JP2001502531A

JP2001502531A - ヒトスルフォニル尿素受容体ｓｕｒｈ

Info

Publication number: JP2001502531A
Application number: JP10516857A
Authority: JP
Inventors: オウ―ヤング、ジャニス; バンドマン、オルガ; コールマン、ロジャー
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2001-02-27
Also published as: WO1998014571A1; AU4742297A; CA2265466A1; EP0932672A1; US6235880B1; US6171815B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトスルフォニル尿素受容体（ＳＵＲＨ）及びＳＵＲＨを同定し、かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は一般的に遺伝子操作された発現ベクタ及びＳＵＲＨをコードする核酸配列を有する宿主細胞を提供すると共に、その蛋白質を精製するための方法を提供する。また本発明は、ＳＵＲＨ、ＳＵＲＨに対するタゴニスト、或いはＳＵＲＨに対するアンタゴニストを含む医薬品組成物を提供し、ＳＵＲＨの発現と関連する疾患の予防或いは治療におけるそのような組成物の使用法を提供する。さらに本発明は、ＳＵＲＨの発現に関連する疾患の治療のためにＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の使用を提供する。また、本発明は、ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチドのゲノム配列或いは転写物、またはＳＵＲＨに特に結合する抗ＳＵＲＨ抗体にハイブリダイゼーションするためにそのポリヌクレオチド或いはそのフラグメント或いは補体を利用する診断測定法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトスルフォニル尿素受容体ＳＵＲＨ技術分野本発明は新規のヒトスルフォニル尿素受容体の核酸配列及びアミノ酸配列に関連し、疾患の診断、研究、予防並びに治療におけるこれらの配列の使用に関連する。背景技術ＡＴＰ感受性カリウム（Ｋ_ATP）チャネルは、多くの種類の細胞において代謝性状態を電気活性に結合する役割を果たす。細胞を過分極することにより、Ｋ_AT _P チャネルは電気活性を制限し、それゆえＣａ²⁺流入を筋肉及び神経細胞に還元する。膵臓においては、Ｋ_ATPが血糖濃度とインスリン分泌とに間の臨界的な関連をもたらす。スルフォニル尿素（ＳＵ）は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療において幅広く用いられる経口の血糖降下剤である。ＳＵ刺激インスリンはランゲルハンス島ｂ細胞から遊離する。インスリン遊離のメカニズムは、１）ｂ細胞静止膜電位を設定するＫ_ATPチャネルの抑制、２）ｂ細胞脱分極を引き起こすＫ^-流出の削減、３）Ｃａ２＋流入、エキソサイトシス並びにインスリン遊離をもたらす１つ或いはそれ以上の電位依然性Ｌタイプカルシウムチャネルの活性化を伴う。トルブタミド或いはグリブリドのようなＳＵは、Ｋ_ATPチャネル活性を減少させ、それにより細胞を脱分極し、インスリン遊離を引き起こす。最近まで、Ｋ_ATPチャネル及びスルフォニル尿素受容体（ＳＵＲ）は、同じ分子であると考えられていた(Aguilar-Bryan et al(1995)Science268:423-426)。しかしながらＳＵＲは内因性Ｋ^-チャネル活性を所有していない(Ammala C et al (1996)Nature 379:545-548)。その代わりににＳＵＲは内向き整流Ｋ^-チャネルと相互作用し、これらのチャネルの活性にＳＵ及びＡＴＰ感受性を与え、これらのチャネルの活性を調節する(Inagaki N et al(1995)Science 270:1166-1170)。ＳＵＲ２で示されるＳＵＲの第２のアイソフォームが最近ラットにおいて発見されている。このアイソフォームは、ラットＳＵＲとは異なる組織分布及び異なるＳＵ及びＡＴＰ結合特性を有する(InagakiN et al(1996)Neuro 16:1011-1017) 。ＳＵＲ２と同時発現するＫｉｒ６．２、内向き整流Ｋ^-チャネルのチャネル動態は、ＳＵＲと同時発現するＫｉｒ６．２のチャネル動態とは異なる。これらの観測に基づいて、構造的に関連するが、機能的に異なるＳＵＲのファミリが、種々の組織におけるＡＴＰ感受性及びＫ_ATPチャネルの薬理学的反応を確定する(In agakiN et al(1996)，上記)。ラット及びハムスターからのＳＵＲは、１２個の電位膜貫通らせんを有する、それぞれ１５８１及び１５８２のアミノ酸からなる(Aguilar-Bryan et al．上記 )。