresar un cAr anti-BCMA. A este respecto, las células T pueden cultivarse antes y/o después de ser modificadas genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas para expresar un CAR anti-BCMA contemplado en la presente descripción).
2. Activación y expansión
Para lograr dosis terapéuticas suficientes de composiciones de células T, las células T a menudo se someten a una o más rondas de estimulación, activación y/o expansión. Las células T pueden activarse y expandirse generalmente mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 6 352 694; 6 534055; 6 905680; 6 692 964; 5858 358; 6 887 466; 6 905 681; 7 144 575; 7067 318; 7 172 869; 7232 566; 7 175 843; 5883 223; 6 905 874; 6 797 514; y 6 867 041. Las células T modificadas para expresar un CAR anti-BCMA pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen las células T. Además, las células T pueden ponerse en contacto con uno o más agentes que modulan la vía de señalización de las células PI3K antes, durante y/o después de la activación y/o expansión. Las células T fabricadas mediante los métodos contemplados en la presente descripción se someten a una, dos, tres, cuatro o cinco o más rondas de activación y expansión, cada una de las cuales puede incluir uno o más agentes que modulan la vía de señalización de las células PI3K.
En un aspecto, se presenta un ligando coestimulador en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en una célula T, lo que proporciona de esta manera una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3, media una respuesta deseada de las células T. Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen, sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (IcAm ), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3.
En un aspecto particular, un ligando coestimulador comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, que incluye, pero no se limita a, CD27, Cd28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, antígeno 1 asociado a la función linfocítica (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.
Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen además antígenos diana, que pueden proporcionarse en forma soluble o expresarse en APC o aAPC que se unen a TCR o CAR modificados por ingeniería genética expresados en células T modificadas.
En diversos aspectos, un método para fabricar células T contemplado en la presente descripción comprende activar una población de células que comprenden células T y expandir la población de células T. La activación de las células T puede lograrse al proporcionar una señal de estimulación primaria a través del complejo TCR/CD3 de las células T o mediante la estimulación de la proteína de superficie CD2 y al proporcionar una señal de coestimulación secundaria a través de una molécula accesoria, por ejemplo, CD28.
El complejo TCR/CD3 puede estimularse al poner en contacto la célula T con un agente de unión a CD3 adecuado, por ejemplo, un ligando de CD3 o un anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos CD3 incluyen, sin limitación, OKT3, G19-4, BC3 y 64.1.
Puede usarse un agente de unión a CD2 para proporcionar una señal de estimulación primaria a las células T. Los ejemplos ilustrativos de agentes de unión a CD2 incluyen, pero no se limitan a, ligandos de CD2 y anticuerpos anti-CD2, por ejemplo, el anticuerpo T11.3 en combinación con el anticuerpo T11.1 o T11.2 (Meuer, S.C. y otros (1984) Cell 36: 897-906) y el anticuerpo 9.6 (que reconoce el mismo epítopo que TI 1.1) en combinación con el anticuerpo 9-1 (Yang, S.Y. y otros (1986) J. Immunol. 137: 1097-1100). También se pueden usar otros anticuerpos que se unen a los mismos epítopos que cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Se pueden preparar e identificar anticuerpos adicionales, o combinaciones de anticuerpos, mediante técnicas estándar como se describe en otra parte de la presente descripción.
Además de la señal de estimulación primaria proporcionada a través del complejo TCR/CD3, o mediante CD2, la inducción de respuestas de células T requiere una segunda señal coestimuladora. En aspectos particulares, puede usarse un agente de unión a CD28 para proporcionar una señal coestimuladora. Los ejemplos ilustrativos de agentes de unión a CD28 incluyen, sin limitación: ligandos naturales de CD28, por ejemplo, un ligando natural para CD28 (por ejemplo, un miembro de la familia de proteínas B7, como B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86); y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 o fragmento de este que puede unirse a la molécula CD28, por ejemplo, anticuerpos monoclonales 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 y EX5.3D10.
En un aspecto, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora están acopladas a la misma superficie.
Los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras se localizan en la superficie de una célula. Esto puede lograrse al transfectar o transducir una célula con un ácido nucleico que codifica el agente de unión en una forma adecuada para su expresión en la superficie celular o, alternativamente, acoplar un agente de unión a la superficie celular.
En otro aspecto, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se muestran en las células presentadoras de antígeno.
La molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se proporcionan en superficies separadas.
Uno de los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras es soluble (proporcionado en solución) y el(los) otro(s) agente(s) se proporciona(n) en una o más superficies.
En un aspecto particular, los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras se proporcionan en forma soluble (proporcionado en solución).
En diversos aspectos, los métodos para producir células T contemplados en la presente descripción comprenden activar células T al poner en contacto las células T con anticuerpos solubles anti-CD3 y anti-CD28.
Las composiciones de células T fabricadas mediante los métodos contemplados en la presente descripción comprenden células T activadas y/o expandidas en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización de células PI3K. Las células T modificadas para expresar un CAR anti-BCMA pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen las células T. En aspectos particulares una población de células T se activa, se modifica para expresar un CAR anti-BCMA y luego se cultiva para su expansión.
Las células T fabricadas mediante los métodos contemplados en la presente descripción comprenden un mayor número de células T que expresan marcadores indicativos de un alto potencial proliferativo y la capacidad de autorrenovarse pero que no expresan o expresan marcadores sustancialmente indetectables de diferenciación de células T. Estas células T pueden activarse y expandirse repetidamente de una manera robusta y, de esta manera, proporcionar una composición terapéutica mejorada de células T.
En un aspecto, una población de células T activadas y expandidas en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización de células PI3K se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K.
Una población de células T con caracterizada por la expresión de marcadores, las células T jóvenes se activan y expanden en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización de células PI3K se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con la población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K.
En un aspecto, expandir las células T activadas por los métodos contemplados en la presente descripción comprende además cultivar una población de células que comprenden células T durante diversas horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 7 días a aproximadamente 28 días o cualquier valor entero horario intermedio. En otro aspecto, la composición de células T puede cultivarse durante 14 días. En un aspecto particular, las células T se cultivan durante aproximadamente 21 días. En otro aspecto, las composiciones de células T se cultivan durante aproximadamente 2-3 días. También pueden desearse diversos ciclos de estimulación/activación/expansión de manera que el tiempo de cultivo de las células T pueda ser de 60 días o más. En aspectos particulares, las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Esencial Mínimo o RPMI Media 1640 o X-vivo 15, (Lonza)) y uno o más factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, que incluye, pero no se limita a, el suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo adecuado para el crecimiento de células conocido por el experto en la materia.
Otros ejemplos ilustrativos de medios de cultivo celular incluyen, entre otros, RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o suplementados con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocinas suficiente para el crecimiento y expansión de células T.
Los ejemplos ilustrativos de otros aditivos para la expansión de células T incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, piasmanato, tampones de pH como HEPES y agentes reductores como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol.
Antibióticos, por ejemplo, la penicilina y la estreptomicina se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que van a infundirse en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más CO2 al 5%).
Las PBMC o las células T aisladas se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como IL-2, IL-7 y/o IL-15.
En otros aspectos, la APC artificial (aAPC) se fabrican mediante ingeniería genética de las células K562, U937, 721.221, T2 y C1R para dirigir la expresión y secreción estables de una variedad de moléculas coestimuladoras y citocinas. En un aspecto particular, las aAPC K32 o U32 se usan para dirigir la expresión de una o más moléculas estimuladoras basadas en anticuerpos en la superficie celular de las AAPC. Las poblaciones de células T pueden expandirse mediante aAPC que expresan una variedad de moléculas coestimuladoras que incluyen, pero no se limitan a, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) y/o CD80 o CD86. Finalmente, las aAPC proporcionan una plataforma eficiente para expandir las células T modificadas genéticamente y para mantener la expresión de CD28 en las células T CD8. Las aAPC se proporcionan en los documentos WO 03/057 171 y US2003/0147869.
3. Agentes
Se proporciona un método para fabricar células T que expande células T indiferenciadas o con desarrollo potente que comprenden poner en contacto células T con un agente que modula una vía PI3K en las células. Se proporciona un método para fabricar células T que expande células T indiferenciadas o con desarrollo potente que comprenden poner en contacto T células con un agente que modula una vía PI3K/AKT/mTOR en las células. Las células pueden ponerse en contacto antes, durante y/o después de la activación y expansión. Las composiciones de células T retienen suficiente potencia de células T de manera que pueden sufrir múltiples rondas de expansión sin un aumento sustancial en la diferenciación.
Como se usa en la presente descripción, los términos "modular", "modulador" o "agente modulador" o un término comparable se refieren a la capacidad de un agente para provocar un cambio en una vía de señalización celular. Un modulador puede aumentar o disminuir una cantidad, la actividad de un componente de la vía o aumentar o disminuir un efecto o salida deseados de una vía de señalización celular. En un aspecto, el modulador es un inhibidor. En otro aspecto, el modulador es un activador.
