FR2842811A1 - Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une reponse de type ctl antitumorale ou anti-infectueuse - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une molécule d'intérêt pharmaceutique, de préférence un ligand du Complexe Majeur d'Histocompatibité (CMH) hydrophobe soluble dans des solvants tels que le DMSO, rendu soluble dans un milieu aqueux injectable à l'Homme pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer une réponse immunitaire médiée par des lymphocytes T cytotoxiques. L'invention concerne également l'utilisation de tels peptides mélangés ou couplés à une protéine porteuse pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention de maladie infectieuses ou le traitement des cancers. L'invention a également pour objet de tels peptides, notamment à titre de médicament anti-infectieux ou antitumoral.
Description
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La présente invention a pour objet un procédé général de solubilisation en milieu aqueux d'un peptide hydrophobe, en particulier d'un composé peptidique d'intérêt pharmaceutique comme un ligand du Complexe Majeur d'Histocompatibité (CMH) hydrophobe soluble dans des solvants tels que le DMSO. L'invention a également pour objet de tels ligands du CMH ainsi modifiés notamment à titre de médicament anti-infectieux ou antitumoral et leur utilisation pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer une réponse immunitaire médiée par des lymphocytes T cytotoxiques. L'invention concerne également l'utilisation de tels ligands mélangés ou couplés à une protéine porteuse pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention de maladies infectieuses ou le traitement des cancers.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ce domaine a permis d'étendre le concept de vaccin dans le domaine des maladies auto-immunes et du cancer.
Dans le cadre d'une thérapie anti-virale ou anticancereuse, la génération de réponses CTL et T auxiliaires est de toute importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 2128-2136 ; Borrow P., J. Viral Hepat., 1997,4, 16-24 ; revue de Rivoltini et al., Crit. Rev. Immunol., 1998,18, 55-63), comme l'attestent de nombreuses études montrant in vivo le rôle protecteur des réponses dirigées contre des épitopes viraux (Arvin AM., J. Inf. Dis., 1992,166, S35-S41 ; Koszinowski et al., Immunol. Lett., 1987,16, 185-192).
Les lymphocytes T cytotoxiques reconnaissent des peptides provenant de la dégradation de protéines intracellulaires qui sont présentées par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules.
Après processing des protéines, les peptides CTL sont sélectionnés à partir du pool de peptides cytosoliques sur la base de leur longueur et de leur séquence en acide aminé et transportés vers le réticulum endoplasmique puis associés aux molécules du CMH de classe I. Plusieurs études ont montré que ces peptides naturellement présentés par le CMH de classe # ont en général une longueur de 91 acides aminés et contiennent des résidus d'ancrage spécifiques qui possèdent des propriétés particulières en terme d'hydrophobicité et de charge (Falk K. et al., Nature, 1991, 351:290-296 ; Hunt DF et al., Science, 1992,255:1261-1263). La qualité et la position de ces résidus d'ancrage sont dictées par les poches du sillon de présentation d'antigène spécifiques de chaque allèle du CMH classe # (Matsumara M. et al., Science, 1992,257:927-934)
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suggérant que les résidus d'ancrage sont essentiellement impliqués dans la fixation au CMH de classe I. Cette hypothèse semble confirmée par le fait que toute altération (remplacement, délétion) des résidus d'ancrage de ces peptides CTL abroge la fixation de ceux-ci au CMH classe I, et que toute mutation des molécules de CMH de classe # au niveau des poches de fixation modifie le répertoire des peptides liés (Ruppert J. et al., Cell., 1993, 74:929-937 ; Rohren EM et al., J. Exp. Med., 1993,177: 1713-1721).
Cependant, plusieurs études montrent que des peptides plus longs peuvent accommoder une association aux molécules HLA-A2 (E.J. Collins et al. Nature 1994, 371,626-629 ; Y. Chen et al. J. Immunol., 1994,152, 2874-2881) ou à d'autres molécules HLA de classe I (R.G. Urban et al., PNAS, USA, 1994,91, 1534-1538).
Il a été également montré dans la littérature que des modifications apportées à des épitopes CTL en N-ou C-terminal du peptide, pouvaient soit permettre de conserver l'activité CTL du peptide tout en augmentant sa stabilité (Brinckerhoff L. H. et al., 1999 Int. J. Cancer, 83,326-334 ; Loing E. et al., 2000, J. Immunol., 164,900- 907), soit conduire à une perte totale de l'activité du peptide (Beck et al., 2001, J. Pep.
Res., 57,528-538 ; Widmann et al., 1991, J. Immunol. 147, 3745-3751).
De nombreux ligands du CMH (classes 1 et Il) et notamment des peptides épitopes CTL ont été identifiés (HG Rammensee et al., Immunogenetics, 1999,50 (3- 4), 213-219 ; Sette et al., Immunogenetics, 1999,50, 201-212). L'intérêt de ces ligands du CMH est confirmé par le nombre croissant d'études cliniques chez l'Homme de ces composés en tant que candidats vaccins contre différentes pathologies, notamment contre le mélanome (Jager E. et al., Int. J. Cancer, 2000,86, 538-547 ; M. L. Salgaller et al., Cancer Research, 1996,56, 4749-4757 ; S. A. Rosenberg et al., 1998, Nature Medecine, 4, n 3, 321-327 ; S. R. Reynolds et al., 1998, J. Immunol., 161, 6970-6976), contre HBV (Livingston et al., J.Immunol., 1999,162, 3088-3095) et autres antigènes (revue par C.J.M. Melief and W. M. Kast Immunological Reviews, 1995,146, 167-177).
Toutefois, la difficulté de ces études réside à la fois dans le fait que ces peptides sont très souvent peu immunogènes (Melief et al., 1992, Adv. Cancer Res., 58,143-175 ; Nanda et Sercarz, 1995, Cell, 82,13-17) donc nécessitent la présence d'un porteur et d'un adjuvant, mais également dans le fait qu'ils sont très souvent hydrophobes et nécessitent donc l'utilisation de solvants tels que le DMSO pour leur solubilisation avant leur administration aux patients. La présence de DMSO est très souvent préjudiciable pour la protéine porteuse qui peut précipiter, posant des problèmes de reproductibilité des préparations injectables, ce qui n'est pas tolérable pour un usage pharmaceutique.
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De plus, l'utilisation de DMSO reste problématique surtout lors d'injections répétées au cours des thérapies anticancéreuses. En effet, le DMSO est rarement associé à une forme injectable en raison de ses activités pharmacologiques et toxicologiques non négligeables. Il n'entre dans la composition que de deux spécialités à base d'idoxuridine (C. Heintz et C. Boymond STP PHARMA 5,1989, 548-560).
Notre étude visant à solubiliser des peptides hydrophobes a été menée sur deux peptides CTL modèles décrits dans la littérature comme étant très hydrophobes : le peptide FluM1 58-66 de la protéine de la matrice M1 du virus de la grippe et le peptide ELA 26-35 de la protéine Melan/Mart-1, antigène décrit comme étant associé aux cellules tumorales du mélanome. Ces deux peptides sont décrits ci-dessous.
Le peptide FluM1 56-68 de séquence TKGILGFVFTLTV (SEQ ID No. 1) a été décrit comme épitope CTL restreint HLA-A2 par Gotch et al. (Nature, 1987,326, 881- 882). Cette séquence a été optimisée dans un premier temps par Gotch et al. (J. Exp.
Med., 1988, 168, 2045-2057), qui ont clairement montré que les peptides FluM1 57-68, 58-68,59-68 avaient la même activité CTL que le peptide FluM1 56-68. Bednarek et al. (J. Immunol., 1991,147, 4047-4053) ont également optimisé ce peptide et ont démontré que le peptide FluM1 58-66 GILGFVFTL (SEQ ID No. 2) donnait une réponse CTL 100 à 1000 fois plus importante que le peptide 57-68.
Ce peptide étant très hydrophobe, une étude visant à rendre ce peptide hydrosoluble avait déjà été menée (Bednarek et al., J. Immunol. Meth., 1991, 139, 41- 47). Les auteurs de cet article ont réalisé cette étude sur le peptide FluM1 57-68 moins actif que le peptide FluM1 58-66, en substituant les résidus 58,59, 60 ainsi que les résidus 65,67 et 68 par des acides aminés moins hydrophobes, rendant ce peptide plus hydrosoluble.
Les épitopes CTL dominants issus de l'antigène associé au mélanome Mart-1, restreints HLA-A2 de séquences AAGIGILTV (SEQ ID No. 45) et EAAGIGILTV (SEQ ID No. 46) ont été identifiés par Y. Kawakami et al. (J. Exp. Med. 1994, 180, 347-352).
Le peptide ELA de séquence ELAGIGILTV (SEQ ID No. 47) correspondant au peptide Melan26-35 analogue au décamère parent EAAGIGILTV (SEQ ID No. 46), a été décrit par Valmori D. et al. (International Immunology, Vol. 11 N 12, pp1971- 1979) comme étant un excellent ligant du HLA-A2 et étant capable d'induire une réponse CTL chez la souris A2-Kb supérieure à celle obtenue avec le peptide parent .
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Ce peptide, très hydrophobe est solubilisé et conservé dans le DMSO pour les essais biologiques. Il semble qu'aucune étude visant à améliorer sa solubilité dans les milieu aqueux n'ait été menée.
Les peptides ELA et FluM1 ont déjà été injectés à l'Homme solubilisés dans le DMSO 20 % (Jager E. et al., Int. J. Cancer, 2000,86, 538-547) ou dans le DMSO pur pour ELA (Wang F. et al., Clinical Cancer Research, 1999,5, 2756-2765) lors d'études cliniques réalisées sur des patients atteints de mélanome.
Des études de solubilité ont également été menées avec l'antigène associé aux tumeurs hTERT dérivé de la télomérase.
Ainsi, il reste souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé général permettant de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux, notamment en milieu injectable à l'Homme, d'un composé peptidique de nature hydrophobe. De préférence, ledit procédé doit permettre, le cas échéant, de conserver au moins une part suffisante d'une activité biologique d'intérêt dudit composé hydrophobe.