さらに蛋白質はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリのヌクレオチド結合折りたたみ構造（ＮＢＦ）に強い類似性を有する２つのドメインを含む。ラット、ハムスター並びに最近報告されたヒトＳＵＲ(GenBank GI 1369844;un published)の提案されたトポロジーは、１つの外部アミノ末端、９個の予測膜貫通らせん、第１のサイトゾルＮＢＦ(ＮＢＦ−１)、４個以上の膜貫通らせん、第２のサイトゾルＮＢＦ（ＮＢＦ−２）並びにサイトゾルＣ−末端からなる。ＳＵＲのトポロジーは、多剤耐性（ＭＤＲ）蛋白質及び嚢胞性繊維症膜制限因子を含むＡＢＣスーパーファミリの他のメンバと類似である(CFTR;Philipson LH and S teiner DF(1995)Science 268:372-373)。ＡＢＣスーパーファミリ蛋白質のＮＢＦは、サイトゾルヌクレオチドとの相互作用を介して活性を制御する。嚢胞性繊維症では、より頻度が高く、かつ深刻な疾患突然変異が、ＣＦＴＲ蛋白質の２つのＮＢＦをコードするヌクレオチド内に配置される(Tsui L-C(1992)Trends Genet 8:392)。乳幼児期の家族性の持続高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）は、ＳＵＲのＮＢＦ−２に影響する突然変異により引き起こされる場合がある(Thomas PM et al(1995)Scienc e 268:426-429)。ＳＵ感受性Ｋ_ATPチャネルは脳細胞内に存在し、神経末端における神経分泌においてその役割を果たす。黒質、大きなＳＵ結合性を示す脳の領域におけるＫ_AT _P チャネルは、高いグルコース濃度及び抗糖尿病性ＳＵにより抑制され、ＡＴＰ欠失及び酸素欠乏により活性化される。さらにＫ_ATPチャネルの抑制は、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）遊離を活性化するのに対して、Ｋ_ATPチャネルの活性化は、ＧＡＢＡ遊離を抑制する(Amoroso S et al(1990)Science 247:854;Schmidt-Anto marchi et al(1990)Pro Natl Acad Sci USA 87:3489-3492)。心臓細胞における活動電位は、ＳＵＲに結合するＳＵ化合物により調節される。モルモット心臓細胞の活動電位の持続時間は、酸化的硫酸化の潅流或いは遮断により細胞内ＡＴＰ濃度（[ＡＴＰ]_in）を減少させることにより著しく減少した。グリベンクラミド、ＳＵ化合物は、これらの[ＡＴＰ]_in欠失性心臓細胞における正常な或いは概ね正常な活動電位を回復することが分かった(Fosset M et al( 1988)J Biol Chem 263:7933-7936)。回復により、ＳＵＲを介して活動するスルフォニル尿素化合物が心臓Ｋ_ATPチャネルを抑制するようになった。ＳＵＲは内向き整流カリウムチャネルに対するＡＴＰ及びＳＵ感受性を与え、それにより、代謝性状態を脳、膵臓並びに心臓のような組織内の電気的活性に結合する。ＳＵＲは、ＮＩＤＤＭ及びＰＨＨＩのような特異なＫ_ATPチャネル機能に関連する疾患の診断及び治療に有用である。ＳＵＲの発現或いは活性化を選択的に変更することにより、そのような疾患を有効に管理することができる。発明の開示本発明は、以後ＳＵＲＨと呼び、ラット及びハムスターからのＳＵＲ蛋白質に化学的及び構造的類似性を有するヒトスルフォニル尿素受容体蛋白質を開示する。従って、本発明は配列番号：１のアミノ酸配列及びＳＵＲの構造的な特徴を有する実質的に精製されたＳＵＲＨを特徴とする。本発明の１つの態様は、ＳＵＲＨをコードする分離され、かつ実質的に精製されたポリヌクレオチドを特徴とする。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号：２のヌクレオチド配列である。別の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号：２のＴ₂₇₈₀からＡ₂₉₂₃まで伸展するヌクレオチド配列である。また本発明は、配列番号：２の補体或いはその変異体を含むポリヌクレオチド配列に関連する。さらに本発明は、厳密性条件下で配列番号：２にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を特徴とする。また本発明はＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクタに関連し、宿主細胞或いは生体を形質転換或いは形質移入するためにそのベクタを使用することに関連する。また本発明はＳＵＲＨを精製するための方法を特徴とする。また本発明は、ＳＵＲＨポリペプチドに特に結合する抗体、並びにＳＵＲＨのアゴニスト及びアンタゴニストに関連する。また本発明は、適切な医薬品担体と共に、ＳＵＲＨ、そのフラグメント、ＳＵＲＨのアゴニスト或いはＳＵＲＨのアンタゴニストを含む医薬品組成物に関連する。