CN113366017A

CN113366017A - 结合hla-dr的嵌合抗原受体和car-t细胞

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Publication number: CN113366017A
Application number: CN201980067331.8A
Authority: CN
Inventors: 權炳世; 金永昊; 金光熙; 郑智元; 张荣均; 李保林; 李汀胤; 李承炫; 任宣佑; 崔镇敬; 孙贤台; E.H.柳
Original assignee: Eutilex Co Ltd
Current assignee: Eutilex Co Ltd
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-09-07
Also published as: US11013765B2; US20200237821A1; EP3835320A1; EP3835320A4; CA3109209A1; SG11202101169PA; WO2020032784A1; JP2021533755A; MX2021001672A; US11951130B2; KR20210043623A; US20220031742A1; BR112021002487A2; AU2019317229A1

Abstract

本发明涉及抗原结合分子以及表达所述抗原结合分子的细胞系；所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗原结合分子是T细胞受体(TCR)。

Description

结合HLA-DR的嵌合抗原受体和CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及能够结合HLA-DR的嵌合抗原受体和CAR-T细胞。

背景技术

制备成表达嵌合抗抗原受体(CAR)的T细胞在癌症治疗中具有高治疗潜力(Grupp等,2013；Kochenderfer等,2010,2015；Porter等,2011)。

这些细胞的临床成功是CAR融合结构的结果，其中各种信号转导结构域和具有各种亲合力(avidity)的抗原结合结构域被人工地结合(Maus等,2014；van der Stegen等,2015)。

CAR是指基于胞外表达的识别靶抗原的抗原结合结构域的合成分子，其包括识别位点、跨膜结构域(模块)、一个或多个共刺激信号转导结构域和携带激活信号的嵌合胞内信号(Jensen和Riddell,2015)。

具有CAR的T细胞与肿瘤细胞表位的结合不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)并且可以通过细胞毒性T细胞的机制诱导肿瘤细胞凋亡和细胞死亡(Ramos和Dotti，2011)。

近年来，已经证明了靶向CD 19(分化簇19)的CAR-T在治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中的显著结果(Kochenderfer,JN等(2010)Blood 116:4099-4102；Porter,D.L'等(2011)N.Engl.J.Med.365:725-733；Grupp,SA等(2013)N.Engl.J Med.368:1509-1518；Kochenderfer,JN等(2015)J.Clin.Oncol.33:540-549；Brown,CE等(2016)N.Engl.J.Med.375:2561-2569)。

虽然CD19 CAR-T细胞疗法成功治疗了复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤，但是客观缓解率从20-30％提高到79％，并且完全缓解率为30-50％。该数值比之前的结果高7倍(Crump等,2016；Locke等,2017)。

对于本说明书中使用的恶性肿瘤变体受体(Malignancy Variant Receptor，MVR)，脾细胞分离自用人源性B细胞淋巴瘤细胞反复免疫的Balb/c小鼠，并与SP2/0骨髓瘤细胞杂交以制备杂交瘤库，抗-MVR杂交瘤选自仅对B细胞淋巴瘤特异性反应且显示高反应性的杂交瘤库(WO2016-094304)。

CD19在正常细胞和癌细胞中表达，因此CD19抗体不能准确地区分正常细胞和癌细胞，但是MVR抗体可以准确地区分正常细胞和癌细胞，从而确保高治疗效果和安全性(Han等,2018)。

存在的问题是CAR-T细胞不能由具有高亲和力(affinity)的特定HLA-DR型T细胞产生。为了改善这一点，在该专利中，已经制备了具有各种结合亲和力的抗体，并最终选择了适合作为CAR-T细胞治疗剂的抗体。

本发明是旨在通过鼠MVR抗体的序列变异来获得对抗原的多种结合亲和力的专利；预期抗体本身可以用作治疗剂，或者可以用于使用抗体(CAR-T细胞治疗剂)等的治疗剂。另外，本发明的抗体，通过用鼠MVR抗体产生人源化抗体，使得免疫原性最小化。此外，通过发现具有各种结合亲和力的抗体，可以预期的是，当应用CAR-T时，CAR-T的产生优于亲本抗体，并且可以应用于用于血液癌症治疗的CAR-T细胞治疗剂。

发明详述

要解决的问题

本发明的目的是提供可以在临床上应用的MVR，以及提供具有优异治疗效果的CAR-T细胞。具体地，本发明提供了可以引入到各种CAR-T细胞中的共刺激结构域，作为在第二代CAR-T细胞中在其功能中起主要作用的共刺激结构域。此外，本发明的目的是提供各种抗原结合结构域，其能够结合在特定癌细胞表面上表达的抗原并能够形成CAR-T细胞。

解决问题的手段

1.一种抗原结合分子，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；并且所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

2.根据项目1的抗原结合分子，其包含序列编号7所示的重链可变区和序列编号8所示的轻链可变区。

3.根据项目1的抗原结合分子，其包含序列编号9所示的氨基酸序列。

4.根据项目1的抗原结合分子，其还包含序列编号13所示的氨基酸序列。

5.根据项目1的抗原结合分子，其还包含序列编号14所示的氨基酸序列。

6.根据项目1的抗原结合分子，其还包含跨膜结构域和胞内信号转导结构域，用于活化T细胞。

7.根据项目6的抗原结合分子，其中，所述跨膜结构域选自下组：T细胞受体的α链，T细胞受体的β链，T细胞受体的ζ链，CD28，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，其中所述胞内信号转导结构域是CD3ζ信号转导结构域和共刺激信号转导结构域。

8.根据项目7的抗原结合分子，其中所述共刺激信号转导结构域选自下组：CD28、OXO40、CD27、ICAM-1、CD278和CD137。

9.一种核酸分子，其编码项目1-8中任一项所述的抗原结合分子。

10.一种表达载体，其包括项目9所述的核酸分子。

11.一种细胞，其包含项目9所述的核酸分子。

12.根据项目11的细胞，其是T细胞。

13.根据项目12的细胞，其中，所述T细胞是CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞。

14.根据项目11所述的细胞，其是嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)。

15.一种药物组合物，用于治疗癌症，其包含项目11所述的细胞作为药学有效成分。

16.根据项目15的药物组合物，其中，所述癌症是食道腺癌，结肠直肠癌，黑素瘤，眼黑素瘤，小细胞肺癌，神经母细胞瘤，畸胎瘤，胎儿癌，鳞状细胞癌，头颈鳞状细胞癌，胸腺瘤，淋巴细胞性白血病，B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，白血病，急性髓细胞性白血病等。

17.一种癌症治疗方法，其包括向患有癌症的患者给予包含T细胞的药物组合物的步骤，所述T细胞包含治疗有效量的项目1-8中任一项所述的抗原结合分子。

18.根据项目17的癌症治疗方法，其中，所述药物组合物包含CD8+ T细胞，或者包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。

19.根据项目18所述的癌症治疗方法，其中，CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的细胞计数的比例大致为1:1。

20.一种制造用于治疗癌症的具有修饰的嵌合抗原受体(CAR-T)的T细胞的方法，其包含用核酸转染T细胞的步骤，所述核酸编码抗原结合分子，所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；并且所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

21.一种治疗性药物组合物，用于治疗癌症，其包含作为药学有效成分的包含项目1-8中任一项所述的抗原结合分子的T细胞。

22.根据项目21的治疗性药物组合物，其中，所述药物组合物包含CD8+ T细胞，或者包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。

23.根据项目18的治疗性药物组合物，其中，CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的细胞计数的比例大致为1:1。

发明效果

在本发明中开发的MVR的情况下，可以选择性地识别肿瘤细胞中增加的HLA-DR，并且当使用其产生了CAR-T细胞时，MVR表现出强体外功效和在动物中高功效。

其还具有增加功效的作用，这是通过将五个氨基酸添加到常规4-1BB共刺激结构域中。

附图简要说明

图1显示了小鼠MVR抗体和2种制备的人源化抗体(huMVR.L1H1，huMVR.L2H2)各自的VH氨基酸序列。

图2显示了小鼠MVR抗体和2种制备的人源化抗体(huMVR.L1H1，huMVR.L2H2)各自的VL氨基酸序列。

图3显示了muMVR和2种人源化抗体(huMVR.L1H1，huMVR.L2H2)的亲和力分析的结果。

图4显示了人源化抗体huMVR.M2H2(其为MVR)的分子建模和亲和力热点预测。

图5显示了已经应用亲和力热点的15种突变体类型的亲和力分析的结果。

图6a是CD19 CAR、CD19CAR_euCD137和huMVR.L2H2CAR_euCD137构建体的示意图。CD19CAR在共刺激结构域中利用了4-1(CD137)结构域的214-255aa，而CD19CAR_euCD137和huMVR.L2H2CAR_euCD137利用了4-1(CD137)结构域的209-255aa。

图6b显示了慢病毒载体和对应的基因，其显示了CAR-T细胞的主要功能和CD19CAR构建体的基因序列。具体地，其显示了CD8前导序列，包括EF1α启动子，scFv huMVR.L2H2，CDα铰链和人CD8跨膜结构域，和4-1BB和CD3ζ信号结构域，用于增加CAR表达率。还显示了安全级慢病毒生产所需的相应基因。

图7显示了慢病毒载体和对应的基因，其显示了CAR-T细胞的主要功能和CD19 CAR构建体的基因序列。具体地，其显示了CD8前导序列，包括EF1α启动子，scFv MVR.L2H2，CDα铰链和人CD8跨膜结构域，和4-1BB和CD3ζ信号结构域，用于增加CAR表达率。还显示了安全级慢病毒生产所需的相应基因。

图8显示了MVR CAR-T细胞生产过程。

图9显示了证实MVR CAR-T体外细胞凋亡功能的实验结果。

图10显示了已经引入CD19CAR和CD19CAR_euCD137的两种类型的CD19 CAR-T细胞的生产率和功效评估。A：产生2个CD19 CAR-T后的14天，对CD8和CAR-T细胞进行染色，并显示了使用FACS获得的CAR-T产生比率。B：在使2种产生的CAR-T与靶标反应4小时后进行荧光素酶测定后，显示了各个CAR-T的细胞毒性的比较。

图11显示了评估huMVR CAR-T在动物模型中的作用之前，使用FACS进行的细胞系中HLA-DR的表达和huMVR L2H2 scFv的亲和力。

图12显示了在确认图9中细胞系水平上CAR-T细胞产生比例和细胞毒性后，在动物模型中使用CAR-T细胞系进行的功效评估。A：在通过向小鼠皮下注射表达荧光素酶的癌细胞来皮下诱导动物模型后，使用IVIS成像设备评估CAR-T效果的结果。B：成像后确认并绘制各小鼠光子值的结果。