Plus particulièrement, il reste souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé permettant d'une part de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux injectable à l'Homme, d'un ligand peptidique hydrophobe du CMH de classe 1 ou Il, notamment d'un ligand peptidique dont le fragment épitope CTL est de nature hydrophobe, ceci tout en conservant sa capacité à se lier aux molécules du CMH et/ou sa capacité à induire une réponse CTL.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont en effet constaté qu'il est possible d'améliorer de manière très significative la solubilité en milieu aqueux, notamment en milieu aqueux injectable à l'Homme, des composés peptidiques possédant une activité recherchée comme ceux ayant un intérêt pharmaceutique tels que les ligands du CMH comportant un épitope CTL de nature hydrophobe, ceci en leur ajoutant au moins au total 3 résidus sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine avec au moins 1 résidu arginine, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale de ces ligands hydrophobes tout en conservant au moins en partie cette activité biologique recherchée lorsque ces composés peptidiques sont utilisés en milieu aqueux.
Les inventeurs ont mis en évidence de façon tout à fait surprenante, que l'addition de résidus arginine et/ou lysine à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale de peptide, tel que le ligand du CMH FluM1 de séquence SEQ ID No. 2 ou le ligand du CMH ELA de séquence SEQ ID No. 47 ou encore les ligands du CMH dérivés de la télomérase hTERT 572 Y1 de séquence SEQ ID No. 66, hTERT 988 de séquence
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SEQ ID No. 67 et hTERT 988 Y1 de séquence SEQ ID No. 68, permettait d'obtenir une solubilité accrue de ces peptides ainsi modifiés en milieu aqueux tout en conservant pour ceux testés leur capacité à induire une réponse CTL en milieu aqueux.
Les inventeurs ont mis par exemple en évidence que l'addition de 3 résidus acide aspartique à l'extrémité N-terminale ou C-terminale du ligand du CMH FluM1 de séquence SEQ ID No. 2 si elle ne perturbe pas la capacité de fixation de ce peptide au HLA-A2 provoque néanmoins une perte totale de sa capacité à induire une réponse CTL lorsqu'il est testé dans les mêmes conditions que le peptide FluM1 additionné de résidus arginine et/ou Lysine en N-ou C-terminal, montrant ainsi la difficulté supplémentaire d'obtenir à la fois une meilleure solubilité pour un peptide, tout en conservant l'activité biologique recherché pour ce peptide.
Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé permettant de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine avec au moins 1 résidu arginine, lesdits au moins 3 résidus pouvant être de forme L ou D, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, et pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
Pour plus de clarté, on entendra désigner dans la présente description, notamment dans le jeu de revendications, et en absence de précision complémentaire par peptide ou par ligand du CMH , le peptide ou le ligand du CMH non encore modifié par le procédé de l'invention, ceci par opposition respectivement au terme peptide modifié (ou peptide ainsi modifié ) ou ligand du CMH modifié (ou ligand du CMH ainsi modifié ).
De préférence, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux obtenue pour le peptide ainsi modifié est suffisante pour qu'au moins une part de l'activité biologique dudit peptide non modifié que l'on recherche à exercer, soit conservée par ledit peptide ainsi modifié par le procédé de l'invention lorsque ce dernier est utilisé en milieu aqueux.
Par activité biologique pour un peptide ou pour un composé peptidique, on entend désigner toute activité biologique telle que par exemple, et sans s'y limiter, une activité antigénique, notamment capable d'induire une réponse immune, de type humorale ou cellulaire, telle que la capacité à se fixer au CMH (ligand de CMH), notamment de classe # ou Il et, le cas échéant, de générer des cellules T helper et/ou
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des lymphocytes de type CTL, ou encore une activité anticorps, de ligand de récepteur, de récepteur, d'inhibiteur, enzymatique, hormonale, de médiateur de signal, d'inducteur, de substrat pour une réaction biochimique, etc..
Par au moins une part de l'activité biologique pour un peptide modifié ou pour un composé peptidique modifié selon le procédé de l'invention, on entend désigner toute activité biologique exercée par le peptide non modifié et qui est au moins exercée de manière partielle en milieu aqueux par le peptide ou le composé peptidique modifié.
Il est également entendu que fait aussi partie de l'invention un procédé selon l'invention dans lequel un résidu autre qu'un résidu arginine ou lysine est également ajouté à l'extrémité N-terminale ou C-terminale dudit composé peptidique, ceci en outre desdits au moins 3 résidus arginine et/ou lysine, si cet autre résidu ajouté ne réduit pas significativement l'accroissement de solubilité et, le cas échéant, l'activité biologique observé (s) en milieu aqueux pour le peptide modifié par l'ajout des seuls résidus arginine et/ou lysine.
Dans la présente description, on entendra désigner par composé peptidique , tout composé comprenant un peptide constitué d'une séquence d'acides aminés naturels ou non, de forme L ou D, ledit composé peptidique pouvant être choisi notamment parmi les peptides, les peptides-nucléiques acides, les lipopeptides ou les glycopeptides.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme peptide également les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment.
Par milieu aqueux, on entend désigner tout particulièrement une solution aqueuse telle qu'une solution tampon, notamment physiologique, comme un tampon salin tel qu'un tampon phosphate salin (PBS) ou toute solution aqueuse injectable à l'Homme.
En outre, les inventeurs ayant mis en évidence, comme il ressortira des exemples suivants, une amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide comprenant au moins 3 résidus arginine ou lysine, la présente invention concerne également, selon un deuxième aspect, un procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité d'un peptide par adjonction d'au moins au total 3 résidus consistant en un panachage de résidus arginine et lysine. Par panachage, il faut comprendre que les résidus arginine et lysine peuvent être alternés, de manière aléatoire, les uns avec les autres, et ce sans se soucier de leur répartition entre les extrémités N- et C-terminal.
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Plusieurs combinaisons sont envisageables comme par exemple, sans aucune limitation, KKK-peptide-R, R-peptide-KKK, RKRK-peptide, peptide-RKRK, KKKRpeptide ou encore peptide-RKKK.
Selon un troisième aspect préféré, le procédé objet de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus arginine, de forme L ou D, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, ces au moins 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
Dans un mode de réalisation également préféré, la présente invention a pour objet un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le nombre total de résidus arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses et, encore mieux, est de 4.
Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine constituent une chaîne linéaire d'acide aminé.
Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit peptide.
Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine ajoutés sont de forme L.
Dans un mode de réalisation également préféré, ledit peptide (non encore modifié par le procédé selon l'invention) comprend au moins 6 acides aminés, de préférence au moins 7 ou 8 acides aminés.
Dans un mode de réalisation également préféré, ledit peptide (non encore modifié) comprend au plus 50 acides aminés, de préférence au plus 45,40 ou 35 acides aminés, de manière plus préférée au plus 30,25, 20 ou 15 acides aminés.
Dans un mode de réalisation également préféré, l'ajout par liaison covalente desdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine à l'extrémité libre N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide est réalisée par synthèse chimique, ou encore par fusion génétique lorsque la structure dudit peptide ainsi modifié le permet.
Dans un mode de réalisation également préféré, le peptide modifié obtenu par le procédé selon l'invention, est soluble en milieu aqueux, notamment dans un tampon PBS, à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 6 ou 7 mg/ml, au moins 7 mg/ml étant le minimum de solubilité le plus préféré.
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Sous un autre aspect préféré, ledit peptide est un peptide utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique.
De préférence, ledit peptide est un principe actif capable d'exercer une action thérapeutique (préventive ou curative).
De préférence encore ledit peptide est un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe.
Par épitope antigénique , on entend désigner ici un peptide qui lorsqu'il est administré chez un animal ou l'Homme, seul ou en présence d'adjuvant de l'immunité ou encore en association avec une molécule porteuse, est capable d'induire une réponse immune de type humoral ou cellulaire dirigée spécifiquement contre cette épitope, de préférence capable de générer des lymphocytes CTL dirigés spécifiquement contre cette épitope.
Sous un autre aspect particulièrement préféré, ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, notamment de classe 1 ou II.
De préférence, ledit peptide est choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme, de préférence pathogène pour un mammifère tel que l'homme, ces microorganismes pouvant être des virus, bactéries, levures, champignons ou parasites, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
De préférence, ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, caractérisé en ce qu'il peut être également choisi parmi des constructions polypeptidiques multi-épitopiques, des pseudopeptides, des peptides rétro-inverso de peptides, des peptoïdes, des peptido-mimétiques, ou encore choisi parmi des peptides inclus dans des composés peptidiques tels que des peptides-nucléiques acides, des lipopeptides ou des glycopeptides.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme polypeptide multi-épitopiques , une construction peptidique comprenant sur une même séquence un ensemble de plusieurs épitopes de nature peptidique.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme pseudopeptide , tout peptide, ou molécule analogue, contenant une ou plusieurs liaisons non peptidiques entre les acides a aminés.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme peptide rétroinverso , pour un peptide donné de n acides aminés et de séquence générale H2N-
Xi-X2-.........-Xn-i-Xn-COOH, un peptide de n acides aminés de séquence H2N-Xn-
Xi-X2-.........-Xn-i-Xn-COOH, un peptide de n acides aminés de séquence H2N-Xn-
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Xn~-.........X2-X-COOH, où les acides aminés de la série L sont remplacés par des acides aminés de la série D, où H2N-X, (ou H2N-Xn t) et Xn-COOH (ou X1-COOH) représentent respectivement le résidu d'acide aminé en position N-terminale et le résidu d'acide aminé en position C-terminale dudit peptide.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme peptoïde , des oligomères obtenus à partir de dérivés glycine N-substitués.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme peptidomimétique , toute molécule présentant au moins une propriété fonctionnelle propre aux peptides et, plus particulièrement, toute molécule dans lesquelles les liaisons amides sont complètement ou partiellement remplacées par des liaisons non peptidiques tout en conservant les chaînes d'acides aminés essentiels à l'activité dans une position spatiale définie et/ou toute molécule dans lesquelles les a CH sont remplacés par un atome d'azote et/ou toute molécule dans lesquelles les chaînes latérales des acides aminés sont modifiées.
De préférence, ledit peptide non modifié est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL.
De préférence, ledit peptide non modifié est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide, de décapeptide hydrophobes, de préférence se présentant sous la forme d'un peptide d'au plus 15 acides aminés, ou encore sous la forme d'un regroupement d'épitopes hydrophobes.