Un "agente" se refiere a un compuesto, molécula pequeña, por ejemplo, molécula orgánica pequeña, ácido nucleico, polipéptido o un fragmento, isoforma, variante, análogo o derivado del mismo utilizado en la modulación de una vía de PI3K/AKT/mTOR.
Una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD, menos de aproximadamente 4 kD, menos de aproximadamente 3 kD, menos de aproximadamente 2 kD, menos de aproximadamente 1 kD o menos de aproximadamente 0,5 kD. Las moléculas pequeñas pueden comprender ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, peptoides, carbohidratos, lípidos, componentes de los mismos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Se conocen en la técnica bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos de hongos, bacterias o algas, y pueden cribarse con cualquiera de los ensayos de la descripción. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en: (Carell y otros, 1994a; Carell y otros, 1994b; Cho y otros, 1993; DeWitt y otros, 1993; Galope y otros, 1994; Zuckermann y otros, 1994).
Un "análogo" se refiere a un pequeño compuesto orgánico, un nucleótido, una proteína o un polipéptido que posee una actividad o función similar o idéntica a la del compuesto, nucleótido, proteína o polipéptido o compuesto que tiene la actividad deseada de la presente descripción, pero no es necesario que comprenda una secuencia o estructura que sea similar o idéntica a la secuencia o estructura de la modalidad preferida.
Un "derivado" se refiere a un compuesto, una proteína o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido original que ha sido alterada por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos, o un ácido nucleico o nucleótido que se ha modificado mediante la introducción de sustituciones o deleciones de nucleótidos, adiciones o mutaciones. El ácido nucleico, nucleótido, proteína o polipéptido derivado posee una función similar o idéntica a la del polipéptido original.
En diversos aspectos, el agente que modula una vía PI3K activa un componente de la vía. Un "activador" o "agonista" se refiere a un agente que promueve, aumenta o induce una o más actividades de una molécula en una vía PI3K/AKT/mTOR que incluye, sin limitación, una molécula que inhibe una o más actividades de una PI3K.
En diversos aspectos, el agente que modula una vía PI3K inhibe un componente de la vía. Un "inhibidor" o "antagonista" se refiere a un agente que inhibe, disminuye o reduce una o más actividades de una molécula en una vía de PI3K que incluye, sin limitación, una PI3K. En un aspecto, el inhibidor es un inhibidor de molécula dual. El inhibidor puede inhibir una clase de moléculas que tienen actividades iguales o sustancialmente similares (un inhibidor total) o puede inhibir específicamente la actividad de una molécula (un inhibidor selectivo o específico). La inhibición también puede ser irreversible o reversible.
En un aspecto, el inhibidor tiene una IC50 de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 200 nM, al menos 500 nM, al menos 1 pM, al menos 10 pM, al menos 50 pM, o al menos 100 pM. Las determinaciones de IC50 pueden realizarse mediante el uso de cualquier técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse una IC50 al medir la actividad de una enzima dada en presencia de un intervalo de concentraciones del inhibidor en estudio. Los valores de actividad enzimática obtenidos experimentalmente se representan luego frente a las concentraciones de inhibidor usadas. La concentración del inhibidor que muestra un 50 % de actividad enzimática (en comparación con la actividad en ausencia de cualquier inhibidor) se toma como el valor "IC50". De manera análoga, pueden definirse otras concentraciones inhibidoras mediante determinaciones apropiadas de actividad.
En diversos aspectos, las células T se ponen en contacto o se tratan o cultivan con uno o más moduladores de una vía PI3K a una concentración de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 200nM, al menos 500 nM, al menos 1 pM, al menos 10 pM, al menos 50 pM, al menos 100 pM o al menos 1 M.
En aspectos particulares, las células T pueden ponerse en contacto o tratarse o cultivarse con uno o más moduladores de una vía PI3K durante al menos 12 horas, 18 horas, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, en al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión. a. Vía PI3K/Akt/mTOR
La vía de la fosfatidil-inositol-3 quinasa/Akt/mamífero diana de la rapamicina sirve como conducto para integrar la señalización del factor de crecimiento con la proliferación, diferenciación, metabolismo y supervivencia celular. Las PI3K son una familia de lípidos quinasas intracelulares altamente conservadas. Las PI3K de clase IA son activadas por las tirosinas quinasas receptoras del factor de crecimiento (RTK), ya sea directamente o mediante la interacción con la familia de moléculas adaptadoras del sustrato del receptor de insulina. Esta actividad da como resultado la producción de fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), un regulador de la serina/treonina quinasa Akt. mTOR actúa a través de la vía canónica PI3K a través de 2 complejos distintos, cada uno caracterizado por diferentes socios de unión que confieren distintas actividades. mTORC1 (mTOR en complejo con PRAS40, raptor y mLST8/GbL) actúa como un efector descendente de la señalización de PI3K/Akt, al vincular las señales del factor de crecimiento con la traducción de proteínas, el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia. mTORC2 (mTOR en complejo con rictor, mSIN1, protor y mLST8) actúa como un activador corriente arriba de Akt.
Tras la activación de PI3K mediada por el receptor del factor de crecimiento, la Akt se recluta en la membrana a través de la interacción de su dominio de homología pleckstrina con PIP3, por lo que expone su bucle de activación y permite la fosforilación en treonina 308 (Thr308) por la proteína quinasa 1 (PDK1) dependiente de fosfoinosítido constitutivamente activa. Para una activación máxima, la Akt también es fosforilada por mTORC2, en la serina 473 (Ser473) de su motivo hidrófobo C-terminal. También se ha demostrado que la DNA-Pk y HSP son importantes en la regulación de la actividad de la Akt. La Akt activa el mTORC1 a través de la fosforilación inhibidora de TSC2, que junto con TSC1 regula negativamente a mTORC1 al inhibir la Rheb GTPasa, un regulador positivo de mTORC1. mTORC1 tiene 2 sustratos bien definidos, p70S6K (en adelante S6K1) y 4E-BP1, los cuales regulan críticamente la síntesis de proteínas. Por tanto, mTORCI es un importante efector descendente de PI3K, que vincula la señalización del factor de crecimiento con la traducción de proteínas y la proliferación celular.
b. Inhibidores de PI3K
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de PI3K" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que se une e inhibe al menos una actividad de PI3K. Las proteínas PI3K pueden dividirse en tres clases, PI3K de clase 1, PI3K de clase 2 y PI3K de clase 3. Las PI3K de clase 1 existen como heterodímeros que constan de una de las cuatro subunidades catalíticas de p110 (p110a, p110p p1105 y p110Y y una de las dos familias de subunidades reguladoras. Un inhibidor de PI3K de la presente descripción se dirige preferentemente a los inhibidores de PI3K de clase 1. En un aspecto, un inhibidor de PI3K mostrará selectividad por una o más isoformas de los inhibidores de PI3K de clase 1 (es decir, selectividad por p110a, p110p, p1108 y p110Y o uno o más de p110a, p110p, p1105 y p110Y). En otro aspecto, un inhibidor de PI3K no mostrará selectividad de isoforma y se considerará un "inhibidor de pan-PI3K". En un aspecto, un inhibidor de PI3K competirá por unirse con ATP al dominio catalítico de PI3K.
Un inhibidor de PI3K puede, por ejemplo, apuntar a PI3K, así como también a proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. En aspectos particulares, un inhibidor de PI3K que se dirige tanto a mTOR como a PI3K puede denominarse inhibidor de mTOR o inhibidor de PI3K. Un inhibidor de PI3K que solo se dirige a PI3K puede denominarse inhibidor selectivo de PI3K. En un aspecto, puede entenderse que un inhibidor selectivo de PI3K se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibidora del 50 % con respecto a PI3K que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, menor que la IC50 del inhibidor con respecto a mTOR y/u otras proteínas en la vía.
En un aspecto particular, los inhibidores de PI3K ilustrativos inhiben la PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM o menos. En un aspecto, un inhibidor de la PI3K inhibe la PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de la PI3K adecuados para su uso en los métodos de fabricación de células T contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, BKM120 (inhibidor de PI3K de clase 1, Novartis), XL147 (inhibidor de PI3K de clase 1, Exelixis), (inhibidor de pan-PI3K, GlaxoSmithKline) y PX-866 (inhibidor de PI3K de clase 1; isoformas p110a, p110p y p110Y, Oncothyreon).
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores selectivos de PI3K incluyen, pero no se limitan a, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 e IPI-145.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de totales de PI3K incluyen, pero no se limitan a, BEZ235, LY294 002, GSK1 059615, TG100713 y GDC-0941.
c. Inhibidores de AKT
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de AKT" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de AKT. Los inhibidores de AKT pueden agruparse en diversas clases, que incluye los inhibidores basados en lípidos (por ejemplo, inhibidores que se dirigen al dominio de homología pleckstrina de AKT que evita que AKT se localice en las membranas plasmáticas), inhibidores competitivos de ATP e inhibidores alostéricos. En un aspecto, los inhibidores de AKT actúan al unirse al sitio catalítico de AKT. En un aspecto particular, los inhibidores de Akt actúan al inhibir la fosforilación de dianas de AKT aguas abajo tales como mTOR. En otro aspecto, la actividad de AKT se inhibe al inhibir las señales de entrada para activar Akt al inhibir, por ejemplo, la activación de AKT por ADN-PK, la activación de AKT por PDK-1 y/o la activación de Akt por mTORC2.