图13显示了以3-4天的间隔在小鼠中进行眼眶血液收集后使用FACS检测的血液中存在的CAR-T的比例和数量。A：该图通过CD8+/CAR+细胞的FACS染色确认了血液中总CD19CAR-T比例。B：该图在确认总CAR-T比例后，再次确认了CD8和CD4CAR-T比例。C.该图表显示了FACS染色期间通过使用FACS计数珠粒检测的血液中存在的CAR-T细胞的数量。

图14显示了使用腹膜内动物模型的CD8 huMVR CAR-T和CD4/CD8 huMVR CAR-T的功效测试。A：通过将表达荧光素酶的癌细胞系注入小鼠腹腔来诱导动物模型后，CD8 huMVRCAR-T和CD4/CD8 huMVR CAR-T作用的IVIS成像结果。B.该图表显示了腹腔诱导的动物模型中癌细胞的光子值。

图15显示了使用动物模型进行的MVR CAR-T的功效测试。A：IVIS成像结果，其显示了通过将表达荧光素酶的癌细胞系皮下注入小鼠来诱导动物模型后，MVR CAR-T的作用。B：该图表显示了用自动卡尺测量后皮下诱发的癌块的大小。

图16是显示基于图15的各组中小鼠的活力的图。

图17显示了在MVR CAR-T给予后以3-4天的间隔在小鼠中进行眼眶血液收集后使用FACS进行检测的血液中存在的CAR-T的比例和数量。A：显示小鼠血液中hCD45+/CAR+细胞比例的图表。B：该图表显示了FACS染色期间通过使用FACS计数珠粒检测的在小鼠血液中存在的MVR CAR-T细胞的数量。

实施本发明的最佳方式

本发明涉及表达嵌合抗原受体的细胞，包含其的药物组合物，和使用其的癌症治疗方法。

如本发明中所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”指通过暴露于细胞外部的能识别靶分子的受体起作用的抗原结合结构域；一个或多个铰链结构域或间隔子结构域；跨膜结构域；一个或多个胞内共刺激信号转导结构域；和胞内刺激结构域。

如本发明中所用，术语“T细胞”指这样的淋巴细胞，其源自胸腺并在细胞免疫中起重要作用。T细胞包括CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，记忆T细胞，调节T细胞，自然杀伤性T细胞等。在本发明的一个实施方式中，引入CAR的T细胞是CD8+ T细胞，或CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。

如在该说明书中所用，“抗体”和“抗原结合蛋白”可以互换使用，并且根据本发明的抗原结合蛋白不仅包括完整抗体形式，还包括抗体分子的功能性片段。完整抗体是具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，并且各轻链通过二硫键和重链连接。抗体分子的功能性片段指具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv等。在这些抗体片段中，Fab具有单个抗原结合位点，其结构具有轻链，重链可变区，轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1)。Fab′与Fab′的不同之处在于其具有这样的铰链区，所述铰链区在重链CH1结构域的C末端包含至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体是通过Fab'的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键而产生的。

公开的国际专利申请WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086和WO 88/09344已经公开用于生成具有最小抗体片段的Fv片段(其中Fv仅有重链可变区和轻链可变区)的重组技术。双链Fv(dsFv)是其中重链可变区和轻链可变区连接的二硫键，而单链Fv(scFv)通常通过肽接头共价连接轻链和重链的可变区。这类抗体可以使用蛋白水解酶获得(例如，可以将整个抗体限制在木瓜蛋白酶中，并且可以获得Fab，并且切割胃蛋白酶可以产生F(ab')2片段)。

在本说明书中，HLA-DR(人白细胞抗原-抗原D相关)指主要组织相容性复合物II类分子(Shackelford,DA等,(1982)Immunol.Rev.66:133-187)。HLA-DR(九个或更多氨基酸的肽)及其配体构成TCR的配体。HLA-DR分子响应信号转导而上调。在感染的情况下，肽(例如葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素I肽)与DR分子结合，并提供给在辅助T细胞中发现的许多T细胞受体。这些细胞结合刺激B细胞增殖的B细胞表面抗原。

HLA-DR的主要功能是呈递最初不在免疫系统中的外来肽抗原，以诱导或抑制辅助T细胞的应答以诱导产生针对相同肽抗原的抗体。HLA-DR是αβ二聚体和细胞表面受体；各亚基包含两个胞外结构域，跨膜结构域和胞质尾。α和β链均固定在细胞膜上。成熟蛋白的N-末端结构域形成α-螺旋，其构成结合基团的暴露部分，而C-末端胞质区域与其他链相互作用，以在跨细胞膜的结合部分下形成β-折叠。大多数肽接触位置位于各链的前80个残基处。

HLA-DR在抗原呈递细胞如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和B细胞中有限地表达。因为细胞表面DR“抗原”的富度增加常常响应刺激，DR也是免疫作用的标志物，由于细胞恶性肿瘤中HLA-DR的高表达以及正常细胞中有限的表达谱，已经开发了针对HLA-DR的抗体并在临床前和临床研究对于B细胞恶性肿瘤进行了测试(Nagy,ZA,等(2002)Nat.Med.8:801-807；DeNardo,GL,等(2005)Clin.Cancer Res.11:7075s-7079s；Ivanov,A.,等(2009)J.Clin.Invest.119:2143-2159；Lin,TS,等(2009)Leuk.Lymphoma 50:1958-1963)。虽然I/II期测试中的毒性并不严重，但是由于疗效有限，停止了进一步的研究(Lin,T.S.等(2009)Leuk.Lymphoma 50:1958-1963)。考虑到CAR-T细胞通过将抗原特异性纳入大规模T细胞反应来增强单克隆抗体的治疗功效的潜力，人们认识到针对HLA-DR的CAR-T细胞可能是B细胞中恶性肿瘤的有效治疗方法。

在本发明的一个实施方式中，抗原结合蛋白包含scFv，并且具有这样的形式，其中跨膜结构域、共刺激信号转导结构域和胞内信号转导结构域功能性地连接。对于跨膜结构域，T细胞受体的α、β或ζ链，或CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的一个或多个，但不限于此。胞内信号转导域基本上是CD3ζ主要信号转导域；对于共刺激信号域，可以使用CD28、OXO40、CD27、ICAM-1、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)中的一个或多个，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，跨膜结构域是CD8，而共刺激信号转导结构域是4-1BB。

本发明的scFv包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，并且具有VL-VH或VH-VL结构，并且VL和VH可以直接连接或通过接头连接。如果使用接头，任选地，可以使用本领域已知的接头，例如(GGGGS)₂、(GGGGS)₃、(Gly)₆、(Gly)₈或EAAAK)_n(其中n为1-3的任何整数)，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，抗原结合蛋白包含VL-接头-VH构建体，而接头是(GGGGS)₃。

本发明的抗原结合分子的scFv特异性结合在细胞表面上呈递的抗原；具体地，该抗原是在靶细胞(例如癌细胞)中特异性表达或在癌细胞中过表达的细胞表面蛋白，并且例如可以选自下组中的至少一种：CD30、CD20、CD19、CD22和CD138。在本发明的一个实施方式中，抗原是HLA-DR。

在本发明的一个实施方式中，scFv是huMVR(针对HLA-DR的抗体)。所述huMVR包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。在本发明的一个实施方式中，scFv包含序列编号7所示的重链可变区和序列编号8所示的轻链可变区；在本发明的另一个实施方式中，scFv包含huMVR序列编号9所示的氨基酸序列。

本发明的抗原结合分子是具有scFv作为抗原结合位点的嵌合抗原受体(CAR)；在本发明的一个实施方式中，抗原结合分子还包括在scFv的C-末端的跨膜结构域和用于活化T细胞的胞内信号转导结构域。

在本发明的另一个实施方式中，CAR包含序列编号7或序列编号8所示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方式中，跨膜结构域选自下组：T细胞受体的α链，T细胞受体的β链，T细胞受体的ζ链，CD28，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，和其变体，其中所述胞内信号转导结构域是CD3ζ信号转导结构域和共刺激信号转导结构域；在本发明的一个实施方式中，共刺激信号转导域选自：CD28，OX40，CD27，ICAM-1，CD278和CD137。

“分离的多肽”，“分离的肽”或“分离的蛋白质”指基本不含在天然状态下通常与之结合的化合物(例如，其他蛋白质或多肽，核酸，酸，碳水化合物，脂质)的多肽或蛋白质。“分离(的)”并不意指移出与其它化合物的人工或合成混合物，移出不干扰生物活性的杂质，或移出这样的杂质，所述杂质可能是因例如在未完成的产品或药学上可接受的制备物的制剂中添加稳定剂所致。

术语“可变区”指在进行特异性结合抗原的功能时表现出许多序列变异的抗体分子部分；CDR1、CDR2和CDR3存在于可变区中。“互补决定区(CDR)”是涉及抗原识别的位点；这些位点对于根据该位点的序列变化确定抗体对抗原的特异性很重要。在CDR之间，以正确的方向存在一个“框架区(FR)”，其支撑CDR环；特别地，存在FR1、FR2、FR3和FR4。

在本发明的一个实施方式中，本发明的另一抗原结合蛋白可以是人源化抗体。在本发明中，术语“人源化抗体”通常指非免疫原性或免疫原性降低的抗体，如上所述。人源化抗体是改变的抗体，并且可以重新排列抗体的氨基酸序列以满足期望的目的。这些可能的改变是多种多样的，并且可以从改变一个或多个氨基酸到完全重新配置抗体的可变或恒定区。通常，在进行可变区修饰以增加抗原的亲和力和亲合力时，进行恒定区的改变以增加胞内作用，如补体的固定，与膜的相互作用和其他效应剂的功能。本发明提供的人源化抗体可以通过重组方法与各种恒定区结合。重链恒定区为γ、μ、α、δ、ε类型，并被归类为γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2。轻链的恒定区具有κ和λ类型(Coleman等,《免疫学基础》(Fundamentalimmunology),第2版,1989,55-73)。

术语“片段”在应用于多核苷酸或多肽序列时指这样的核酸序列或肽序列，其相较于上述核酸或蛋白质的长度缩短，并且包含与上述核酸或蛋白质的核苷酸序列或肽序列的部分相同的至少部分。根据本发明的这类核酸片段和多肽片段(如果合适)可以包括在较大的多核苷酸或多肽中作为其组分。这类片段可以包含这样的寡核苷酸或寡肽或由其组成，所述寡核苷酸或寡肽具有来自根据本发明的核酸或蛋白质的连续核苷酸或肽序列，其长度至少为6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多。