De préférence, ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH comprend un peptide choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
De préférence, ledit peptide est un ligand du CMH, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH comprend un peptide choisi parmi les peptides suivants : a) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et b) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la
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séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47, et caractérisé en ce que ledit ligand du CMH est capable de générer des lymphocytes T de type cytotoxique et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un ligand du CMH, notamment de classe I ou II, de nature peptidique, modifié par l'adjonction d'au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine, répartis à son extrémité N-terminale et/ou Cterminale, ces 3 résidus arginine et/ou lysine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée, de préférence le ligand du CMH avant modification étant de nature hydrophobe.
Par le terme hydrophobe dans la présente description, on entend désigner pour un peptide ou un ligand du CMH de nature peptidique, un peptide ou un ligand du CMH non soluble dans un milieu aqueux, ou insuffisamment soluble pour pouvoir exploiter dans ce milieu aqueux l'ensemble ou l'une au moins des activités biologiques pouvant être exercées par ce même peptide ou ligand du CMH dans un autre milieu (notamment dans un milieu contenant du DMSO).
De préférence, ledit ligand du CMH selon l'invention, est caractérisé en ce le nombre total de résidus arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou Cterminale dudit ligand est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses.
De préférence encore, lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine constituent une chaîne linéaire d'acide aminé.
De préférence encore, lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit ligand du CMH.
De préférence encore, l'ensemble des résidus arginine et/ou lysine ajoutés est de forme L.
De préférence encore, ledit ligand du CMH (non modifié) comprend au plus 50 acides aminés, de préférence au plus 45,40 ou 35 acides aminés, de manière plus préférée au plus 30,25, 20 ou 15 acides aminés.
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Parmi cesdits ligands du CMH (non modifié), on préfère les ligands du CMH constitués d'au plus 15 acides aminés.
De préférence, ledit ligand du CMH de nature peptidique non modifié est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifiques dudit ligand du CMH et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu ; et, est caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux dudit ligand du CMH de nature peptidique avant modification est significativement inférieure à celle dans les mêmes conditions dudit ligand du CMH ainsi modifié selon l'invention.
De préférence, ledit ligand du CMH non modifié n'est pas soluble en milieu aqueux, notamment en tampon phosphate salin (PBS), à une concentration supérieure à 1 mg/ml.
De préférence, la différence de solubilité évaluée en tampon PBS entre ledit ligand du CMH non modifié et ledit ligand du CMH modifié est supérieure ou égale à 2, de préférence à 3 et 4 mg/ml.
Comme méthode de calcul de solubilité, on pourra se référer notamment à la méthode comme décrite à l'exemple 2.
De préférence ledit ligand du CMH modifié est caractérisé en ce qu'il est soluble en milieu aqueux, notamment en tampon phosphate salin (PBS), à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 6 ou 7 mg/ml, 7 mg/ml étant la solubilité minimale la plus préférée.
De préférence, ledit ligand du CMH ainsi modifié est capable en solution aqueuse de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
De préférence encore, ledit ligand du CMH selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL.
De préférence encore, ledit ligand du CMH selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de décapeptide ou un regroupement d'épitopes hydrophobes.
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De préférence encore ledit ligand du CMH de nature peptidique avant modification comprend un ou est constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
Parmi cesdits ligands du CMH ainsi modifiés selon l'invention, on préfère les ligands du CMH de nature peptidique choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID Nos. 75,76 et 77 et les peptides de séquence SEQ ID Nos. 78 et 79, ces peptides pouvant, le cas échéant, comprendre une mutation ponctuelle dans la séquence du ligand du CMH non modifié dont il est issu, notamment une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé naturel ou non naturel.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou un ligand du CMH selon l'invention comme médicament.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi : - un peptide modifié par un procédé selon l'invention, ou un ligand du CMH modifié selon l'invention, le cas échéant mélangé ou couplé à une protéine porteuse ou l'un de ses fragments ; ou - une construction nucléique contenant un ADN codant pour un peptide modifié par un procédé selon l'invention, ou pour un ligand du CMH modifié selon l'invention, le cas échéant contenant en outre un ADN codant pour une protéine porteuse ou l'un de ses fragments.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant de tels épitopes antigéniques, pour la préparation
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d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections par ce microorganisme, notamment des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant de tels épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers associés à cette antigène, préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs associées à cette antigène.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène ou dérivé d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou en ce qu'il comprend un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant au moins un tel épitope antigénique.
La présente invention a également pour objet un vaccin selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant, de préférence choisi parmi les adjuvants suivants : les protéines de la membrane externe de type A, dénommées OmpA d'entérobactérie, TT, PLGA, ISCOM, IFA, Montanide, ISA 720, ISA 51, les ammonium quaternaires lipidiques, MPL-A, le Quil-A et autres saponines (QS21) les CpG.
La présente invention porte également sur un vaccin selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend en outre, un composé porteur mélangé ou couplé audit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou audit ligand du CMH modifié.
La présente invention porte également sur un vaccin selon l'invention caractérisé en ce que ledit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou ledit ligand du CMH modifié, associé éventuellement à un composé porteur, est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
L'invention a également pour objet un vaccin selon l'invention caractérisé en ce que ledit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou ledit
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ligand du CMH modifié, associé éventuellement à un composé porteur, est véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
Parmi les véhicules permettant d'améliorer la stabilité et/ou l'immunogénicité desdits peptides, on préfère notamment les liposomes, les PLGA ou autres polymères ainsi que les vecteurs viraux ou bactériens contenant une construction nucléique codant pour ledit peptide et éventuellement en outre ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments.
De préférence, ledit composé porteur est une protéine porteuse choisie parmi la protéine TT (Toxoïde Tétanique) ou ses dérivés, la protéine DT (Toxoïde Diphtérique) ou ses dérivés, la KLH (Key Limpet Haemocyanin), les protéines de choc thermique ou HSP, les protéines de membranes bactériennes de type Omp, notamment d'entérobactéries, ou leurs fragments.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme Omp (pour Outer Membrane Protéin ), les protéines de la membrane externe, et par OmpA celles de type A.
Par fragment ou composés dérivés d'une protéine porteuse, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine porteuse qui, lorsqu'il est associé à un immunogène, est capable de générer ou accroître une réponse immune, notamment humorale et/ou de type CTL, dirigée contre ledit immunogène et comprenant au moins 8 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15,20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés de ladite protéine porteuse, leurs composés dérivés comprenant au moins l'un de ses fragments.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend un vaccin selon l'invention dans laquelle la protéine porteuse Omp d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie ou par voie recombinante.
Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description.
On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J. F. et al. (Eur. J. Biochem, 255,446-454, 1998).
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui également bien connues de l'homme de l'art. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, on peut citer par exemple les cellules
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bactériennes (Olins P. O. et Lee S. C., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4 :520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4 :538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards C.P. et Aruffo A., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4 :558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V. A., 1993, Curr. Op.
Biotechnology, 4 :564-572).
De manière tout à fait préférée, ladite protéine porteuse est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, en particulier la protéine P40 de séquence SEQ ID No. 72, l'un de ses fragments d'au moins 8 acides aminés, de préférence au moins 10,15, 20, 30 ou 50 acides aminés, ou un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence de P40 ou l'un de sesdits fragments.
La protéine porteuse nommée P40, dérivée de la membrane externe de type A de Klebsiella pneumoniae a été décrite en particulier dans les demandes de brevet WO 95/27787 et WO 96/14415 comme permettant d'augmenter la réponse immune, notamment de type humorale et cellulaire, lorsque celle-ci était associée à un immunogène.
Sous un autre aspect, l'invention concerne un vaccin selon l'invention, caractérisée en ce que ledit vaccin contient un vecteur comprenant une construction nucléique codant pour le peptide hybride résultant du couplage entre le peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou pour ledit ligand du CMH et ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, ou contient une cellule hôte transformée par ledit vecteur capable d'exprimer ledit peptide hybride.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ou un vaccin selon l'invention, administrable par voie systémique, notamment par voie injectable, mucosale ou transdermique.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Légendes des figures : Figures 1A à 1D : Sécrétion d'IFNy, induite par les peptides FluM1 (1A), 4K-FluM1 (1C), FluM1-4K(1D), et 4k-FluM1 (1B), solubillisés dans le PBS, chez un sujet HLA-A2 positif et sensibilisé par le virus de la grippe.
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Figures 2A à 2D : Sécrétion d'IFNy, induite par les peptides FluM1 (2A), 4K-FluM1 (2C), FluM1-4K (2D), et 4k-FluM1 (2B), solubillisés dans le DMSO, chez un sujet HLAA2 négatif.
Figures 3A à 3C : de la réponse CTL induite par les peptides 4K-FluM1 (3A), FluM1-4K (3B) et 4k-FluM1 (3C) solubillisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figures 4A à 4C : Etude de la réponse CTL induite par les peptides 4K-ELA (4A), ELA- 4K (4B) et 4k-ELA (4C) solubillisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figures 5A et 5B : de la réponse CTL induite par les peptides 4R-ELA solubilisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figure 6 : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 5K-ELA solubilisé à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figure 7 : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 3D-FluM1 solubilisé à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figures 8A à 8E : Sécrétiond'IFNy, induite par les peptides FluM1, 4K-FluM1, FluM1- 4K et 4k-FluM1 solubilisés dans le DMSO, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluMl.
Figures 9A à 9D : Sécrétion d'IFNy, induite par les peptides 4K-FluM1, FluM1-4K et 4k- FluM1 solubilisés dans le PBS, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluMl.
EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse, purification et caractérisation de peptides
Les 69 peptides FluMl et ELA et dérivés ainsi que les 6 peptides épitopes CTL HLA-A2 et dérivés appartenant à la télomérase, ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur multiple de peptides (Advanced ChemTech, modèle 348 oméga) en phase solide en utilisant la chimie Fmoc à l'échelle de 50 pmoles. Les résines de types Wang-ou 2-chlorotrityl- préchargées portant le résidu COOH-terminal des peptides à synthétiser ont été introduites dans les puits d'un réacteur comportant 96 puits. La fonction a-NH2 des acides aminés utilisés pour la synthèse était protégée par un groupement (Fmoc) et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés étaient protégées par des groupes compatibles avec la chimie Fmoc [Cys(Trt) ; Arg (Pmc) ;
Les 69 peptides FluMl et ELA et dérivés ainsi que les 6 peptides épitopes CTL HLA-A2 et dérivés appartenant à la télomérase, ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur multiple de peptides (Advanced ChemTech, modèle 348 oméga) en phase solide en utilisant la chimie Fmoc à l'échelle de 50 pmoles. Les résines de types Wang-ou 2-chlorotrityl- préchargées portant le résidu COOH-terminal des peptides à synthétiser ont été introduites dans les puits d'un réacteur comportant 96 puits. La fonction a-NH2 des acides aminés utilisés pour la synthèse était protégée par un groupement (Fmoc) et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés étaient protégées par des groupes compatibles avec la chimie Fmoc [Cys(Trt) ; Arg (Pmc) ;
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His (Trt) ; Trp (Boc) ; Asn (Trt) ; Gln(Trt) ; Lys (Boc) ; Ser(tBu) ; Thr (tBu) ; Tyr(tBu) ; Asp(OtBu) ; Glu(OtBu)].
I. Protocole de synthèse Lavages préliminaires : DCM 1500 l/puits 3 fois 5 min
DMF 1500 l/puits 3 fois 10 min 1. Déprotections : a. DMF 1125 l/puits pipéridine 375 pl/puits 1 fois 2 min rinçage: DMF 1500 l/puits vidange b. DMF 1125 pl/puits pipéridine 375 pl/puits 1 fois 10 min 2. Lavages : DMF 1500 l/puits 6 fois 2 min 3. Couplages : a. aa/HOBt 0. 5M 500 l/puits
HBTU 0. 5M 500 l/puits
DIEA 2M 250 pl/puits 1 fois 20 min Lavages DMF 1500 l/puits 2 fois 2 min b. Aa/HOBt 0. 5M 500 l/puits
HATU 0. 5M 500 l/puits
DIEA 2M 250 l/puits 1 fois 20 min 4. Lavages DMF 1500 l/puits 4 fois 2 min
DCM 1500 l/puits 3 fois 1 min 5. Acétylation mélange
1500 pl/puits 1 fois 10 min 6 .Lavages DCM 1500 l/puits 3 fois 1 min
DMF 1500 fil/puits 4 fois 2 min ≈Mélange utilisé : Anhydride acétique 10 %, DIEA 5 %, dans le DCM.
DMF 1500 l/puits 3 fois 10 min 1. Déprotections : a. DMF 1125 l/puits pipéridine 375 pl/puits 1 fois 2 min rinçage: DMF 1500 l/puits vidange b. DMF 1125 pl/puits pipéridine 375 pl/puits 1 fois 10 min 2. Lavages : DMF 1500 l/puits 6 fois 2 min 3. Couplages : a. aa/HOBt 0. 5M 500 l/puits
HBTU 0. 5M 500 l/puits
DIEA 2M 250 pl/puits 1 fois 20 min Lavages DMF 1500 l/puits 2 fois 2 min b. Aa/HOBt 0. 5M 500 l/puits
HATU 0. 5M 500 l/puits
DIEA 2M 250 l/puits 1 fois 20 min 4. Lavages DMF 1500 l/puits 4 fois 2 min
DCM 1500 l/puits 3 fois 1 min 5. Acétylation mélange
1500 pl/puits 1 fois 10 min 6 .Lavages DCM 1500 l/puits 3 fois 1 min
DMF 1500 fil/puits 4 fois 2 min ≈Mélange utilisé : Anhydride acétique 10 %, DIEA 5 %, dans le DCM.
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Le cycle comprenant les étapes 1 à 6 est répété n fois jusqu'à l'obtention des séquences désirées. Après le dernier cycle de couplage, la fonction a-NH2 du peptidylrésine est déprotégée à l'aide de pipéridine comme décrit dans l'étape 1.
En fin de synthèse, les peptidylrésines sont lavés comme ci-après : Lavages DMF 1500 l/puits 4 fois 2 min
DCM 1500 l/puits 4 fois 3 min avant d'être séchés pendant 3 heures sous azote.
DCM 1500 l/puits 4 fois 3 min avant d'être séchés pendant 3 heures sous azote.
Il. Clivage des peptidylrésines et récupération des peptides
Les peptides sont ensuite clivés de la résine et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés sont déprotégées par réaction pendant 3 h à température ambiante du peptidylrésine avec un mélange de clivage dont la composition est la suivante pour 100 mg de peptidylrésine, 1,5 ml du mélange : TFA 82,5 % ; H20 5 % ; 2,5 % ; Thioanisol 5 % et phénol 5 %.
Les peptides sont ensuite clivés de la résine et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés sont déprotégées par réaction pendant 3 h à température ambiante du peptidylrésine avec un mélange de clivage dont la composition est la suivante pour 100 mg de peptidylrésine, 1,5 ml du mélange : TFA 82,5 % ; H20 5 % ; 2,5 % ; Thioanisol 5 % et phénol 5 %.
La résine est séparée du peptide par simple filtration. Le peptide est ensuite précipité par addition de diéthyléther à 4 C. Le peptide brut est récupéré par centrifugation à 3000 tr/min pendant 3 min. Après trois lavages à l'éther, le peptide est repris à l'aide d'une solution aqueuse d'acide acétique puis lyophilisé.
III. Purification des peptides
Les peptides sont repris dans un mélange d'acide acétique et d'eau et purifiés par RP-HPLC (Chromatographie liquide haute performance en phase reverse) semipréparative sur une colonne C4 ou C18. Le système d'élution étant un gradient H20 et acétonitrile en présence de 0,1% de TFA.
Les peptides sont repris dans un mélange d'acide acétique et d'eau et purifiés par RP-HPLC (Chromatographie liquide haute performance en phase reverse) semipréparative sur une colonne C4 ou C18. Le système d'élution étant un gradient H20 et acétonitrile en présence de 0,1% de TFA.
IV. Analyses des peptides
La pureté du peptide est vérifiée par RP-HPLC en phase inverse. L'identité du peptide est confirmée par spectrométrie de masse de type ES-MS.
La pureté du peptide est vérifiée par RP-HPLC en phase inverse. L'identité du peptide est confirmée par spectrométrie de masse de type ES-MS.
Caractéristiques des nonapeptides synthétisés : pureté des peptides : 85 % (RP-HPLC) identité des peptides : accord avec la masse attendue (ES-MS)
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Abréviations : Aa : Fmoc acide aminé ; Boc :Tertiobutyloxycarbonyl ; DCM : Dichloromethane ; DIEA : Diisopropyléthylamine ; DMF : Dimethylformamide ; EDT : Ethanedithiol ; ESMS : Electrospray Mass Spectrometry ; Fmoc : 9-Fluorenylmethoxycarbonyl ; haut : 0- (7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tétraméthyluronium hexafluorophosphate; HBTU : 2- (1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate ; HOBt : Hydroxybenzotriazole ; NMP : N-méthyl-2-pyrrolidone ; Pmc : 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl ; RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography ; TBu (OtBu) : Tertiobutyl ; TFA : Trifluoroacetic acid ; Trt : Trityl.
Tableau 1 : Séquence des 48 peptides FLUM1 et dérivés synthétisés
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb>
FluM1 <SEP> GILGFVFTL <SEP> 2 <SEP>
<tb> 1K-FluM1 <SEP> KGILGFVFTL <SEP> 3
