BR112021002487A2

BR112021002487A2 - receptor de antígeno quimérico que se liga a hla-dr e célula car-t

Info

Publication number: BR112021002487A2
Application number: BR112021002487-5A
Authority: BR
Inventors: Byoung Se Kwon; Jin Kyung Choi; Hyun Tae Son; Eun Hye Yoo; Young Ho Kim; Kwang Hee KIM; Ji Won Chung; Young Gyoon Chang; Bo Rim Yi; Jung Yun Lee; Seung Hyun Lee; Sun Woo Im
Original assignee: Eutilex Co., Ltd.
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-07-27
Also published as: MX2021001672A; JP2021533755A; US11013765B2; EP3835320A4; CA3109209A1; CN113366017B; SG11202101169PA; US11951130B2; KR20210043623A; US20220031742A1; JP7539161B2; US20200237821A1; WO2020032784A1; AU2019317229A1; EP3835320A1; CN113366017A

Abstract

RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO QUESE LIGA A HLA-DR E CÉLULA CAR-T. A presente invenção refere-se a uma molécula de ligação a antígeno e uma cepa celular para expressar a mesma, a molécula de ligação a antígeno sendo um receptor de célula T (TCR) e compreendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1) 1 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela sequência número 1, HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela sequência número 2 e HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela sequência número 3; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR1) 1 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela sequência número 4, LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela sequência número 5 e LCDR3 compreendendo uma sequência de amininoácido representada pela sequência número 6.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO QUE SE LIGA A HLA-DR E CÉLULA CAR-T". Campo da Técnica

[001] A presente invenção refere-se a receptores de antígeno quimérico e células CAR-T que se ligam a HLA-DR. Técnica Antecedente

[002] Células T feitas para expressar o receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alto potencial terapêutico no tratamento de câncer (Grupp et al., 2013; Kochenderfer et al., 2010, 2015; Porter et al., 2011).

[003] O sucesso clínico destas células é o resultado da estrutura de fusão de CARs em que vários domínios de sinalização e domínios de ligação a antígeno com várias avidezes são artificialmente ligados (Maus et al., 2014; van der Stegen et al., 2015).

[004] CAR se refere a moléculas sintéticas com base em um domínio de ligação a antígeno extracelularmente expressado que reconhece um antígeno alvejado, compreendendo um sítio de reconhecimento, um domínio de transmembrana (módulo), um ou mais domínios de sinalização coestimuladores e um sinal intracelular quimérico que porta um sinal de ativação (Jensen and Riddell, 2015).

[005] A ligação de células T tendo CAR com epítopos de células tumorais não é dependente do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) e pode induzir apoptose e morte celular de células tumorais através do mecanismo de células T citotóxicas (Ramos and Dotti, 2011).

[006] Nos últimos anos, CAR-Ts que alvejam CD 19 (Grupamento de Diferenciação 19) mostraram resultados notáveis no tratamento de pacientes com leucemia linfocítica aguda recorrente/refratária (ALL) (Kochenderfer, JN et al. (2010) Blood 116: 4099 - 4102; Porter, D. L ‘et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365: 725 - 733; Grupp, SA et al. (2013) N.

Engl. J Med. 368: 1509 - 1518; Kochenderfer, JN et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33: 540 - 549; Brown, CE et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375:2561 - 2569).

[007] Embora a terapia com célula CAR-T de CD19 tenha sido bem-sucedida no tratamento de linfoma não-Hodgkin de célula B reincidente/refratário, a taxa de resposta objetiva melhorou de 20 a 30% a 79%, com um 30 a 50% de taxa de remissão completa. Este número é 7 vezes mais alto do que os resultados prévios (Crump et al., 2016; Locke et al., 2017).

[008] Para o Receptor de Variante de Malignidade (MVR) usado neste relatório descritivo, esplenócitos foram isolados de camundongos Balb/c repetidamente imunizados com células de linfoma de células B derivadas do ser humano e hibridizados com células de mieloma SP2/0 para preparar misturas de hibridoma e hibridomas anti-MVR foram selecionados a partir da mistura de hibridoma que respondeu especificamente apenas a linfoma de células B e mostrou alta reatividade. (WO2016-094304)

[009] CD19 é expressado tanto em células normais quanto cancerosas, de modo que o anticorpo de CD19 não possa exatamente distinguir entre células normais e células cancerosas, mas o anticorpo de MVR pode exatamente distinguir entre células normais e cancerosas, garantindo desse modo alto efeito terapêutico e segurança. (Han et al., 2018).

[010] Houve um problema de que células CAR-T não são produzidas a partir de células T do tipo HLA-DR particulares tendo alta afinidade. De modo a melhorar isto, nesta patente, anticorpos tendo várias afinidades de ligação foram preparadas e finalmente, um anticorpo adequado como um produto terapêutico de célula CAR-T foi selecionado.

[011] A presente invenção é uma patente designada para ter uma variedade de afinidades de ligação ao antígeno através da variação de sequência do anticorpo de MVR de murino; espera-se que o anticorpo por si só possa ser usado como um agente terapêutico, ou que ele possa ser usado em agentes terapêuticos usando o anticorpo (produtos terapêuticos de célula CAR-T) e similares. Além disso, o anticorpo da presente invenção, produzindo-se um anticorpo humanizado com um anticorpo de MVR de murino para minimizar a imunogenicidade. Além disso, descobrindo-se anticorpos tendo várias afinidades de ligação, a produção de CAR-T pode ser esperada ser superior ao anticorpo precursor quando CAR-T é aplicado e pode ser aplicada a produtos terapêuticos de célula CAR-T para o tratamento de câncer sanguíneo. Descrição Detalhada da Invenção Problema a Ser Resolvido

[012] Um objetivo da presente invenção é fornecer um MVR que pode ser clinicamente aplicado e fornecer células CAR-T tendo um excelente efeito terapêutico. Especificamente, a presente invenção fornece um domínio coestimulador que pode ser introduzido em várias células CAR-T como um domínio coestimulador que desempenha um papel principal em sua função em células CAR-T de segunda geração. Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer vários domínios de ligação a antígeno que são capazes de se ligar a antígenos expressados na superfície de células cancerosas particulares e são capazes de formar células CAR-T. Meios de Resolver o Problema

[013] 1. Uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 1, uma HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 2 e uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 3; um região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 4; uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 5; e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 6; com a molécula de ligação a antígeno sendo um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[014] 2. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 1, compreendendo uma região variável de cadeia pesada representada pela Sequência No 7 e uma região variável de cadeia leve representada pela Sequência No 8.

[015] 3. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 1, compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 9.

[016] 4. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 1, compreendendo ainda a sequência de aminoácido representada pela Sequência No 13.

[017] 5. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 1, compreendendo ainda a sequência de aminoácido representada pela Sequência No 14.

[018] 6. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 1, compreendendo ainda um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular para ativar células T.

[019] 7. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 6, em que o referido domínio de transmembrana é selecionado a partir do grupo composto de uma cadeia alfa de um receptor de célula T, uma cadeia beta de um receptor de célula T, uma cadeia zeta de um receptor de célula T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33,

CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD 137 e CD154, em que o referido domínio de sinalização intracelular é um domínio de sinalização de CD3zeta e um domínio de sinalização coestimulador.

[020] 8. Uma molécula de ligação a antígeno de acordo com o Item 7, em que o domínio de sinalização coestimulador é selecionado a partir do grupo composto de CD28, OXO40, CD27, ICAM-1, CD278 e CD137.

[021] 9. Uma molécula de ácido nucleico que codifica a molécula de ligação a antígeno de qualquer um dos Itens 1 a 8.

[022] 10. Um vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico do Item 9.

[023] 11. Uma célula compreendendo a molécula de ácido nucleico do Item 9.

[024] 12. Uma célula de acordo com o Item 11 que é uma célula T.

[025] 13. Uma célula de acordo com o Item 12, em que as células T são células T CD8+ e/ou células T CD4+.

[026] 14. Uma célula de acordo com o Item 11 que é uma célula T modificada por receptor de antígeno quimérico (CAR-T).

[027] 15. Uma composição farmacêutica para tratar câncer, compreendendo a célula do Item 11 como um ingrediente farmaceuticamente eficaz.

[028] 16. Uma composição farmacêutica de acordo com o Item 15, em que o câncer é adenocarcinoma esofágico, câncer colorretal, melanoma, melanoma ocular, câncer pulmonar de células pequenas, neuroblastoma, teratoma, câncer fetal, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, timoma, leucemia linfocítica, linfoma de células B, linfoma de células B grande difuso, leucemia, leucemia mieloide aguda, ou similares.

[029] 17. Um método de tratar câncer, compreendendo uma etapa de administrar, a um paciente tendo câncer, uma composição farmacêutica compreendendo uma célula T compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação a antígeno de qualquer um dos Itens 1 a 8.

[030] 18. Um método de tratamento de câncer de acordo com o Item 17, em que a composição farmacêutica compreende células T CD8+, ou compreende células T CD4+ e células T CD8+.

[031] 19. Um método de tratamento de câncer de acordo com o Item 18, em que a proporção das contagens celulares de células T CD4+ para células T CD8+ é substancialmente 1:1.

[032] 20. Um método de fabricar uma célula T com um receptor de antígeno quimérico (CAR-T) modificado para o tratamento de câncer, compreendendo uma etapa de transfectar uma célula T com ácidos nucleicos que codificam uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 1, uma HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 2 e uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 3; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 4, uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 5 e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 6; com a molécula de ligação a antígeno sendo um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[033] 21. Uma composição farmacêutica para tratar câncer, compreendendo como um ingrediente farmaceuticamente eficaz, células T compreendendo a molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer um dos Itens 1 a 8.

[034] 22. Uma composição farmacêutica de acordo com o Item 21, em que a composição farmacêutica compreende células T CD8+ ou compreende células T CD4+ e células T CD8+.

[035] 23. Uma composição farmacêutica terapêutica de acordo com o Item 18, em que a proporção das contagens celulares de células T CD4+ para células T CD8+ é substancialmente 1:1. Efeito da Invenção

[036] No caso do MVR desenvolvido na presente invenção, HLA- DR aumentado pode ser seletivamente reconhecido em células tumorais e quando células CAR-T foram produzidas usando o mesmo, o MVR exibe uma forte eficácia in vitro e alta eficácia em animais.

[037] O mesmo também tem o efeito de aumentar a eficácia adicionando-se cinco aminoácidos a um domínio coestimulador de 4- 1BB convencional. Breve Descrição dos Desenhos

[038] A FIG. 1 mostra a respectiva sequência de aminoácido de VH do anticorpo de MVR de camundongo e 2 anticorpos humanizados fabricados (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).

[039] A FIG. 2 mostra a respectiva sequência de aminoácido de VL do anticorpo de MVR de camundongo e 2 anticorpos humanizados fabricados (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).

[040] A FIG. 3 mostra o resultado a análise de avidez de muMVR e 2 anticorpos humanizados (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).

[041] A FIG. 4 mostra a modelagem molecular e a predição do ponto quente de afinidade do anticorpo humanizado huMVR.M2H2, que é um MVR.

[042] A FIG. 5 mostra o resultado da análise de avidez de 15 tipos mutantes aos quais um ponto quente de afinidade foi aplicado.

[043] A FIG. 6a é uma esquemática das construções de CD19 CAR, CD19CAR_euCD137 e huMVR.L2H2CAR_euCD137. CD19CAR utilizou 214 a 255 aa do domínio 4-1 (CD137) no domínio coestimulador e CD19CAR_euCD137 e huMVR.L2H2CAR_euCD137 utilizaram 209 a 255 aa no domínio 4-1 (CD137).

[044] A FIG. 6b mostra os vetores lentivirais e os genes correspondentes que mostram as principais funções das células CAR-T e a sequência gênica da construção de CD19 CAR. Especificamente, a mesma mostra a sequência líder de CD8 incluindo o promotor EF1 alfa, o huMVR.L2H2 de scFv, a dobradiça de CDα e o domínio de transmembrana CD8 humano e os domínios de sinalização 4-1BB e CD3 zeta para aumentar a taxa de expressão de CAR. Também mostrados são genes correspondentes necessários para a produção lentiviral de grau seguro.

[045] A FIG. 7 mostra os vetores lentivirais e os genes correspondentes que mostram as principais funções de células CAR-T e a sequência gênica da construção de CD19 CAR. Especificamente, a mesma mostra a sequência líder de CD8 incluindo o promotor EF1 alfa, o MVR.L2H2 de scFv, a dobradiça de CDα e o domínio de transmembrana CD8 humano e os domínios de sinalização 4-1BB e CD3 zeta para aumentar a taxa de expressão de CAR. Também mostrados são genes correspondentes necessários para a produção lentiviral de grau seguro.

[046] A FIG. 8 mostra o processo de produção de célula CAR-T de MVR.

[047] A FIG. 9 mostra um resultado experimental que confirma a função apoptótica in vitro de CAR-Ts de MVR.

[048] A FIG. 10 mostra a taxa de produção e a avaliação da eficácia para os dois tipos de células CD19 CAR-T em que CD19CAR e CD19CAR_euCD137 foram introduzidos. A: 14 dias depois da produção dos 2 CD19 CAR-Ts, as células CD8 e CAR-T foram tingidas e a razão de produção de CAR-T obtida usando FACS é mostrada. B: A comparação é mostrada da citotoxicidade dos respectivos CAR-Ts, depois de realizar um ensaio de luciferase 4 horas depois de reagir 2 espécies de CAR-T produzido com um alvo.