多肽或蛋白质的“变体”指衍生自该多肽或蛋白质并且保留该多肽或蛋白质的至少一种生物学特性的任何类似物、片段、衍生物或突变体。该多肽或蛋白质的不同变体可以自然存在。这些变体可以是等位基因的变异形式，其特征在于编码蛋白质的结构基因的不同核苷酸序列，或者可以包括差异化的剪接或翻译后修饰。本领域技术人员可以产生具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或替代的变体。这些变体可以包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸取代的变体，(b)其中一个或多个氨基酸被添加至多肽或蛋白质的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，和(d)其中多肽或蛋白质与另一种多肽如血清白蛋白融合的变体。

保守变体也指具有这样序列改变的氨基酸序列，所述序列改变不会不利地影响蛋白质生物学功能。如果改变的序列干扰或破坏了与蛋白质相关的生物学功能，那么取代、插入或缺失被描述为对蛋白质产生不利影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水性-亲水性，而不会不利地影响生物活性。因此，可以改变氨基酸序列，使得例如肽表现出较高的疏水性或亲水性，而不会不利地影响蛋白质的生物活性。本领域普通技术人员已知获得这些变体的技术，其包括遗传(抑制、缺失、突变等)、化学和酶促技术。

在本发明的一个实施方式中，公开了编码抗原结合分子的核酸分子。所述核酸分子可以包含编码序列编号7所示氨基酸序列的核酸序列，或者编码序列编号7所示氨基酸序列的核酸序列。

在本发明的另一个实施方式中，核酸分子可以包含用于编码序列编号9所示的scFv的序列。在本发明的另一个实施方式中，核酸分子可以包含编码CAR的核酸序列，其由序列编号15或序列编号16所示。此外，在本发明的另一个实施方式中，核酸分子可以包含具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的核酸序列，用于编码多肽，其与由上述序列编码的蛋白质的氨基酸序列相同，或具有至少95％，至少96％，至少97％％，至少98％或至少99％的同源性。

发明中的术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且指单链或双链形式的核糖核苷(腺苷，鸟苷，尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸腺嘧啶或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯的螺旋；或硫代磷酸酯或任何磷酸酯类似物如硫酯。这其中，有可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，并且不限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括，在这些分子中，存在于染色体中的线性或环状DNA分子(例如，限制性内切酶片段)，质粒，超螺旋DNA和双链DNA。在该说明书中讨论特定双链DNA分子的结构时，本文可以根据常规惯例描述序列，即仅沿未转录的DNA链的5'-3'方向给出序列(即具有对应mRNA的序列)。“重组DNA分子”是经分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于：cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。

如本领域已知，“百分比相同性”是通过比较序列确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。此外，在本领域中，术语“相同性”指(视情况而定)通过序列字串之间的匹配程度确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列对应的程度。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于《计算机分子生物学》(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M.,等,牛津大学出版社(OxfordUniversity Press),纽约,(1988)；《生物运算：信息学和基因组工程》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),(Smith,D.W.编著),学术出版社(Academic Press),纽约,(1993)；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著),胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州,(1994)；《分子生物学的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology),(vonHeine,G.),学术出版社,1987；和《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer),(Gribskov,M.和Devereux),J.编著,M斯托克顿出版社(M Stockton Press),纽约,(1991)中所述的那些。

确定相同性的优选方法旨在提供经测试的序列之间的最佳匹配。确定相同性和相似性的方法已编入可公开获得的计算机程序中。可以使用序列分析软件，诸如LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR有限公司(DNASTAR Inc.)，威斯康辛州麦迪逊)的Megaalign程序软件，进行序列比对和相同性百分比计算。可以使用具有默认参数(缺口罚分(GAPPENALTY)＝10，缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10)的Clustal比对方法(Higgins等，CABIOS.5:151 1989)进行序列的多重比对。用于使用Clustal方法的成对比对的默认参数可以选自：KTUPLE 1，缺口罚分＝3，窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。如本领域已知的，两种多肽之间的“相似性”这样确定：比较多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代和第二多肽的序列。本申请中针对这些序列的相同性或同源性指在不考虑任何保守取代作为部分序列相同性的情况下，对序列进行比对并根据需要引入缺口(gap)以实现同源性百分比最大化，然后定义为候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分比。在N端、C端或内部的肽序列中的扩增、缺失或插入不应解释为影响同源性。

术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的百分比相同性。可以通过本领域已知的技术确定一个部分的序列与另一部分的序列之间的对应性。例如，可以通过比对序列信息并使用可及的计算机程序来直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。或者，同源性可以这样确定：在相同种类的区域之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶切割并确定切割的片段的大小。

如在该说明书中所用，术语“同源性”的所有语法形式和拼写形式指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的对应关系(Reeck等,Cell 50:667(1987))，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质以及来自其他物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)。鉴于其具有高序列相似性，这些蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性。然而，在常规使用和在本申请中，当用副词例如“高度”修饰术语“同源性”时指序列同源性，并且不表示共同的进化源。

因此，术语“序列相似性”的所有语法形式指可能具有或不具有共同进化源的核酸或氨基酸序列之间的相同性或对应性的程度(Reeck等,Cell50:667(1987))。在一个实施方式中，当约50％(例如，至少约75％、90％或95％)的核苷酸与限定长度或更长的DNA序列匹配时，所述两个DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似”。可以这样鉴定基本上同源的序列：通过使用可及的标准软件将序列与序列数据库进行比较，或者例如在针对特定系统定义的严格条件下进行的Southern杂交实验。定义合适的杂交条件在本领域的技术范围内(参见例如，Sambrook等1989)。

如在该说明书中所用，“基本上相似”指这样的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的取代，但不影响该DNA序列编码的蛋白质的功能特性。“基本上相似”还指这样的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响该核酸片段通过反义或共抑制技术介导基因表达改变的能力。“基本上相似”还指本发明的核酸片段的修饰，如一个或多个核苷酸碱基的缺失或插入，其基本上不影响所得转录本的功能特性。因此，本发明应理解为还包括所示的特定序列。各个建议的修饰在本领域普通技术人员的范围内，诸如确定编码的产物的生物学活性的保留。

此外，技术人员将理解的是，本发明所涵盖的基本相似的序列是这样定义的：在严格条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃和0.1X SSC，0.1％SDS，在用2X SSC洗涤后，0.1％SDS)与本说明书中所示序列杂交的能力。本发明的基本上相似的核酸片段是这样的DNA序列的核酸片段，其与本说明书中报道的核酸片段的DNA序列至少约70％、80％、90％或95％相同。

在本发明的一个实施方式中，提供了这样的表达载体，其包含编码根据本发明的抗原结合蛋白的核酸分子。术语“表达”指由编码序列编码的产物的生物产生。在大多数情况下，转录包含编码序列的DNA序列，以形成信使RNA(mRNA)。然后，翻译信使RNA，以形成具有相应生物学活性的多肽产物。另外，表达过程可包括处理RNA转录产物(例如，剪接以去除内含子)和/或翻译后处理多肽产物的其它步骤。

如在该说明书中所用，术语“表达载体”指设计成在表达插入的核酸序列后转化宿主的载体、质粒或运载体。

通常将克隆的基因，即插入的核酸序列，置于控制元件如启动子、最小启动子、增强子等的控制下。能够用于诱导所需宿主细胞中核酸表达的许多起始调控区或启动子为本领域技术人员所熟知。能够实质上诱导这些基因表达的任何启动子包括但不限于：病毒启动子，细菌启动子，动物启动子，哺乳动物启动子，合成启动子，组成型启动子，组织特异性启动子，发病原或与疾病相关启动子，发育特异性启动子，诱导型启动子，光调节型启动子等；并且包括但不限于：含有SV40早期(SV40)启动子区域和劳斯肉瘤病毒(RSV)的3'长末端重复序列(LTR)的启动子；腺病毒(Ad)或主要晚期启动子(MLP)的E1A；人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子；单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子；杆状病毒IE1启动子；延伸因子1α(EF1)启动子；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GSPDH)启动子，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；泛素C(Ubc)启动子；白蛋白启动子；小鼠金属硫蛋白-L启动子和转录调控区的调控序列；遍在启动子(HPRT，波形蛋白，β-肌动蛋白，微管蛋白等)；中间丝(肌间线蛋白，神经原纤维，角蛋白，GFAP等)，治疗基因的启动子(MDR，CFTR或VIII因子形式和类似物)，发病或与疾病相关启动子；和已经用于转基因动物并表现出组织特异性的启动子，如在胰腺腺泡细胞(如胰腺腺泡细胞)中具有活性的弹性蛋白酶的基因调控区；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因调节区；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因调节区；在睾丸，乳腺，淋巴和巨噬细胞中具有活性的小鼠乳腺癌病毒调节区；在肝脏中具有活性的白蛋白基因；Apo AI和ApoAII调节区，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因调节区；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区；在骨髓细胞中具有活性的β-珠蛋白基因调节区；在大脑少突胶质细胞中具有活性的活性髓鞘碱性蛋白调节区；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链2基因调节区，和在下丘脑中具有活性的释放促性腺激素；丙酮酸激酶启动子；绒毛蛋白启动子；脂肪酸结合蛋白肠蛋白的启动子；在平滑肌细胞中的β-肌动蛋白的启动子。

术语“载体”涵盖用于将核酸体外、离体或体内引入细胞中的非病毒和病毒运载体。

载体可以是连接另一DNA片段的复制子，以扩增所连接的片段。术语“复制子”指能够充当体内DNA复制的自主单位，即在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒(eosmid)、染色体、病毒)。本领域已知多种载体可以用于工程改造核酸，将反应元件和启动子纳入基因等。优选的载体包括例如质粒或修饰的病毒，其包含例如腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒，疱疹病毒或质粒，诸如PBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体。例如，可以通过将适当的DNA片段与选定的具有互补粘性末端的载体组合来将对应反应元件和启动子的DNA片段插入适当的载体中。如果不是这种情况，可以通过酶促修饰DNA分子的末端，或者可以通过将核苷酸序列(接头)与DNA末端结合来产生任何位点。可以操作这类载体，从而包含选择性标志物基因，用于筛选将标志物纳入细胞基因组中的细胞。这类标志物使得可以鉴定和/或筛选表达通过该标志物编码的蛋白质的宿主细胞。

载体提供了必要调控序列(例如，转录和翻译元件)，以调控融合蛋白在适当宿主细胞中的表达。调控序列可以包括启动子区，增强子区，转录终止位点，核糖体结合位点，起始密码子，剪接信号，内含子，聚腺苷酸化信号，夏因-达尔加诺翻译序列和Kozak共有序列。调节序列将鉴于其中将产生融合蛋白的宿主细胞来选择。合适的细菌启动子包括但不限于：噬菌体λpL或pR，T6，T7，T7/lacO，lac，recA，gal，trp，ara，hut和trp-lac。合适的真核启动子包括但不限于：PRBI，GAPDH，金属硫蛋白，胸苷激酶，病毒LTR，巨细胞病毒，SV40或组织特异性或肿瘤特异性启动子，诸如α-胎儿蛋白，淀粉酶，组织蛋白酶E，M1毒蕈碱受体或γ-谷氨酰转移酶。