<tb> 2K-FluM1 <SEP> KKGILGFVFTL <SEP> 4
<tb> 3K-FluM1 <SEP> KKKGILGFVFTL <SEP> 5
<tb> 4K-FluM1 <SEP> KKKKGILGFVFTL <SEP> 6
<tb> 5K-FluM1 <SEP> KKKKKGILGFVFTL <SEP> 7
<tb> 1R-FluM1 <SEP> RGILGFVFTL <SEP> 73
<tb> 2R-FluM1 <SEP> RRGILGFVFTL <SEP> 74
<tb> 3R-FluM1 <SEP> RRRGILGFVFTL <SEP> 75
<tb> 4R-FluM1 <SEP> RRRRGILGFVFTL <SEP> 76
<tb> 5R-FluM1 <SEP> RRRRRGILGFVFTL <SEP> 77
<tb> 1H-FluM1 <SEP> HGILGFVFTL <SEP> 8
<tb> 2H-FluM1 <SEP> HHGILGFVFTL <SEP> 9
<tb> 3H-FluM1 <SEP> HHHGILGFVFTL <SEP> 10
<tb> 4H-FluM1 <SEP> HHHHGILGFVFTL <SEP> 11
<tb> 5H-FluM1 <SEP> HHHHHGILGFVFTL <SEP> 12
<tb> 1D-FluM1 <SEP> DGILGFVFTL <SEP> 13
<tb> 2D-FluM1 <SEP> DDGILGFVFTL <SEP> 14
<tb> 3D-FluM1 <SEP> DDDGILGFVFTL <SEP> 15
<tb> 4D-FluM1 <SEP> DDDDGILGFVFTL <SEP> 16
<tb> 5D-FluM1 <SEP> DDDDDGILGFVFTL <SEP> 17
<tb>
<tb> 1K-FluM1 <SEP> KGILGFVFTL <SEP> 3
<tb> 2K-FluM1 <SEP> KKGILGFVFTL <SEP> 4
<tb> 3K-FluM1 <SEP> KKKGILGFVFTL <SEP> 5
<tb> 4K-FluM1 <SEP> KKKKGILGFVFTL <SEP> 6
<tb> 5K-FluM1 <SEP> KKKKKGILGFVFTL <SEP> 7
<tb> 1R-FluM1 <SEP> RGILGFVFTL <SEP> 73
<tb> 2R-FluM1 <SEP> RRGILGFVFTL <SEP> 74
<tb> 3R-FluM1 <SEP> RRRGILGFVFTL <SEP> 75
<tb> 4R-FluM1 <SEP> RRRRGILGFVFTL <SEP> 76
<tb> 5R-FluM1 <SEP> RRRRRGILGFVFTL <SEP> 77
<tb> 1H-FluM1 <SEP> HGILGFVFTL <SEP> 8
<tb> 2H-FluM1 <SEP> HHGILGFVFTL <SEP> 9
<tb> 3H-FluM1 <SEP> HHHGILGFVFTL <SEP> 10
<tb> 4H-FluM1 <SEP> HHHHGILGFVFTL <SEP> 11
<tb> 5H-FluM1 <SEP> HHHHHGILGFVFTL <SEP> 12
<tb> 1D-FluM1 <SEP> DGILGFVFTL <SEP> 13
<tb> 2D-FluM1 <SEP> DDGILGFVFTL <SEP> 14
<tb> 3D-FluM1 <SEP> DDDGILGFVFTL <SEP> 15
<tb> 4D-FluM1 <SEP> DDDDGILGFVFTL <SEP> 16
<tb> 5D-FluM1 <SEP> DDDDDGILGFVFTL <SEP> 17
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
<tb>
<tb> 1E-FluM1 <SEP> EGILGFVFTL <SEP> 18
<tb> 2E-FluM1 <SEP> EEGILGFVFTL <SEP> 19
<tb> 3E-FluM1 <SEP> EEEGILGFVFTL <SEP> 20
<tb> 4E-FluM1 <SEP> EEEEGILGFVFTL <SEP> 21
<tb> 5E-FluM1 <SEP> EEEEEGILGFVFTL <SEP> 22
<tb> 1S-FluM1 <SEP> SGILGFVFTL <SEP> 23
<tb> 2S-FluM1 <SEP> SSGILGFVFTL <SEP> 24
<tb> 3S-FluM1 <SEP> SSSGILGFVFTL <SEP> 25
<tb> 4S-FluM1 <SEP> SSSSGILGFVFTL <SEP> 26
<tb> 5S-FluM1 <SEP> SSSSSGILGFVFTL <SEP> 27
<tb> 1T-FluM1 <SEP> TGILGFVFTL <SEP> 28
<tb> 2T-FluM1 <SEP> TTGILGFVFTL <SEP> 29
<tb> 3T-FluM1 <SEP> TTTGILGFVFTL <SEP> 30
<tb> 4T-FluM1 <SEP> TTTTGILGFVFTL <SEP> 31
<tb> 5T-FluM1 <SEP> TTTTTGILGFVFTL <SEP> 32
<tb> 1N-FluM1 <SEP> NGILGFVFTL <SEP> 33
<tb> 2N-FluM1 <SEP> NNGILGFVFTL <SEP> 34
<tb> 3N-FluM1 <SEP> NNNGILGFVFTL <SEP> 35
<tb> 4N-FluM1 <SEP> NNNNGILGFVFTL <SEP> 36
<tb> 5N-FluM1 <SEP> NNNNNGILGFVFTL <SEP> 37
<tb> 1Q-FluM1 <SEP> QGILGFVFTL <SEP> 38
<tb> 2Q-FluM1 <SEP> QQGILGFVFTL <SEP> 39
<tb> 3Q-FluM1 <SEP> QQQGILGFVFTL <SEP> 40
<tb> 4Q-FluM1 <SEP> QQQQGILGFVFTL <SEP> 41
<tb> 5Q-FluM1 <SEP> QQQQQGILGFVFTL <SEP> 42
<tb> FluM1-4K <SEP> GILGFVFTLKKKK <SEP> 43
<tb> 4k*-FluM1 <SEP> kkkkGILGFVFTL <SEP> 44
<tb>
* k = D-Lysine
<tb> 1E-FluM1 <SEP> EGILGFVFTL <SEP> 18
<tb> 2E-FluM1 <SEP> EEGILGFVFTL <SEP> 19
<tb> 3E-FluM1 <SEP> EEEGILGFVFTL <SEP> 20
<tb> 4E-FluM1 <SEP> EEEEGILGFVFTL <SEP> 21
<tb> 5E-FluM1 <SEP> EEEEEGILGFVFTL <SEP> 22
<tb> 1S-FluM1 <SEP> SGILGFVFTL <SEP> 23
<tb> 2S-FluM1 <SEP> SSGILGFVFTL <SEP> 24
<tb> 3S-FluM1 <SEP> SSSGILGFVFTL <SEP> 25
<tb> 4S-FluM1 <SEP> SSSSGILGFVFTL <SEP> 26
<tb> 5S-FluM1 <SEP> SSSSSGILGFVFTL <SEP> 27
<tb> 1T-FluM1 <SEP> TGILGFVFTL <SEP> 28
<tb> 2T-FluM1 <SEP> TTGILGFVFTL <SEP> 29
<tb> 3T-FluM1 <SEP> TTTGILGFVFTL <SEP> 30
<tb> 4T-FluM1 <SEP> TTTTGILGFVFTL <SEP> 31
<tb> 5T-FluM1 <SEP> TTTTTGILGFVFTL <SEP> 32
<tb> 1N-FluM1 <SEP> NGILGFVFTL <SEP> 33
<tb> 2N-FluM1 <SEP> NNGILGFVFTL <SEP> 34
<tb> 3N-FluM1 <SEP> NNNGILGFVFTL <SEP> 35
<tb> 4N-FluM1 <SEP> NNNNGILGFVFTL <SEP> 36
<tb> 5N-FluM1 <SEP> NNNNNGILGFVFTL <SEP> 37
<tb> 1Q-FluM1 <SEP> QGILGFVFTL <SEP> 38
<tb> 2Q-FluM1 <SEP> QQGILGFVFTL <SEP> 39
<tb> 3Q-FluM1 <SEP> QQQGILGFVFTL <SEP> 40
<tb> 4Q-FluM1 <SEP> QQQQGILGFVFTL <SEP> 41
<tb> 5Q-FluM1 <SEP> QQQQQGILGFVFTL <SEP> 42
<tb> FluM1-4K <SEP> GILGFVFTLKKKK <SEP> 43
<tb> 4k*-FluM1 <SEP> kkkkGILGFVFTL <SEP> 44
<tb>
* k = D-Lysine
<Desc/Clms Page number 21>
Tableau Il : Séquence des 21 peptides ELA et dérivés synthétisés
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb>
ELA <SEP> ELAGIGILTV <SEP> 47
<tb> K-ELA <SEP> KELAGIGILTV <SEP> 48
<tb> 2K-ELA <SEP> KKELAGIGILTV <SEP> 49
<tb> 3K-ELA <SEP> KKKELAGIGILTV <SEP> 50
<tb> 4K-ELA <SEP> KKKKELAGIGILTV <SEP> 51
<tb> 5K-ELA <SEP> KKKKKELAGIGILTV <SEP> 52
<tb> ELA-4K <SEP> kkkkELAGIGILTV <SEP> 53
<tb> 4k*-ELA <SEP> ELAGIGILTVKKKK <SEP> 54
<tb> 3R-ELA <SEP> RRRELAGIGILTV <SEP> 78
<tb> 4R-ELA <SEP> RRRRELAGIGILTV <SEP> 79
<tb> D-ELA <SEP> DELAGIGILTV <SEP> 55
<tb> 2D-ELA <SEP> DDELAGIGILTV <SEP> 56
<tb> 3D-ELA <SEP> DDDELAGIGILTV <SEP> 57
<tb> 4D-ELA <SEP> DDDDELAGIGILTV <SEP> 58
<tb> 5D-ELA <SEP> DDDDDELAGIGILTV <SEP> 59
<tb> 4H-ELA <SEP> HHHHELAGIGILTV <SEP> 60
<tb> 4T-ELA <SEP> TTTTELAGIGILTV <SEP> 61
<tb> 4N-ELA <SEP> NNNNELAGIGILTV <SEP> 62
<tb> 4Q-ELA <SEP> QQQQELAGIGILTV <SEP> 63
<tb> 4E-ELA <SEP> EEEEELAGIGILTV <SEP> 64
<tb> 4S-ELA <SEP> SSSSELAGIGILTV <SEP> 65
<tb>
* k = D-lysine
<tb> K-ELA <SEP> KELAGIGILTV <SEP> 48
<tb> 2K-ELA <SEP> KKELAGIGILTV <SEP> 49
<tb> 3K-ELA <SEP> KKKELAGIGILTV <SEP> 50
<tb> 4K-ELA <SEP> KKKKELAGIGILTV <SEP> 51
<tb> 5K-ELA <SEP> KKKKKELAGIGILTV <SEP> 52
<tb> ELA-4K <SEP> kkkkELAGIGILTV <SEP> 53
<tb> 4k*-ELA <SEP> ELAGIGILTVKKKK <SEP> 54
<tb> 3R-ELA <SEP> RRRELAGIGILTV <SEP> 78
<tb> 4R-ELA <SEP> RRRRELAGIGILTV <SEP> 79
<tb> D-ELA <SEP> DELAGIGILTV <SEP> 55
<tb> 2D-ELA <SEP> DDELAGIGILTV <SEP> 56
<tb> 3D-ELA <SEP> DDDELAGIGILTV <SEP> 57
<tb> 4D-ELA <SEP> DDDDELAGIGILTV <SEP> 58
<tb> 5D-ELA <SEP> DDDDDELAGIGILTV <SEP> 59
<tb> 4H-ELA <SEP> HHHHELAGIGILTV <SEP> 60
<tb> 4T-ELA <SEP> TTTTELAGIGILTV <SEP> 61
<tb> 4N-ELA <SEP> NNNNELAGIGILTV <SEP> 62
<tb> 4Q-ELA <SEP> QQQQELAGIGILTV <SEP> 63
<tb> 4E-ELA <SEP> EEEEELAGIGILTV <SEP> 64
<tb> 4S-ELA <SEP> SSSSELAGIGILTV <SEP> 65
<tb>
* k = D-lysine
<Desc/Clms Page number 22>
Tableau III : Séquence des 6 peptides CTL HLA-A2 dérivés de la télomérase synthétisés
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> YLFFYRLSV <SEP> 66
<tb> hTERT <SEP> 988 <SEP> DLQVNSLQVT <SEP> 67
<tb> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> YLQVNSLQVT <SEP> 68
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLFFYRLSV <SEP> 69
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> KKKKDLQVNSLQVT <SEP> 70
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLQVNSLQVT <SEP> 71
<tb>
Exemple 2 : Identification des peptides solubles dans le PBS, notamment à 7 mg/ml I. Résultats généraux obtenus pour l'ensemble des peptides synthétisés
Il ressort des résultats obtenus que, quelle que soit la nature du peptide de base auquel est appliqué le procédé, le couplage avec des acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, et notamment avec 4 desdits acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, ne donne que des niveaux de solubilité inférieurs à environ 2 mg/ml, ce qui n'est pas exploitable pour les applications souhaitées.