図面の簡単な説明第１Ａ図−第１Ｍ図は、MacDNAsis soft ware(Hitachi Software Engineering Co Ltd.)を用いて精製されるヒトスルフォニル尿素受容体蛋白質ＳＵＲＨのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す。第２Ａ図−第２Ｈ図は、DNAStar software(DNAStar Inc.Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて生成されるＳＵＲＨ(配列番号：１) 、ヒトＳＵＲアイソフォーム(GI 1369844、配列番号：３)、ノルウェーラットからのＳＵＲ（ＧＩ 13115343、配列番号：４）並びにクロハラハムスターからのＳＵＲ（GI 784874、配列番号：５）間のアミノ酸配列アライメントを示す。定義本明細書で用いる「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌクレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖である場合があるゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアンチセンス鎖を表す。同様にここで用いるアミノ酸は蛋白質或いはペプチド配列ことである。本明細書で用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、１）無関係な（unca lled）塩基を分解するために再配列されているもの、２）５’或いは３’方向に XL-PCR(Perkin Elmer)を用いて伸展され、再配列されているもの、３）２つ以上のIncyte clone GCG Fragment Assembly System.(GCG，Madison WI)より大きい重複配列から構築されているもの、或いは４）伸展及び構築のいずれもが施されているもののことである。本明細書で用いる「ペプチド核酸」は、リジンのようなアミノ酸残基及びアミノ基が加えられているオリゴマーからなる分子のことである。これらの小さな分子は、抗遺伝因子(antl-gene agent)とも呼ばれ、核酸の相補（鋳型）鎖（Nielsen PE et al（1993）Anticancer Drug Des 8:53-63）に結合することにより転写伸展を停止する。ＳＵＲＨの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸を置換することにより異なるアミノ酸配列と定義される。変異体は「保存的に」変化する場合があり、置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンと置換する場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあるが、変異体は、グリシンをトリプトファンと置換する場合のように「非保存的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、またはその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくアミノ酸残基が、どのように何個置換、挿入或いは欠失されればよいかを確定する際の指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNAStar softwareを用いて見出すことができる。「欠失」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド残基或いはアミノ酸残基がそれぞれ欠失して、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列のいずれかが変化することである。「挿入」或いは「付加」は、結果的に、自然発生ＳＵＲＨに比べて、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド残基或いはアミノ酸残基がそれぞれ加わり、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列が変化することである。「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸により置換されることに起因する。用語「生物学的活性」は、自然発生ＳＵＲＨの構造的、調節的或いは生化学的機能を有するＳＵＲＨのことである。同様に「免疫学的活性」は、自然、組換え体或いは合成ＳＵＲＨまたはそのオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ特定の抗体と結合する能力と定義する。用語「アゴニスト」は、ＳＵＲＨに結合される際に、ＳＵＲＨの生物学的活性を調節するＳＵＲＨの変化を引き起こす分子のことである。