其它载体包括：脂质复合物(阳离子脂质体-DNA复合物)，多聚复合物(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物。除了核酸外，载体还包含一个或多个调控区和/或选择性标志物，其能够用于选择、测量和监测核酸递送的结果(递送至特定组织，表达持续时间等)。

载体可以通过本领域已知的方法导入所需细胞，诸如注射，转染，电穿孔，显微注射，转导，细胞融合，脂质转染，磷酸钙沉淀(Graham,F.L.等,Virology,52:456(1973)；和Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752(1987))，脂质体介导的结构化盐方法(Wong,T.K.等,Gene,10:87(1980)；Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)；和Nicolau等,Methods Enzymol.,149:157-176(1987))，DEAE-葡聚糖处理(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))，基因轰击(gene bombardment)(Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))使用基因物质或DNA载体转运蛋白(参见例如，Wu等,J.Biol.Chem.267:963(1992)；Wu等,J.Biol.Chem.263:14621(1988)；和Hartmut等,澳大利亚专利申请号2,012,311)。

病毒载体已经用于细胞以及活体动物对象的多种基因转移应用中。可以使用的病毒载体包括但不限于：腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒，腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、杆状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、猿猴病毒40和EB病毒载体。非病毒载体包括：质粒、脂质复合物(阳离子脂质体-DNA复合物)、多聚复合物(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物。除了核酸外，载体还可以包含一个或多个调控区和/或选择性标志物，其能够用于选择、测量和监测核酸递送结果(递送至组织，表达持续时间等)。

根据本发明的多核苷酸可以通过脂质转染体内引入。在过去的几十年中，脂质体用于体外包封和转染核酸的用途已经增加。设计成限制脂质体介导的转染所遇到的困难和风险的合成阳离子脂质可以用于制备用于基因体内转染的脂质体(Feigner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:7413(1987)；Mackey等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027(1988)；和Ulmer等,Science259:1745(1993))。阳离子脂质的使用可以促进包封带负电荷的核酸，并且还可以促进与带负电荷的细胞膜融合(Feigner等,Science 337:387(1989)).WO95/18863、WO96/17823和US 5,459,127中描述了对于递送核酸特别有用的脂质化合物和组合物。使用脂质转染将外源基因体内引入到特定组织具有许多实际优势。脂质体对特定细胞的分子靶向代表了一个优势领域。对于具有细胞异质性的组织，如胰腺、肝、肾和脑，直接转染至特定细胞类型显然是特别需要的。脂质可以化学结合其他分子，用于进行靶向(Mackey等，1988)。靶向的肽(如激素或神经递质)和蛋白质(如抗体)或非肽分子可以化学结合脂质体。

如在该说明书中所用，术语“转染”指细胞摄取外源性或异源性RNA或DNA当外源性或异源性RNA或DNA被引入细胞时，该细胞被这类RNA或DNA“转染”。当结构化的RNA或DNA类型导致表型变化时，该细胞被外源性或异源性RNA或DNA“转化”。导致这种转化的RNA或DNA可以被(共价地)插入染色体DNA中，成为细胞基因组的部分。

如在该说明书中所用，术语“转化”指将核酸片段递送到宿主生物体，导致遗传上稳定的继承。包含转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本发明中所用，术语“重组载体”指这样的基因构建体，其是能够在合适的宿主细胞中表达目标蛋白的表达载体，并且包含操作性连接的调控元件以表达该基因插入物。

其他分子，诸如阳离子寡肽(例如，WO95/21931)，衍生自DNA结合蛋白的肽(例如，WO96/25508)或阳离子聚合物(例如，WO95/21931)也能够用于促进体内核酸转染。

还有可能引入体内载体作为裸DNA质粒(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。也可以使用受体介导的DNA递送(Curiel等,Hum.Gene Ther.3:147(1992)；和Wu等,J.Biol.Chem.262:4429(1987))。

在本发明的一个实施方式中，公开了这样的细胞，其包含编码根据本发明的抗原结合蛋白的核酸分子。在本发明的一个实施方式中，细胞是T细胞；在另一实施方式中，T细胞是CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞；并且在另一个实施方式中，细胞是嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)。

在本发明的一个实施方式中，提供了用于癌症治疗的药物组合物，其包含表达抗原结合蛋白的细胞作为药学有效成分。

如本文所用，术语“抗癌”包括“预防”和“治疗”；“预防”意指通过给予本发明的组合物来抑制或延缓癌症的任何行为，“治疗”意指通过给予本发明的抗体来改善或有益地改变癌症症状的任何行为。预防可以是完全的，例如对象中症状的完全消失。预防也可以是局部的，如对象中症状的出现少于不存在本发明的情况下出现的症状。

本发明公开的“组合物”指这样的组合：作为活性成分的根据本发明的细胞毒性T细胞，和非活性成分，诸如天然或人工运载体、标记物或检测物，活性成分，诸如佐剂、稀释剂、偶联剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂和防腐剂，并且包括药学上可接受的运载体。运载体还可包括药物学上的赋形剂和其它蛋白质、肽、氨基酸、脂类和糖类(例如单糖；二糖；三糖；四糖；寡聚糖；醛糖醇、醛酸、糖源多糖(如酯化糖或糖聚合物等)，单独或组合时，在1-99.99wt％或体积％下。蛋白质赋形剂包括例如人血清白蛋白、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白等，但不限于此。

可起缓冲作用的代表性氨基酸组分包括例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等，但不限于此。碳水化合物赋形剂还包括例如，单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖；多糖，如棉籽糖、麦芽糊精、葡聚糖和淀粉；以及醛糖，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨醇等，和肌醇；但不限于此。

本领域技术人员将能够通过本领域已知的方法来配制本发明的药物组合物。例如，根据需要，可以与水或其它药学上可接受的液体以注射无菌溶液或悬浮液的形式胃肠外使用。例如，可适当地与药学上可接受的运载体或介质组合，特别是无菌水或盐溶液、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、运载体、防腐剂、粘合剂等；可按公认的药剂学规范要求的单位剂型混合配制。制剂中使用的活性成分量可获得指示范围内的合适剂量。

此外，可以根据常规制剂实践，使用赋形剂液体，如注射用蒸馏水，配制注射用无菌组合物。对于注射用水溶液，可使用例如生理盐水的组合；等渗溶液，其含有葡萄糖或其他辅助剂，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，和合适的助溶剂，例如醇，尤其是乙醇和多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇和非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50。油性液体包括例如芝麻油和豆油，并且可与苯甲酸苄酯和苯甲醇组合作为溶解助剂。

注射制剂可例如通过静脉注射、动脉内注射、选择性动脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、脑室内注射、颅内注射、髓内注射等给药；然而，优选地，通过静脉内注射给药。

本发明的组合物包含药学有效量的T细胞。本领域普通技术人员可以基于本说明书中的公开内容容易地确定有效量。

一般而言，通过首先给予低浓度的活性成分，然后逐渐增加浓度来确定药学有效量，直到在没有任何副作用的情况下在对象中获得所需效果(例如，与癌症相关的症状减轻或消除)。例如，在Goodman和Gilman的《治疗剂的药理学基础》(The PharmacologicalBasis of Therapeutics)，Goodman等编，第11版，McGraw-Hill 2005和《雷明顿：药学的科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版和第21版，Gennaro和费城科学大学编，LWW出版公司(Lippencott Williams&Wilkins)(2003年和2005年)中描述了确定用于施用根据本发明的组合物的给药的适当剂量或施用间隔的方法。

给予根据本发明的组合物的方法可以基于各种因素来确定，例如对象的癌症类型、年龄、体重、性别、医疗状况、疾病的严重程度、给药途径和其他单独给予的药物。因此，尽管给药方法变化很大，但是可以根据常用方法来确定。

将给予对象的根据本发明的组合物的量可以通过多种因素确定，例如给药方法、对象的健康状况、体重和医疗建议；所有这些因素均在本领域普通技术人员的知识范围内。

根据本发明的药物组合物可以包含约1×10⁶细胞/mL或更多、约2×10⁶细胞/mL或更多、约3×10⁶细胞/mL或更多、约4×10⁶细胞/mL或更多、约5×10⁶细胞/mL或更多、约6×10⁶细胞/mL或更多、约7×10⁶细胞/mL或更多、约8×10⁶细胞/mL或更多、约9×10⁶细胞/mL或更多、约1×10⁷细胞/mL或更多、约2×10⁷细胞/mL或更多、约3×10⁷细胞/mL或更多、约4×10⁷细胞/mL或更多、约5×10⁷细胞/mL或更多、约6×10⁷细胞/mL或更多、约7×10⁷细胞/mL或更多、约8×10⁷细胞/mL或更多、约9×10⁷细胞/mL或更多、约1×10⁸细胞/mL或更多、约2×10⁸细胞/mL或更多、约3×10⁸细胞/mL或更多、约4×10⁸细胞/mL或更多、约5×10⁸细胞/mL或更多、约6×10⁸细胞/mL或更多、约7×10⁸细胞/mL或更多、约8×10⁸细胞/mL或更多或约9×10⁸细胞/mL或更多的CAR-T细胞，但本领域普通技术人员将能够在可获得相同效果的范围内调节CAR-T细胞的浓度。处方可能会受到各种因素的影响，如制剂方法，给药方式，患者年龄，体重，性别，发病率，食物，给药时间，给药途径，排泄率和反应敏感性。

也可与缓冲剂，例如磷酸盐缓冲溶液或醋酸钠缓冲溶液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苯甲醇、苯酚和抗氧化剂组合。制备的注射溶液通常装入合适的安瓿中。

悬浮液和乳液可包含例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌肉内注射的悬液或溶液与活性化合物一起是医药上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)，以及(如有必要)适量的盐酸利多卡因。

根据本发明的药物组合物可以给予对象可以例如通过静脉注射(丸剂注射)或连续输注给予对象。例如，根据本发明的药物组合物可在至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少7天，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少3个月，至少6个月，或按照临床判断确定的间隔连续或以指定时间间隔给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或至少5次。可注射制剂可以安瓿形式或具有多剂量容器的单位剂型配制。然而，本领域普通技术人员将理解地是，根据本发明的药物组合物的剂量可取决于各种因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和先前的治疗史。