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> No.
<tb> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> YLFFYRLSV <SEP> 66
<tb> hTERT <SEP> 988 <SEP> DLQVNSLQVT <SEP> 67
<tb> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> YLQVNSLQVT <SEP> 68
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLFFYRLSV <SEP> 69
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> KKKKDLQVNSLQVT <SEP> 70
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLQVNSLQVT <SEP> 71
<tb>
Exemple 2 : Identification des peptides solubles dans le PBS, notamment à 7 mg/ml I. Résultats généraux obtenus pour l'ensemble des peptides synthétisés
Il ressort des résultats obtenus que, quelle que soit la nature du peptide de base auquel est appliqué le procédé, le couplage avec des acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, et notamment avec 4 desdits acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, ne donne que des niveaux de solubilité inférieurs à environ 2 mg/ml, ce qui n'est pas exploitable pour les applications souhaitées.
II. Identification des peptides solubles dans le PBS à 7 mq/ml
Chaque peptide (6 pesées différentes) est repris à 1 mg/ml dans le DMSO (3 échantillons) ainsi que dans le PBS à 10 mg/ml (3 échantillons).
Chaque peptide (6 pesées différentes) est repris à 1 mg/ml dans le DMSO (3 échantillons) ainsi que dans le PBS à 10 mg/ml (3 échantillons).
Les solutions de chaque peptide solubilisé dans le DMSO ou le PBS sont agitées au moyen d'un vortex et placées sur un agitateur vibrant pendant 1 heure à température ambiante. Les solutions sont ensuite placées 5 min dans un bain à ultrasons, puis centrifugées à 10 000 rpm pendant 5 minutes.
Les surnageants sont analysés par RP-HPLC (purs ou dilués au 1/5e ou au 1/10e) sur une colonne C18 (250 mm x 2,1mm x 5 m). Les éluants sont les suivants : A = H20 + 0,05 % TFA et B = CH3CN/H20 80/20 + 0,05 % TFA. Le gradient utilisé est de 20 % à 100 % d'éluant B avec une pente de 2 % d'éluant B / min, le débit est de 0,25 ml/min.
La concentration obtenue est le résultat du calcul de la moyenne du rapport : aire du pic HPLC obtenu avec le peptide solubilisé en PBS (à 10 mg/ml) / aire du pic
<Desc/Clms Page number 23>
HPLC obtenu avec le peptide solubilisé en DMSO (à 1 mg/ml) sur 3 échantillons différents.
Tableau IV : Séquences des peptides FLUM1 / ELA et dérivés solubles dans le PBS à la concentration d'au moins 7 mg/ml
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> Solubilité <SEP> (mg/ml)
<tb> 3K-FluM1 <SEP> KKKGILGFVFTL <SEP> 11.4+/-0.4
<tb> 4K-FluM1 <SEP> KKKKGILGFVFTL <SEP> 9.4 <SEP> +/- <SEP> 0.3 <SEP>
<tb> 5K-FluM1 <SEP> KKKKKGILGFVFTL <SEP> 9.0+/-1.4
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> Solubilité <SEP> (mg/ml)
<tb> 3K-FluM1 <SEP> KKKGILGFVFTL <SEP> 11.4+/-0.4
<tb> 4K-FluM1 <SEP> KKKKGILGFVFTL <SEP> 9.4 <SEP> +/- <SEP> 0.3 <SEP>
<tb> 5K-FluM1 <SEP> KKKKKGILGFVFTL <SEP> 9.0+/-1.4
<tb>
FIuM1-4K GILGFVFTLKKKK 7.3 +I- 0.3
<tb>
<tb> 4k-FluM1 <SEP> kkkkGILGFVFTL <SEP> 8.8 <SEP> +/- <SEP> 0.2 <SEP>
<tb> 4K-ELA <SEP> KKKKELAGIGILTV <SEP> 11.5+/-0.3
<tb> 5K-ELA <SEP> KKKKKELAGIGILTV <SEP> 9.0+/-1.0
<tb> ELA-4K <SEP> ELAGIGILTVKKKK <SEP> 10.9+/-0.5
<tb>
<tb> 4k-FluM1 <SEP> kkkkGILGFVFTL <SEP> 8.8 <SEP> +/- <SEP> 0.2 <SEP>
<tb> 4K-ELA <SEP> KKKKELAGIGILTV <SEP> 11.5+/-0.3
<tb> 5K-ELA <SEP> KKKKKELAGIGILTV <SEP> 9.0+/-1.0
<tb> ELA-4K <SEP> ELAGIGILTVKKKK <SEP> 10.9+/-0.5
<tb>
4k-ELA kkkkELAGIGIL TV 11 +/- 2
<tb>
<tb> 4R-FluM1 <SEP> RRRRGILGFVFTL <SEP> 8,8 <SEP> +/- <SEP> 0,9 <SEP>
<tb> 5R-FluM1 <SEP> RRRRRGILGFVFTL <SEP> 8 <SEP> +/- <SEP> 0,4 <SEP>
<tb>
<tb> 4R-FluM1 <SEP> RRRRGILGFVFTL <SEP> 8,8 <SEP> +/- <SEP> 0,9 <SEP>
<tb> 5R-FluM1 <SEP> RRRRRGILGFVFTL <SEP> 8 <SEP> +/- <SEP> 0,4 <SEP>
<tb>
4R-ELA RRRRELAGIGILTV 9,9+/-0,2
Les peptides insolubles, modifiés par 3,4 ou 5 résidus L- ou D- arginine et/ou lysine en N- ou C-terminal sont solubles dans PBS à au moins 7 mg/ml (Tableau IV) et donc, a fortiori, ont une solubilité supérieure à la limite exploitable dans les applications visées, à savoir 2 mg/ml.
Tableau V : Séquences des peptides CTL HLA-A2 et dérivés hTERT solubles dans le PBS à la concentration d'au moins 7 mg/ml
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> Solubilité <SEP> (mg/ml)
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLFFYRLSV <SEP> 11.7 <SEP> +/- <SEP> 1
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> KKKKDLQVNSLQVT <SEP> 12.6+/-0.2
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLQVNSLQVT <SEP> 8.5 <SEP> +/- <SEP> 0.2 <SEP>
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Séquence <SEP> Solubilité <SEP> (mg/ml)
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 572 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLFFYRLSV <SEP> 11.7 <SEP> +/- <SEP> 1
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> KKKKDLQVNSLQVT <SEP> 12.6+/-0.2
<tb> 4K <SEP> hTERT <SEP> 988 <SEP> Y1 <SEP> KKKKYLQVNSLQVT <SEP> 8.5 <SEP> +/- <SEP> 0.2 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
Sur les 6 peptides synthétisés, seuls ceux qui ont été modifiés par addition de 4 résidus lysine (représentés sur ce tableau) mettent en évidence un gain de solubilité en milieu aqueux suffisant pour les applications envisagées, à savoir une solubilité supérieure à environ 2 mg/ml.
Exemple 3 : Identification de peptides se fixant sur les molécules HLA-A2
Afin de faire un criblage rapide des 67 peptides dérivés de ELA et FluM1 synthétisés, ces derniers ont été évalués, dans un premier temps, par l'étude de leur capacité à se fixer au complexe HLA-A2, propriété nécessaire à toute initiation d'une réponse immunitaire de type cytotoxique. Pour ce faire la lignée cellulaire T2 a été utilisée.
Afin de faire un criblage rapide des 67 peptides dérivés de ELA et FluM1 synthétisés, ces derniers ont été évalués, dans un premier temps, par l'étude de leur capacité à se fixer au complexe HLA-A2, propriété nécessaire à toute initiation d'une réponse immunitaire de type cytotoxique. Pour ce faire la lignée cellulaire T2 a été utilisée.
La lignée T2 est une lignée lymphocytaire humaine correspondant à un hybride cellules T/cellules B, exprimant constitutivement HLA-A2.
Ces cellules, déficientes en transporteur TAP, expriment peu de molécules HLA-A2 à leur surface. En absence de peptide, le complexe HLA-A2-ss2 microglobuline est en permanence recyclé dans la cellule et un niveau basal de complexe est observé à la surface de la cellule. La présence d'un peptide exogène se fixant sur les molécules HLA-A2 stabilise le complexe plus ou moins longtemps, en fonction de son affinité, empêchant la réinternalisation des molécules HLA-A2 et induisant ainsi une augmentation du nombre de molécules HLA-A2 à la surface de la cellule T2.
Les 67 peptides dérivés de ELA et FluM1 ont été testés pour leur capacité à induire une stabilisation plus ou moins importante selon le peptide des molécules HLAA2 à la surface des cellules T2 solubilisées dans le DMSO, alors que seuls les peptides solubles à au moins 7 mg/ml ont été testés dans le PBS (tableau IV). Pour ce faire, des cellules T2 ont été incubées une nuit à 37 C avec 100 g/ml de chacun des peptides en milieu OptiMEM dépourvu de SVF et supplémenté avec 100 ng/ml de ss2 microglobuline. Après 4 lavages ayant pour but d'éliminer l'excès de peptide non fixé, les cellules ont été resuspendues avec 1 ml de milieu RPMI 1640,10 % SVF contenant 10 g/ml de Brefeldine A capable de bloquer l'expression de surface des molécules HLA-A2 nouvellement synthétisées. Après une heure d'incubation à 37 C et 3 lavages les cellules ont été à nouveau incubées à 37 C durant 0,2, 4 ou 6 heures avant d'être marquées avec l'anticorps monoclonal MA2. 1 pour évaluer l'expression de surface des molécules HLA-A2 au FACS (Fluorescens Activated Cells Sorter).
Les résultats (tableau VI) montrent que 45 peptides dérivés de FluM1 solubilisés en DMSO comme le peptide parent FluM1, sont capables parmi les 47
<Desc/Clms Page number 25>
synthétisés d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2. Les peptides incapables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 sont: 5Q-FluM1 et 4k-FluM1.