Los inhibidores de AKT pueden dirigirse a las tres isoformas de AKT, AKT1, AKT2, AKT3 o pueden ser selectivos de isoformas y dirigirse solo a una o dos de las isoformas de AKT. En un aspecto, un inhibidor de AKT puede dirigirse a AKT, así como también a proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. Un inhibidor de AKT que solo se dirige a AKT puede denominarse inhibidor selectivo de AKT. Puede entenderse que un inhibidor selectivo de AKT se refiere a un agente que presenta una concentración inhibidora del 50 % con respecto a AKT que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a otras proteínas en la vía.
En un aspecto particular, los inhibidores de AKT ilustrativos inhiben AKT con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM o menos. En un aspecto, una AKT inhibe la AKT con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de AKT para uso en combinación con conjugados de anticuerpo-fármaco basados en auristatina incluyen, por ejemplo, perifosina (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC-0068 y PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
Un ejemplo ilustrativo, no limitante de un inhibidor selectivo de Akt1 es A-674563.
Un ejemplo ilustrativo, no limitante de un inhibidor selectivo de Akt2 es CCT128930.
En aspectos particulares, la activación de Akt por ADN-PK del inhibidor de Akt, la activación de Akt por PDK-1, la activación de Akt por mTORC2, o la activación de Akt por HSP.
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de DNA-PK incluyen, pero no se limitan a, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 y PP-121.
d. Inhibidores de mTOR
Los términos "inhibidor de mTOR" o "agente que inhibe mTOR" se refieren a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de una proteína mTOR, tal como, por ejemplo, la actividad proteína quinasa serina/treonina en al menos uno de sus sustratos (por ejemplo, p70S6 quinasa 1 ,4E-BP1, AKT/PKB y eEF2). Los inhibidores de mTOR pueden unirse directamente e inhibir mTORCI, mTORC2 o tanto mTORCI como mTORC2.
La inhibición de la actividad de mTORCI y/o mTORC2 puede determinarse mediante una reducción en la transducción de señales de la vía PI3K/Akt/mTOR. Puede utilizarse una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la salida de dicha vía de señalización. Algunas lecturas ilustrativas no limitantes incluyen (1) una disminución en la fosforilación de Akt en los residuos, que incluyen, pero no se limitan a, 5473 y T308; (2) una disminución en la activación de Akt como se evidencia, por ejemplo, por una reducción de la fosforilación de los sustratos de Akt que incluyen, pero no se limitan a, Fox01/o3a T24/32, GSK3a/l3; S21/9 y TSC2 T1462; (3) una disminución en la fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo de mTOR, que incluyen, pero no se limitan a, ribosoma S6 S240/244, 70S6K T389 y 4EBP1 T37/46; y (4) inhibición de la proliferación de células cancerígenas. En un aspecto, los inhibidores de mTOR son inhibidores del sitio activo. Estos son inhibidores de mTOR que se unen al sitio de unión de ATP (también conocido como bolsillo de unión de ATP) de mTOR e inhiben la actividad catalítica tanto de mTORCI como de mTORC2. Una clase de inhibidores del sitio activo adecuados para su uso en los métodos de fabricación de células T contemplados en la presente descripción son los inhibidores de especificidad dual que se dirigen e inhiben directamente tanto PI3K como mTOR. Los inhibidores de especificidad dual se unen al siti o de unión de ATP de mTOR y PI3K. Los ejemplos ilustrativos de tales inhibidores incluyen, pero no se limitan a: imidazo-quinazolinas, wortmanina, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) y NVP-BEZ235 (Novartis).
Otra clase de inhibidores del sitio activo de mTOR adecuados para su uso en los métodos contemplados en la presente descripción inhiben selectivamente la actividad de mTORC1 y mTORC2 en relación con una o más fosatidilinositol 3-quinasas de tipo I, por ejemplo, PI3 quinasa a, p, y o 8. Estos inhibidores del sitio activo se unen al sitio activo de mTOR, pero no a PI3K. Los ejemplos ilustrativos de tales inhibidores incluyen, pero no se limitan a: pirazolopirimidinas, Torinl (Guertin y Sabatini), PP242 (2-(4-Amino-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-3-ilo)-1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) y AZD8055 (Liu y otros, Nature Review, 8, 627-644, 2009).
En un aspecto, un inhibidor selectivo de mTOR se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibidora del 50 % (IC50) con respecto a mTORCI y/o mTORC2, que es al menos 1o veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, menor que la IC50 del inhibidor con respecto a una, dos, tres o más PI3-quinasas de tipo I o a todas las PI3-quinasas de tipo I.
Otra clase de inhibidores de mTOR para su uso en la presente descripción se denominan en la presente descripción "rapalogs". Como se usa en la presente descripción, el término "rapalogs" se refiere a compuestos que se unen específicamente al dominio FRB de mTOR (dominio de unión a rapamicina FKBP), están estructuralmente relacionados con la rapamicina y retienen las propiedades inhibidoras de mTOR. El término rapalogs excluye la rapamicina. Los rapalogs incluyen ésteres, éteres, oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina, así como compuestos en los que los grupos funcionales de la estructura del núcleo de rapamicina se han modificado, por ejemplo, por reducción u oxidación. Las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos también se consideran derivados de rapamicina. Los ejemplos ilustrativos de rapalogs adecuados para su uso en los métodos contemplados en la presente descripción incluyen, sin limitación, tem-sirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI).
En un aspecto, el agente es el inhibidor de mTOR rapamicina (sirolimus).
En un aspecto particular, los inhibidores de mTOR ilustrativos para su uso en la presente descripción inhiben mTORCI, mTORc2 o tanto mTORCI como mTORC2 con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para su uso en la presente descripción inhibe mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, más preferentemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
En un aspecto, los inhibidores de mTOR ilustrativos inhiben PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia alrededor de 60 nM o menos, alrededor de 25 nM, alrededor de 10 nM, alrededor de 5 nM, alrededor de 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para su uso en la presente descripción inhibe PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de mTOR adecuados para su uso en modalidades particulares contempladas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502 y everolimus.
Se ha demostrado que mTOR demuestra una actividad catalítica sólida y específica hacia las proteínas de sustrato fisiológico, la proteína quinasa ribosómica I p70 S6 (p70S6K1) y la proteína de unión a eIF4E 1 (4EBP1) medida por anticuerpos específicos de fósforo en transferencia Western.
En un aspecto, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de quinasa s6 seleccionado del grupo que consiste en: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK y AT7867.
I. Composiciones y formulaciones
Las composiciones contempladas en la presente descripción pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que los comprenden, células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente, etc., como se contempla en la presente descripción. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmacéuticas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición formulada en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea sola o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la descripción también se pueden administrar en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas, quimioterapéuticos, profármacos, fármacos, anticuerpos, u otros diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente la capacidad de la composición para administrar la terapia prevista.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.
Como se usa en la presente descripción, "vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye, sin limitación, cualquier adyuvante, vehículo, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente, surfactante o emulsionante que ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos como aceptable para usar en seres humanos o animales domésticos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto; malta; gelatina; talco; manteca de cacao, ceras, grasas animales y vegetales, parafinas, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxido de zinc; aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tal como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato; y cualquier otra sustancia compatible empleada en formulaciones farmacéuticas.
En aspectos particulares, las composiciones de la presente descripción comprenden una cantidad de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad" se refiere a "una efectiva cantidad" o "una cantidad efectiva" de una célula terapéutica genéticamente modificada, por ejemplo, una célula T, para lograr un resultado profiláctico o terapéutico beneficioso o deseado, lo que incluye resultados clínicos.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una célula terapéutica genéticamente modificada que es efectiva para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una célula terapéutica genéticamente modificada puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células madre y progenitoras para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del virus o de las células terapéuticas se compensan por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" incluye una cantidad que es efectiva para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente).
Cuando se indica una cantidad terapéutica, un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente descripción a administrar teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en la presente descripción puede administrarse a una dosis de 102 a 1010 células/kg de peso corporal, preferentemente 105 a 106 células/kg de peso corporal, que incluye todos los valores enteros dentro de esos intervalos. El número de células dependerá del uso final para el que está destinada la composición, al igual que el tipo de células incluidas en el mismo. Para los usos proporcionados en la presente descripción, las células están generalmente en un volumen de un litro o menos, puede ser de 500 ml o menos, incluso de 250 ml o 100 ml o menos. Por lo tanto, la densidad de las células deseadas es típicamente mayor que 106 células/ml y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que acumulativamente igualan o exceden 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 células. En algunos aspectos de la particularmente dado que todas las células infundidas serán redirigidas a un antígeno diana particular (por ejemplo, cadenas ligeras k o A), pueden administrarse números menores de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). Las composiciones de células que expresan CAR pueden administrarse múltiples veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser alogénicas, singénicas, xenogénicas o autólogas para el paciente sometido a terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenos (por ejemplo, PHA) o linfocinas, citocinas y/o quimiocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-alfa, IL-18 y TNF-beta, GM-CSF,
IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1a, etc.) como se describe en la presente descripción para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria.