在本发明中，术语“癌症”是指由异常、不受控制的细胞生长引起的众多疾病或紊乱中的任何一种。可能致癌的细胞称为癌细胞，其具有不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖等独特的类型特征。通常，癌细胞可能以肿瘤的形式存在，但这种细胞可能在哺乳动物中单独存在，也可能是非肿瘤细胞，如白血病细胞。癌症可通过以下检测：通过检测肿瘤存在的临床或放射学方法；通过检测肿瘤细胞或通过活检等方式获得的其他生物样品；通过检测癌症血液标志物，如CA125、PAP、PSA、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、LDH和NSE；或通过检测癌症标志物基因型，如TP53和ATM。然而，上述方法的阴性发现并不一定意味着非癌症诊断：例如，一个被发现已经从癌症中完全康复的受试者仍然可能患有癌症，正如以复发形式所证实的那样。

在本说明书中，术语“约”可指本领域常用的范围，例如，在平均值的2个标准偏差内。约摂可理解为在所示值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％之内。

在本发明中，“给药/给予”意指将特定物质引入患者中；可以以任何合适的方式进行给药/给予，使得包含本发明抗体的组合物的给药途径可以通过任何通用途径给药，只要其能够到达靶组织。给药/给予可以通过腹膜内给药/给予，静脉内给药/给予，肌肉内给药/给予，皮下给药/给予，皮内给药/给予，口服给药/给予，局部给药/给予，鼻腔给药/给予，肺部给药/给予或直肠给药/给予，但不限于此。但是，在口服给药/给予的情况下，因为蛋白质将被消化，所以期望以包被活性剂或防止其在胃中降解的方式配制口服组合物。

另外，可以通过其中活性物质能够迁移到靶细胞的任何装置来给予药物组合物。

在本发明的一个实施方式中，癌症可以是实体癌或血液癌。更具体地，在本发明的一个实施方式中，通过根据本发明的药物组合物的方法有可能治疗癌症，诸如食道腺癌，结肠直肠癌，黑素瘤，眼黑素瘤，小细胞肺癌，神经母细胞瘤，畸胎瘤，胎儿癌，鳞状细胞癌，头颈鳞状细胞癌，胸腺瘤，淋巴细胞性白血病，B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，白血病，急性髓细胞性白血病等。

本发明的另一个实施方式公开了治疗癌症的方法，所述方法通过向患有癌症的患者给予药物组合物进行。药物组合物包含CD8+ T细胞，或包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，或者包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；基于细胞数目的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比例基本上为1:1。

本发明的一个实施方式公开了一种制造用于治疗癌症的具有修饰的嵌合抗原受体(CAR-T)的T细胞的方法，其包含用核酸感染T细胞的步骤，所述核酸编码抗原结合分子，所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

如在本申请中所用，“构建体”通常指自然界中不存在的组合物。可以通过合成技术(例如，重组DNA的产生和表达)或通过用于核酸或氨基酸的化学合成技术来制备构建体。也可以通过将一种物质添加或结合到另一种物质来制成构建体，从而使结果成为自然界中不存在的形式。

实践实施例1：小鼠源性抗MVR抗体的人源化

小鼠抗MVR抗体(WO2015-133817A1)的人源化抗体生产被设计成两种形式，低亲合力和高亲合力，用于亲合力优化。

1.1重链可变区的人源化

为了选择用于产生人源化抗体的VH的人抗体框架，使用具有类似于小鼠抗MVR抗体(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAV40168.1)序列的Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins')VH框架。

基于此，通过kabat编号定义VH的3个CDR，并且使用选定的人抗体框架和已定义的抗MVR抗体的CDR的组合对VH的低亲合力形式(huMVR.H1，序列编号10)进行测序。

此外，通过回向突变huMVR.H1(huMVR.H2，序列编号7)的VH27、VH29、VH48、VH67、VH71、VH73、VH78生产VH的高亲合力形式(图1)。

1.2轻链可变区的人源化

为了选择用于产生人源化抗体的VL的人抗体框架，选择了已知具有优异稳定性的曲妥珠单抗(US 5821047 A，序列编号25)的VL框架。在此基础上，通过kabat编号定义VL的3个CDR，并将所选的人抗体框架和已定义的抗MVR抗体的CDR组合，并且为了引入人共有序列，通过将VL24中的K突变为RV，将VL48中的I突变为L，将VL53中的S突变为R，将VL56中的T突变为S，将VL66中的R突变为G，将VL71中的F突变为Y，将VL100中的Q突变为G(huMVR.L1序列编号11)由“hu4D5框架-抗MVR CDR组合”产生低亲合力形式的VL。此外，由“hu4D5框架-抗MVR CDR组合”分开地回向突变VL49、VL69和VL71，并通过将VL66中的R突变为G产生高亲合力形式的VL(huMVR.L2序列编号8)(图2)。

设计的人源化抗体基因是huMVR.L1H1(huMVR.L1和huMVR.H1)(序列编号10、序列编号11、序列编号12)，huMVR.L2H2(huMVR.L2和huMVR.H2)(序列编号7，序列编号8，序列编号9)用2种抗体产生。具体地，在scFv形式的VL-(G₄S)₃-VH in pOptivec(英杰公司(Invitrogen))质粒(动物细胞表达载体)制备两种人源化的抗体，并并将6X His标签与c-末端偶联来制备基因。使用Expi293表达系统(英杰公司)以scFv形式表达引入了该基因的质粒，并使用AktaPure纯化器(GE医疗公司(GE Healthcare))和HisTrap柱(GE医疗公司)进行纯化。

实践实施例2：血液癌细胞系的亲合力分析

在FACS样品管(Falcon公司，目录号352052)制备PBMC衍生的B细胞淋巴瘤类淋巴母细胞细胞系，各样品1×10⁵细胞，然后用Expi293F细胞(英杰公司，A14527)产生的muMVRscFv、huMVR.L1H1 scFv(低结合剂)和huMVR.L2H2 scFv(高结合剂)以0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL处理，并将各样品在4℃下孵育15分钟。之后，将3mL洗涤缓冲液(0.5％FBS，0.1％叠氮化钠在PBS中)添加到各样品管中。将各样品以2000rpm离心5分钟，去除上清液，并以1:200稀释比例添加藻红蛋白偶联的抗His抗体(白乐津公司(BioLegend)，目录362603)，以达到200μL总体积。所有样品在4℃下孵育15分钟。

之后，将3mL洗涤缓冲液(0.5％FBS，0.1％叠氮化钠在PBS中)添加到各样品管中，各样品以2000rpm离心5分钟，并去除上清液。将4％多聚甲醛(Biosessang，P2031)稀释至1％后，通过向各样品中添加200μL来固定细胞；用FACS Celesta装置(BD生物科学公司(BDBiosciences))分析固定的样品。

人源化抗体scFv的2种物质(huMVR.L1H1、huMVR.L2H2)以剂量依赖性方式与细胞中表达的靶抗原结合，并且huMVR.L2H2在抗体浓度为1μg/mL时表现出与小鼠MVR scFv类似的亲合力，而huMVR.L1H1的亲合力很低(图3)。

实践实施例3：用于优化人源化抗体亲和力的亲合力热点预测

为了制备两种人源化抗体之间具有各种结合亲合力的突变体，基于小鼠MVR抗体预测了亲和力热点。使用瑞士-模型(Swiss-model)进行分子建模(https://swissmodel.expasy.org/)(图4)，基于两种人源化抗体的亲和力分析的结果，并且选择重链可变区框架中的2个亲和力热点(VH27，VH71)和轻链可变区CDR中的亲合力热点(VL91，VL92)(表1)。使用huMVR.L2H2作为模板，针对4个亲和力热点制备了15个scFv型的单突变体(single-mutant)物质，并以与上述相同的方式进行表达和纯化。

[表1]

热点	突变氨基酸
		VH_27F	Y,L,G
VH_71K	H,L,V
		VL_91Y	F,S,V,W,A
VL_91W	F,Y,L,A

实践实施例4：应用于亲和力热点突变的15个突变体的亲和力分析

在FACS样品管(Falcon公司，目录号352052)制备PBMC衍生的B细胞淋巴瘤类淋巴母细胞细胞系，各样品1×10⁵细胞，然后用Expi293F细胞(英杰公司，A14527)产生的muMVRscFv或huMVR.L2H2或15种突变体以0.1μg/mL处理，并将各样品在4℃下孵育15分钟。之后，将3mL洗涤缓冲液(0.5％FBS，0.1％叠氮化钠在PBS中)添加到各样品管中。将各样品以2000rpm离心5分钟，去除上清液，并以1:200稀释比例添加藻红蛋白偶联的抗His抗体(白乐津公司，目录362603)，以达到200μL总体积。所有样品在4℃下孵育15分钟。之后，将3mL洗涤缓冲液(0.5％FBS，0.1％叠氮化钠在PBS中)添加到各样品管中，各样品以2000rpm离心5分钟，并去除上清液。

将4％多聚甲醛(Biosessang，P2031)稀释至1％后，通过向各样品中添加200μL来固定细胞，并用FACS Celesta装置(BD生物科学公司)分析固定的样品。

15种huMVR.L2H2(序列编号9)突变体scFv对LCL细胞表现出各种亲合力，其中huMVR.L2H2.F27L、huMVR.L2H2.K71H、huMVR.L2H2.Y91F、huMVR.L2H2.Y91W具有相比muMVR和huMVR.L2H2(序列编号9)逐渐降低的亲和力(图5)。

实践实施例5：构建CAR_euCD137

在本发明中，为了增加在胞质信号结构域4-1BB中的免疫学效力，将euCD137(4-lBB aa209-255，序列编号14)(其中5个氨基酸(4-1BB aa 209-213)被添加到4-1BB胞质结构域214-255aa(序列编号3)中)用于CAR-T中，作为共刺激信号因子，以新构建CAR表达载体(CAR_euCD137)(Kwon等,(1989)《细胞免疫学》(cellular immunology)121:414-422，Kwon等,(1998)生物化学与生物物理研究通讯(Biochemical and biophysical researchcommunication)242:613-620)。完整的构建体包含抗CD19或huMVR.L2H2抗MVR结合结构域，其是scFv，包括EFIα启动子，铰链区和跨膜结构域(人CD8)，和细胞内信号转导结构域。特别地，胞内信号转导结构域由刺激结构域和共刺激信号转导结构域组成。对于跨膜结构域，T细胞受体的α、β或ζ链，或CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的一个或多个，但不限于此。其中，本发明使用了CD8。胞内信号转导结构域基本上是CD3ζ主要信号转导结构域中的共刺激信号转导结构域，选自：CD28、OX40、CD27、ICAM-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD 137)和4-1BB 5aa(euCD137)。本发明使用了4-1BB(添加了5个连续氨基酸的共刺激信号结构域)，其与CD3ζ连接。将最终产生的CAR基因片段与用BamHI和Sal I切割的ELPS慢病毒表达载体偶联。另外，使用BamHI/Nhe I限制性酶进行克隆，以仅替换scFv部分(图6)。