用語「アンタゴニスト」は、ＳＵＲＨに結合される際に、ＳＵＲＨとアゴニストとの結合を遮断し、ＳＵＲＨの生物学的活性におけるアゴニスト誘導型の変化を防ぐ分子のことである。アゴニスト及びアンタゴニストは、蛋白質、核酸、炭水化物、或いはＳＵＲＨに結合する他の分子を含むことができる。ここで用いられる用語「調節」は、ＳＵＲＨの生物学的活性の変化或いは変更のことである。調節は、生物学的活性、結合特性の変化、或いはＳＵＲＨの生物学的特性の任意の他の変化を増加或いは減少させることができる。本明細書で用いる用語「誘導体」は、核酸配列をコードするＳＵＲＨ或いはコードされたＳＵＲＨの化学的修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基で置き換えることである。核酸誘導体は、自然ＳＵＲＨの本質的な生物学的特性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、分子、すなわち自然環境から除去されるか、隔離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のいずれかのことであり、自然に結合する他の組成物から少なくとも６０％遊離し、好適には７５％遊離し、さらに好適には９０％遊離している。「厳密性」は典型的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）から約Ｔｍより２０〜２５℃低い温度において生じる。当業者には理解されるように、厳密性ハイブリダイゼーションを用いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定或いは検出するか、或いは類似の、または関連するポリヌクレオチド配列を同定或いは検出することができる。本明細書で用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する任意のプロセス」（Coombs J(1994)Dictionary of Biot echnology ,Stockton Press,New York NY）を含むものとする。ポリメラーゼ連鎖反応技術において実行されるような増幅は、Dieffenbach CW and GSDveksler(19 95,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY) に記載される。好適な実施例本発明は、ヒト脳組織（BRAINOT03）から形成されるライブラリからのｃＤＮＡの中で最初に同定されたヒトスルフォニル尿素受容体蛋白質ＳＵＲＨに関連し、疾患の研究、診断、予防並びに治療においてここで開示される核酸配列及びアミノ酸配列を使用することに関連する。LIFESEQ^TMdatabase(Incyte Pharmaceuti cals,Palo Alto CA)を用いるノーザン法は、ＳＵＲＨコード化ヌクレオチド配列が、脳において最も豊富に転写され、また膵臓、乳房、子宮並びに前立腺においても見いだされるということを示す。ＳＵＲＨの自然発生発現は、これらの組織に制限される必要はないということに注意されたい。また本発明はＳＵＲＨ変異体を含む。ＳＵＲＨ変異体は、ＳＵＲＨアミノ酸配列（配列番号：１）に少なくとも８０％アミノ酸配列類似性を有するものが好ましく、配列番号：１に少なくとも９０％アミノ酸配列類似性を有するものがより好ましく、配列番号：１に少なくとも９５％アミノ酸配列類似性を有するものが最も好ましい。ＳＵＲＨをコードする核酸配列は、アミノ酸配列アライメントに対するコンピュータ生成検索を介してｃＤＮＡ Incyte Clone 662342において最初に同定された。本明細書において開示されるコンセンサスヌクレオチド配列、配列番号：２は、ＳＵＲＨと呼ばれるアミノ酸配列、配列番号：１をコードする。コンセンサスヌクレオチド配列は、LIFESEQTMdatabase(Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto CA)からのIncyte Clones 1270543 (BRAINOT09); 1332410 (PANCNOT07) ;6 40147(BRSTNOT03);641239(BRSTNOT03)，662342(BRAINOT03)並びに952281(PANCNO T05)から伸展されかつ構築された。本発明は、ヒトからのＳＵＲＨ及びＳＵＲアイソフォーム（GI1369844）及びラット（GI 13115343;Aguilar-Bryan et al，上記）並びにハムスター（GI 7848 74;Aguilar-Bryanetal，上記）からのＳＵＲ相同体の中の、第２Ａ図−第２Ｈ図に示される化学的相同性に一部基づいている。ヒトアイソフォーム、ラット相同体並びにハムスター相同体は、ＳＵＲＨに対してそれぞれ９６％、９２％並びに９０％のアミノ酸配列同一性を有する。ＳＵＲＨ蛋白質配列は１５８０アミノ酸からなる。