Generalmente, las composiciones que comprenden las células activadas y expandidas como se describe en la presente descripción pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunocomprometidos. En particular, las composiciones que comprenden las células T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de las neoplasias malignas de las células B. Las células T modificadas con CAR de la presente descripción pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con portadores, diluyentes, excipientes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas contempladas en la presente descripción comprenden una cantidad de células T modificadas genéticamente, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción que comprenden una población de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, tales como las células T, pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente descripción se formulan preferentemente para administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sea soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente, solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede envasarse en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
En un aspecto particular, las composiciones contempladas en la presente descripción comprenden una cantidad efectiva de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Por lo tanto, las composiciones de células efectoras inmunitarias que expresan CAR pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos conocidos contra el cáncer, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también pueden administrarse en combinación con antibióticos. Dichos agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado patológico particular como se describe en la presente descripción, tal como un cáncer particular. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, quimioterapéuticos, radioterapéuticos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.
En determinados aspectos, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR descritas en la presente descripción pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos ilustrativos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; abastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de elliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOt Er E®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cis platino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileukin diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre los cánceres tales como los antiestrógenos, que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Puede usarse una variedad de otros agentes terapéuticos junto con las composiciones descritas en la presente descripción. En un aspecto, la composición que comprende células efectoras inmunitarias que expresan CAR se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o fármacos antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (que incluyen betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.
Otros AINE ilustrativos se eligen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y CELEBREX® (celecoxib) y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se eligen del grupo que consiste en paracetamol, oxicodona, tramadol de hidrocloruro de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se eligen del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF (por ejemplo, Etanercept (En BREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales, así como también formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofín) e intramuscular) y minociclina.
Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos terapéuticos adecuados para la combinación con las células T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, bavituximab, bevacizumab (avastin), bivatuzumab, blinatumomab, conatumumab, daratumumab, duligotumab, dacetuzumab, dalotuzumab, elotuzumab (HuLuc63), gemtuzumab, ibritumomab, indatuximab, inotuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, milatuzumab, moxetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, rituximab, siltuximab, teprotumumab y ublituximab.
En determinados aspectos, las composiciones descritas en la presente descripción se administran junto con una citocina. Por "citocina", como se usa en la presente descripción, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana N-metionil y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteicas como hormona estimulante de folículos (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y el ligando de kit (KL). Como se usa en la presente descripción, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
En aspectos particulares, una composición comprende células T con CAR contempladas en la presente descripción que se cultivan en presencia de un inhibidor de PI3K como se describe en la presente descripción y expresan uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, c D127 y h La -DR puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positivas o negativas. En un aspecto, una composición comprende una subpoblación específica de células T, que expresan uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; y CD38 o CD62L, CD127, CD197 y CD38, se aíslan adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En diversos aspectos, las composiciones no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3.
En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD62L, CD127, CD197 y CD38 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K.
En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3 se reduce al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activado y expandido con un inhibidor de PI3K.
J. Métodos terapéuticos
Las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción proporcionan métodos mejorados de inmunoterapia adoptiva para su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con células B que incluyen, pero no se limitan a afecciones inmunorreguladoras y neoplasias malignas hematológicas.
En aspectos particulares, la especificidad de una célula efectora inmunitaria primaria se redirige a las células B al modificar genéticamente la célula efectora inmunitaria primaria con un CAR contemplado en la presente descripción. En diversos aspectos, se usa un vector viral para modificar genéticamente una célula efectora inmunitaria con un polinucleótido particular que codifica un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno anti-BCMA murino que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio de bisagra; un dominio transmembrana (TM), un enlazador oligo o polipéptido corto, que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares; y un dominio de señalización primaria.
En un aspecto, la presente descripción incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar un CAR que se dirige a las células B que expresan BCMa . En otro aspecto, las células T con CAR anti-BCMA se cultivan en presencia de IL-2 y un inhibidor de PI3K para aumentar las propiedades terapéuticas y la persistencia de las células T con CAR. A continuación, las células T con CAR se infunden a un receptor que las necesite. La célula infundida puede matar las células B que provocan la enfermedad en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células T con CAR pueden replicarse in vivo, lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a una terapia contra el cáncer sostenida.
En un aspecto, las células T con CAR de la invención pueden experimentar una robusta expansión de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado. En otro aspecto, las células T con CAR de la invención evolucionan a células T de memoria específica que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento tumoral adicional.
En aspectos particulares, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción se usan en el tratamiento de afecciones asociadas con la actividad anormal de las células B.
Los ejemplos ilustrativos de afecciones que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse mediante el uso de las células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, miastenia gravis, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, esclerodermia, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolípido, vasculitis asociada a ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki y glomerulonefritis rápidamente progresiva.
Las células efectoras inmunitarias modificadas también pueden tener aplicación en trastornos de células plasmáticas tales como la enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis primaria o asociada a inmunocitos y gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS).
Como se usa en la presente descripción, "neoplasia maligna de las células B" se refiere a un tipo de cáncer que se forma en las células B (un tipo de célula del sistema inmunológico) como se describe más abajo.
En aspectos particulares, las composiciones que comprenden células T con CAR modificadas contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, que incluyen, pero no se limitan a, neoplasias malignas de las células B tales como, por ejemplo, mieloma múltiple (MM) y linfoma no Hodgkin (NHL).
El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de las células B de la morfología de células plasmáticas maduras caracterizada por la transformación neoplásica de un solo clon de este tipo de células. Estas células plasmáticas proliferan en la BM y pueden invadir el hueso adyacente y, a veces, la sangre. Las formas variantes de mieloma múltiple incluyen mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmacitoma óseo solitario y plasmacitoma extramedular (ver, por ejemplo, Braunwald, y otros, (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15a edición (McGraw-Hill 2001)).
El linfoma no Hodgkin abarca un gran grupo de cánceres de linfocitos (glóbulos blancos). Los linfomas no Hodgkin pueden producirse a cualquier edad y a menudo están marcados por ganglios linfáticos que son más grandes de lo normal, fiebre y pérdida de peso. Existen muchos tipos diferentes de linfoma no Hodgkin. Por ejemplo, el linfoma no Hodgkin puede dividirse en tipos agresivos (de crecimiento rápido) e indolentes (de crecimiento lento). Aunque los linfomas no Hodgkin pueden derivarse de células B y células T, como se usa en la presente descripción, el término "linfoma no Hodgkin" y "linfoma no Hodgkin de células B" se usan indistintamente. Los linfomas no Hodgkin de células B (LNH) incluyen el linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto. Los linfomas que se producen después del trasplante de médula ósea o de células madre son usualmente linfomas no Hodgkin de células B.
La leucemia linfocítica crónica (CLL) es un cáncer indolente (de crecimiento lento) que provoca un aumento lento en los glóbulos blancos inmaduros denominados linfocitos B, o células B. Las células cancerígenas se diseminan a través de la sangre y la médula ósea, y también pueden afectar los ganglios linfáticos u otros órganos como el hígado y el bazo. La CLL eventualmente provoca que la médula ósea falle. A veces, en etapas posteriores de la enfermedad, la enfermedad se denomina linfoma linfocítico pequeño.
En aspectos particulares, se proporcionan métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción o una composición que comprende las mismas, a un paciente que lo necesite, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En determinados aspectos, las células de la descripción se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar una afección asociada con la actividad anormal de las células B o una neoplasia maligna de las células B. Por lo tanto, la presente descripción proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de una afección asociada con la actividad anormal de las células B o una neoplasia maligna de las células B que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de las células modificadas con CAR contempladas en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, los términos "individuo" y "sujeto" a menudo se usan indistintamente y se refieren a cualquier animal que presente un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección que pueda tratarse con los vectores de terapia génica, productos terapéuticos basados en células y métodos descritos en otra parte de la presente descripción. En aspectos preferidos, un sujeto incluye cualquier animal que presente síntomas de una enfermedad, trastorno o afección del sistema hematopoyético, por ejemplo, una neoplasia maligna de las células B, que pueda tratarse con vectores de terapia génica, productos terapéuticos basados en células y métodos descritos en otra parte de la presente descripción. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o conejillos de Indias), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gatos o perros). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos. Los sujetos típicos incluyen pacientes humanos que tienen una neoplasia maligna de las células B, que se han diagnosticado con una neoplasia maligna de las células B o están en riesgo o que tienen una neoplasia maligna de las células B.
Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" se refiere a un sujeto que se ha diagnosticado con una enfermedad, trastorno o afección particular que puede tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción "tratamiento" o "tratar", incluye cualquier efecto beneficioso o conveniente sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se trata. El tratamiento puede implicar opcionalmente ya sea la reducción o la mejora de los síntomas de la enfermedad o afección, o el retraso de la progresión de la enfermedad o afección. El "tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o los síntomas asociados a las mismas.