[049] A FIG. 11 mostra a expressão de HLA-DR na linhagem celular e a avidez de huMVR L2H2 scFv, usando FACS, antes de avaliar o efeito de huMVR CAR-T em um modelo animal.

[050] A FIG. 12 mostra a avaliação da eficácia realizada em um modelo animal usando a linhagem celular de CAR-T, depois de confirmar a proporção de produção de célula CAR-T e a citotoxicidade no nível de linhagem celular na FIG. 9. A: Resultado do uso de equipamento de imagiologia IVIS para avaliar a efetividade de CAR-T depois de induzir subcutaneamente um modelo animal injetando-se subcutaneamente um camundongo com uma linhagem celular cancerosa que expressa luciferase. B: Resultado da confirmação e representação gráfica de valores de fóton em cada camundongo depois da imagiologia.

[051] A FIG. 13 mostra a proporção e o número de CAR-T presente no sangue usando FACS depois de realizar a coleta de sangue orbital no camundongo em intervalos de 3 a 4 dias. A: Confirmação por gráfico da proporção de CD19 CAR-T total presente no sangue por intermédio do tingimento por FACS de células CD8+/CAR+. B: reconfirmação por gráfico da proporção de CD8 e CD4CAR-T depois da confirmação da proporção de CAR-T global. C. Gráfico que mostra o número de células CAR-T presentes no sangue usando-se FACS que conta as pérolas durante o tingimento por FACS.

[052] A FIG. 14 ilustra o teste de eficácia de CD8 huMVR CAR-T e CD4/CD8 huMVR CAR-T usando um modelo animal intraperitoneal. A: Resultado da imagiologia IVIS dos efeitos de CD8 huMVR CAR-T e CD4/CD8 huMVR CAR-T depois de induzir modelos animais injetando- se linhagens celulares cancerosas que expressam luciferase na cavidade abdominal de camundongo. B. Gráficos que mostram os valores de fóton de células cancerosas no modelo animal induzido pela cavidade abdominal.

[053] A FIG. 15 ilustra o teste de eficácia de MVR CAR-T usando um modelo animal. A: Resultado da imagiologia IVIS que mostra o efeito de MVR CAR-T depois de induzir modelos animais injetando-se linhagens celulares cancerosas que expressam luciferase em camundongos subcutaneamente. B: Gráficos que mostram o tamanho da massa cancerosa subcutaneamente induzida depois da medição com calibradores automáticos.

[054] A FIG. 16 é um gráfico que mostra as viabilidades de camundongos em cada grupo com base na FIG. 15.

[055] A FIG. 17 ilustra a proporção e o número de CAR-Ts presentes no sangue usando FACS depois de realizar a coleta de sangue orbital no camundongo em intervalos de 3 a 4 dias depois da administração de MVR CAR-T. A: Gráfico que mostra a proporção de células hCD45+/CAR+ no sangue do camundongo. B: Gráfico que mostra o número de células MVR CAR-T presentes no sangue de camundongo usando-se FACS que conta as pérolas durante o tingimento por FACS. Melhor Modo de Realizar a Invenção

[056] A presente invenção se refere a uma célula que expressa um receptor de antígeno quimérico, uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo e um método de tratamento de câncer usando o mesmo.

[057] Como usado na presente invenção, o termo "Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)" se refere a um domínio de ligação a antígeno que atua através de um receptor que é exposto no exterior da célula que reconhece uma molécula alvo; um ou mais domínios de dobradiça ou domínios espaçadores; um domínio de transmembrana;

um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares; e um domínio estimulador intracelular.

[058] Como usado na presente invenção, o termo "célula T" se refere a linfócitos derivados do timo e desempenham um papel importante na imunidade celular. Células T abrangem células T CD4+, células T CD8+, células T de memória, células T reguladoras, células T exterminadoras naturais e similares. Em uma modalidade da presente invenção, as células T em que o CAR é introduzido são células T CD8+, ou células T CD8+ e células T CD4+.

[059] Como usado neste relatório descritivo, "anticorpo" e "proteína de ligação a antígeno" podem ser usados permutavelmente e a proteína de ligação a antígeno de acordo com a presente invenção abrange não a penas a forma de anticorpo integral mas também fragmentos funcionais da molécula de anticorpo. O anticorpo integral é uma estrutura tendo duas cadeias leves de tamanho natural e duas cadeias pesadas de tamanho natural e cada cadeia leve é conectada por uma cadeia pesada e ligação dissulfeto. Fragmentos funcionais de moléculas de anticorpo se referem a fragmentos tendo função de ligação a antígeno e abrangem Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv e similares. Destes fragmentos de anticorpo, Fab tem um único sítio de ligação a antígeno com uma estrutura com uma cadeia leve, região variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve e uma primeira região constante de cadeia pesada (CH1). Fab’ difere de Fab em que ele tem uma região de dobradiça compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína no término C do domínio CH1 de cadeia pesada. Anticorpos F(ab’)2 são produzidos formando-se ligações dissulfeto de resíduos de cisteína na região de dobradiça de Fab’.

[060] Técnicas recombinantes para gerar fragmentos Fv com fragmentos de anticorpo mínimos em que Fv tem apenas uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve foram divulgadas em pedidos de patente internacionais publicados WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 e WO 88/09344. Fv de cadeia dupla (dsFv) é uma ligação dissulfeto, a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve sendo ligadas e Fv de cadeia curta (SCFv) é geralmente covalentemente ligado à região variável da cadeia pesada e da cadeia leve através de um ligante de peptídeo. Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando enzimas proteolíticas (por exemplo, o anticorpo inteiro pode ser restrito à papaína e Fab pode ser obtido e a pepsina de clivagem pode produzir um fragmento F(ab’)2).

[061] Neste relatório descritivo, HLA-DR (Relacionado a Antígeno Leucocítico Humano-Antígeno D) se refere a uma molécula da Classe II de Complexo Principal de Histocompatibilidade (Shackelford, DA et al., (1982) Immunol. Rev. 66: 133 - 187). HLA-DR, que é um peptídeo de nove ou mais aminoácidos e seu ligante, compõem um ligante para TCR. Moléculas de HLA-DR são supra-reguladas em resposta à sinalização. No caso de infecção, peptídeos (por exemplo peptídeos de enterotoxina I de Staphylococcus) são ligados à molécula de DR e são fornecidos a numerosos receptores de célula T encontrados em células T auxiliares. Estas células se ligam a antígenos de superfície de célula B que estimulam a proliferação de célula B.

[062] A principal função de HLA-DR é apresentar antígenos peptídicos estranhos que não estavam originalmente no sistema imune para induzir ou inibir a resposta de células T auxiliares para induzir a produção de anticorpos ao mesmo antígeno peptídico. HLA-DR é um dímero αβ e um receptor de superfície celular; cada subunidade compreende dois domínios extracelulares, um domínio de transposição de membrana e uma cauda citoplásmica. Tanto as cadeias α quanto β são fixadas à membrana celular. O domínio de término N da proteína madura forma uma alfa-hélice que compõe a porção exposta do grupo de ligação e a região citoplasmática de término C interage com outras cadeias para formar folhas beta sob o grupo de ligação através da membrana celular. A maioria dos locais de contato do peptídeo está nos primeiros 80 resíduos de cada cadeia.

[063] HLA-DR é expressado a um grau limitado em células apresentadoras de antígeno tais como células dendríticas, macrófagos, monócitos e células B. Porque a abundância aumentada de ‘antígenos’ de DR na superfície celular frequentemente responde a estímulos, DR é também um marcador de ação imune, devido ao HLA-DR de alta expressão em malignidades celulares e espectro de expressão limitada em células normais, anticorpos contra HLA-DR foram desenvolvidos e testados quanto a malignidades de célula B em estudos pré-clínicos e clínicos (Nagy, ZA, et al. (2002) Nat. Med. 8: 801 - 807; DeNardo, GL, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 7075s-7079s; Ivanov, A., et al. (2009) J. Clin. Invest. 119: 2143 - 2159; Lin, TS, et al. (2009) Leuk. Lynphoma 50: 1958 - 1963). Embora a toxicidade não fosse severa no teste de fase I/II, outra pesquisa foi descontinuada devido à eficácia limitada (Lin, T.S.et al. (2009) Leuk. Lynphoma 50: 1958 - 1963). Devido ao potencial para células CAR-T para realçar a eficácia terapêutica de anticorpos monoclonais incorporando-se a especificidade do antígeno em respostas de célula T em grande escala, é reconhecido que células CAR-T dirigidas por HLA-DR podem ser produtos terapêuticos úteis para tumores malignos em células B.

[064] Em uma modalidade da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende um scFv e tem uma forma em que um domínio de transmembrana, domínio de sinalização coestimulador e domínio de sinalização intracelular são funcionalmente conectados. Para o domínio de transmembrana a cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, ou um ou mais de CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 ou CD154, mas o mesmo não é limitado a estes. O domínio de sinalização intracelular é basicamente um domínio de sinalização primária CD3zeta; como um domínio de sinalização coestimulador, um ou mais de CD28, OXO40, CD27, ICAM-1, ICOS (CD278) e 4-1BB (CD137) podem ser usados, mas o mesmo não é limitado a estes. Em uma modalidade da presente invenção, o domínio de transmembrana é CD8 e o domínio de sinalização coestimulador é 4-1BB.

[065] O scFv da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região variável de cadeia pesada (VH) e tem uma estrutura VL-VH ou VH-VL e VL e VH podem ser ligados diretamente ou conectados por um ligante. Se um ligante for usado, um ligante conhecido na técnica pode ser opcionalmente usado, por exemplo, (GGGGS)2, (GGGGS)3, (Gly)6, (Gly)8, ou (EAAAK)n (onde n é qualquer número inteiro de 1 a 3), mas o mesmo não é limitado a estes. Em uma modalidade da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende uma construção de VL-Ligante-VH e o ligante é (GGGGS)3.

[066] O scFv da molécula de ligação a antígeno da presente invenção especificamente se liga a um antígeno apresentado na superfície celular; este antígeno é em particular uma proteína de superfície celular que é especificamente expressada em células alvos, por exemplo células cancerosas, ou super-expressada em células cancerosas e pode, por exemplo ser pelo menos um selecionado a partir do grupo composto de CD30, CD20, CD19, CD22 e CD138. Em uma modalidade da presente invenção, o antígeno é HLA-DR.

[067] Em uma modalidade da presente invenção, o scFv é huMVR, um anticorpo contra HLA-DR. O huMVR compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 1, uma

HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 2 e uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 3; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 4, uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 5 e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 6; em que a molécula de ligação a antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em uma modalidade da presente invenção, o scFv compreende uma região variável de cadeia pesada representada pela Sequência No 7 e uma região variável de cadeia leve representada pela Sequência No 8; em uma outra modalidade da presente invenção, o scFv compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 9 de huMVR.

[068] A molécula de ligação a antígeno da presente invenção é um receptor de antígeno quimérico (CAR) tendo scFv como um sítio de ligação a antígeno; em uma modalidade da presente invenção, a molécula de ligação a antígeno compreende ainda um domínio de transmembrana no término C do scFv e um domínio de sinalização intracelular para ativar células T.

[069] Em uma outra modalidade da presente invenção, o CAR compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 7 ou Sequência No 8. Em uma modalidade da presente invenção, o domínio de transmembrana é selecionado a partir do grupo composto de uma cadeia alfa de um receptor de célula T, uma cadeia beta de um receptor de célula T, uma cadeia zeta de um receptor de célula T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD 137 e CD154 e variantes do mesmo, em que o referido domínio de sinalização intracelular é um domínio de sinalização de CD3zeta e um domínio de sinalização coestimulador; em uma modalidade da presente invenção, o domínio de sinalização coestimulador é selecionado a partir do grupo composto de CD28, OX40, CD27, ICAM-1, CD278 e CD137.

[070] "Polipeptídeo isolado", "peptídeo isolado", ou "proteína isolada" se refere a um polipeptídeo ou proteína que é substancialmente livre de compostos aos quais o mesmo comumente se ligaria no estado natural (por exemplo, outras proteínas ou polipeptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos). "Isolado" não significa a remoção de misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos, a remoção de impurezas que não interferem com a atividade biológica, ou a remoção de impurezas que podem estar presentes devido por exemplo à adição de um estabilizador a um produto não acabado ou à formulação de uma preparação farmaceuticamente aceitável.

[071] O termo "região variável" se refere à porção de uma molécula de anticorpo que exibe muitas variações de sequência enquanto realizando a função de se ligar especificamente a um antígeno; CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes na região variável. "Regiões determinantes de complementaridade (CDR)" são sítios envolvidos no reconhecimento do antígeno; estes sítios são importantes em determinar a especificidade do anticorpo ao antígeno de acordo com mudanças na sequência para este sítio. Entre as CDRs, existe uma "região de estrutura (FR)" na orientação apropriada que suporta os anéis de CDR; especificamente FR1, FR2, FR3 e FR4 estão presentes.