另外，嵌合抗原受体(huMVR CAR)经制备以包含2种类型的胞质信号结构域(4-1BB，CD3ζ)用于T细胞活化，使用huMVR.L2H2，一种经开发以使基于小鼠MVR抗体的免疫原性最小化的MVR人源化抗体(huMVR)，其为适合CAR-T治疗开发的scFv。具体地，在本发明中，为了增加对胞质信号转导域4-1BB的免疫学功效，其中添加了5个连续氨基酸RFSVV的构建体(MVR CAR_euCD137)包含EF1α启动子，并且不仅包含scFv huMVR.L2H2抗MVR偶联结构域，还包含CD8铰链区和跨膜结构域，和euCD137和胞内信号转导结构域。

实践实施例6：重组huMVR慢病毒产生

用于产生重组慢病毒的293T细胞培养物包含这样的培养基，所述培养基包含在高葡萄糖DMEM(Welgene公司，LM001)中的10％FBS(密理博公司(Millipore)，TMS-013-BKR)和1×P/S(吉布可公司(Gibco)，15140-122)。293T细胞在包含10％FBS的DMEM培养基中孵育24小时，然后在37℃ 5％CO₂培养箱中转导。第二天，为了进行转染，将转染试剂和四个慢病毒质粒以适当比例混合，并孵育48小时。然后收集含有慢病毒的上清液，并以400xg离心10分钟。此外，使用50mL注射器，用0.45μm注射器过滤器过滤上清液。将获得的上清液与慢病毒富集试剂盒(克隆泰克公司(Clontech)，631231)以3:1混合，并在4℃下反应24-48小时。然后在4℃和4,000rpm下离心2小时以获得病毒，将其重悬浮于不包含FBS的0.5mL RPMI(Welgene公司，LM001-01)中以产生慢病毒。

6.1:使用与嵌合抗原n末端偶联的标签检查感染的慢病毒颗粒的数量

通过使用Jurkat细胞分析具有实际转导能力的慢病毒的颗粒计数来测量转化单位(TU/mL)。在第一天，将Jurkat细胞以每孔1×10⁵细胞/100μL接种到96孔板中。第二天，将慢病毒在96孔板上连续稀释1/3，然后对已经接种的Jurkat细胞进行慢病毒转导。此时，通过将聚凝胺(密理博公司)引入RPMI培养基(10％FBS和1x P/S)，慢病毒的转导被进一步提高。在以1200xg和25℃离心2小时后，细胞在37℃ 5％CO₂培养箱中孵育3小时，每孔仅添加100μL RPMI。在第5天，用抗标签-DYKDDDDK(白乐津公司，目录号637310)将感染到细胞中的慢病毒的标签染色，用流式细胞仪分析转导的细胞的百分比。使用该方法，如Follenzi和Naldini，2002(Follenzi和Naldini，2002)所述计算效价，结果为1.4×10¹⁰TU/mL。

实践实施例7：T细胞解冻和活性

将冷冻的外周血单核细胞(PBMC)在37℃恒温浴中解冻5分钟，并用RPMI1640悬浮。然后以1500rpm离心5分钟，并去除上清液。使用CD4微珠(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec)，130-045-101)和CD8微珠(美天旎生物技术公司，130-045-201)分离T细胞。对于分离CD4，CD8 T细胞的方法，参考CD4，CD8微珠方案(DS_130-045-101，DS_130-045-201)。

使分离的细胞的细胞密度达到1x10⁶细胞/mL后，添加CAR-T培养基(IL优化剂(Optimizer)CTS基础培养基+26mL优化剂CTS+50mL CTS免疫细胞SR+10mL青霉素链霉素+10mL GlutaMAX-1)，并以20IU/mL添加IL-2。此外，每1×10⁶细胞添加10μL T细胞TransAct(美天旎生物技术公司，130-111-160)，置于T75培养瓶或24孔板中，并在培养箱(37℃ 5％CO₂)中孵育2天(图8)。

实践实施例8：CAR转导和CAR-T细胞孵育

将活化2天的T细胞以每24孔板每1孔2×10⁶细胞添加，并添加感染复数(MOI)为1-3的具有CAR基因的慢病毒。添加硫酸鱼精蛋白(产品编号ADR301)并悬浮至终浓度10μg/mL。将24孔板在400xg和32℃下离心2小时，然后将细胞悬浮于20mL CAR-T培养基(IL-2 200IU/mL)中，将其置于T75培养瓶中并在培养箱(37℃ 5％CO₂)中孵育2天。2天后，采集细胞计数，并将细胞密度设定为0.5×10⁶细胞/mL，并将细胞添加到CAR-T培养基，而对于孵育肉汤的总量，IL-2以200IU/mL的浓度添加。如果细胞密度低于0.5×10⁶细胞/mL，那么相对于培养肉汤的总量添加200IU/mL IL-2，而不添加CAR-T培养基。之后，每两天采集一次细胞计数，并以0.5×10⁶细胞/mL的参照细胞密度添加CAR-T培养基(IL-2 200IU/mL)。在孵育开始后7-14天之间收获CAR-T细胞(图7)。

实践实施例9：细胞毒性实验

通过基于荧光素酶的试验分析CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性。用携带荧光素酶基因的EBV病毒感染靶细胞，从而产生携带荧光素酶基因的靶细胞。与效应细胞的共培养在37℃下以效应物与靶标(E/T)的比例进行24小时。共培养并然后用CytoTox-Glo细胞毒性(普洛麦格公司(Promega)，G9290)试剂处理后，用Fluroskan FL微板光度计(Thermo公司)测量活靶细胞的RLU值。

更具体地说，在96孔白色平底板(COSTAR，3917)中设三重复制备，其中效应细胞为4.5×10⁵细胞/50μL，E/T比例为3：1，基于靶细胞数为1.5×10⁴细胞，并稀释1/3以制备E/T比为3:1、1:1、0.3:1和0.1:1。在用效应细胞准备的各孔中，靶细胞的1.5×10⁴细胞(50μL)在培养箱(37℃，5％CO₂)中共培养18-24小时，然后添加100μL CytoTox-Glo细胞毒性(普洛麦格公司，G9290)并避光，5分钟后，用Fluroskan FL微板光度计(Thermo公司)测量发光值。

因此，经确认的是huMVR CAR-T在3:1的比例表现出95.4％的细胞毒性活性(图8)。

实践实施例10：细胞系孵育

将国家癌症中心(National Cancer Center)分配的CBKLCL-Luc和KHJ LCL-Luc(以下称LCL-Luc)细胞系在20％胎牛血清(FBS，密理博公司，目录号TMS-013-KBR)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司，目录号15140-122)的RPMI1640培养基(Welgene公司，目录号LM011-01)中孵育。

实践实施例11：引入了CD19CAR和CD19CAR_euCD137的CD19CAR-T细胞的两种类型的验证

为了提高免疫效力，分别制备了CD19CAR(序列编号17，US8906682序列编号12)和CD19CAR_euCD137(序列编号18)，其中用euCD137替代了CD19CAR中的4-1BB结构域，并用CD19CAR-T细胞进行了培养，从而验证具有euCD137(4-1BBaa209-255，序列编号14)作为共刺激信号转导因子的CAR表达载体(CAR_euCD137)的新建立的功效。

进行FACS染色以确认14天孵育后两种CAR-T细胞的生产比例。对于各种CAR-T细胞类型，在FACS管(FALCON公司，目录号352052)中收集2×10⁵个细胞，然后添加2mL的FACS缓冲液，并使用离心机(Thermo公司，ST16)以2,000rpm离心5分钟。丢弃上清液后，添加0.5μL/管的抗CD8APC(SKI，百乐津公司，目录号344722)，0.5μL/管的抗CD4 BV650(RPA-T4，百乐津公司，目录号300536)和0.125μL/管的抗标签PE(L5，百乐津公司，目录号637310)，并在室温下染色30分钟。添加2mL的FACS缓冲液并以2,000rpm离心5分钟后，重复该过程1次。为了对活/死细胞进行染色，添加1μL/管7-AAD(百乐津公司，目录号420404)，并将混合物置于室温5分钟，然后使用FACS(BD公司，FACSCelesta)进行分析。

在皮下动物模型中证明使用CAR构建体(CD19CAR_euCD137，序列编号18)(其中将euCD137(氨基酸209-255，序列编号14)为添加了五个氨基酸的4-1BB结构域(氨基酸214-255，序列编号13))和常规构建体(CD19CAR，序列编号17，US8906682序列编号12)的CD19CAR-T的作用之前，使用在实践实施例2中开发的方法验证了CAR-T细胞的比例。使用FACS染色来确认产生的CD19 CAR-T细胞的比例确认了在改良构建的CD19 CAR-T细胞(5aa CD19CAR-T)的情况下，细胞比率为CD4+/CAR+为29.4％，CD8+/CAR+为50.8％和总CAR-T为80.2％。经确认的是，对于未经改良构建的CAR-T细胞(CD 19 CAR-T)，细胞比率为CD4+/CAR+为42.7％，CD8+/CAR+为29.3％，和总CAR-T为72.0％。

因此，经确认的是5aa CD19 CAR-T细胞相比CD19 CAR-T细胞的CAR表达高8.2％，并且CD8+/CAR+细胞为21.5％，或约2倍之多(图9-A)。

实践实施例12：确认产生的CD19CAR-T细胞的细胞毒性

为了确定培养14天的两种CAR-T细胞类型的细胞毒性，将CAR-T(E):LCL(T)比例设定为在96孔白板中(Corning，目录号3917)为30:1、10:1、3:1和1:1。首先，将CAR-T细胞分别以6×10⁵细胞/50μL、2×10⁵细胞/50μL、9×10⁴细胞/50μL和2×10⁴细胞/50μL置于孔中。然后，将靶细胞系，即CBK LCL-Luc细胞系，添加到37℃ CO₂培养箱(Mammert公司，INCO153med)中的2×10⁴细胞/50μL中，并反应4小时。4小时后，将100μL的Bright-Glo^TM(普洛麦格公司，目录号E2620)添加到各孔中，并在5分钟后，使用ELISA(Thermo公司，Fluorescan FL)测量相对光单位(RLU)值。

发现在引入常规4-1BB的CART和引入euCD137的CAR-T细胞之间，细胞毒性没有差异，所述euCD137包含向4-1BB结构域添加的五个氨基酸。

作为该实验的结果，当两种CAR-T细胞和CBK LCL-Luc细胞系以30:1的比例共同孵育时，发现它们的细胞毒性在4小时后为约80％，而当它们以10:1孵育时，细胞毒性为约50％。随着与癌细胞孵育的CAR-T细胞各自的数量减少了3倍，细胞毒性下降了约3倍；此外，当在向4-1BB结构域体外添加5个氨基酸时，证实其不影响细胞毒性(图9B)。

实践实施例13：细胞系中HLADR表达确认和HuMVR L2H2 scFv亲合力测试

使用培养的LCL-Luc细胞系进行FACS分析，从而验证细胞系中HLADR的表达并测试开发的huMVR L2H2 scFv的亲合力。在将2×10⁵细胞的LCL-Lu细胞仪转移到FACS管后，添加2mL的FACS缓冲液并使用离心机以2,000rpm离心5分钟。弃去上清液后，以0.5μL/管添加抗HLADR APC-H7(G46-6，BD pharmigen^TM目录号561358)，并以1.0μg/管添加自产MVR L2H2，并在室温下进行30分钟染色。添加2mL的FACS缓冲液用于洗涤，然后以2,000rpm进行离心5分钟，并弃去上清液。再次重复该步骤。为了对huMVR L2H2 scFv进行二次染色，添加1μL/管的抗His PE(百乐津公司，目录号362603)，并在室温下进行30分钟染色。然后将使用FACS缓冲液的洗涤过程重复两次，并添加100μL FACS缓冲液，然后使用FACS进行分析.