アミノ酸配列アライメント（第２Ａ図−第２Ｈ図）及びその疎水性から、ＳＵＲＨは31-51,75-94,135-155, 169-189,306-323,350-368,448-469,540-560,576-596,1002-1020,1063-1076,1154 -1172,and 1276-1296に或いはその付近の残基に位置する１２個の電位膜貫通らせんを有する。さらにその蛋白質は、残基695-893(NBF-1)及び1356-1534(NBF-2) を含む２つのヌクレオチド結合折りたたみ構造（ＮＢＦ）ドメインを含む。ＳＵＲＨの予測トポロジーは、１つの細胞外アミノ末端、９個の膜貫通らせん、サイトゾルＮＢＦ −１、４個の膜貫通らせん並びにサイトゾルＣ−末端において最大数になるサイトゾルＮＢＦ−２からなる。さらにＳＵＲＨ蛋白質配列は、１１個の電位Ｎ−グリコシレーション部位を含む。これらの電位Ｎ−グリコシレーション部位の４つ、Ｎ₁₀、Ｎ₄₀₅、Ｎ₁₀₄₈、並びＮ₁₀₅₈は、予測された細胞外に面する表面ループ上に存在する。第２Ａ図−第２Ｈ図に示されるように、ＮＢＦ−１と１０番目の予測膜貫通らせんとの間にある領域の位置９１３−９２３、９２５−９４３並びに９５２−９６０におけるＳＵＲＨアミノ酸配列は、ヒトＳＵＲアイソフォーム (GI 1369844)内の対応するアミノ酸残基と同一ではない。ＳＵＲＨコード化配列ＳＵＲＨの構築された核酸配列及び由来するアミノ酸配列が第１Ａ図−第１Ｍ図に示される。本発明により、ＳＵＲＨのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＳＵＲＨを発現する組み換え体分子を生成することができる。ここで記載される特定の実施例では、ＳＵＲＨをコードする部分配列は、ヒト脳組織ｃＤＮＡライブラリ(BRAINT03)からのIncyte Clone 662342として最初に分離された。上記のように、ヒトＳＵＲアイソフォーム(GI 1369844)と配列番号：２のヌクレオチドＴ２７８０からＡ２９２３に対応する配列番号：１のアミノ酸Ｓ９１３からＲ９６０間のＳＵＲＨとの間に最小限のアミノ酸配列同一性が存在する。配列番号：２のこの領域に対するオリゴヌクレオチド相補性は、本発明のＳＵＲＨに対して著しい特異性を有する。そのようなオリゴヌクレオチドはＳＵＲＨに対して特定の診断及び治療に対して有用である。遺伝子のコードの縮重の結果として、その内の幾つかが任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最小限の類似性を示す、多数のＳＵＲＨコード化ヌクレオチド配列が生成される場合があるということは当業者には理解されよう。本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより形成されることができるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異体を考慮する。これらの組み合わせは、自然発生ＳＵＲＨのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝子コードにより行われ、全てのそのような変異体が特に開示されるものと見なされるべきである。ＳＵＲＨをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適当に選択された厳密性の条件下で自然発生ＳＵＲＨのヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできることが好ましいが、実質的に異なるコドンを使用するＳＵＲＨコード化ヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利である場合もある。コドンを選択することにより、特定のコドンが宿主により利用される頻度によりペプチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加することができる。コードされたアミノ酸配列を変更することなくＳＵＲＨをコードするヌクレオチド配列及びその誘導体を実質的に変更するための他の理由は、自然発生配列から形成される転写物ではなく、より大きな半減期を有するようなより望ましい特性のＲＮＡ転写物を生成することを含む。合成化学を用いて、ＳＵＲＨをコードするＤＮＡ配列あるいはその一部及びその誘導体を完全に生成することができ、その後その合成遺伝子は、本特許出願の出願時点で当技術分野において周知の試薬を用いて、多くの市販のＤＮＡベクタ及び細胞系の任意のものに挿入されることができる。さらに合成化学を用いて、ＳＵＲＨをコードする遺伝子内に突然変異を導入することができる。