[072] Em uma modalidade da presente invenção, a outra proteína de ligação a antígeno da presente invenção pode ser um anticorpo humanizado. Na presente invenção, o termo "anticorpo humanizado" se refere geralmente a um anticorpo que é não-imunogênico ou reduzido em imunogenicidade em seres humanos, como descrito acima. Anticorpos humanizados são anticorpos alterados e a sequência de aminoácido do anticorpo pode ser rearranjada para satisfazer o propósito desejado. Estas possíveis mudanças são numerosas e podem variar a partir da mudança de um ou uma pluralidade de aminoácidos até a reconfiguração completa da região variável ou constante de um anticorpo. Em geral, embora a modificação da região variável seja realizada para aumentar a avidez e a afinidade do antígeno, a alteração na região constante é realizada para aumentar a ação intracelular tal como fixação do complemento, interação com a membrana e a função de outros agentes de efeito. Os anticorpos humanizados fornecidos pela presente invenção podem ser combinados com todos os tipos de regiões constantes por métodos recombinantes. A região constante de cadeia pesada é do tipo gama (γ), mi (µ), alfa (α), delta (δ) épsilon (ε) e subclassificado como gama 1 (γ1) gama 2 (γ2) gama 3 (γ3) gama 4 (γ4) alfa1 (α1), alfa2 (α2). As regiões constantes das cadeias leves têm os tipos capa (κ) e lambda (λ) (Coleman et al., Fundamental immunology, 2o Ed., 1989, 55 - 73).

[073] O termo "fragmento," como aplicado a sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo, se refere a uma sequências de ácido nucleico ou sequências de peptídeo que tem um comprimento reduzido comparado ao ácido nucleico ou proteína anteriormente mencionados e compreende pelo menos uma porção que é idêntica à sequência de nucleotídeo ou sequências de peptídeo daquele ácido nucleico ou proteína anteriormente mencionados. Tais fragmentos de ácido nucleico e fragmentos de polipeptídeo de acordo com a presente invenção podem, se apropriado, ser compreendidos dentro de polinucleotídeos ou polipeptídeos maiores como componentes dos mesmos. Tais fragmentos podem compreender ou consistir em oligonucleotídeos ou oligopeptídeos tendo sequências de nucleotídeo ou peptídeo contínuas de um ácido nucleico ou proteína de acordo com a presente invenção, com comprimentos de pelo menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23,

24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 ou mais.

[074] Uma "variante" de um polipeptídeo ou proteína se refere a qualquer análogo, fragmento, derivado ou mutação derivados daquele polipeptídeo ou proteína e retendo pelo menos uma propriedade biológica deste polipeptídeo ou proteína. Diferentes variantes deste polipeptídeo ou proteína podem estar presentes na natureza. Estas variantes podem ser variações de alelos caracterizadas por diferentes sequências de nucleotídeo do gene estrutural que codifica a proteína, ou podem compreender modificações de splicing ou pós-traducionais diferenciadas. Um técnico no assunto pode produzir variantes tendo uma ou uma pluralidade de substituições, deleções, adições ou substituições de aminoácido. Estas variantes podem compreender: (a) uma variante em que um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos com aminoácidos conservativos ou não conservativos, (b) uma variante em que um ou mais aminoácidos são adicionados a um polipeptídeo ou proteína, (c) uma variante em que um ou mais dos aminoácidos compreendem um substituinte e (d) uma variante em que o polipeptídeo ou proteína é fundido com um outro polipeptídeo, tal como albumina sérica.

[075] Variantes conservativas também se referem a sequências de aminoácido tendo alterações de sequência que não afetam adversamente a função biológica da proteína. Se uma sequência alterada interfere com ou destrói uma função biológica associada com uma proteína, então a substituição, inserção ou deleção é descrita como afetando adversamente a proteína. Por exemplo, a carga total, estrutura ou hidrofobicidade-hidrofilicidade de uma proteína pode ser alterada sem afetar adversamente a atividade biológica. Consequentemente, a sequência de aminoácido pode ser alterada tal que, por exemplo, o peptídeo exibe hidrofobicidade ou hidrofilicidade mais alta sem afetar adversamente a atividade biológica da proteína. Técnicas para obter tais variantes, que abrangem técnicas genéticas (supressão, deleção, mutação e similares), químicas e enzimáticas, são conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.

[076] Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica a molécula de ligação a antígeno é divulgada. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 7, ou uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 7.

[077] Em uma outra modalidade da presente invenção, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência para codificar o scFv representado pela Sequência No 9. Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR, representada pela Sequência No 15 ou Sequência No 16. Além disso, ainda em uma outra modalidade da presente invenção, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de homologia, para codificar um polipeptídeo que é a mesma sequência de aminoácido como a proteína codificada pela sequência acima, ou que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de homologia.

[078] Os termos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico," "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" na presente invenção são usados permutavelmente e se referem a formas de filamento único ou duplo de hélices de ésteres de fosfato de ribonucleosídeos (adenosina,

guanosina, uridina ou citidina; "moléculas de RNA") ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimina ou desoxicitidina, "moléculas de DNA"); ou fosforotioato ou qualquer análogo de éster de fosfato tal como tioéster. Destes, hélices de DNA-DNA, DNA-RNA e RNA-RNA são possíveis. O termo molécula de ácido nucleico e em particular Molécula de DNA ou RNA, se refere apenas às estruturas primárias e secundárias da molécula e não é limitada a qualquer forma terciária particular. Assim, este termo abrange, dentre estas moléculas, moléculas de DNA lineares ou cíclicas (por exemplo, fragmentos de enzima de restrição), plasmídeos, DNA superespiralado e DNA de filamento duplo encontrado em cromossomos. Na discussão da estrutura de uma molécula de DNA de filamento duplo particular neste relatório descritivo, a estrutura pode ser descrita de acordo com a convenção geral que a sequência é apresentada apenas na direção 5’ a 3’ ao longo do filamento de DNA não-transcrito (isto é, o filamento com a sequência correspondendo ao mRNA). "Moléculas de DNA recombinante" são moléculas de DNA que passaram por manipulação molecular-biológica. O DNA abrange, mas não é limitado a, cDNA, DNA genômico, DNA plasmídico, DNA sintético e DNA semissintético.

[079] Como é conhecido na técnica, o termo "porcentagem de identidade" é a relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, como determinado comparando-se as sequências. Além disso, na técnica, o termo "identidade" se refere, como o caso pode ser, ao grau de correspondência de sequência entre sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, como determinado pelo grau de correspondência entre as sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos incluindo mas não limitados àqueles descritos em Computational Molecular Biology ((Lesk, A. M.,

ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991).

[080] Métodos preferidos de determinar a identidade são designados para fornecer a correspondência ideal entre as sequências testadas. Métodos de determinar identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Cálculos de alinhamento de sequência e porcentagem de identidade podem ser realizados usando software de análise de sequência tal como o programa Megaalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). O alinhamento múltiplo de sequências pode ser realizado usando o método de alinhamento Clustal com parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) (Higgins et al., CABIOS. 5: 151 (1989)). Os parâmetros padrão para alinhamento aos pares usando o método Clustal podem ser selecionados a partir de KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5. Como é conhecido na técnica, "similaridade" entre 2 espécies de polipeptídeos é determinada comparando-se a sequência de aminoácido e as substituições de aminoácido conservadas do polipeptídeo com a sequência do 2o polipeptídeo. Identidade ou homologia a estas sequências no presente pedido se refere ao alinhamento das sequências e à introdução de lacunas conforme necessário para obter porcentagem de homologia máxima, sem considerar qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência e depois é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos peptídeos conhecidos. Expansão, deleção ou inserção nas sequências de peptídeo, no término N, término C ou internamente, não deve ser interpretado como afetando a homologia.

[081] O termo "homologia" se refere à porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou duas porções polipeptídeo. A correspondência entre as sequências de uma parte e uma outra parte pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, homologia pode ser determinada alinhando-se a informação de sequência e a informação de sequência imediatamente comparada entre duas moléculas de polipeptídeo usando programas de computador disponíveis. De outro modo, homologia pode ser determinada hibridizando-se polinucleotídeos sob condições que formam um duplex estável entre as regiões do mesmo tipo e depois clivando-se com uma nuclease específica de filamento único e dimensionando-se os fragmentos clivados.

[082] Como usado neste relatório descritivo, todas as formas gramaticais e ortográficas do termo "homologia" se referem à correspondência entre as proteínas com "origem evolutiva comum" (Reeck et al., Cell 50:667 (1987)), incluindo proteínas de uma superfamília (por exemplo, a superfamília de imunoglobulina) e proteínas homólogas de outras espécies (por exemplo, cadeia leve de miosina e similares). Estas proteínas (e os genes que as codificam) têm homologia de sequência devido à sua alta similaridade de sequência. Entretanto, em uso geral e no presente pedido, quando modificado com um advérbio tal como "muito", o termo "homológo" se refere à homologia de sequência e não indica uma fonte evolutiva comum.

[083] Assim, o termo "similaridade de sequência" em todas as formas gramaticais se refere ao grau de identidade ou correspondência entre sequências de ácido nucleico ou aminoácido que podem ter ou não uma origem evolutiva comum (Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). Em uma modalidade, quando cerca de 50 % (por exemplo, pelo menos cerca de 75 %, 90 %, ou 95 %) dos nucleotídeos corresponde a uma sequência de DNA de um comprimento definido ou mais, as duas sequências de DNA são "substancialmente homológas" ou "substancialmente similares". Sequências substancialmente homológas podem ser identificadas comparando-se as sequências usando software padrão disponível com um banco de dados de sequência ou, por exemplo, experimentos de hibridização Southern sob condições severas como definido para um sistema particular. Definir as condições de hibridização apropriadas está dentro do escopo técnico da técnica (consultar, para exemplo, Sambrook et al. 1989).

[084] Como usado neste relatório descritivo, "substancialmente similar" se refere a um fragmento de ácido nucleico no qual uma mudança em uma ou mais bases de nucleotídeos causa a substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afeta as propriedades funcionais da proteína que esta sequência de DNA codifica. "Substancialmente similar" também se refere a um fragmento de ácido nucleico no qual uma mudança em uma ou mais bases de nucleotídeo não afeta a capacidade do fragmento de ácido nucleico de mediar mudanças na expressão gênica por técnicas de antissenso ou de cosupressão. "Substancialmente similar" também se refere a modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção, como deleções ou inserções de uma ou mais bases de nucleotídeos que não afetam substancialmente as propriedades funcionais do transcrito resultante. Consequentemente, a presente invenção deve ser entendida como abrangendo também as sequências particulares ilustradas. Cada uma das modificações sugeridas está dentro da habilidade comum na técnica, de modo a determinar a retenção da atividade biológica do produto codificado.

[085] Além disso, o técnico no assunto entenderá que sequências substancialmente similares abrangidas pela presente invenção são definidas pela capacidade de hibridizar com as sequências ilustradas neste relatório descritivo sob condições rigorosas (0,1X SSC, 0,1 % de SDS, 65 °C e 0,1 X SSC, 0,1 % de SDS após lavagem com 2X SSC, 0,1% de SDS). Fragmentos de ácido nucleico substancialmente similares da presente invenção são fragmentos de ácido nucleico cujas sequências de DNA são pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 90 % ou 95% idênticas à sequência de DNA dos fragmentos de ácido nucleico relatados neste relatório descritivo.

[086] Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção. O termo "expressão" se refere à produção biológica de um produto codificado por uma sequência de codificação. Na maioria dos casos, a sequência de DNA que compreende a sequência de codificação é transcrita para formar o RNA mensageiro (mRNA). O RNA mensageiro é então traduzido para formar um produto polipeptídico com atividade biológica correspondente. Além disso, o processo de expressão pode compreender uma etapa adicional de processamento de produtos de transcrição de RNA (por exemplo, splicing para remover íntrons) e/ou processamento pós-tradução do produto polipeptídico.

[087] Como usado neste relatório descritivo, o termo "vetor de expressão" se refere a um vetor, plasmídeo ou transportador designado para transformar um hospedeiro após expressar uma sequência de ácido nucleico inserida.