进行FACS染色和分析，以确认癌细胞中HLA DR(其为huMVR L2H2的靶标)的表达和huMVR L2H2 scFv的亲合力。

LCL-Luc细胞系中的HLA DR表达的确认表明表达了100％的HLA DR。因此，当使用huMVR L2H2 scFv进行亲合力测试时，确认了与表达的HLA DR的结合为至少97％(图10)。

实践实施例14：通过自动卡尺和IVIS成像诱导皮下动物模型并验证CAR-T

对于实验动物，使用NSG(NOD-scidIL2rγμL1)小鼠(杰克逊实验室公司(TheJackson Laboratory))，并在动物保育室中在恒定条件下对其进行管理。温度为23±2℃，光照/黑暗周期12小时，且湿度为50±10％；任意进食饮水。在使用将5个氨基酸添加到4-1BB结构域的CD19CAR-T(5aaCD19CAR-T)的功效实验中，以2×10⁶细胞/100μLDPBS/头制备CBK LCL-Luc细胞系，并皮下注射到6周龄雌性小鼠，以诱导皮下动物模型。当使用自动卡尺(Youngbio，TM900)测量的癌症大小达到50-100mm³时，将改良构造的CD19 CAR-T细胞和未改良的CD19 CAR-T细胞以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量1)和6×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量2)通过尾静脉给予一次，以确认功效。在下一个实验中，使用构建成在4-1BB结构域中含有5个氨基酸的CAR构建体中表达huMVR的构建体(huMVR CAR_euCD137，图6C)在动物模型中评估huMVR CAR-T细胞的功效。皮下动物模型这样诱导：通过以4×10⁶细胞/100μLDPBS/头向6周龄雌性小鼠皮下注射LCL-Luc细胞。为了确认疗效，当癌症大小达到50-100mm³范围时，以1×10⁶细胞/100μL DPBS/头、2×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量1)和5×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量3)通过尾静脉给予单剂量的MVR CAR-T。在所有动物实验中，定期确认癌症的大小和活力。

更具体地，在CAR-T给予后3和4天的间隔，使用自动卡尺和IVIS成像设备(帕金埃尔默公司(PerkinElmer)，Luna III)测量癌症大小和光子值。在使用TM900的情况下，将设备放置在癌症部位后确定癌症大小。当使用IVIS成像设备确认成像和光子值时，首先小鼠腹膜内给予150mg/kg XenoLight^TMD-荧光素(帕金埃尔默公司，目录号122799)。15分钟后，使用异氟烷诱导吸入麻醉，并在5分钟后，使用IVIS对癌细胞的存在进行成像。成像后，进行标准化，然后确认荧光素酶值(光子值)并作图。

更具体地，在使用CBK LCL-Luc细胞系构建皮下动物模型后，使用IVIS成像比较CD19 CAR-T和5aa CD19 CAR-T细胞的作用。如图11A所示，可以在给予两种CAR-T细胞后1周内确认该作用。

在以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头和6×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予具有CD19CAR_euCD137的CD19 CAR-T的实验组中，在给药后1周在IVIS成像上观察癌细胞。此外，在用未改良构建的CD19 CAR-T治疗的组中，当给予6×10⁶细胞/100μLDPBS/头时，在给药1周内罕有成像观察到癌细胞。然而，1周后，在给予未改良的CD19 CAR-T的实验组中发现了癌细胞。

CAR-T给药后1周，如成像中所示，确定成像过程后各对象中成像的萤光素酶的值；仅在以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予CD19 CAR-T的组中确认了荧光素酶值。当此后3周或更长时间观察时，肿瘤在没有给予CAR-T细胞的小鼠中继续生长，并且在癌细胞最初消失的三个实验组中没有发现癌细胞。然而，10天后，接受2x10⁶细胞/100μL DPBS/头的CD19CAR-T的组中的荧光素酶水平降低，但是癌细胞在3周后并未完全消失。当以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予改良构建的5aa CD19 CAR-T时，通过对癌细胞进行实验成像发现，其功效与以6×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予CD19 CAR-T的治疗组相似。结果表明，5aa CD 19CAR-T和CD 19 CAR-T的体外细胞毒性没有差异，但是已确认动物模型中5aa CD19 CAR-T的功效是其5倍更优(图11)。

实践实施例15：确认在4-1BB结构域具有5个添加氨基酸的CD19 CAR-T在体内动物模型中的比例

在皮下动物模型中给予CAR-T细胞以验证改良构建的CAR-T细胞的效力后，由小鼠血液确认CAR-T的存在。

更具体地，在给予CAR-T后的3和4天间隔从小鼠进行眼眶血液采集。在每次血液收集时，收集70μL血液，并使用60μL血液来确认CAR-T细胞的比例和细胞计数。将60μL血液置于5mL FACS管中，并使用Zombie Aqua BV510(百乐津公司，目录号423101)进行活/死细胞染色。浓度达到0.1μL/100μL DPBS/管后，在室温下进行10分钟染色。自添加计数珠(分子探针公司(Molecularprobes)，目录号C36950)、抗CD45 FITC(HI30，百乐津公司，目录号304006)、抗CD8 BV786(SK-1，百乐津公司，目录号344740)、抗CD4 BV650和抗标签PE，在室温下染色30分钟。将各种抗体混入0.5μL/100μL FACS缓冲液/管中，并向其中添加25μL计数珠。30分钟后，添加2mL的IX RBC裂解缓冲液(百乐津公司，目录号422401)，并在室温下反应5分钟。使用离心机以2,000rpm离心5分钟后，弃去所有上清液。

将2mL的FACS洗涤缓冲液添加到该管中，并以2,000rpm离心5分钟。再重复该过程一次，然后添加50μL FACS缓冲液并使用FACS分析。

在CAR-T细胞给予后1周，在5aa CD19 CAR-T治疗组中，在2x10⁶细胞/100μL DPBS/头和6×10⁶细胞/100μL DPBS/头组的血液中确认5aa CD19 CAR-T细胞为20％；但在给予CD19 CAR-T的组中，当给予6×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予时，确认了CD19 CAR-T仅为5％。3天后，小鼠体内CAR-T细胞的数量和比例达到最大并降低。在一周内，在其中鉴定出CAR-T细胞(5aa CD19 CAR-T；2×10⁶细胞/100μL DPBS/头和6×10⁶细胞/100μL DPBS/头，CD19 CAR-T；6×10⁶细胞/100μL DPBS/头)的3个实验组中，癌细胞被快速杀死，因为它们有可能在它们在小鼠体内增殖之前接触到相对较多的CAR-T细胞。然而，在以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予CD19CAR-T的实验组中，CAR-T细胞的比例和数量在2周时达到最大值，并且CAR-T比例约为25％，伴随癌细胞增殖相对良好。改良构建的5aa CD 19 CAR-T的在数量上比CD19 CAR-T更稳定，CAR-T比例最初增加，后来下降。然而，在CD 19 CAR-T的情况下，CAR-T细胞的比例在后续时间增加或减少，因此肿瘤在小鼠体内消失所需的时间更长。因此，如该实验的结果所示，以2x10⁶细胞/100μL DPBS/头给予5aa CD19 CAR-T的组在小鼠中表现出与以6x10⁶细胞/100μL DPBS/头给予的组相似的CAR-T水平和作用，这表明5aa CD19CAR-T具有更好的效果(图12)。

实践实施例16：腹膜内动物模型的诱导和在腹膜内动物模型中评估CD8和CD4/CD8huMVR CAR-T(CAR_euCD137)的功效

用于诱导腹膜内动物模型的实验动物与实践实施例14中使用的动物相同，并且在相同条件下进行管理。使用改良的CAR构建体(CAR_euCD137)构建CD8 huMVR CAR-T和CD4/CD8 huMVR CAR-T，并在腹膜内动物模型中评估功效。为了诱导腹膜内动物模型，通过腹腔以2×10⁶细胞/100μL DPBS/头给予表达荧光素酶的LCL-Luc细胞系，并在9天后，根据光子值将动物分为五组。分如相应组后，通过注射到尾静脉中分别为0.5×10⁶细胞/100μLDPBS/头(剂量1)、2.0×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量2)和10×10⁶细胞/100μL DPBS/头(剂量3)的CD4和CD8 huMVR CAR-T来给予CD8 MVR CAR-T。在所有动物实验中，定期检查癌症的大小和活力。特定实验方法与实施例14中所述的相同。

在将与CD4和CD8与分离自健康成年人血液的PCMC分离后，在修饰的CAR构建体中表达了huMVR scFv，并使用huMVR CAR-T在腹膜动物模型中进行了功效评估。huMVR CAR-T的功效通过表达荧光素酶的癌细胞的成像和光子值进行评估。

在使用IVIS成像设备每周检查2次后，在实验组中CAR-T给予27天后，所有其中存在癌症且未给予CAR-T的对照组小鼠死亡。然而，所有其中形成癌症并给予huMVR CAR-T的个体存活至少27天。在以低剂量(0.5×10⁶细胞/100μL DPBS/头)给予CD8 huMVR CAR-T的组中，肿瘤显示出减少的趋势，然后在10天后再次增加；以中剂量(2.0×10⁶细胞/100μLDPBS/头)给予CD8 huMVR CAR-T的组到第27天显示出光子值缓慢下降的趋势。然而，当以高剂量(10.0×10⁶细胞/100μL DPBS/头)给予CD8 huMVR CAR-T时，确认所有癌症在13天后消失。此外，当以低剂量给予CD4和CD8 MVR CAR-T时，确认到第27天左右，癌症在大多数的小鼠(5只小鼠中的3只)中消失了，尽管不如高剂量的CD8 huMVR CAR-T有效。因此，该实验表明，huMVR CAR-T在中剂量或更高剂量下具有作用，并且当与CD4一起而不是与CD8单独使用时，即使是使用较小剂量的CAR-T也具有该作用(图13)。