Como se usa en la presente descripción, "prevenir" y palabras similares tales como "prevenido", "que previene", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o afección. También se refiere a retrasar el inicio o la recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se usa en la presente descripción, "prevención" y palabras similares incluyen además reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o afección antes del inicio o la recurrencia de la enfermedad o afección.
Por "potenciar" o "promover", o "aumentar" o "expandir" se refiere en general a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción, por ejemplo, una célula genéticamente modificada o vector que codifica un CAR para producir, provocar o inducir una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos aguas abajo) en comparación con la respuesta provocada ya sea por un vehículo o una molécula/composición control. Una respuesta fisiológica medible puede incluir un aumento en la expansión, activación y persistencia de células T y/o un aumento en la capacidad de matar células cancerígenas, entre otros evidentes a partir de la comprensión en la técnica y la descripción en la presente descripción. Una cantidad "aumentada" o "potenciada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (que incluye todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la respuesta producida por el vehículo o una composición de control.
Por "disminuir" o "aminorar" o "atenuar" o "reducir" o "mitigar" se refiere generalmente a la capacidad de la composición contemplada en la presente descripción para producir, inducir o provocar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos aguas abajo) en comparación a la respuesta provocada ya sea por un vehículo o una molécula/composición control. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la respuesta (respuesta de referencia) producida por el vehículo, una composición control o la respuesta en un linaje celular particular.
Por "mantener" o "preservar" o "mantenimiento" o "sin cambio" o "sin cambio sustancial" o "sin disminución sustancial" se refiere generalmente a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción para producir, inducir o provocar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos aguas abajo) en una célula, en comparación con la respuesta provocada ya sea por un vehículo, una molécula/composición de control o la respuesta en un linaje celular particular. Una respuesta comparable es aquella que no es diferente significativamente o diferente cuantitativamente de la respuesta de referencia.
En un aspecto, un método para tratar una afección relacionada con las células B en un sujeto que lo necesita comprende administrar una cantidad efectiva, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción. La cantidad y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como la afección del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque los ensayos clínicos pueden determinar las dosis apropiadas.
En un aspecto, la cantidad de células T en la composición administrada a un sujeto es al menos 0,1 x 105 células, al menos 0,5 x 105 células, por lo menos 1 x 105 células, por lo menos 5 x 105 células, por lo al menos 1 x 106 células, al menos 0,5 x 107 células, al menos 1 x 107 células, al menos 0,5 x 108 células, al menos 1 x 108 células, al menos 0,5 x 109 células, al menos 1 x 109 células, al menos 2 x 109 células, al menos 3 x 109 células, al menos 4 x 109 células, al menos 5 x 109 células o al menos 1 x 1010 células. En aspectos particulares sobre 1 x 107 células T con CAR a aproximadamente 1 x 109 células T con CAR, aproximadamente 2 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,9 x 109 células T con CAR, aproximadamente 3 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,8 x 109 células T con CAR, aproximadamente 4 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,7 x 109 células T con CAR, aproximadamente 5 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,6 x 109 células T con CAR o aproximadamente 5 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,5 x 109 células T con CAR se administran a un sujeto.
En un aspecto, la cantidad de células T en la composición administrada a un sujeto es al menos 0,1 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 5 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 105 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 106 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 106 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 107 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 107 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 2 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 3 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 4 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 5 x 108 células/kg de peso corporal, o al menos 1 x 109 células/kg de peso corporal. En modalidades particulares, se administran a un sujeto aproximadamente 1 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 1 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, aproximadamente 2 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a alrededor de 0,9 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, aproximadamente 3 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a alrededor de 0,8 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, aproximadamente 4 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a alrededor de 0,7 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, aproximadamente 5 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a alrededor de 0,6 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, o alrededor de 5 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal hasta aproximadamente 0,5 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal.
Un experto en la técnica reconocerá que pueden requerirse múltiples administraciones de las composiciones de la descripción para efectuar la terapia deseada. Por ejemplo, una composición puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces durante un período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años, 10 años o más.
En determinados aspectos, puede desearse administrar células efectoras inmunitarias activadas a un sujeto y subsecuentemente volver a extraerle sangre (o realizarle una aféresis), células efectoras inmunitarias activadas a partir de ellas de acuerdo con la presente descripción y reinfundir al paciente con estas células efectoras inmunitarias activadas y expandidas. Este proceso puede llevarse a cabo diversas veces cada poca semana. En determinadas modalidades, las células efectoras inmunitarias pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, las células efectoras inmunitarias se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc o 400 cc o más. Sin estar limitados por la teoría, el uso de este protocolo de extracción múltiple/reinfusión múltiple de sangre puede servir para seleccionar determinadas poblaciones de células efectoras inmunitarias.
La administración de las composiciones contempladas en la presente descripción puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, lo que incluye por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. En un aspecto preferido, las composiciones se administran por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" tal como se usan en la presente descripción se refieren a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal. En un aspecto, las composiciones contempladas en la presente descripción se administran a un sujeto mediante inyección directa en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En un aspecto, a un sujeto que lo necesita se le administra una cantidad efectiva de una composición para aumentar la respuesta inmunitaria celular a una afección relacionada con las células B en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede incluir respuestas inmunitarias celulares mediadas por células T citotóxicas capaces de matar células infectadas, células T reguladoras y respuestas de células T auxiliares. También pueden inducirse respuestas inmunitarias humorales, mediadas principalmente por células T auxiliares capaces de activar las células B, lo que conduce a la producción de anticuerpos. Puede usarse una variedad de técnicas para analizar el tipo de respuestas inmunitarias inducidas por las composiciones de la presente descripción, que están bien descritas en la técnica; por ejemplo, Current Protocols in Immunology, editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, Nueva York.
En el caso de la muerte mediada por células T, la unión CAR-ligando inicia la señalización de CAR a la célula T, lo que resulta en la activación de una variedad de vías de señalización de las células T que inducen a la célula T a producir o liberar proteínas capaces de inducir apoptosis de las células diana mediante diversos mecanismos. Estos mecanismos mediados por células T incluyen (pero no se limitan a) la transferencia de gránulos citotóxicos intracelulares de la célula T a la célula diana, la secreción de células T de citocinas proinflamatorias que pueden inducir la muerte de las células diana directamente (o indirectamente a través del reclutamiento de otras células efectoras asesinas), y una regulación positiva de los ligandos de receptores de muerte (por ejemplo, FasL) en la superficie de las células T que inducen la apoptosis de las células diana después de la unión a su receptor de muerte correspondiente (por ejemplo, Fas) en la célula diana.
En un aspecto, la descripción proporciona una población de células efectoras inmunitarias modificadas para su uso en un método de tratamiento de un sujeto diagnosticado con una afección relacionada con las células B, que comprende retirar las células efectoras inmunitarias de un sujeto diagnosticado con una afección relacionada con las células B que expresa un BCMA, modificar genéticamente dichas células efectoras inmunitarias con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR como se contempla en la presente descripción, lo que produce de esta manera la población de células efectoras inmunitarias modificadas y administrar la población de células efectoras inmunitarias modificadas al mismo sujeto. En un aspecto preferido, las células efectoras inmunitarias comprenden células T.
En determinados aspectos, la presente descripción también proporciona métodos para estimular una respuesta inmunomoduladora mediada por células efectoras inmunitarias a una población de células diana en un sujeto, que comprende las etapas de administrar al sujeto una población de células efectoras inmunitarias que expresan una construcción de ácido nucleico que codifica una molécula CAR.
Los métodos para administrar las composiciones celulares descritas en la presente descripción incluyen cualquier método que sea efectivo para dar como resultado la reintroducción de células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente ex vivo que expresen directamente un CAR de la invención en el sujeto o la reintroducción de los progenitores genéticamente modificados de las células efectoras inmunitarias que al introducirse en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras que expresan el CAR. Un método comprende transducir células T de sangre periférica ex vivo con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la descripción y devolver las células transducidas al sujeto.
Ejemplos
E je m p lo 1
Construcción de car anti-bcma
Los CAR que contienen anticuerpos scFv anti-BCMA murinos se diseñaron para contener un promotor de MND unido operativamente a un scFv anti-BCMA, un dominio bisagra y transmembrana de CD8a y dominios coestimuladores de CD137 seguidos por el dominio de señalización intracelular de la cadena de CD3z. Ver, por ejemplo, la Figura 1. Los CAR de BCMA mostrados en la Figura 1 comprenden una secuencia de péptido señal (SP) de CD8a para la expresión superficial en células efectoras inmunitarias. La secuencia polinucleotídica de un CAR de BCMA ilustrativo se establece en la SEQ ID NO: 10; una secuencia polipeptídica ilustrativa de BCMA CAR se establece en la SEQ ID NO: 9; y en la Figura 1 se muestra un mapa vectorial de una construcción CAR ilustrativa. La Tabla 3 muestra la Identidad, la Referencia del Genbank, el Nombre de la Fuente y la Citación de los diversos segmentos de nucleótidos de diversos vectores lentivirales de los CAR anti-BCMA ilustrativos.