[088] Os genes clonados, ou seja, as sequências de ácido nucleico inseridas, são geralmente colocados sob o controle de elementos reguladores tais como promotores, promotores mínimos, intensificadores e similares. Inúmeras regiões reguladoras de iniciação ou promotores que são úteis para induzir a expressão de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira desejada são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

Qualquer promotor capaz de induzir substancialmente a expressão desses genes inclui, mas não é limitado a promotores virais, promotores bacterianos, promotores animais, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos de tecido, promotores de patogênese ou relacionados a doenças, promotores específicos de desenvolvimento, promotores induzíveis, promotores regulados por luz e similares; e incluem, mas não são limitados a, promotores contendo a região de promotor inicial de SV40 (SV40) e a repetição de término longo 3’ (LTR) do vírus do sarcoma de Rous (RSV); E1A de adenovírus (Ad) ou principais promotores tardios (MLP); promotores iniciais imediatos de citomegalovírus humano (HCMV); promotores da timidina cinase (TK) do vírus herpes simplex (HSV); promotores de IE1 de baculovírus; promotores de fator de alongamento 1 alfa (EF1); promotores da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GSPDH), promotores da fosfoglicerato cinase (PGK); promotores da ubiquitina C (Ubc); promotores de albumina; promotores de metalotioneína-L de rato e sequências reguladoras de regiões reguladoras de transcrição; promotores ubíquos (HPRT, vimentina, β-actina, tubulina, etc.); filamentos intermediários (desmina, neurofibrilas, queratina, GFAP e similares), promotores de genes terapêuticos (formas MDR, CFTR ou fator VIII e similares), promotores de início ou relacionados à doença; e promotores que foram usados em animais transgênicos e exibem especificidade de tecido, como regiões reguladoras de genes para elastases que são ativas em células acinares pancreáticas (como células acinares pancreáticas); regiões reguladoras do gene da insulina ativas em células beta pancreáticas; regiões reguladoras de genes de imunoglobulina ativas em células linfoides; regiões reguladoras do vírus do câncer de mama de camundongo ativas em testículos, mama,

linfáticos e macrófagos; genes da albumina ativos no fígado; Regiões reguladoras de Apo AI e Apo AII, regiões reguladoras de genes de alfa- fetoproteína ativas no fígado; regiões reguladoras do gene da alfa 1- antitripsina ativas no fígado; regiões reguladoras do gene da beta- globina ativas nas células da medula óssea; regiões reguladoras de proteínas básicas de mielina ativas ativas em células de oligodendrócitos no cérebro; regiões reguladoras do gene da cadeia leve 2 da miosina ativas no músculo esquelético e hormônio liberador gonadotrópico ativo no hipotálamo; promotores de piruvato cinase; promotores de vilina; promotores de proteínas intestinais de ligação a ácidos graxos; promotores de β-actina em células musculares lisas.

[089] O termo "vetor" abrange transportadores não virais e virais para a introdução de ácidos nucleicos em células in vitro, ex vivo ou in vivo.

[090] O vetor pode ser um replicon com outro fragmento de DNA anexado para amplificar o fragmento anexado. O termo "replicon" se refere a qualquer elemento genético (por exemplo, um plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que é capaz de atuar como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo, ou seja, replicar sob seu próprio controle. Muitos vetores conhecidos na técnica podem ser usados para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de resposta e promotores em genes e similares. Os vetores preferidos compreendem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificados compreendendo, por exemplo, adenovírus, retrovírus, vírus adeno-associados, vírus de herpes ou plasmídeos como PBR322 ou derivados de plasmídeo pUC ou vetores Bluescript. Por exemplo, fragmentos de DNA correspondentes a elementos de reação e promotores podem ser inseridos em vetores apropriados combinando os fragmentos de DNA apropriados com vetores selecionados tendo terminais coesivos complementares. Se este não for o caso, os terminais das moléculas de

DNA podem ser modificados enzimaticamente, ou qualquer local pode ser gerado ligando a sequência de nucleotídeos (ligante) com os terminais do DNA. Esses vetores podem ser manipulados de modo a conter um gene marcador de seleção para o rastreio de células que incorporaram o marcador no genoma celular. Esses marcadores permitem identificar e/ou rastrear células hospedeiras que expressam a proteína codificada pelo marcador.

[091] O vetor fornece as sequências reguladoras necessárias (por exemplo, elementos de transcrição e tradução) para regular a expressão da proteína de fusão na célula hospedeira apropriada. As sequências reguladoras podem compreender regiões promotoras, regiões estimuladoras, locais de terminação da transcrição, locais de ligação ribossômica, códons de iniciação, sinais de splice, íntrons, sinais de poliadenilação, sequências de tradução Shine/Dalgarno e sequências de consenso Kozak. A sequência reguladora é selecionada em função da célula hospedeira na qual a proteína de fusão será produzida. Os promotores bacterianos adequados incluem, mas não são limitados a, bacteriófago XPL ou pR, T6, T7, T7/lacO, lac, recA, gal, trp, ara, cabana e trp-goma-laca. Os promotores eucarióticos adequados incluem, mas não são limitados a, PRBI, GAPDH, metalotioneína, timidina cinase, LTR viral, citomegalovírus, SV40 ou promotores específicos de tecido ou tumorais, tais como proteína α-fetal, amilase, catepsina E, receptor muscarínico M1 ou γ-glutamil transferase.

[092] Outros vetores incluem lipoplexos (complexos de lipossoma- DNA catiônico), poliplexos (complexos de polímero-DNA catiônico) e os complexos de DNA-proteína. Além dos ácidos nucleicos, o vetor também pode compreender uma ou mais regiões reguladoras e/ou marcadores selecionáveis úteis para selecionar, medir e monitorar os resultados da entrega de ácido nucleico (entrega a um determinado tecido, duração da expressão e similares).

[093] Os vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira desejada por um método conhecido na técnica, tal como injeção, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, lipofecção, precipitação com fosfato de cálcio (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973); e Chen e Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745- 2752 (1987)), método de sal texturizado mediado por lipossoma (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau e Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982); e Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987)), tratamento com DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188- 1190 (1985)), bombardeamento de genes (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 87: 9568-9572 (1990)) usando espécies de genes ou transportadores de vetor de DNA (ver, para exemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988); e Hartmut et al., Pedido de Patente Canadense No 2.012.311)

[094] Os vetores virais têm sido utilizados em uma vasta gama de aplicações de transferência de genes em células bem como em indivíduos animais vivos. Os vetores virais que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, vetores de adenovírus, retrovírus, vírus vaccinia, poxvírus, vírus adeno-associado, vírus herpes simplex, lentivírus, baculovírus, vírus sendai, vírus do sarampo, vírus símio 40 e vírus Epstein-Barr. Os vetores não virais incluem plasmídeos, lipoplexos (complexos catiônicos de lipossoma-DNA), poliplexos (complexos catiônicos de polímero-DNA) e complexos de proteína-DNA. Além dos ácidos nucleicos, o vetor pode compreender uma ou mais regiões reguladoras e/ou marcadores de seleção úteis para triagem, medição e monitoramento dos resultados de entrega de ácido nucleico (entrega ao tecido, persistência de expressão e similares).

[095] Os polinucleotídeos de acordo com a presente invenção podem ser introduzidos in vivo por lipofeco. Nas últimas décadas, o uso de lipossomas para encapsular e transfectar ácidos nucleicos in vitro tem aumentado. Lipídeos catiônicos sintéticos, designados para limitar as dificuldades e riscos encontrados pela transfecção mediada por lipossomas podem ser usados para preparar lipossomas para transfecção in vivo de genes (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84: 7413 (1987 ); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027 (1988); e Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)). O uso de lipídios catiônicos pode promover a encapsulação de ácidos nucleicos carregados negativamente e também pode promover a fusão com membranas celulares carregadas negativamente (Feigner et al., Science 337: 387 (1989)). Compostos lipídicos e composições particularmente úteis para a distribuição de ácidos nucleicos são descritos em WO95/18863, WO96/17823 e US 5.459.127. O uso de lipofecção para introduzir genes exógenos em tecidos particulares in vivo tem várias vantagens práticas. O direcionamento molecular de lipossomas para células específicas apresenta uma área de vantagem. A transfecção direta para tipos de células específicos será claramente particularmente desejável para tecidos com heterogeneidade celular, como o pâncreas, fígado, rim e cérebro. Os lipídios podem se ligar quimicamente a outras moléculas para direcionamento (Mackey et al. 1988). Peptídeos direcionados, como hormônios ou neurotransmissores, e proteínas, como anticorpos, ou moléculas não peptídicas podem ser quimicamente ligados aos lipossomas.

[096] Como usado neste relatório descritivo, o termo "transfecção" se refere à absorção de RNA ou DNA exógeno ou heterólogo por uma célula. Quando RNA ou DNA exógeno ou heterólogo é introduzido na célula, a célula é "transfectada" por tal RNA ou DNA. Quando o tipo de RNA ou DNA texturizado causa alteração fenotípica, a célula é "transformada" por RNA ou DNA exógeno ou heterólogo. O RNA ou DNA que causa essa transformação pode ser inserido (covalentemente) no DNA cromossômico para se tornar parte do genoma da célula.

[097] Como usado neste relatório descritivo, o termo "transformação" se refere à entrega de fragmentos de ácido nucleico em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgênicos" ou "recombinantes" ou "transformados".

[098] Como usado na presente invenção, o termo "vetor recombinante" se refere a uma construção de gene que é um vetor de expressão capaz de expressar uma proteína alvo em uma célula hospedeira adequada e compreende elementos reguladores necessários que estão operacionalmente ligados de modo a expressar a inserção do gene.

[099] Outras moléculas, tais como oligopeptídeos catiônicos (por exemplo, WO95/21931), peptídeos derivados de proteínas de ligação ao DNA (por exemplo, WO96/25508) ou polímeros catiônicos (por exemplo, WO95/21931), também são úteis para facilitar a transfecção de ácidos nucleicos in vivo.

[0100] Também é possível introduzir um vetor in vivo como um plasmídeo de DNA nu (ver Pat. dos EUA Nos 5.693.622, 5.589.466 e

5.580.859). A liberação de DNA mediada por receptor também pode ser usada (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147 (1992); e Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429 (1987)).

[0101] Em uma modalidade da presente invenção, uma célula é revelada que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção. Em uma modalidade da presente invenção, a célula é uma célula T; em outra modalidade, a célula T é uma célula T CD8+ e/ou uma célula T CD4+; e em outra modalidade, a célula é uma célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR-T).

[0102] Em uma modalidade da presente invenção, uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer é fornecida, compreendendo como um ingrediente farmaceuticamente eficaz uma célula que expressa uma proteína de ligação a antígeno.

[0103] Como usado neste documento, o termo "anticâncer" abrange "prevenção" e "tratamento"; "Prevenção" significa qualquer ação em que o câncer é inibido ou retardado pela administração de uma composição da presente invenção, e "tratamento" significa qualquer ação que melhora ou altera beneficamente os sintomas do câncer pela administração do anticorpo da presente invenção. A prevenção pode ser completa, por exemplo, o desaparecimento completo dos sintomas no indivíduo. A profilaxia também pode ser parcial, tal como a ocorrência de sintomas em um indivíduo sendo menor do que teria ocorrido sem a presente invenção.

[0104] A "composição" divulgada nesta invenção se refere a uma combinação das células T citotóxicas de acordo com a presente invenção como o ingrediente ativo e ingredientes inativos, como transportadores naturais ou artificiais, marcadores ou detectores, um ingrediente ativo, como adjuvantes, diluentes, agentes de acoplamento, estabilizadores, tampões, sais, solventes lipofílicos e conservantes, e compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. O portador também pode compreender excipientes farmacêuticos e proteínas adicionais, peptídeos, aminoácidos, lipídeos e carboidratos (por exemplo, monossacarídeos; dissacarídeos; trissacarídeos; tetrassacarídeos; oligossacarídeos; alditol, ácido aldônico, polissacarídeos derivados de açúcar, como açúcar esterificado, ou um polímero de açúcar ou similares), sozinho ou em combinação, de 1 a 99,99 % em peso ou % em volume. Excipientes de proteína incluem, por exemplo, albumina de soro humano, albumina humana recombinante, gelatina, caseína e similares, mas não são limitados a estes.

[0105] Componentes de aminoácidos representativos que podem desempenhar um papel tampão incluem, por exemplo, alanina, arginina, glicina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, e similares, mas não são limitados a estes. Excipientes de carboidratos também incluem, por exemplo, monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose; dissacarídeos, como lactose, sacarose, trealose, celobiose; polissacarídeos, tais como rafinose, maltodextrina, dextrano e amido; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, sorbitol e mioinositol; mas não são limitados a isso.

[0106] Uma pessoa versada na técnica será capaz de formular a composição farmacêutica da presente invenção por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, conforme necessário, pode ser usado parenteralmente na forma de uma injeção de uma solução ou suspensão estéril com água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, pode ser apropriadamente combinado com veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, em particular água esterilizada ou solução salina, óleo vegetal, emulsionante, agente de suspensão, surfactante, estabilizador, excipiente, veículo, conservante, aglutinante e similares; pode ser formulado por mistura em uma forma de dosagem unitária exigida pela prática farmacêutica geralmente aceita. A quantidade de ingrediente ativo usada na formulação é tal que uma dosagem adequada na faixa indicada pode ser obtida.

[0107] Além disso, as composições estéreis para injeção podem ser formuladas de acordo com a prática de formulação convencional usando líquidos de excipientes, tais como água destilada para injeção. Como a solução aquosa para injeção podem ser usadas, por exemplo, combinações de soro fisiológico; soluções isotônicas contendo glicose ou outros agentes auxiliares, por exemplo D-sorbitol, D-manose, D-

manitol, cloreto de sódio e auxiliares de dissolução adequados, por exemplo álcoois, em particular etanol, e poliálcoois, por exemplo propilenoglicol, polietilenoglicol; e tensoativos não iônicos, tais como polissorbato 80 (TM), HCO-50. Os líquidos oleosos incluem, por exemplo, óleo de gergelim e óleo de soja, e podem ser usados em combinação com benzoato de benzila e álcool benzílico como um auxiliar de dissolução.

[0108] As formulações de injeção podem ser administradas, por exemplo, por injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intra- arterial seletiva, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, injeção intraventricular, injeção intracraniana, injeção intramedular e similares; de preferência, no entanto, são administrados por injeção intravenosa.

[0109] A composição da presente invenção compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de células T. A quantidade eficaz pode ser facilmente determinada por técnicos no assunto com base na divulgação neste relatório descritivo.