Les résultats (tableau VII) montrent également que 7 peptides dérivés de ELA solubilisés en DMSO, parmi les 20 synthétisés sont capables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2. Les peptides incapables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 sont : 4k-ELA ; 1 D-, 2D-, 3D-, 4D- et 5D-ELA ; 4H-, 4T-, 4N-, 4Q-, 4E-, 4SELA et 3R-ELA.
Les résultats (tableaux VI et VII) montrent que tous les peptides dérivés de ELA et FluM1 solubles dans le PBS à au moins 7 mg/ml sont capables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 à l'exception des peptides 4k-FluM1, 4k-ELA et 3R-ELA.
Tableau VI : Fixation des peptides dérivés de FluM1 solubilisés en DMSO ou en PBS sur les molécules HLA-A2 des cellules T2
<tb>
<tb> Peptides <SEP> DMSO <SEP> PBS
<tb> FluM1 <SEP> ++++
<tb> 1K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> 4K-FluM1 <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 5K-FluM1 <SEP> ++ <SEP> +
<tb> FluM1-4K <SEP> + <SEP> +
<tb> 4K-FluM1 <SEP> - <SEP> -
<tb> 1R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 2R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 4R-FluM1 <SEP> + <SEP> ++
<tb> 5R-FluM1 <SEP> + <SEP> +
<tb> 1H-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2H-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3H-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb>
<tb> Peptides <SEP> DMSO <SEP> PBS
<tb> FluM1 <SEP> ++++
<tb> 1K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3K-FluM1 <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> 4K-FluM1 <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 5K-FluM1 <SEP> ++ <SEP> +
<tb> FluM1-4K <SEP> + <SEP> +
<tb> 4K-FluM1 <SEP> - <SEP> -
<tb> 1R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 2R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3R-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 4R-FluM1 <SEP> + <SEP> ++
<tb> 5R-FluM1 <SEP> + <SEP> +
<tb> 1H-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2H-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3H-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
<tb>
<tb> 4H-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5H-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd <SEP>
<tb> 2D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5D-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 2E-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3E-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 4E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 1S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd <SEP>
<tb> 2S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 1T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 2T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3T-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1N-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 2N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3N-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb>
<tb> 4H-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5H-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd <SEP>
<tb> 2D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4D-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5D-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 2E-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3E-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 4E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5E-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 1S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd <SEP>
<tb> 2S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 3S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5S-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 1T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 2T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3T-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5T-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 1N-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 2N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 3N-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 4N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb> 5N-FluM1 <SEP> + <SEP> nd
<tb>
1 Q-FluM 1 ++ nd
<tb>
<tb> 2Q-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3Q-FluM1 <SEP> ++++ <SEP> nd
<tb> 4Q-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5Q-FluM1 <SEP> - <SEP> nd
<tb>
<tb> 2Q-FluM1 <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3Q-FluM1 <SEP> ++++ <SEP> nd
<tb> 4Q-FluM1 <SEP> ++ <SEP> nd
<tb> 5Q-FluM1 <SEP> - <SEP> nd
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
nd : non déterminé (car non soluble ou peu suffisamment soluble en PBS pour pouvoir être testé) Tableau VII: Fixation des peptides dérivés de ELA solubilisés en DMSO ou en PBS sur les molécules HLA-A2 des cellules T2.
<tb>
<tb>
<tb>
Peptides <SEP> DMSO <SEP> PBS
<tb> ELA <SEP> ++++ <SEP> -
<tb> 1 <SEP> K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 4K-ELA <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 5K-ELA <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> ELA-4K <SEP> + <SEP> +
<tb> 4k-ELA
<tb> 3R-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4R-ELA <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> 1 <SEP> D-ELA <SEP> - <SEP> nd
<tb> 2D-ELA- <SEP> nd
<tb> 3D-ELA- <SEP> nd
<tb> 4D-ELA- <SEP> nd
<tb> 5D-ELA <SEP> - <SEP> nd
<tb> 4H-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4T-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4S-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4E-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4N-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4Q-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb>
nd : non déterminé (car non soluble ou peu suffisamment soluble en PBS pour pouvoir être testé)
<tb> ELA <SEP> ++++ <SEP> -
<tb> 1 <SEP> K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 2K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 3K-ELA <SEP> +++ <SEP> nd
<tb> 4K-ELA <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 5K-ELA <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> ELA-4K <SEP> + <SEP> +
<tb> 4k-ELA
<tb> 3R-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4R-ELA <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> 1 <SEP> D-ELA <SEP> - <SEP> nd
<tb> 2D-ELA- <SEP> nd
<tb> 3D-ELA- <SEP> nd
<tb> 4D-ELA- <SEP> nd
<tb> 5D-ELA <SEP> - <SEP> nd
<tb> 4H-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4T-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4S-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4E-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4N-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb> 4Q-ELA <SEP> - <SEP> nd <SEP>
<tb>
nd : non déterminé (car non soluble ou peu suffisamment soluble en PBS pour pouvoir être testé)
<Desc/Clms Page number 28>
Exemple 4 : Mesure de la sécrétion de IFNy par les lymphocytes T humains, induite par les peptides 4K-FluM1, FluM1-4K et 4k-FluM1
Les peptides dérivés de FluM1 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1 négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le PBS testés sur des cellules T cytotoxiques CD8+ d'un sujet HLA-A2 positif et sensibilisé par le virus de la grippe, pour leur capacité à induire une sécrétion d'interféron y par ces cellules.
Les peptides dérivés de FluM1 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1 négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le PBS testés sur des cellules T cytotoxiques CD8+ d'un sujet HLA-A2 positif et sensibilisé par le virus de la grippe, pour leur capacité à induire une sécrétion d'interféron y par ces cellules.
Brièvement, 10 cellules de sang périphérique, obtenues après Ficoll sont reprises en RPMI-10 % SVF dans des tubes de 15 ml en polypropylène et mises en présence de 100 l de peptide à tester, à une concentration de 10 g/ml (solution mère à 4 mg/ml) pendant 2 h à 37 C dans un incubateur. 800 l de RPMI-10 % SVF contenant 12,5 g/ml de Bréfeldine A, bloquant la sécrétion de cytokines, sont ajoutés puis les tubes sont replacés pendant 4 heures dans l'incubateur, à 37 C.
A la fin de la période d'incubation, 100 l de PBS-EDTA 20 mM froid sont ajoutés puis après 5 minutes, les cellules sont centrifugées et remises en suspension dans 100 l de PBS-1 % BSA-0,01 % NaN3 (BSA pour sérum albumine bovine), contenant 0,7 l d'anticorps anti-CD8 couplé à l'allophycocyanine (APC).
Après transfert en plaque 96 puits à fonds coniques, les cellules sont incubées 20 minutes à 4 C puis fixées 10 minutes, à l'obscurité, à température ambiante avec 100 l de paraformaldéhyde (PFA) 2 % dans du PBS. Après deux lavages en PBS, 50 l de PBS-Hepes 1 mM-Saponine 0,1 %, contenant 0,4 l d'anticorps antj-IFNy couplé au FITC (solution mère à 0,5 mg/ml) sont ajoutés sur les culots cellulaires, dans chaque puits. Après 30 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées deux fois puis transférées dans des tubes Micronic, pour une analyse par cytométrie en flux.
L'analyse par cytométrie en flux de la sécrétion de IFNy par les lymphocytes T CD8+, présentée dans la figure 1, montre qu'en présence des peptides 4K-FluM1 et FluM1-4K 0,16 % et 0,14 %, respectivement des lymphocytes T CD8+ sécrètent de l'IFNy alors qu'en présence du peptide 4k-FluM1, 0,03 % des T CD8+ sont positifs en sécrétion de l'IFNy.
Dans ces conditions, le peptide FluM1 n'est pas soluble et n'induit pas de sécrétion d'IFNy par les cellules T CD8+ (0,06 % de cellules positives).
La figure 2 montre que quel que soit le peptide dérivé de FluM1 testé chez un individu HLA-A2 négatif, il n'y a pas de sécrétion d'IFNy par les cellules T CD8+.
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Exemple 5 : Mesure de la sécrétion de IFN[gamma] induite par les peptides 4K-FluM1, FluM1-4K et 4k-FluM1, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluM1
Les peptides dérivés de FluM1, 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1, négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le DMSO ou le PBS et testés sur des cellules issues d'un clone T cytotoxique CD8+ humain, spécifique de FluM1, pour leur capacité à induire une sécrétion d'IFNy par ces cellules.
Les peptides dérivés de FluM1, 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1, négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le DMSO ou le PBS et testés sur des cellules issues d'un clone T cytotoxique CD8+ humain, spécifique de FluM1, pour leur capacité à induire une sécrétion d'IFNy par ces cellules.
Brièvement, 5.10cellules du clone FluM1 sont incubées, en tube, 1h à température ambiante, sous agitation lente, en présence de dimères vides ou de dimères chargés la veille à 37 C en présence d'un excès du peptide à tester. Les cellules sont alors lavées deux fois en PBS BSA 0,2 % et marquées avant passage au FACS.
Les figures 8C à 8E et 9B à 9D montrent respectivement que parmi les peptides FluM1 modifiés 4K-FluM1, 4k-FluM1 et FluM1-4K, solubilisés dans le DMSO ou dans le PBS, seuls les peptides 4K-FluM1 et FluM1-4K sont capables, lorsqu'ils sont présentés par l'intermédiaire de dimères du CMH classe I, d'induire une sécrétion d'interféron y chez l'ensemble de la population clonale testée, sécrétion comparable à celle induite par le peptide natif FluM1 (cf. figure 8B). Comme attendu, lorsque l'expérience est effectuée en présence de dimères non chargés, aucune production d'interféron y n'est observée (cf. figures 8A et 9A).