Tabla 3.
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continuación
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Ejemplo 2
Evaluación de un car de bcma murino
Introducción
La transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha surgido como un enfoque prometedor para tratar cánceres. Un CAR es una molécula artificial compuesta por un fragmento variable de cadena simple (scFv) reactivo con antígeno fusionado con dominios de señalización de células T a través de una región transmembrana. En este ejemplo, se evaluó una molécula CAR específica del antígeno de maduración de células B (BCMA). El BCMA se expresa en mieloma múltiple, plasmocitoma y algunos linfomas, pero la expresión normal se limita a las células plasmáticas (Avery y otros, 2003; Carpenito y otros, 2009; Chiu y otros, 2007).
Se construyó un CAR anti-BCMA02 mediante el uso de secuencias de un anticuerpo anti-BCMA de ratón (C11D5.3). El CAR anti-BCMAIO se construyó mediante el uso de secuencias modificadas y es una versión "humanizada" del CAR anti-BCMA02. En una serie de ensayos in vitro, las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T con CAR anti-BCMA10 exhibieron una especificidad tumoral, una alta expresión de CAR y provocaron una potente reactividad con las dianas que expresan el antígeno. Se demostró que las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T con CAR anti-BCMA10 tienen una reactividad comparable a las líneas celulares tumorales que expresan BCMA. Aunque tanto las células T con CAR anti-BCMA02 como las células T con CAR anti-BCMA10 fueron capaces de causar regresiones en un modelo de tumor de ratón, las células T con CAR anti-BCMA10 mostraron secreción de citocinas inflamatorias independiente del antígeno y, por lo tanto, tienen el potencial de causar toxicidades clínicas altos niveles de citocinas asociados.
Resultados
Liberación tónica de citocinas inflamatorias de células T anti-BCMA10 asociada con apoptosis
La proteína BCMA es detectable en el suero de pacientes con mieloma múltiple (Sánchez y otros, 2012). El promedio de BCMA en suero en pacientes con mieloma múltiple fue de 10 ng/ml, pero alcanzó niveles máximos de hasta 100 ng/ml. Se evaluó el impacto de los niveles fisiológicos de BCMA soluble en los candidatos de células T con CAR anti-BCMA.
Se examinó la liberación de IFNy de células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR19A después de un cultivo de 24 horas con BCMA soluble (Figura 2a). Las células T con CAR anti-BCMA02 respondieron con una liberación mínima de citocinas después de un cultivo de 24 horas con hasta 1 ug/ml de BCMA. Por el contrario, las células T con CAR anti-BCMA10 respondieron con niveles crecientes de IFNy que eran proporcionales a la concentración de BCMA soluble añadida al cultivo. A 100 ng/ml de BCMA, los niveles máximos informados en pacientes con mieloma múltiple, las células T con CAR anti-BCMA10 secretaron 82,1 ng/ml de IFNy en comparación con 28,8 ng/ml de IFNy secretado por las células T con CAR anti-BCMA02. Se detectó incluso IFNy en diversos experimentos de cocultivo con células T con CAR anti-BCMA10 más líneas celulares control que carecían de antígeno BCMA (Figura 2b, co-cultivo K562). Estos datos sugirieron que las células T con CAR anti-BCMA10 tenían una mayor sensibilidad a la estimulación por BCMA soluble y el potencial de respuestas de citocinas independientes de antígeno en las células T.
Se examinó el potencial de secreción tónica de citocinas a partir de células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 (10 días desde el inicio del cultivo) y células T con CAR19A. Después de la fabricación de células T con CAR, se analizaron los medios de crecimiento de los cultivos de células T con CAR anti-BCMA02, células T con CAR anti-BCMA10 y células T con CAR19A para detectar la presencia de citocinas inflamatorias. A pesar de la ausencia de estimulación antigénica, los cultivos de células T con CAR anti-BCMA10 contenían más de 10 ng/ml de IFNy en comparación con menos de 1 ng/ml de IFNy en cultivos de células T con CAR anti-BCMA02 (Figura 3). Los cultivos de células T con CAR anti-BCMA10 también contenían significativamente (p<0,001) más TNFa. Para cuantificar aún más la cantidad de citocina producida por células T con CAR anti-BCMA10 sin la estimulación de antígenos, la liberación de citocinas se midió a partir de 5 x 104 células T con CAR durante un cultivo de 24 horas. Las células T con CAR anti-BCMA10 produjeron cantidades significativamente mayores de citocinas inflamatorias MIP1a, IFNy, GMCSF, MIP1I3, IL-8 y TNFa en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02 (Figura 4, p<0,0001). Las concentraciones de MlP1a e IFNy fueron las más altas entre todas las citocinas examinadas. Las células T con CAR anti-BCMA10 produjeron 4,7 ng MIP1a/5 x 104 células/24 horas, 3,0 ng IFN/5 x 104 células/24 horas y ~1 ng/5 x 104 células/24 horas o menos de las otras citocinas. No se detectaron diferencias significativas en las citocinas antiinflamatorias IL-10, IL-2 e IL-4.
Se midió la expresión de marcadores fenotípicos de activación de células T al final de la fabricación de células T con CAR anti-BCMA10 para examinar si la secreción tónica de citocinas inflamatorias era indicativa de un estado hiperactivo en células T con CAR anti-BCMA10. HLA-DR y CD25 son marcadores de superficie que normalmente exhiben un pico de expresión de 12-24 horas después de la activación de las células T y luego disminuyen con el tiempo. Las células T con CAR preparadas a partir de tres donantes normales mostraron que una media del 40 ± 2 % de las células T con CAR anti-BCMA02 expresaban HLA-DR. La expresión de HLA-DR en estas células fue comparable a las células T no transducidas (43 ± 2,3 %) y las células T control CAR19A (32 ± 2,2 %). Por el contrario, el 88 ± 1,2 % de células T con CAR anti-BCMAl0 expresaron HLA-DR (Figura 5). La expresión de otro marcador de activación CD25 también fue mayor en las células T con CAR anti-BCMA10 en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02 (53 ± 0,9 % frente a 35 ± 2,4 %). Por lo tanto, las células T con cAr anti-BCMA10 exhibieron características fenotípicas de las células T activadas en ausencia de antígenos añadidos.
La hiperactividad en las células T a menudo se asocia con la muerte celular inducida por activación (AICD) por apoptosis. Se midieron los niveles de caspasa-3 activada para examinar si la hiperactividad de las células T con CAR anti-BCMA10 podría dar como resultado niveles apoptóticos más altos en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02. El 48 % de las células T con CAR anti-BCMA10 de dos donantes tenían caspasa-3 activa en comparación con el 16 % de las células T con CAR anti-BCMA02 (Figura 6). Por tanto, en ausencia de antígeno BCMA añadido, las células T con CAR anti-BCMA10 contienen una mayor frecuencia de células apoptóticas asociadas con una mayor activación y secreción de citocinas inflamatorias en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02.
Se evaluaron las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T con CAR anti-BCMA10 para determinar si las células T con CAR podían responder selectivamente a niveles bajos de BCMA o tener reactividad cruzada con un antígeno no relacionado en el suero humano usado para el crecimiento de las células T. Las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T anti-BCMA10 CAR se mantuvieron en un medio que carecía de suero humano durante dos días y luego se cambiaron a un medio que contenía suero bovino fetal (FBS), suero humano (HABS) o HABS en presencia o ausencia de BCMA soluble 100 ng/ml (Figura 7). La liberación de IFNy se ensayó 24 horas después mediante ELISA. Tanto las células T con CAR anti-BCMA02 como las células T con CAR anti-BCMA10 respondieron al BCMA soluble. Sin embargo, las células T con CAR anti-BCMA10 secretaron 10 veces más IFNy que las células T con CAR anti-BCMA02. En ausencia de BCMA, sólo las células T con CAR anti-BCMA10 liberaron IFNy independientemente del cultivo en suero fetal bovino (FBS) (p = 0,0002) o suero AB humano (HABS) (p = 0,0007). Estos datos sugirieron que la secreción de citocinas inflamatorias era intrínseca a las células T con CAR anti-BCMA10.
Función antitumoral inferior de las células T con CAR anti-BCMA10 en modelo de ratón de mieloma múltiple La hiperactivación y el aumento de la apoptosis podrían afectar negativamente la persistencia de las células T con CAR en los pacientes y, en última instancia, la eficacia clínica. La función antitumoral de las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T con CAR anti-BCMA10 se examinó en un modelo de tumor de ratón. Ratones con NOD scid gamma (NSG) con ~ 100 mm3 experimental mieloma múltiple sub-cutánea humana (RPMI-8226) los tumores se trataron con 107 células T con CAR anti-BCMA02, 107 células T con CAR anti-BCMA10, o Bortezomib (Velcade). El crecimiento de RPMI-8226 se controló con calibradores. En dos experimentos independientes (Figuras 8a y 8b), Bortezomib controló el crecimiento del tumor en comparación con los animales de control del vehículo. Los animales transferidos adoptivamente con células T con CAR anti-BCMA02 exhibieron una eliminación tumoral rápida y duradera (los gráficos insertados magnifican las regresiones tumorales tempranas). La transferencia adoptiva de células T con CAR anti-BCMA10 también provocó regresiones tumorales, pero se retrasó en ambos experimentos en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02.