[0110] Em geral, uma quantidade farmaceuticamente eficaz é determinada pela primeira administração de uma baixa concentração de um ingrediente ativo e, em seguida, aumentando gradualmente a concentração até que um efeito desejado seja alcançado no indivíduo sem quaisquer efeitos colaterais (por exemplo, os sintomas associados com câncer são reduzidos ou eliminados). Os métodos de determinação das dosagens ou intervalos de administração apropriados para a administração das composições de acordo com a presente invenção são descritos, por exemplo, em Goodman e Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., Eds., 11ª Edição, McGraw-Hill 2005, e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª e 21ª Edições, Gennaro e University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 e 2005).

[0111] O método de administração da composição de acordo com a presente invenção pode ser determinado com base em vários fatores, tais como o tipo de câncer do indivíduo, idade, peso, sexo, condição médica, gravidade da doença, via de administração e outros medicamentos administrados separadamente. Consequentemente, embora o método de administração varie amplamente, ele pode ser determinado de acordo com um método comumente usado.

[0112] A quantidade da composição de acordo com a presente invenção a ser administrada a um indivíduo pode ser determinada por vários fatores, tais como o método de administração, estado de saúde do indivíduo, peso e conselho médico; todos esses fatores estão dentro do escopo do conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

[0113] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender aproximadamente 1 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 2 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 3 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 4 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 5 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 6 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 7 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 8 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 9 × 106 células/mL ou mais, aproximadamente 1 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 2 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 3 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 4 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 5 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 6 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 7 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 8 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 9 × 107 células/mL ou mais, aproximadamente 1 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 2 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 3 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 4 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 5 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 6 × 10 8 células/mL ou mais, aproximadamente 7 × 108 células/mL ou mais, aproximadamente 8 × 108 células/mL ou mais, ou aproximadamente 9 × 108 células/mL ou mais de células CAR-T, mas um técnico no assunto será capaz de ajustar a concentração de células CAR-T dentro da faixa em que os mesmos efeitos podem ser obtidos. A prescrição pode ser afetada de várias maneiras por fatores como métodos de formulação, modos de administração, idade do paciente, peso, sexo, morbidade, comida, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibilidade de resposta.

[0114] Pode também ser combinado com tampões, por exemplo tampão de fosfato, ou de soluções de tampão de acetato de sódio; analgésicos, por exemplo cloridrato de procaína; estabilizadores, por exemplo, álcool benzílico, fenóis e antioxidantes. A solução de injeção preparada é geralmente carregada em uma ampola adequada.

[0115] As suspensões e emulsões podem conter como veículos, por exemplo, gomas naturais, ágar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico. As suspensões ou soluções para injeção intramuscular, juntamente com o composto ativo, são veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como água estéril, azeite, oleato de etila, glicóis, por exemplo, propilenoglicol e, se necessário, quantidades apropriadas de cloridrato de lidocaína.

[0116] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada a um indivíduo, por exemplo, por injeção venosa (injeção de bolo) ou infusão contínua. Por exemplo, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, continuamente ou em intervalos de tempo especificados, ao longo de pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias,

pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, ou pelo menos intervalos determinados por julgamento clínico. As preparações injetáveis podem ser formuladas na forma de ampola ou em uma forma de dosagem unitária com um recipiente multidose. No entanto, um técnico no assunto entenderá que a dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode variar dependendo de vários fatores, tais como a idade do indivíduo, peso, altura, sexo, condição médica geral e histórico de tratamento anterior.

[0117] Como usado na presente invenção, o termo "câncer" se refere a qualquer uma das numerosas doenças ou distúrbios causados por crescimento celular anormal e descontrolado. As células que podem causar câncer são chamadas de células cancerosas e têm características tipológicas únicas, como proliferação descontrolada, imortalidade, potencial metastático, rápido crescimento e proliferação. Frequentemente, as células cancerosas podem estar na forma de um tumor, mas tais células podem estar presentes individualmente em mamíferos ou podem ser células não tumorais, como células de leucemia. O câncer pode ser detectado por um método clínico ou radiológico para detectar a presença de tumores; testando células de tumores ou outras amostras biológicas obtidas por meios como biópsias; pela detecção de marcadores sanguíneos de câncer, como CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH e NSE; ou pela detecção de genótipos de marcadores de câncer, como TP53 e ATM. No entanto, uma descoberta negativa por um método acima não significa necessariamente um diagnóstico de não câncer: Por exemplo, um indivíduo que se recuperou totalmente do câncer ainda pode ter câncer; isso é confirmado na forma de uma recaída.

[0118] Como usado no presente relatório descritivo, o termo "cerca de" pode ser entendido dentro da faixa comumente usada na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. "Sobre" pode ser entendido como significando 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20%, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1%, 0,05 % ou 0,01 % do valor mencionado.

[0119] Na presente invenção, "administração" significa a introdução de uma determinada substância em um paciente; a administração pode ser feita de qualquer maneira adequada de modo que a via de administração da composição que compreende o anticorpo da presente invenção possa ser administrada por qualquer via geral, desde que seja capaz de atingir o tecido alvo. A administração pode ser por administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intradérmica, administração oral, administração tópica, administração nasal, administração pulmonar ou administração retal, mas não é limitada a isso. No entanto, no caso de administração por via oral, porque a proteína é digerida, é desejável formular a composição oral em tais como modo para o revestimento o agente ativo ou para protegê-lo contra a degradação no estômago.

[0120] Além disso, a composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer dispositivo no qual a substância ativa é capaz de migrar para a célula alvo.

[0121] Em uma modalidade da presente invenção, o câncer pode ser um câncer sólido ou um câncer do sangue. Mais especificamente, em uma modalidade da presente invenção, é possível tratar, por meio da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, cânceres tais como adenocarcinoma de esôfago, câncer colorretal, melanoma, melanoma ocular, câncer pulmonar de células pequenas, neuroblastoma, teratoma, câncer fetal, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço,

timoma, leucemia linfocítica, linfoma de células B, linfoma difuso de grandes células B, leucemia, leucemia mieloide aguda e similares.

[0122] Outra modalidade da presente invenção divulga um método de tratamento do câncer por meio da administração da composição farmacêutica a um paciente que tem câncer. A composição farmacêutica compreende células T CD8+, ou compreende células T CD4+ e células T CD8+, ou compreende células T CD4+ e células T CD8+; a proporção de células T CD4+ e células T CD8+ com base no número de células é substancialmente 1:1.

[0123] Uma modalidade da presente invenção divulga um método de fabricação de uma célula T com um receptor de antígeno quimérico modificado (CAR-T) para o tratamento de câncer, compreendendo uma etapa de infectar uma célula T com ácidos nucleicos que codificam um antígeno molécula de ligação compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 1, uma HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 2 e uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 3; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 4, uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 5 e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela Sequência No 6; em que a molécula de ligação a antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0124] Como usado no presente pedido, uma "construção" geralmente se refere a uma composição que não existe na natureza. As construções podem ser preparadas por técnicas sintéticas (por exemplo, produção e expressão de DNA recombinante) ou por técnicas de síntese química para ácidos nucleicos ou aminoácidos. As construções também podem ser feitas adicionando ou ligando uma substância a outra de modo que o resultado seja uma forma que não exista na natureza. Exemplo prático 1: Humanização de anticorpos anti-MVR derivados de camundongo

[0125] A produção de anticorpo humanizado do anticorpo anti-MVR de camundongo (WO2015-133817 A1) foi designada em duas versões, baixa avidez e alta avidez respectivamente, para utilização na optimização da avidez.

1.1 Humanização da região variável de cadeia pesada

[0126] Para selecionar a estrutura de anticorpo humano de VH para a produção de anticorpos humanizados, estruturas de VH de BLASTP (https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins’) com sequências similares para anticorpos anti-MVR de rato foram escolhidas (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAV40168.1)

[0127] Com base nisto, 3 CDRs de VH foram definidas por numeração de Kabat, e uma combinação de uma estrutura de anticorpo humano selecionada e uma CDR de um anticorpo anti-MVR definida foi utilizada a sequência de uma versão de baixa avidez de VH (huMVR. Sequência H1 No 10).

[0128] Além disso, uma versão de alta avidez de VH foi produzida por retromutação de VH27, VH29, VH48, VH67, VH71, VH73, VH78 de huMVR.H1 (huMVR.H2, Sequência No 7). (FIGURA 1)

1.2 Humanização da região variável de cadeia leve

[0129] Para selecionar a estrutura de anticorpo humano de VL para a produção de anticorpos humanizados, a estrutura de VL de Trastzumab (US 5821047 A, Sequência No 25), que é conhecida por ter uma excelente estabilidade, foi escolhido. Nesta base, 3 CDRs de VL foram definidas por numeração de Kabat, e a estrutura de anticorpo humano selecionada e as CDRs de anticorpo anti-MVR definido foram combinadas, e para a introdução da sequência de consenso humano, uma versão de baixa avidez de VL foi produzida a partir da estrutura ‘hu4D5 - combinação de CDR anti MVR’ por mutação de K para R em VL24, I para L em VL48, S para R em VL53, T para S em VL56, R para G em VL66, F para Y em VL71, Q a G em VL100 (huMVR.L1 Sequência No 11). Além disso, separadamente, VL49, VL69 e VL71 foram mutados de volta a partir da estrutura ‘hu4D5 - combinação de CDR anti-MVR’, e uma versão de alta avidez de VL foi produzida por mutação de R para G em VL66 (huMVR.L2 Sequência No 8). (FIGURA 2)

[0130] O gene do anticorpo humanizado designado é huMVR.L1H1 (huMVR.L1 & huMVR.H1) (Sequência No 10, Sequência No 11, Sequência No 12), huMVR.L2H2 (huMVR.L2 & huMVR.H2) (Sequência No 7, Sequência No 8, Sequência No 9) foi produzida com 2 anticorpos. Especificamente, dois anticorpos humanizados foram preparados na forma scFv de VL-(G4S)3-VH no plasmídeo pOptivec (Invitrogen), que é um vetor de expressão de célula animal, e um marcador 6X His foi conjugado ao término c para preparar um gene. Os plasmídeos nos quais o gene foi introduzido foram expressados na forma scFv usando o sistema de expressão Expi293 (Invitrogen) e purificados usando purificador AktaPure (GE Healthcare) e coluna HisTrap (GE Healthcare). Exemplo Prático 2: Análise de Avidez para Linhagens Celulares de Câncer Sanguíneo

[0131] Linhagens celulares linfoblastoides de linfoma de células B derivadas de PBMC foram preparadas em tubos de amostra FACS (Falcon, Cat, 352052) com 1 × 10 5 células por amostra e, em seguida, tratadas com muMVR scFv, huMVR.L1H1 scFv (ligante baixo) e huMVR.L2H2 scFv (aglutinante alto) a 0,5 µg/mL, 0,1 µg/mL, 0,05 µg/mL produzido por Expi293F Cell (Invitrogen, A14527), e cada amostra foi incubada a 4ºC por 15 minutos. Depois disso, 3 mL de tampão de lavagem (0,5 % FBS, 0,1 % de azida de sódio em PBS) foram adicionados a cada tubo de amostra. Cada amostra foi centrifugada a

2.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e o anticorpo anti- His conjugado com ficoeritrina (BioLegend, Cat. 362603) foi adicionado a uma proporção de diluição de 1:200 para atingir um volume total de 200 µL. Todas as amostras foram incubadas a 4 °C durante 15 minutos.

[0132] Depois disso, 3 mL de tampão de lavagem (0,5 % de FBS, 0,1 % de azida de sódio em PBS) foram adicionados a cada tubo de amostra, cada amostra foi centrifugada a 2000 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante foi removido. Após diluição de Paraformaldeído a 4 % (Biosessang, P2031) para 1%, as células foram imobilizadas adicionando 200 µL a cada amostra; as amostras imobilizadas foram analisadas com um dispositivo FACS Celesta (BD Biosciences).

[0133] As 2 espécies (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2) de scFv de anticorpo humanizado ligado a antígenos alvos que são expressados em células dependentemente da dose, e huMVR.L2H2 exibiu uma avidez similar a scFv de MVR de camundongo a uma concentração de anticorpo de 1 µg/mL, enquanto huMVR.L1H1 exibiu avidez muito baixa. (FIG. 3) Exemplo prático 3: Predição por Ponto Quente de Afinidade para Otimizar a Avidez de Anticorpos Humanizados

[0134] A fim de preparar mutantes tendo várias avidezes de ligação entre dois anticorpos humanizados, um ponto quente de afinidade foi previsto com base em anticorpo MRV de camundongo. A modelagem molecular foi realizada usando modelo Swiss (https://swissmodel.expasy.org/ ) (FIG. 4), com base no resultado da análise de avidez dos dois anticorpos humanizados, e 2 pontos de afinidade na estrutura de região variável de cadeia pesada (VH27,

VH71) e um ponto quente de afinidade (VL91, VL92) na CDR de região variável da cadeia leve foram selecionados (Tabela 1). 15 espécies de mutante único do tipo scFv foram preparadas para 4 pontos quentes de afinidade usando huMVR.L2H2 como um modelo e expressadas e purificadas da mesma maneira como descrito acima. Tabela 1 Ponto quente Aminoácidos mutantes VH_27F Y, L, G VH_71K H, L, V VL_91Y F, S, V, W, A VL_91W F, Y, L, A Exemplo prático 4: Análise de avidez de 15 mutantes aplicados à mutação de pontos quentes de afinidade

[0135] Linhagens celulares linfoblastoides de linfoma de células B derivadas de PBMC foram preparadas em tubos de amostra FACS (Falcon, Cat, 352052) com 1 × 105 células por amostra e, em seguida, tratadas com muMVR scFv ou huMVR.L2H2 produzido por Expi293F Cell (Invitrogen, A14527) ou 15 espécies de mutantes a 0,1 µg/mL, e cada amostra foi incubada a 4 ºC por 15 minutos. Depois disso, 3 mL de tampão de lavagem (0,5 % FBS, 0,1 % de azida de sódio em PBS) foram adicionados a cada tubo de amostra. Cada amostra foi centrifugada a

2.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e o anticorpo anti- His conjugado com ficoeritrina (BioLegend, Cat. 362603) foi adicionado a uma proporção de diluição de 1:200 para atingir um volume total de 200 µL. Todas as amostras foram incubadas a 4 °C durante 15 minutos. Depois disso, 3 mL de tampão de lavagem (0,5 % FBS, 0,1 % de azida de sódio em PBS) foram adicionados a cada tubo de amostra, cada amostra foi centrifugada a 2.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi removido.