实践实施例17：皮下动物模型中CD4/8 huMVR CAR-T功效的评估

在实践实施例13中，确认在构建MVR CAR-T时使用CD4和CD8 T细胞一起产生huMVRCAR-T在用于动物实验中时更有效。根据上述实例，产生CD4/CD8 huMVR CAR-T并以低、中和高剂量给予，并使用皮下动物模型评估CAR-T的功效。

当用自动卡尺检查癌症生长时，在用高剂量(5.0×10⁶细胞/100μL DPBS/头；剂量3)处理的组中，癌症生长在第10天减慢，癌症生长在第14天逆转，并且大多数癌症在第17天消失。如图14A所示，在第21天成像中难以确认癌症。即使在给予中剂量(2.0×10⁶细胞/100μL DPBS/头；剂量2)和低剂量(1.0×10⁶细胞/100μL DPBS/头；剂量1)的组中，癌症生长在CAR-T给予后的第17天开始减慢，并且癌症从第21天减少。然而，因为使用了成像设备，一些个体中的癌细胞在体内存留超过4周，并且虽然在中和低剂量中显示出该效果，但是相较于高剂量而言，该效果较慢。当通过IVIS成像对癌细胞进行成像时，虽然通过皮下给予诱导了肿瘤模型，但是随着时间的流逝，已确认癌症已经扩散到了淋巴结。然而，当给予MVR CAR-T时，所有转移性癌细胞被杀死。

(图15)此外，当通过该实验确认通过huMVR CAR-T给药的动物模型的活力时，对照组小鼠组中未给予CAR-T的所有小鼠在第18天死亡，但是在给予MVR CAR-T的组中全部存活。(图16)。

实践实施例18：动物模型中CD4/8MVR CAR-T的体内鉴定

对获自实施例17中使用的小鼠的血液进行血液分析，以确认动物体内存在的CAR-T的比例和数量。血液分析表明，确认CAR-T在给予CAR-T 3天后的个体中的比例较低，而高剂量组在10天后CAR-T的数量从7％快速增长到31％。这是癌症大小和光子值在MVR高剂量组中下降的原因。此外，在中剂量和低剂量的huMVR CAR-T的情况下，从给药后第17天起，CAR-T比例增加，并且从第21天起，癌症大小和光子值减小(图17)。

[表2]

序列编号	信息
		1	huMVR.H2重链的CDR1
2	huMVR.H2重链的CDR2
		3	huMVR.H2重链的CDR3
4	huMVR.L2轻链的CDR1
		5	huMVR.L2轻链的CDR2
6	huMVR.L2轻链的CDR3
		7	huMVR.H2重链的可变区
8	huMVR.L2轻链的可变区
		9	huMVRL2H2的scFv
10	huMVR.H1重链的可变区
		11	huMVR.L1轻链的可变区
12	huMVRL1H1的scFv
		13	4-1BB信号转导结构域
14	euCD137
		15	MVR.L2H2 CAR
16	MVR.L2H2 CAR_euCD137
		17	CD19 CAR
18	CD19 CAR_euCD137
		19	EF1a-启动子
20	CD8-α引导序列
		21	标签
22	CD19scFv
		23	CD8/铰链/跨膜序列
24	CD3z
		25	土拨鼠(Woodchuck)/PRE
26	R/区

例如，为了构建权利要求的目的，并不打算以比其文字更窄的方式来解释下面陈述的权利要求，因此也不打算将说明书中的示例性实施例读入权利要求。因此，应当理解，本发明是通过说明而不是通过限制权利要求的范围来描述的。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有出版物、已授权专利、专利申请、书籍和期刊文章均通过引用整体并入本申请。

序列表自由文本

1.huMVR.H2重链的CDR1

2.huMVR.H2重链的CDR2

3.huMVR.H2重链的CDR3

4.huMVR.L2轻链的CDR1

5.huMVR.L2轻链的CDR2

6.huMVR.L2轻链的CDR3

7.huMVR.H2重链的可变区

8.huMVR.L2轻链的可变区

9.huMVRL2H2的scFv

10.huMVR.H1重链的可变区

11.huMVR.L1轻链的可变区

12.huMVRL1H1的scFv

13. 4-1BB信号转导结构域

14.euCD137

15.MVR.L2H2 CAR的序列

16.MVR.L2H2 CAR_euCD137的序列

17.CD19 CAR的序列

18.CD19CAR_euCD137的序列

19.EF1a-启动子

20.CD8-α前导序列

21.标签

22.CD19scFv

23.CD8/铰链/跨膜序列

24.CD3z

25.土拨鼠(Woodchuck)/PRE

26.R/区

<110> 优特力克斯有限公司（EUTILEX CO., LTD.）

<120> 结合HLA-DR的嵌合抗原受体和CAR-T细胞

<130> 18OP08010PCT

<150> US 62/717267

<151> 2018-08-10

<150> US 62/867503

<151> 2019-06-27

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.H2重链的CDR1

<400> 1

Arg Tyr Ser Val His

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.H2重链的CDR2

<400> 2

Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.H2重链的CDR3

<400> 3

Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.L2轻链的CDR1

<400> 4

Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.L2轻链的CDR2

<400> 5

Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.L2轻链的CDR3

<400> 6

Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.H2重链的可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.L2轻链的可变区

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVRL2H2的scFv

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr

210 215 220

Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.H1重链的可变区

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVR.L1轻链的可变区

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huMVRL1H1的scFv

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Trp Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr

210 215 220

Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 13

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB信号转导结构域

<400> 13

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 14

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> euCD137

<400> 14

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

<210> 15

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MVR.L2H2 CAR的序列

<400> 15

gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60

atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca 120

ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct 180

cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag 300

ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360

ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 420

tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg 480

cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac 540

tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg 600

tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat 660

gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc 720

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgctagc 780

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 960

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1020

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1080

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1140

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1200

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1260

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1320

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1380

caggccctgc cccctcgcta a 1401

<210> 16

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MVR.L2H2 CAR_euCD137的序列

<400> 16

gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60

atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca 120

ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct 180

cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag 300

ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360

ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 420

tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg 480

cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac 540

tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg 600

tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat 660

gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc 720

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgctagc 780

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgtt tctctgttgt taaacggggc 960

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1020

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1080

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1140

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1416

<210> 17

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 CAR的序列

<400> 17

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgctagccag 780

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 840

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 960

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1020

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1080

gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1140

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1200

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1260

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1320

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1380

gccctgcccc ctcgctaa 1398

<210> 18

<211> 1420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 CAR_euCD137的序列

<400> 18

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgctagccag 780

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 840

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgccgtttct ctgttgttaa acggggcaga 960

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1020

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1080

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1140

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1200

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1260

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1320

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1380

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taagtcgaca 1420

<210> 19

<211> 1184

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF1a-启动子

<400> 19

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360

ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420

cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480

ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540

tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600

gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660

tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720

tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780

caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840

ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900

ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960

tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020

cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080

tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140

agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184

<210> 20

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8-a前导序列

<400> 20

ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60

gccaggccg 69

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 21

gactacaagg acgacgatga caag 24

<210> 22

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19scFv

<400> 22

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 23

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8/铰链/跨膜序列

<400> 23

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgctag ccagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207

<210> 24

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3z

<400> 24

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 25

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 土拨鼠（Woodchuck）/PRE

<400> 25

atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60

cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120

tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180

ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240

gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300

ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360

tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg 420

cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480

atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540

gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct g 591

<210> 26

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R/区

<400> 26

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttca 98

Claims

1.一种抗原结合分子，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

2.如权利要求1所述的抗原结合分子，其包含序列编号7所示的重链可变区和序列编号8所示的轻链可变区。

3.如权利要求1所述的抗原结合分子，其包含序列编号9所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的抗原结合分子，其还包含序列编号13所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的抗原结合分子，其还包含序列编号14所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的抗原结合分子，其还包含跨膜结构域和胞内信号转导结构域，用于活化T细胞。

7.如权利要求6所述的抗原结合分子，其中，所述跨膜结构域选自下组：T细胞受体的α链，T细胞受体的β链，T细胞受体的ζ链，CD28，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，其中所述胞内信号转导结构域是CD3ζ信号转导结构域和共刺激信号转导结构域。

8.如权利要求7所述的抗原结合分子，其中所述共刺激信号转导结构域选自下组：CD28、OXO40、CD27、ICAM-1、CD278和CD137。

9.一种编码权利要求1-8中任一项所述的抗原结合分子的核酸分子。

10.一种包含权利要求9所述核酸分子的表达载体。

11.一种包含权利要求9所述核酸分子的细胞。

12.如权利要求11所述的细胞，其是T细胞。

13.如权利要求12所述的细胞，其中，所述T细胞是CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。

14.如权利要求11所述的细胞，其是嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)。

15.一种药物组合物，用于治疗癌症，其包含权利要求11所述的细胞作为药学有效成分。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述癌症是食道腺癌，结肠直肠癌，黑素瘤，眼黑素瘤，小细胞肺癌，神经母细胞瘤，畸胎瘤，胎儿癌，鳞状细胞癌，头颈鳞状细胞癌，胸腺瘤，淋巴细胞性白血病，B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，白血病，急性髓细胞性白血病等。

17.一种癌症治疗方法，其包括向患有癌症的患者给予包含T细胞的药物组合物的步骤，所述T细胞包含治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的抗原结合分子。

18.如权利要求17所述的癌症治疗方法，其中，所述药物组合物包含CD8+T细胞，或者包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。

19.如权利要求18所述的癌症治疗方法，其中，CD4+T细胞与CD8+T细胞的细胞计数的比例大致为1:1。

20.一种制造用于治疗癌症的具有修饰的嵌合抗原受体(CAR-T)的T细胞的方法，其包含用核酸感染T细胞的步骤，所述核酸编码抗原结合分子，所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含序列编号1所示氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含序列编号2所示氨基酸序列的HCDR2和包含序列编号3所示氨基酸序列的HCDR3；所述轻链可变区包括包含序列编号4所示氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含序列编号5所示氨基酸序列的LCDR2和包含序列编号6所示氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

21.一种治疗性药物组合物，用于治疗癌症，其包含作为药学有效成分的包含权利要求1-8中任一项所述的抗原结合分子的T细胞。

22.如权利要求21所述的治疗性药物组合物，其中，所述药物组合物包含CD8+T细胞，或者包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。

23.如权利要求18所述的治疗性药物组合物，其中，CD4+T细胞与CD8+T细胞的细胞计数的比例大致为1:1。