Exemple 6 : Vérification de l'activité CTL des peptides dérivés de FluM1 et de ELA solubles dans le PBS (tableau IV) dans un modèle de souris transgéniques HLAA2/Kb
Parallèlement aux mesures d'interféron y chez le sujet HLA-A2 positif sensibilisé par le virus de la grippe, chacun des peptides solubles dans le PBS, décrits ci-dessus dans le tableau IV ainsi que le peptide 3D-FluM1 non soluble à 10 mg/ml dans le PBS mais soluble à 2 mg/ml dans le PBS concentration suffisante pour permettre de réaliser un test CTL, ont été testés pour l'induction d'une réponse de type cytotoxique (CTL) chez la souris HLA A2/kb. Pour ce faire ces peptides ont été administrés individuellement, par voie sous cutanée. Une injection constituée de 50 g de peptide dérivé de ELA, ou deux injections à une semaine d'intervalle constituées de 100 g de peptide dérivé de FluM1, + 300 g de P40 ont été effectuées. Dix jours
Parallèlement aux mesures d'interféron y chez le sujet HLA-A2 positif sensibilisé par le virus de la grippe, chacun des peptides solubles dans le PBS, décrits ci-dessus dans le tableau IV ainsi que le peptide 3D-FluM1 non soluble à 10 mg/ml dans le PBS mais soluble à 2 mg/ml dans le PBS concentration suffisante pour permettre de réaliser un test CTL, ont été testés pour l'induction d'une réponse de type cytotoxique (CTL) chez la souris HLA A2/kb. Pour ce faire ces peptides ont été administrés individuellement, par voie sous cutanée. Une injection constituée de 50 g de peptide dérivé de ELA, ou deux injections à une semaine d'intervalle constituées de 100 g de peptide dérivé de FluM1, + 300 g de P40 ont été effectuées. Dix jours
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après la dernière injection les cellules de la rate sont mises en culture en présence d'IL2 et de cellules présentatrices fixées et chargées avec le peptide ELA ou FluMl.
Sept jours après cette première stimulation, une seconde stimulation des cellules effectrices est effectuée suivie, après 5 jours d'une évaluation de l'activité cytotoxique par un test de relarguage de 51Cr. Ce test consiste à incuber des cellules EL4 A2/kb chargées avec le peptide avec différents ratio de cellules effectrices issues de la mise en culture et d'évaluer l'activité cytotoxique de ces cellules effectrices par calcul de la quantité de 51Cr relarguée par les cellules cibles lors de leur lyse par les cellules effectrices selon la formule : (Lyse des cellules cibles chargées - lyse spontanée) / (Lyse totale des cellules cibles chargées - lyse spontanée) x 100.
Dans cette formule, la lyse des cellules cibles correspond pour chaque ratio à la mise en contact des cellules cibles et des cellules effectrices ; la lyse spontanée correspond au relarguage spontané de 51Cr des cellules cible en absence de toute autre cellule et la lyse totale correspond au relarguage maximum de 51 Cr lors d'une lyse de la totalité des cellules cibles par addition de triton X100.
Afin de déterminer la spécificité de la réaction, un témoin est effectué en remplaçant les cellules cibles chargées avec le peptide par des cellules cibles non chargées qui ne doivent donc pas être reconnues par les cellules effectrices et par conséquent ne doivent pas être lysées par ces dernières.
Les figures 3A à 3C, 4A à 4C et 5A et 5B ci-après montrent que parmi les peptides testés, les dérivés ayant 4 résidus arginine et/ou lysine du côté N-terminal ou 4 résidus arginine et/ou lysine du côté C-terminal du peptide FluMl (figures 3A à 3C) et du peptide ELA (figures 4A à 4C et 5B) sont capables de générer une réponse CTL significative chez les souris HLA A2 Kb. L'importance particulière des peptides 4K- FluM1, 5K-FluM1, 4K-ELA, FluM1-4K, ELA-4K et 4R-ELA, réside en fait dans l'observation que des cellules effectrices issues de souris immunisées par ces peptides modifiés sont capables de lyser des cellules cibles chargées par les peptides parents FluMl ou ELA respectivement (figures 3A et 3B, 4A et 4B, 5B et 6).
En revanche, la substitution des résidus L-arginine et/ou L-lysine par des résidus D-arginine et/ou D-lysine semble avoir un effet négatif sur l'induction de la réponse cytotoxique malgré une solubilité aqueuse équivalente. En effet, les résultats obtenus avec les peptides 4k-FluM1 et 4k-ELA montrent l'absence de toute induction de réponse CTL lorsque ces peptides sont utilisés pour immuniser les souris HLA-
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A2/Kb. Les résultats obtenus dans les tests CTL sont en parfait accord avec ceux observés chez le sujet testé dans l'exemple 4 de sécrétion d'IFNy.
Il est également important de noter que le peptide 3D-FluM1, qui stabilise les molécules HLA-A2 à la surface des cellules T2 de façon similaire au peptide 4K- FluM1, n'est pas capable de générer une réponse cytotoxique (figure 7) lorsqu'il est testé dans des conditions identiques à celles de 4K-FluM1.
Claims (42)
1. Procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine avec au moins 1 résidu arginine, lesdits au moins trois résidus pouvant être de forme L ou D, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, et pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits au moins au total 3 résidus consistent en un panachage de résidus arginine et lysine.
3. Procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus arginine, de forme L ou D, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, ces au moins au total 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le nombre total de résidus arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou Cterminale dudit peptide modifié est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses, et encore mieux est de 4.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit peptide.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'ensemble des résidus arginine et/ou lysine ajoutés est de forme L.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'ajout par liaison covalente desdits au moins au total 3 résidus arginine et/ou lysine à l'extrémité libre N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide est réalisé par synthèse chimique, ou encore par fusion génétique lorsque la structure dudit peptide ainsi modifié le permet.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le peptide modifié est soluble en milieu aqueux à au moins 5 mg/ml.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit peptide modifié est soluble en milieu aqueux à au moins 7 mg/ml.
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10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit peptide est un principe actif capable d'exercer une action thérapeutique.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit peptide est un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit peptide est capable d'induire une réponse immune de type humoral ou cellulaire dirigée spécifiquement contre cet épitope.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit peptide est choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène pour un mammifère, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit peptide est capable de générer des lymphocytes CTL dirigés spécifiquement contre cet épitope.
15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, notamment de classe 1 ou II.
16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques choisi parmi les épitopes CTL.
17. Procédé selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que ledit peptide est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous la forme d'octapeptide, de nonapeptide, de décapeptide hydrophobes, d'un peptide hydrophobe d'au plus 15 acides aminés, ou encore sous la forme d'un regroupement d'épitopes hydrophobes.
18. Procédé selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisé en ce que : a) ledit peptide est un ligand du CMH capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu ; et, caractérisé en ce que :
<Desc/Clms Page number 34>
b) ledit ligand du CMH modifié est capable en solution aqueuse d'exercer une au moins des activités citées en a).
19. Procédé selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, comprenant ou constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
20. Procédé selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, comprenant ou constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et b) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; caractérisé en ce que : le ligand du CMH modifié est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand modifié du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
21. Ligand du CMH de nature peptidique modifié par l'adjonction d'au moins au total 3 résidus arginine, répartis à son extrémité N-terminale et/ou C-terminale, ces 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
22. Ligand du CMH modifié selon la revendication 21, caractérisé en ce que le nombre total de résidus arginine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit ligand modifié est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses.
23. Ligand du CMH modifié selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce qu'au moins 3 résidus arginine ont été ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit ligand du CMH.
24. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'ensemble des résidus arginine ajoutés est de forme L.
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25. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification est constitué d'au plus 15 acides aminés.
26. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 25, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène pour un mammifère, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
27. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 26, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes CTL.
28. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 27, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de décapeptide ou un regroupement d'épitopes hydrophobes.
29. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 28, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifiques dudit ligand du CMH et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu ; et, caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux dudit ligand du CMH avant modification est inférieure à 1 mg/ml.
30. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 29, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifiéest soluble en milieu aqueux à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 7 mg/ml.
31. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 30, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifié est capable en solution aqueuse de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-y et, le cas échéant, du TNF-a, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
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32. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 31, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification comprend un ou est constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
33. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 32, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifié est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID Nos. 75,76 et 77 et les peptides de séquence SEQ ID Nos. 78 et 79, ces peptides pouvant, le cas échéant, comprendre une mutation ponctuelle dans la séquence du ligand du CMH non modifié dont il est issu, notamment une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé naturel ou non naturel.
34. Peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 11 à 20, ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 21 à 33, comme médicament.
35. Composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi : - un peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 11 à 20, ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 21 à 33, le cas échéant mélangé ou couplé à une protéine porteuse ou l'un de ses fragments ; ou - une construction nucléique contenant un ADN codant pour un peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 11 à 20, ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 21 à 33, le cas échéant contenant en outre un ADN codant pour une protéine porteuse ou l'un de ses fragments.
36. Utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 13 à 18, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 32 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections par ce microorganisme, notamment des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
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37. Utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 13 à 20, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 34 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers associés à cette antigène, préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs associées à cette antigène.
38. Vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène ou associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 13 à 20, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 21 à 34 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques.
39. Composition pharmaceutique selon la revendication 35 ou vaccin selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant.
40. Composition pharmaceutique selon la revendication 35 ou 39 ou vaccin selon la revendication 38 ou 39, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un composé porteur mélangé ou couplé audit peptide modifié ou audit ligand du CMH modifié.
41. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 35,39 et 40 ou vaccin selon l'une des revendications 38,39 et 40, caractérisé en ce qu'il est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
42. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 35,39 à 41 ou vaccin selon l'une des revendications 38,39 à 40, caractérisé en ce qu'il est administrable par voie systémique, notamment par voie injectable, mucosale ou transdermique.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| FR0209522A FR2842811A1 (fr) | 2002-07-26 | 2002-07-26 | Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une reponse de type ctl antitumorale ou anti-infectueuse |
| PCT/FR2003/002353 WO2004011486A2 (fr) | 2002-07-26 | 2003-07-25 | Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une response de type ctl antitumorale ou anti-infectieuse |
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| FR2789588A1 (fr) * | 1999-02-17 | 2000-08-18 | Pf Medicament | Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie associee a un antigene dans une composition pharmaceutique destinee a generer ou accroitre une reponse cytotoxique antivirale, antiparasitaire ou antitumorale |
-
2002
- 2002-07-26 FR FR0209522A patent/FR2842811A1/fr active Pending
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| FR2789588A1 (fr) * | 1999-02-17 | 2000-08-18 | Pf Medicament | Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie associee a un antigene dans une composition pharmaceutique destinee a generer ou accroitre une reponse cytotoxique antivirale, antiparasitaire ou antitumorale |
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