Conclusiones
Las células T con CAR anti-BCMA02 y las células T con CAR anti-BCMA10 exhibieron una función antitumoral comparable en ensayos in vitro, pero las células T con CAR anti-BCMA10 tenían características que podrían afectar negativamente la seguridad y eficacia en el tratamiento del paciente. Las células T con CAR anti-BCMA10 respondieron de manera contundente con la secreción de citocinas inflamatorias después de la exposición a niveles fisiológicos de la proteína BCMA. La tormenta de citocinas o el síndrome de liberación de citocinas es una toxicidad clínica conocida asociada con las terapias con células T con CAR. Las preocupaciones sobre la liberación de citocinas a BCMA se agravaron después de la observación de la actividad tónica de las células T con CAR anti-BCMA10. Incluso en ausencia de estimulación antigénica, las células T con CAR anti-BCMA10 liberaron altos niveles de citocinas inflamatorias. La secreción persistente de citocinas tiene el potencial de causar toxicidades clínicas sustanciales y de afectar negativamente la función antitumoral. De hecho, encontramos una mayor composición de células apoptóticas y una función antitumoral inferior en las células T con CAR anti-BCMA10 en comparación con los cultivos de células T con CAR anti-BCMA02 en un modelo de mieloma múltiple de ratón.
Referencias
Avery y otros, (2003). BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells. J Clin Invest, 112(2), 286-297.
Carpenito y otros, (2009). Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. Proc Natl Acad Sci USA, 106(9), 3360-3365.
Chiu y otros, (2007). Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to Ba FF and APRiL. Blood, 109(2), 729-739.
Sánchez y otros. (2012). Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival. Br J Haematol, 158(6), 727-738.
Ejemplo 3
La expresión mínima de bcma en los linfomas activa las células T con CAR anti-BCMA
Se midió el nivel de expresión de BCMA en líneas celulares de linfoma y leucemia (Daudi y Raji) para determinar si la expresión era suficiente para activar las células T con CAR anti-BCMA02.
La expresión de BCMA en células de linfoma, leucemia y mieloma múltiple se cuantificó mediante citometría de flujo. En este ensayo, la expresión relativa de BCMA en las células se evaluó al correlacionar la intensidad de fluorescencia de la expresión de BCMA con un número conocido de anticuerpos unidos (capacidad de unión de anticuerpos, ABC). Los niveles de expresión de BCMA en las líneas celulares de linfoma se compararon con los niveles de expresión de BCMA en una línea celular de mieloma múltiple (RPMI-8226) conocida por activar las células T con CAR anti-BCMA02. Se expresaron 12 590 ± 1275 moléculas de BCMA02 en la superficie de las células RPMI-8226. Por el contrario, las células Daudi expresaron 1173 ± 234 moléculas BCMA02 y las células JeKo-1 (una línea celular de linfoma de células del manto) expresaron solo 222 ± 138 moléculas BCMA02 (Figura 9, círculos).
En otro conjunto de experimentos, se probó la actividad de las células T con CAR anti-BCMA02 a los niveles mínimos de BCMA observados en líneas celulares de linfoma y leucemia (Figura 9, cajas). Se generaron células T con CAR anti-BCMA02 mediante el uso de métodos estándar y la actividad se evaluó mediante ELISA de IFNy después de cocultivo con líneas de células tumorales positivas para BCMA y negativas para BCMA. La reactividad de las células T con CAR anti-BCMA02 se correlacionó con la cantidad relativa de expresión de ARNm de BCMA (por encima de un umbral) y/o la densidad del receptor de BCMA en la superficie de diversas líneas de células tumorales después del co-cultivo (Figura 9). Se libera poco, o ninguno, IFNy en el co-cultivo de células T con CAR de BCMA con líneas celulares tumorales negativas para BCMA (BCMA-): leucemia mielógena (K562), leucemia linfoblástica aguda (NALM-6 y NALM-16); Linfoma de células del manto (ReC-1); o linfoma de Hodgkin (HDLM-2). Por el contrario, se liberaron cantidades sustanciales de IFNy en el co-cultivo de células BCMA02 CAR T con líneas de células tumorales positivas para BCMA (BCMA+): leucemia linfoblástica crónica de células B (MEC-1), linfoma de células del manto (JeKo-1), enfermedad de Hodgkin linfoma (RPMI-6666), linfoma de Burkitt (células de Daudi y células de Ramos) y mieloma múltiple (RPMI-8226).
La reactividad de las células T con CAR anti-BCMA02 a las células de linfoma de Burkitt que expresan BCMA (células Daudi) se extendió a estudios con animales in vivo. Las células Daudi también expresan CD19. La actividad in vivo de las células T con CAR anti-BCMA02 se comparó con la actividad in vivo de las células T con CAR anti-CD 19. Los ratones NOD scid gamma (NSG) fueron inyectados IV con 2 x 106 células Daudi y se permitió la acumulación de una gran carga tumoral sistémica antes de ser tratados con células T con CAR. Se administraron células T con CAR a los 8 días y 18 días después de la inducción del tumor (Figuras 10A y 10B, respectivamente). El vehículo y el control negativo (células T con CAR anti-CD19A) no lograron prevenir el crecimiento tumoral, como se muestra por los aumentos de bioluminiscencia en fase logarítmica, lo que resulta en pérdida de peso y muerte (Figura 10A, dos paneles de ratón más a la izquierda). Las células T con CAR anti-CD19 y anti-BCMA02 impidieron el crecimiento tumoral, lo que resultó en el mantenimiento del peso corporal y la supervivencia. Las células T con CAR anti-CD19 y anti-BCMA02 fueron igualmente efectivas cuando se administraron el día 8 (Figura 10A, dos paneles de ratón más a la derecha). Las células T con CAR anti-BCMA02 también fueron eficaces para disminuir la carga tumoral cuando se administraron 18 días después de la inducción del tumor. Figura 10B, panel más a la derecha.
Ejemplo 4
Actividad in vitro potente de las células t con car anti-bcma
La actividad in vitro potente de las células T con CAR anti-BCMA02 se logró con una reducción del 50 por ciento de la expresión de CAR anti-BCMA02. Las poblaciones de células T se transdujeron con entre 4 x 108 y 5 x 107 unidades de transducción de un lentivirus que codifican una molécula de CAR anti-BCM02A. Las poblaciones de células T resultantes mostraron una frecuencia reducida de células T con CAR anti-BCMA02 (ensayada como porcentaje positivo) y una expresión reducida de moléculas CAR anti-BCMA02 (ensayada como intensidad de fluorescencia media: MFI).
Se determinó el impacto de la expresión reducida de la molécula de CAR sobre la actividad anti-BCMA02. La frecuencia de las células T positivos para CAR anti-BCMA se normalizó con células T no transducidos para contener 26 ± 4 % de células T reactivos a bCmA (Figura 11A). El MFI de las células T con CAR anti-BCMA02 normalizadas varió de 885 a 1875 (Figura 11B). K562 es una línea celular de CML que carece de expresión de BCMA. Las células K562 se diseñaron para expresar BCMA y se utilizaron en un ensayo citolítico in vitro para evaluar la actividad de células T con CAR anti-BCMA02 con expresión de CAR de BCMA variada (Figura 11C). Las células K562 se marcaron con trazas de violeta celular mientras que las células K562 que expresaban de manera estable BCMA (K562-BCMA) se marcaron con CFSE. Las células T, las células K562 y las células K562-BCMA se recolectaron, lavaron y resuspendieron en un medio que carecía de citocinas exógenas. Las células se cultivaron a una proporción de 20:1 o 10:1 efector (E; células T) a diana (T; mezcla 1:1 de células K562 y K562 BCMA) durante 4 horas en una incubadora de 37 °C con CO2 al 5 %. A continuación, las células se tiñeron con Live/Dead y se analizaron mediante FACS. La citotoxicidad se determinó mediante la diferencia en la relación de células K562:K562-BCMA normalizadas a condiciones que carecen de células T.
Ejemplo 5
Proceso de fabricación de células T con CAR anti-BCMA
Se fabrican productos únicos de células T con CAR anti-BCMA02 para cada tratamiento de paciente. La fiabilidad del proceso de fabricación de productos de células T con CAR anti-BCMA02 se evaluó generando células T con CAR anti-BCMA02 a partir de PBMC de 11 individuos donantes normales. La expansión de células T con CAR anti-BCMA02 de cada donante fue comparable a un cultivo no transducido emparejado realizado en paralelo (Figura 12A).