[0136] Depois de diluir 4% de paraformaldeído (Biosessang, P2031) a 1%, as células foram imobilizadas por adição de 200 uL de cada amostra, e as amostras imobilizadas foram analisadas com um dispositivo de FACS Celesta (BD Biosciences).

[0137] As 15 espécies de scFv mutante de huMVR.L2H2 (Sequência No 9) exibiram várias avidezes para células LCL, e destas, huMVR.L2H2.F27L, huMVR.L2H2.K71H, huMVR.L2H2.Y91F, huMVR.L2H2.Y91W, tinham uma afinidade incrementalmente menor do que muMVR e huMVR.L2H2 (Sequência No 9) (FIG. 5). Exemplo prático 5: Construção de CAR_euCD137

[0138] Na presente invenção, para aumentar a eficácia imunológica no domínio de sinal citoplasmático 4-1BB, euCD137 (4-lBB aa209-255, Sequência No 14) para o qual 5 aminoácidos (4-1BB aa 209-213) foram adicionados no domínio citoplasmático de 4-1BB 214-255aa (Sequência No 3) usado em CAR-T, como um fator de sinal coestimulador, para construir um vetor de expressão CAR (CAR_euCD137) (Kwon et al., (1989) Cellular Immunology 121: 414-422, Kwon et al., (1998) Biochemical and biophysical research communication 242: 613-620). A construção concluída compreende um domínio de ligação anti-MVR anti-CD19 ou hu MVR.L 2H2, que é um scFv, incluindo o promotor alfa EFI, uma região de dobradiça e um domínio transmembrana de CD8 humano e um domínio de sinalização intracelular. Em particular, o domínio de sinalização intracelular consiste em um domínio estimulador e um domínio de sinalização coestimulador. Para o domínio de transmembrana, a cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T ou um ou mais de CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 ou CD154, mas não é limitado aos mesmos. Destes, a presente invenção utilizou CD8. Os domínios de sinalização intracelular são basicamente os domínios de sinalização coestimuladores no domínio de sinalização primário

CD3zeta, selecionados entre CD28, OX40, CD27, ICAM-1, ICOS (CD278), 4-1BB (CD 137) e 4-1BB 5aa (euCD137 ) A presente invenção utilizou 4-1BB, um domínio de sinal coestimulador ao qual foram adicionados 5 aminoácidos consecutivos, ao qual CD3zeta foi ligado. O fragmento do gene CAR finalmente produzido foi conjugado a vetores de expressão lentivirais ELPS clivados com BamH I e Sal I. Além disso, a clonagem foi realizada usando a enzima de restrição BamH I/Nhe I para substituir apenas a parte scFv (FIG. 6).

[0139] Além disso, um receptor de antígeno quimérico (hu MVR CAR) foi preparado compreendendo 2 tipos de domínios de sinal citoplasmático (4-1BB, CD3ζ) para ativação de células T, usando hu MVR.L 2H2, um anticorpo humanizado MVR (huMVR) desenvolvido para minimizar a imunogenicidade com base em anticorpos MVR de camundongo, que é um scFv adequado para o desenvolvimento terapêutico de CAR-T. Em particular, na presente invenção, a fim de aumentar a eficácia imunológica para o domínio de sinalização citoplasmática 4-1BB, a construção (MVR CAR_euCD137) à qual 5 aminoácidos contínuos RFSVV foram adicionados, compreende o promotor EF1 alfa e é composta não apenas de um domínio de acoplamento anti-MVR scFv hu MVR.L 2H2, mas também uma região de dobradiça CD8 e domínio de transmembrana e euCD137 e domínio de sinalização intracelular. Exemplo Prático 6: Produção de Lentivírus de huMVR Recombinante

[0140] A cultura de células 293T usada para a produção de lentivírus recombinantes contém meio compreendendo 10 % de FBS (Millipore, TMS-013-BKR) e 1 × P/S (Gibco, 15140-122) em DMEM de alto teor de glicose (Welgene, LM001-05). As células 293T foram incubadas em meio DMEM contendo 10 % de FBS durante 24 horas antes da transdução em uma incubadora de CO2 a 5 % a 37 °C. No dia seguinte, para a transfecção, o reagente de transfecção e quatro plasmídeos lentivirais foram misturados em uma proporção apropriada e incubados por 48 horas. O sobrenadante contendo o lentivírus foi então coletado e centrifugado a 400 xg por 10 minutos. Além disso, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de seringa de 0,45 µm usando uma seringa de 50 mL. O sobrenadante obtido foi misturado 3:1 com um kit de enriquecimento lentiviral (Clontech, 631231) e reagiu a 4°C durante 24 a 48 horas. Isto foi seguido por centrifugação por 2 horas a 4°C e 4.000 rpm para obter um vírus, que foi recolocado em suspensão em 0,5 mL de RPMI (Welgene, LM001-01) não compreendendo FBS para produzir um lentivírus.

6.1: Verificação do número de partículas lentivirais infectadas usando indicador conjugado ao terminal n de antígeno quimérico

[0141] Unidades de transformação (TU/mL) foram medidas pela análise da contagem de partículas dos lentivírus capazes de transdução utilizando células Jurkat. No primeiro dia, as células Jurkat foram semeadas em placas de 96 poços a 1 × 10 5 células/100 μL por poço. No segundo dia, o lentivírus foi diluído em série em 1/3 em placas de 96 poços, e a transdução lentiviral foi realizada nas células Jurkat já semeadas. Neste momento, através da introdução de polibreno (Millipore) no meio RPMI (10% de FBS e 1x P/S), a transdução de lentivírus foi aumentada ainda mais. Após centrifugação a 1200xg e 25°C durante 2 horas, as células foram incubadas durante 3 horas em uma incubadora de CO2 a 5% a 37°C, e apenas 100 ul de meio RPMI apenas foi adicionado por poço. No dia 5, o sinalizador do lentivírus infectado na célula foi tingido com anti-Flag-DYKDDDDK (Biolegend, Cat No 637310) para analisar a porcentagem de células transduzidas com um citômetro de fluxo. Com isso, o título foi calculado conforme descrito em Follenzi e Naldini, 2002 (Follenzi e Naldini, 2002), e o resultado foi 1,4 × 1010 TU/mL.

Exemplo prático 7: Descongelamento e Atividade de Célula T

[0142] Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) congeladas foram descongeladas durante 5 minutos em um banho de temperatura constante de 37°C e colocadas em suspensão com RPMI1640. A centrifugação foi então realizada a 1500 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido. As células T foram isoladas usando CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-045-101) e CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-045-201). Para o método de isolamento de células T CD4, CD8, foi feita referência ao protocolo CD4, CD8 MicroBeads (DS_130-045-101, DS_130-045-201).

[0143] Depois de levar a densidade celular das células isoladas a 1x106 células/ml, meio de CAR-T (meio basal de CTS Otimizador IL + 26 mL de CTS de otimizador + 50 ml de SR de célula imune CTS + 10 mL de penicilina estreptomicina + 10 mL de GlutaMAX-1) foi adicionado, e IL-2 foi adicionada a 20 IU/mL. Além disso, 10 µL de células T TransAct (Miltenyi Biotec, 130-111-160) foram adicionados por 1 × 106 células, colocados em um frasco T75 ou placa de 24 poços e incubados em uma incubadora (37°C, CO2 a 5 %) por 2 dias. (FIG. 8) Exemplo prático 8: Transdução de CAR e Incubação de Célula de CAR-T

[0144] Células T ativadas por 2 dias foram adicionadas a 2 × 106 células por 1 poço de uma placa de 24 poços, e um lentivírus com um gene CAR foi adicionado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 a 3. Sulfato de protamina (Produto No ADR301) foi adicionado e colocado em suspensão a uma concentração final de 10 µg/mL. A placa de 24 poços foi centrifugada a 400 xg e 32°C por 2 h e após colocar em suspensão as células em 20 mL de meio CAR-T (IL-2 200 IU/mL), elas foram colocadas em um frasco T75 e incubadas em um incubadora (37°C, CO2 a 5%) por 2 dias. Após 2 dias, a contagem de células foi realizada e a densidade celular foi levada para 0,5 × 106 células/mL, e as células foram adicionadas ao meio CAR-T e IL -2 foi adicionada a 200 IU/mL para a quantidade total de caldo de incubação. Se a densidade celular fosse inferior a 0,5 × 106 células/mL, 200 UI/mL de IL- 2 eram adicionados em relação à quantidade total de caldo de cultura, sem adição de meio CAR-T. Depois disso, a contagem de células foi feita a cada 2 dias e meio CAR-T (IL-2 a 200 IU/mL) foi adicionado a uma densidade celular de referência de 0,5 × 106 células/mL. As células CAR-T foram colhidas entre 7 e 14 dias após o início da incubação (FIG. 7). Exemplo Prático 9: Ensaio de Citotoxicidade

[0145] A citotoxicidade de células CAR-T contra células alvos foi analisada por ensaios com base em luciferase. As células alvos foram infectadas com o vírus EBV carregando o gene da luciferase, de modo a criar células alvos carregando o gene da luciferase. A co-cultura com células efetoras foi realizada em uma proporção de efetor para alvo (E/T) por 24 horas a 37 °C. Após co-cultura e tratamento com o reagente CytoTox-Glo Cytotoxicity (promega, G9290), os valores de RLU de células-alvo vivas foram medidos com um luminômetro de microplaca Fluroskan FL (Thermo).

[0146] Mais especificamente, a Triplicata foi preparada em uma placa de fundo plano branco de 96 poços (COSTAR, 3917), com células efetoras em 4,5 × 10 5 células/50 µL, em uma proporção E/T de 3:1 com base em uma contagem de células alvos de 1,5 × 104 células e diluídas a 1/3 para preparar razões E/T de 3:1, 1:1, 0,3:1 e 0,1:1. Em cada poço 4 preparado com células efetoras, 1,5 × 10 células (50 µL) de células alvos foram co-cultivadas em uma incubadora (37 °C, 5 % de CO 2 ) por 18 a 24 horas e, em seguida, 100 µL de CytoTox-Glo Citotoxicity (Promega, G9290) foram adicionados e a luz foi bloqueada, e após 5 minutos, o valor de luminescência foi medido com um luminômetro de microplaca Fluroskan FL (Thermo).

[0147] Como um resultado, confirmou-se que huMVR CAR-T exibiu 95,4 % de atividade citotóxica em uma proporção de 3:1 (Fig. 8). Exemplo prático 10: Incubação de Linhagem Celular

[0148] As linhagens celulares CBKLCL-Luc e KHJ LCL-Luc (posteriormente LCL-Luc) distribuídas pelo National Cancer Center foram incubadas em 20 % de soro fetal bovino (FBS, Millipore, Cat N o TMS-013-KBR) e 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco, Cat. No 15140-122) em meio RPMI1640 (Welgene, Cat. No LM011-01). Exemplo prático 11: Verificação de dois Tipos de Células CD19CAR-T em que CD19CAR e CD19CAR_euCD137 foram introduzidos

[0149] Para aumentar a eficácia imunológica, CD19CAR (Sequência No 17, US8906682 Sequência No 12) e CD19CAR_euCD137 (Sequência No 18) em que o domínio 4-1BB em CD19CAR foi substituído por euCD137 foram preparados separadamente e cultivados com Células CD19CAR-T a fim de verificar a eficácia recém-estabelecida do vetor de expressão de CAR (CAR_euCD137) com euCD137 (4-1BBaa209-255, Sequência No 14) como um fator de sinalização coestimulador.

[0150] A coloração por FACS foi realizada para confirmar a proporção da produção das duas espécies de células CAR-T após 14 dias de incubação. Para cada tipo de célula CAR-T, 2 x 105 células foram coletadas em tubos FACS (FALCON, Cat. No 352052) e, em seguida, 2 mL de tampão FACS foram adicionados e a centrifugação foi realizada por 5 minutos a 2.000 rpm usando uma centrífuga (Thermo, ST16). Depois de se rejeitar o sobrenadante, 0,5 uL/tubo de anti-CD8 APC (SKI, BioLegend, Cat. No 344.722), 0,5 mL/tubo de anti-CD4 BV650 (RPA-T4, BioLegend, Cat. No 300536) e 0,125 mL/tubo anti-indicador PE (L5, Biolegend, Cat. No 637310) foi adicionado e a coloração foi realizada na temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de adicionar 2 mL de tampão FACS e centrifugar a 2.000 rpm por 5 minutos, este processo foi repetido mais 1 vez. para a coloração de células sobreviventes/mortas, foi adicionado 1 µL/tubo de 7-AAD (Biolegend, Cat. No 420404) e a mistura foi deixada durante 5 minutos na temperatura ambiente e depois analisada usando FACS (BD, FACSCelesta ).

[0151] Antes de demonstrar em um modelo animal subcutâneo o efeito de CD19 CAR-T usando a construção de CAR (CD19CAR_euCD137, Sequência No 18) em que euCD137 (aminoácido 209 a 255, Sequência No. 14) foi adicionado ao Domínio 4- 1BB (aminoácido 214 a 255, Sequência No 13) contendo cinco aminoácidos e a construção convencional (CD19CAR, Sequência No 17, Sequência US8906682 No 12), a proporção de células CAR-T foi verificada usando o método desenvolvido no Exemplo Prático 2. A confirmação da proporção das células CD19 CAR-T produzidas usando a coloração por FACS confirmou que, no caso das células CD19 CAR-T de construção melhorada (5aa CD19 CAR-T), as razões de células eram CD4+/CAR + 29,4 %, CD8+/CAR + 50,8 % e CAR-T total de 80,2 %. Foi confirmado que as células CAR-T não melhoradas pela construção (CD 19 CAR-T), as proporções celulares eram de 42,7 % para CD4+/CAR +, 29,3 % para CD8+/CAR + e 72,0 % para CAR-T total.

[0152] Consequentemente, confirmou-se que as células 5aa CD19 CAR-T tinham 8,2 % de expressão mais alta de células CD19 CAR-T, e a célula CD8+/CAR+ foi 21,5 %, ou cerca de 2 vezes mais. (FIG. 9-A) Exemplo prático 12: Confirmação da citotoxicidade de células CD19CAR-T produzidas

[0153] Para determinar a citotoxicidade dos dois tipos de células CAR-T cultivadas por 14 dias, a proporção CAR-T (E):LCL (T) foi levada para 30:1, 10:1, 3:1 e 1:1 em placas brancas de 96 poços (Corning, Cat. No 3917). Em primeiro lugar, as células CAR-T foram colocadas em poços a 6 × 105 células/50 µL, 2 × 105 células/50 µL, 9 × 104 células/50 µL e 2 × 104 células/50 µL, respectivamente. Em seguida, a linhagem celular alvo, isto é, a linhagem celular CBK LCL-Luc, foi adicionada a 2 4 × 10 células/50 µL em uma incubadora de CO2 a 37 °C (Mammert, INCO153med) e reagiu por 4 horas. Após 4 horas, 100 µL de Bright-Glo ™ (Promega, Cat. No E2620) foram adicionados a cada poço, e 5 minutos depois, o valor da unidade de luz relativa (RLU) foi medido usando ELISA (Thermo, Fluorescan FL).

[0154] Não se verificou existir qualquer diferença na citotoxicidade entre CARTs em que 4-1BB convencional foi introduzido e células CAR- T em que euCD137 contendo cinco aminoácidos adicionados ao domínio 4-1BB foi introduzido.

[0155] Como resultado deste experimento, quando duas células CAR-T e linhagens celulares CBK LCL-Luc foram incubadas juntas em uma proporção de 30: 1, a citotoxicidade foi encontrada em torno de 80% após 4 horas, e quando elas foram incubadas a 10: 1, a citotoxicidade foi de cerca de 50%. Como o respectivo número de células CAR-T incubadas com células cancerosas diminuiu em um fator de 3, a citotoxicidade diminuiu em torno de um fator de 3; além disso, quando 5 aminoácidos foram adicionados ao domínio 4-1BB in vitro, foi confirmado que isso não afetou a citotoxicidade. (FIG. 9B) Exemplo prático 13: Confirmação da expressão de HLADR e teste de avidez de HuMVR L2H2 scFv em linhagens celulares

[0156] A análise FACS foi realizada utilizando a linhagem celular de LIC-Luc cultivada, a fim de verificar a expressão de HLADR na linhagem celular e testar a avidez do huMVR L2H2 scFv desenvolvido. Após a transferência de 2 x 10 5 células da linhagem celular LCL-Luc para um tubo FACS, 2 mL de tampão FACS foram adicionados e centrifugados a 2.000 rpm por 5 minutos usando uma centrífuga. Depois que o sobrenadante foi descartado, foram adicionados anti-HLADR APC-H7

(G46-6, BD pharmigen™ Cat. No 561358) a 0,5 µL/tubo e MVR L2H2 1,0 autoproduzido em µg/tubo, e a coloração foi realizada na temperatura ambiente por 30 minutos. 2 mL de tampão FACS foram adicionados para lavagem e a centrifugação foi então realizada a 2.000 rpm por 5 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Este procedimento foi repetido mais uma vez. Para a coloração secundária de huMVR L2H2 scFv, foi adicionado 1 µL/tubo de PE anti-His (Biolegend, Cat. No 362603) e a coloração foi realizada por 30 minutos na temperatura ambiente. O processo de lavagem usando tampão FACS foi então repetido duas vezes e 100 µL de tampão FACS foram adicionados, e a análise foi então realizada usando FACS.

[0157] A coloração e análise FACS foram realizadas para confirmar a expressão de HLA DR, que é o alvo de huMVR L2H2, e a avidez de huMVR L2H2 scFv, em células cancerosas.

[0158] A confirmação da expressão de HLA DR na linhagem celular LCL-Luc mostrou que 100 % de HLA DR foi expressa. Aqui, quando o teste de avidez foi realizado usando huMVR L2H2 scFv, pelo menos 97% da ligação ao HLA DR expressado foram confirmados. (FIG. 10) Exemplo Prático 14: Indução de modelos animais subcutâneos e validação de CAR-T por meio de calibrador automático e imagem

IVIS

[0159] No caso dos animais experimentais, camundongos NSG (nod-scid IL2rγμL1) (The Jackson Laboratory) foram usados e administrados sob condições constantes em um viveiro para animal. A temperatura era de 23 ± 2°C com ciclo claro/escuro de 12 horas e umidade de 50 ± 10 %; ração e bebida foram fornecidas à vontade. Em experimentos de eficácia usando CD19CAR-T (5aaCD19CAR-T) com cinco aminoácidos adicionados ao domínio 4-1BB, as linhagens celulares CBK LCL-Luc foram preparadas em 2 × 10 6 células/100 μL de DPBS/cabeça e injetadas por via subcutânea em 6 camundongos fêmeas de uma semana de idade para induzir um modelo animal subcutâneo. Quando o tamanho do câncer atingiu entre 50 e 100 mm 3, conforme medido usando um calibrador automático (Youngbio, TM900), células CD19 CAR-T de construção aprimorada e células CD19 CAR-T não aprimoradas em 2 × 10 6 células/100 µL de DPBS/cabeça (dose 1) e 6 × 10 6 células/100 µL de DPBS/cabeça (dose 2) foram administradas uma vez através da veia da cauda para confirmar a eficácia. No próximo experimento, a eficácia das células huMVR CAR-T foi avaliada em um modelo animal usando a construção (hu MVR CAR-euCD137, FIG. 6C) que foi construída para expressar huMVR em uma construção de CAR contendo cinco aminoácidos no Domínio 4-1BB. Modelos animais subcutâneos foram induzidos por injeção subcutânea de células LCL- Luc em camundongos fêmeas de 6 semanas de idade a 4 × 10 6 células/100 μL de DPBS/cabeça. Para confirmar a eficácia, quando o tamanho do câncer atingiu a faixa de 50 a 100 mm3, uma dose única de MVR CAR-T foi administrada em 1 × 10 6 células/100 µL DPBS/cabeça, 2 × 10 6 células/100 µL DPBS/cabeça (dose 1) e 5 × 10 6 células/100 µL DPBS/cabeça (dose 3), através da veia da cauda. Em todos os experimentos com animais, o tamanho e a viabilidade do câncer foram confirmados periodicamente.

[0160] Mais especificamente, o tamanho do câncer e os valores de fótons foram medidos usando calibradores automáticos e equipamento de imagem IVIS (PerkinElmer, Luna III), em intervalos de 3 e 4 dias após a administração de CAR-T. No caso do uso do TM900, o tamanho do câncer foi determinado após a colocação do equipamento no local do câncer. Ao confirmar imagens e valores de fótons usando um dispositivo de imagem IVIS, 150 mg/kg XenoLight ™ D-luciferina (PerkinElmer, Cat. No. 122799) foi administrado pela primeira vez por via intraperitoneal em camundongos. Após 15 minutos, a anestesia inalatória foi induzida com isoflurano, e 5 minutos depois, IVIS foi usado para a imagem da presença de células cancerosas. Após a imagem, a normalização foi realizada e os valores de luciferase (valores de fótons) foram então confirmados e representados graficamente.

[0161] Mais especificamente, após a construção de um modelo animal subcutâneo usando uma linhagem celular CBK LCL-Luc, os efeitos das células CD19 CAR-T e 5aa CD19 CAR-T foram comparados usando imagens IVIS. Como mostrado na FIG. 11A, o efeito pode ser confirmado dentro de 1 semana após a administração das 2 espécies de células CAR-T.

[0162] No grupo experimental em que CD19 CAR-T com CD19CAR_euCD137 foi administrado em 2 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça e 6 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça, as células cancerosas foram observadas na imagem IVIS 1 semana após a administração. Além disso, no grupo tratado com a construção CD19 CAR-T não melhorado, quando 6 × 106 células/100 µL de DPBS/cabeça foram administrados, as células cancerosas foram raramente observadas por imagem dentro de 1 semana de administração. No entanto, as células cancerosas foram identificadas no grupo experimental administrado com CD19 CAR-T não melhorado após 1 semana.

[0163] Após 1 semana após a administração de CAR-T, como mostrado na imagem, o valor da luciferase fotografada em cada indivíduo após o processo de imagem foi determinado; Os valores de luciferase foram confirmados apenas no grupo que recebeu CD19 CAR- T a 2 × 106 células/100 µL de DPBS/cabeça. Quando observados 3 semanas ou mais depois disso, os tumores continuaram a crescer em camundongos não administrados com células CAR-T e nenhuma célula cancerosa foi identificada nos três grupos experimentais nos quais as células cancerosas desapareceram inicialmente. No entanto, após 10 6 dias, os níveis de luciferase diminuíram no grupo que recebeu 2x10 células/100 µL DPBS/cabeça para CD19 CAR-T, mas as células cancerosas não desapareceram completamente após 3 semanas. Ao administrar a construção melhorada 5aa CD19 CAR-T 2 × 106 células/100 μL DPBS/cabeça, foi descoberto por meio de imagens experimentais de células cancerosas que a eficácia foi similar ao grupo tratado com CD19 CAR-T a 6 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça. Os resultados mostraram que não houve diferença na citotoxicidade de 5aa CD 19 CAR-T e CD 19 CAR-T in vitro, mas foi confirmado que a eficácia foi 5 vezes melhor em 5aa CD19 CAR-T em modelos animais. (FIG. 11) Exemplo prático 15: Confirmação da proporção de CD19 CAR-T com 5 aminoácidos adicionados no domínio 4-1BB em modelo animal in vivo

[0164] Após a administração de células CAR-T em um modelo animal por via subcutânea para verificar a potência da construção melhorada por células CAR-T, a presença de CAR-T foi confirmada a partir do sangue de camundongo.

[0165] Mais especificamente, a coleta de sangue orbital foi realizada de camundongos em intervalos de 3 e 4 dias após a administração de CAR-T. Em um momento de cada coleta de sangue, 70 μL de sangue foram coletados e 60 μL do sangue foram usados para confirmar a proporção de células CAR-T e a contagem de células. 60 μL de sangue foram colocados em um tubo FACS de 5 mL e a coloração de células vivas/mortas foi realizada usando Zombie Aqua BV510 (Biolegend, Cat. No. 423101). Após atingir a concentração de 0,1 μL/100 μL de DPBS/tubo, a coloração foi realizada em temperatura ambiente por 10 minutos. Desde a contagem de grânulos (Molecularprobes, Cat. No C36950), anti-CD45 FITC (HI30, Biolegend, Cat. No 304006), anti-CD8 BV786 (SK-1, Biolegend, Cat. No. 344740), anti-CD4 BV650 e anti-indicador PE foram adicionados e tingidos em temperatura ambiente por 30 minutos. Cada anticorpo foi misturado a

0,5 μL/100 μL de tampão/tubo FACS e 25 μL de grânulos de contagem foram adicionados ao mesmo. Após 30 minutos, 2 mL de tampão de lise IX RBC (Biolegend, Cat. No 422401) foram adicionados e feitos reagir na temperatura ambiente durante 5 minutos. Após centrifugação por 5 minutos a 2.000 rpm usando uma centrífuga, todo o sobrenadante foi descartado.