Al final del período de cultivo (día 10), se evaluó la eficiencia de la transducción de células T al cuantificar el número de lentivirus integrados con qPCR y conjuntos de cebadores específicos lentivirales (número de copias del vector, VCN). Los cultivos de células T con CAR anti-BCMA02 de los 11 donantes mostraron una eficiencia de transducción lentiviral comparable (Figura 12B). La frecuencia de células T positivas para CAR anti-BCMA02 se midió mediante citometría de flujo y se encontró que la expresión de BCMA era comparable en todos los donantes (Figura 12C). La actividad de cada producto de células T con CAR anti-BCMA02 se evaluó mediante liberación de IFNy después de un cocultivo con células K562 diseñadas para expresar BCMA. Todos los productos de células T con CAR anti-BCMA02 exhibieron niveles terapéuticamente relevantes de liberación de IFNy cuando se expusieron a células K562 que expresan BCMA (Figura 12D).
Ejemplo 56
Expresión de CD62L, CD127, CD197 y CD38 en células T con CAR tratadas con IL-2 o IL-2 y ZSTK474
Las células T con CAR cultivadas con IL-2 y ZSTK474 muestran un aumento de la expresión de CD62L en comparación con las células T con CAR cultivadas con IL-2 sola. El análisis de expresión de 29 marcadores de superficie celular adicionales en células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con IL-2 y ZSTK474 se realizó mediante el uso de citometría de masas multiparamétrica (CyTOF) y se comparó con células T con CAR cultivadas en IL-2 sola. Tres marcadores adicionales (CD127, CD197 y CD38) mostraron una expresión aumentada en las células T con CAR tratadas con IL-2 ZSTK474 en comparación con las células T con cAr tratadas con IL-2 sola. Por tanto, la coexpresión de CD62L, CD127, CD197 y CD38 estratificó adicionalmente las células T con CAR cultivadas con ZSTK474. Después del cultivo en medios que contienen IL-2, el 7,44 % de células T con CAR anti-BCMA02 coexpresaron CD127, CD197 y CD38 en comparación con el 24,5 % de las células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con IL-2 y ZSTK474. El diagrama de Venn de la Figura 13 ilustra la coexpresión de CD127, CD197 y CD38 en células T anti-BCMA02 positivas para CD62L.
Ejemplo 7
El tratamiento con ZSTK474 aumenta la frecuencia de las células T CD8
La expresión de CD8 se cuantificó en células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con IL-2 sola o IL-2 y ZSTK474. La expresión de CD8 se determinó mediante el uso de un anticuerpo anti-CD8 marcado con fluorescencia y citometría de flujo. Las células T con CAR anti-BCMA02 de siete donantes normales cultivadas con IL-2 y ZSTK474 tenían una expresión de CD8 significativamente mayor en comparación con las células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con IL-2 sola. Figura 14.
Ejemplo 8
Falta de actividad independiente de antígeno en células T con CAR ANTI-BCMA tratadas con ZSTK474
La actividad tónica de las células T con CAR en ausencia de antígeno se ha asociado con una actividad biológica reducida. La actividad tónica de las células T con CAR anti-BCMA02 se evaluó al cuantificar la liberación de interferón-Y (IFN-y) en ausencia de antígeno después del cultivo en presencia de IL-2 y ZSTK474 en comparación con las condiciones de cultivo estándar con IL-2 sola. Se prepararon cultivos de células T con CAR anti-BCMA mediante el uso de un sistema directamente escalable a grandes procesos de fabricación clínica. Brevemente, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en matraces estáticos en medios que contenían IL-2 (CellGenix) y anticuerpos específicos para CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec). Se añadieron 2 x 108 unidades de transducción de lentivirus que codifica CAR anti-BCMA un día después del inicio del cultivo.
Las células T con CAR anti-BCMA02 se mantuvieron en fase logarítmica mediante la adición de medio fresco que contenía IL-2 y una dosis optimizada de ZSTK474 durante un total de diez días de cultivo. Al final de la fabricación, se volvió a cultivar un número equivalente de células T con CAR anti-BCMA02 durante 24 horas en medio solo. La cantidad de IFN-y liberada en 24 horas se cuantificó mediante ELISA. En este ensayo, los niveles de IFN-y por debajo de 200 pg/ml no representan actividad tónica. La Figura 15 muestra que la cantidad de IFN-y liberada por células T con CAR anti-BCMA02 de 14 donantes es consistente con la falta de actividad tónica independientemente de que las células T con CAR se cultiven con ZSTK474 o no.
Ejemplo 9
Las células T con CAR ANTI-BCMA02 tratadas con ZSTK474 muestran actividad terapéutica en un modelo de tumor de linfoma
Se usaron células tumorales Daudi para interrogar la actividad antitumoral de células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con IL-2 o IL-2 y ZSTK474. Las células Daudi expresan un nivel bajo de proteína BCMA y proporcionan un modelo de tumor de linfoma agresivo y difícil de tratar.
2 x 106 células tumorales Daudi se marcaron con un gen de luciferasa de luciérnaga y se inyecta en ratones con desactivación génica NOD SCID gamma (NSG) con receptor de cadena a IL-2 por inyección intravenosa. Después de dejar que se formaran los tumores, se inyectaron 1 x 107 células T con CAR a ratones portadores de tumores. Se inyectaron ratones con i) células T con CAR anti-BCMA02 tratadas durante diez días con IL-2 o IL-2 y ZSTK474; o ii) una célula T con CAR anti-BCMA02 (tBCMA02) deficiente en señalización truncada tratada durante diez días con IL-2 y ZSTK474. El crecimiento del tumor se controló mediante bioluminiscencia mediante el uso de un sistema de formación de imágenes Xenogen-IVIS.
Se observó una regresión tumoral completa en el 50 % de los ratones a los que se les administraron células T con CAR anti-BCMA02 tratadas con IL-2 y ZSTK474. Figura 16.
Ejemplo 10
Las células T con CAR tratadas con ZSTK474 muestran actividad terapéutica en un modelo de ratón de mieloma humano
Los animales con 100 mm3 tumores subcutáneos de mieloma múltiples (RPMI-8226) fueron infundidos con dosis equivalentes de células T con CAR (1 x 106 células T positivas para CAR anti-BCMA02) o las células T no modificadas de un donante compatible de células T (no transducido). Se trataron células T con CAR anti-BCMA con IL-2 o IL-2 y ZSTK474 como se describe en el Ejemplo 8.
Los animales tratados con IL-2- o IL-2 y células T con CAR anti-BCMA02 cultivadas con ZSTK474 evitaron completamente el crecimiento tumoral. Figura 17. Por el contrario, los animales tratados con vehículo no transducido o no pudieron controlar el crecimiento tumoral. Figura 17.
En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no deben interpretarse para limitar las reivindicaciones a las modalidades específicas descritas en la especificación y las reivindicaciones, sino que deben interpretarse para incluir todas las posibles modalidades junto con el alcance completo de los equivalentes a los que

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende los aminoácidos 22-493 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9.
2. El CAR de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9.
3. El CAR de la reivindicación 2, en donde el CAR está codificado por la secuencia polinucleotídica establecida en la SEQ ID NO: 10.
4. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica el CAR de la reivindicación 2.
5. El vector de la reivindicación 4, en donde el vector es un vector de expresión, un vector episomal, un vector viral, un vector retroviral o un vector lentiviral.
6. El vector de la reivindicación 5, en donde el vector lentiviral se selecciona del grupo que consiste esencialmente en: virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1); virus de inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV).
7. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, que comprende una LTR retroviral izquierda (5'), una señal de empaquetamiento Psi (^), un segmento central de polipurina/pliegue de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral; un promotor unido operativamente al polinucleótido; y una LTR retroviral derecha (3').
8. El vector de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia de poliadenilación heteróloga.
9. El vector de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el promotor de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
10. El vector de la reivindicación 8, en donde el promotor heterólogo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de los simios 40 (SV40).
11. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la LTR 5' o LTR 3' es una LTR de lentivirus.
12. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la LTR 3' es una LTR autoinactivable (SIN).
13. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la secuencia de poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o una secuencia señal de poliadenilación de p-globina de conejo.
14. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde el promotor unido operativamente al polinucleótido de la reivindicación 2 se selecciona del grupo que consiste en: un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-a), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), un potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo (CAG), potenciador de polioma/promotor de timidina quinasa del herpes simple (MC1), un promotor de beta actina (p-ACT), un promotor del virus de los simios 40 (SV40) y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor del sitio de unión al cebador dl587rev sustituido (MND).
15. Una célula efectora inmunitaria ex vivo o in vitro que expresa un polinucleótido que codifica el CAR de la reivindicación 2.
16. Una célula efectora inmunitaria ex vivo o in vitro que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14.
17. La célula efectora inmunitaria ex vivo o in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16,
en donde la célula efectora inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T y una célula asesina natural (NK).
18. Una composición que comprende la célula efectora inmunitaria ex vivo o in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 y un excipiente fisiológicamente aceptable.
19. Un método in vitro o ex vivo para generar una célula efectora inmunitaria que comprende el CAR de la reivindicación 1, que comprende introducir en una célula efectora inmunitaria el vector de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14.
20. El método de la reivindicación 19, en donde la célula efectora inmunitaria es un linfocito T o una célula NK.
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