[0166] 2 mL de tampão de lavagem de FACS foi adicionado a este tubo e a centrifugação foi realizada durante 5 min a 2000 rpm. Este processo foi repetido mais uma vez e, em seguida, 50 µL de tampão FACS foram adicionados e analisados usando FACS.

[0167] Uma semana após a administração das células CAR-T, no grupo de tratamento 5aa CD19 CAR-T, aproximadamente 20 % das 6 células 5aa CD19 CAR-T foram confirmadas no sangue em 2x10 células/100 μL de DPBS/cabeça e 6 × 10 6 células/100 μL DPBS/grupos principais; mas no grupo administrado com CD19 CAR-T, quando 6 × 10 6 células/100 μL de DPBS/cabeça foram administrados, apenas 5 % de CD19 CAR-T foi confirmado. 3 dias depois, o número e a proporção de células CAR-T no corpo do camundongo atingiram um máximo e diminuíram. Dentro de uma semana, nos 3 grupos experimentais em que as células CAR-T foram identificadas (5aa CD19 CAR-T; 2 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça e 6 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça, CD19 CAR -T; 6 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça), as células cancerosas foram mortas rapidamente porque foi possível que elas entrassem em contato com relativamente muitas células CAR- T antes de proliferarem no corpo do camundongo. No entanto, no grupo 6 experimental administrado CD19CAR-T a 2 × 10 células/100 µL de DPBS/cabeça, a proporção e o número de células CAR-T atingiram um máximo em 2 semanas, e a proporção de CAR-T foi de cerca de 25 % com células cancerosas proliferando relativamente bem. A construção 5aa CD 19 CAR-T melhorada era mais estável em quantidade do que o

CD19 CAR-T, depois que a proporção de CAR-T aumentou inicialmente e depois diminuiu. No caso do CD 19 CAR-T, entretanto, a proporção de células CAR-T aumentou e diminuiu posteriormente e, consequentemente, demorou mais para o tumor desaparecer no corpo do camundongo. Como um resultado, como nos resultados deste 6 experimento, o grupo administrou 5aa CD19 CAR-T a 2x 10 células/100 μL de DPBS/cabeça exibiu níveis de CAR-T similares e efeitos em camundongos como o grupo administrado CD19 CAR-T em 6x 10 6 células/100 μL de DPBS/cabeça, indicando que 5aa CD19 CAR- T tem um efeito superior. (FIG. 12) Exemplo prático 16: Indução de modelo animal intraperitoneal e avaliação da eficácia de CD8 e CD4/CD8 huMVR CAR-T (CAR_euCD137) em modelo animal intraperitoneal

[0168] Os animais experimentais utilizados para induzir o modelo animal intraperitoneal foram os mesmos que os animais utilizados no Exemplo Prático 14 e mantidos sob as mesmas condições. CD8 huMVR CAR-T e CD4/CD8 huMVR CAR-T foram construídos usando uma construção de CAR aprimorada (CAR_euCD137) e a eficácia foi avaliada em um modelo animal intraperitoneal. Para induzir o modelo animal intraperitoneal, a linhagem celular LCL-Luc expressando luciferase em 2 × 106 células/100 μL de DPBS/cabeça foi administrada através da cavidade abdominal e nove dias depois, os animais foram classificados em cinco grupos de acordo com os valores de fótons. Após a divisão em grupos respectivos, o CD8 MVR CAR-T foi administrado por injeção na veia da cauda a 0,5 × 106 células/100 µL de DPBS/cabeça (dose 1), 2,0 × 106 células/100 µL de DPBS/cabeça (dose 2) e 10 × 106 células/100 µL de DPBS/cabeça (dose 3), ou 0,5 × 106 células de CD4 e CD8 huMVR CAR-T, respectivamente, foram misturados e administrados uma vez. Em todos os experimentos com animais, o tamanho e a viabilidade do câncer foram verificados periodicamente.

(FIG. 13) O método experimental específico foi o mesmo descrito no Exemplo 14.

[0169] Após o isolamento de CD4 e CD8 de PBMC isoladas a partir de sangue adulto saudável, o huMVR scFv foi expressado em uma construção de CAR modificada, e a avaliação da eficácia foi realizada em um modelo animal peritoneal usando huMVR CAR-T. A eficácia de huMVR CAR-T foi avaliada por imagens e valores de fótons exibidos por células cancerosas que expressam luciferase.

[0170] Após a verificação 2 vezes por semana usando um equipamento de imagiologia IVIS, 27 dias após a administração CAR-T no grupo experimental todos os camundongos do grupo de controle em que o câncer estava presente e CAR-T não foi administrado tinham morrido. No entanto, todos os indivíduos nos quais o câncer foi formado e o huMVR CAR-T foi administrado sobreviveram por pelo menos 27 dias. No grupo que recebeu CD8 huMVR CAR-T em dose baixa (0,5 × 6 10 células/100 µL DPBS/cabeça), os tumores mostraram uma tendência a diminuir e, em seguida, aumentar novamente após 10 dias; o grupo administrado com CD8 huMVR CAR-T em dose média (2,0 × 106 células/100 µL DPBS/cabeça) mostrou uma tendência para os valores de fótons diminuírem lentamente até o dia 27. No entanto, quando o CD8 huMVR CAR-T foi administrado em uma dose elevada (10,0 × 106 células/cabeça), foi confirmado que todo o câncer desapareceu após 13 dias. Além disso, quando o CD4 e o CD8 MVR CAR-T foram administrados juntos em baixas doses, foi confirmado que o câncer desapareceu na maioria dos camundongos (3 em 5 camundongos) por volta do dia 27, embora isso não fosse tão eficaz quanto a alta dose de CD8 huMVR CAR-T. Consequentemente, este experimento mostrou que hu MVR CAR-T tem um efeito em uma dose média ou superior, e quando usado junto com CD4 em vez de CD8 sozinho, o efeito estava presente mesmo quando usando uma dose menor de CAR-T. (FIG. 13) Exemplo prático 17: Avaliação da eficácia de CD4/8 huMVR CAR-T em modelos animais subcutâneos

[0171] No Exemplo Prático 13, a produção de huMVR CAR-T, utilizando células T CD4 e CD8 em conjunto quando a construção de MVR CAR-T foi confirmada a ser mais eficaz quando usada em experiências com animais. Com base no exemplo acima, CD4/CD8 huMVR CAR-T foi produzido e administrado em doses baixas, médias e altas, e a eficácia de CAR-T foi avaliada usando um modelo animal subcutâneo.

[0172] Quando o crescimento do câncer foi verificado com um calibrador automático, no grupo tratado com a dose alta (5,0 × 10 6 células/100 µL/cabeça; dose 3), o crescimento do câncer desacelerou no dia 10, o crescimento do câncer foi revertido no dia 14, e a maioria do câncer desapareceu no dia 17. Como mostrado na FIG. 14A, o câncer foi difícil de confirmar na imagem do dia 21. Mesmo nos grupos administrados com a dose média (2,0 × 106 células/100 µL/cabeça; dose 2) e dose baixa (1,0 × 106 células/100 µL/cabeça; dose 1), o crescimento do câncer desacelerou a partir do dia 17 após A administração de CAR- T e o câncer diminuíram a partir do dia 21. No entanto, como resultado do uso de equipamento de imagem, houve alguns indivíduos nos quais as células cancerosas permaneceram no corpo por mais de 4 semanas, embora o efeito tenha sido mostrado em doses médias e baixas, o efeito foi lento em comparação com a dose elevada. Quando as células cancerosas foram fotografadas por meio de imagens IVIS, embora o modelo do tumor tenha sido induzido por administração subcutânea, com o tempo foi confirmado que o câncer se espalhou para os nódulos linfáticos. No entanto, quando MVR CAR-T foi administrado, todas as células cancerosas metastáticas foram mortas.

[0173] (FIG. 15) Além disso, quando a viabilidade do modelo animal através da administração de huMVR CAR-T foi confirmada por meio deste experimento, todos os camundongos morreram no dia 18 no grupo de camundongos de controle não administrados com CAR-T, mas todos sobreviveram no grupo administrado com MVR CAR-T. (FIG. 16) Exemplo prático 18: Identificação in vivo de CD4/8 MVR CAR-T em modelos animais

[0174] O sangue obtido a partir do camundongo usado no Exemplo Prático 17 foi submetido a análise de sangue para confirmar a proporção e número de CAR-T presentes no corpo do animal. A análise de sangue mostrou que o CAR-T foi confirmado em uma proporção baixa em indivíduos aos quais foi administrado o CAR-T após 3 dias, e a quantidade de CAR-T aumentou rapidamente de 7 % para 31 % no grupo de alta dosagem após 10 dias. Este foi o ponto em que o tamanho do câncer e os valores de fótons diminuíram no grupo de MVR de alta dosagem. Além disso, no caso de dosagem média e baixa de hu MVR CAR-T, a proporção de CAR-T foi aumentada a partir do dia 17 após a administração, e o valor do tamanho de fotões e câncer foram diminuídos a partir do dia 21. (fig. 17) Tabela 2 Número da sequência Informação 1 CDR1 de cadeia pesada de huMRV.H2 2 CDR2 de cadeia pesada de huMRV.H2 3 CDR3 de cadeia pesada de huMRV.H2 4 CDR1 de cadeia leve de huMRV.L2 5 CDR2 de cadeia leve de huMRV.L2 6 CDR3 de cadeia leve de huMRV.L2 7 Região variável de cadeia pesada de huMRV.H2 8 Região variável de cadeia leve de huMRV.L2 9 scFV de huMRVL2H2 10 Região variável de cadeia pesada de huMRV.H1 11 Região variável de cadeia leve de huMRV.L1

12 scFV de huMRVL1H1 13 Domínio de sinalização 4-1BB 14 euCD137 15 MRV.L2H2 CAR 16 MRV.L2H2 CAR_euCD137 17 CD19 CAR 18 CD19 CAR_euCD137 19 Promotor de EF1a 20 Sequência líder de CD8-α 21 Identificador 22 CD19scFv 23 CD8/Dobradiça/Sequência de Transmembrana 24 CD3z 25 Woodchuck/PRE 26 R/região

[0175] Por exemplo, para fins de construção de reivindicação, não se pretende que as reivindicações estabelecidas abaixo sejam interpretadas de qualquer forma mais restrita do que sua linguagem literal e, portanto, não se pretende que modalidades exemplares do relatório descritivo sejam lidas nas reivindicações. Consequentemente, deve ser entendido que a presente invenção foi descrita por meio de ilustração e não como forma de limitar o escopo das reivindicações. Consequentemente, a presente invenção é limitada apenas pelas reivindicações seguintes. Todas as publicações, patentes publicadas, pedidos de patentes, livros e artigos científicos, citados neste pedido são todos incorporados no presente pedido por referência em sua totalidade. Texto livre de listagem de sequências

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 1, uma HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 2, uma HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 3; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 4, uma LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 5 e uma LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 6; em que a molécula de ligação a antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

2. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada representada pela Sequência No 7 e uma região variável de cadeia leve representada pela Sequência No 8.

3. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 9.

4. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácido representada pela Sequência No 13.

5. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 14.

6. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular para ativar células T.

7. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o referido domínio de transmembrana é selecionado a partir do grupo composto de uma cadeia alfa de um receptor de célula T, uma cadeia beta de um receptor de célula T, uma cadeia zeta de um receptor de célula T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154, em que o referido domínio de sinalização intracelular é um domínio de sinalização de CD3zeta e um domínio de sinalização coestimulador.

8. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização coestimulador é selecionado a partir do grupo composto de CD28, OXO40, CD27, ICAM-1, CD278 e CD137.

9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.

11. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.

12. Célula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é uma célula T.

13. Célula, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as células T são células T CD8+ e/ou células T CD4+.

14. Célula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é uma célula T modificada por receptor de antígeno quimérico (CAR-T).

15. Composição farmacêutica para tratar câncer, caracterizada pelo fato de que compreende a célula como definida na reivindicação 11 como um ingrediente farmaceuticamente eficaz.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o câncer é adenocarcinoma esofágico, câncer colorretal, melanoma, melanoma ocular, câncer pulmonar de células pequenas, neuroblastoma, teratoma, câncer fetal, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, timoma, leucemia linfocítica, linfoma de células B, linfoma de células B grande difuso, leucemia, leucemia mieloide aguda, ou similares.

17. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de administrar, a um paciente tendo câncer, uma composição farmacêutica compreendendo uma célula T compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

18. Método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende células T CD8+, ou compreende células T CD4+ e células T CD8+.

19. Método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proporção das contagens celulares de células T CD4+ para células T CD8+ é substancialmente 1:1.

20. Método de fabricar uma célula T com um receptor de antígeno quimérico (CAR-T) modificado para o tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de infectar uma célula T com ácidos nucleicos que codificam uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 1, uma HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 2 e uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 3; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 4, uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 5 e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela Sequência No 6; em que a molécula de ligação a antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

21. Composição farmacêutica terapêutica para tratar câncer, caracterizada pelo fato de que compreende como um ingrediente farmaceuticamente eficaz, células T compreendendo a molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

22. Composição farmacêutica terapêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende células T CD8+ ou compreende células T CD4+ e células T CD8+.

23. Composição farmacêutica terapêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a proporção das contagens celulares de células T CD4+ para células T CD8+ é substancialmente 1:1.

24. Uso de uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 14, ou molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou medicamento para o tratamento de câncer.

25. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.