また種々の厳密性の条件下で、第１Ａ図−第１Ｍ図のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド配列が本発明の範囲内に含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、参照して本明細書の一部としている Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,SanDiegoCA)に開示される核酸結合複合体或いはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された厳密性において用いることができる。本発明のおいて用いることができるＳＵＲＨをコードする変更された核酸配列は、同一或いは機能的に等価なＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入或いは置換を含む。また蛋白質は、サイレントな変化を引き起こし、機能的に等価なＳＵＲＨをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換を示す場合もある。ＳＵＲＨの生物活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基づいて故意にアミノ酸を置換することができる。負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びプルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン、或いはアルギリンを含み、類似の親水性値を有する帯電しない極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フエニルアラニン並びにチロシンを含む。ＳＵＲＨのアレルが本発明の範囲内に含まれる。ここで用いられる「アレル」或いは「アレル配列」は、ＳＵＲＨの別形態である。アレルは、突然変異、すなわち核酸配列における変化を引き起こし、一般に変更されたｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成する。ポリペプチドの構造或いは機能は変更されてもされなくてもよい。任意の所与の遺伝子は、アレル形を含まない場合、或いは１つ或いは多くのアレル形を含む場合がある。アレルを生じる共通の突然変異的な変化は、一般にアミノ酸の自然欠失、付加或いは置換に依存する。それぞれのこの種の変化は、単独で、或いは他の変化と組み合わせて、所与の配列において一度或いはそれ以上生ずる場合がある。ＤＮＡ配列化のための方法は当分野において周知であり、Klenowfragment of DNA polymerase I.Sequenase登録商標(US BiochemicalCorp.Clevel and OH),Taq polymerase(Perkin Elmer,Norwalk CT),thermostable T7 polymerase(Amersham ,Chicago IL)或いはGibco BRL(Gaithersburg MD）により市販されるELONGASE Am plification Systemのような組み換え体ポリメラーゼ及びプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組み合わせのような酵素を用いる。そのプロセスは、Hami lton Micr Lab 2200(Hamilton,Reno NV),Peltier Thermal Cycler（PTC200:MJ R esearch,Watertown MA）並びにABI377ＤＮＡsequencers(Perkin Elmer)のような機械を用いて自動化されることが好ましい。ポリヌクレオチド配列の伸展ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチド配列は、部分ヌクレオチド配列並びにプロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において既知の種々の方法を用いて伸展されることができる。例えば、ある方法では、汎用プライマを用いて既知の位置に隣接する未知の配列を回復する直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる場合がある（Gobi nda et al(1993)PCR Methods Applic 2:318-22）。特に、ゲノムＤＮＡは、リンカー配列に対するプライマの存在時に、かつ既知の領域における特定のプライマの存在時に増幅される。増幅された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特定のプライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列される。逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅或いは伸展することができる（Triglia T et al（1988）Nucleic Acids Res 16:8186 ）。プライマはOLIGO（登録商標）4.06 Primer Analysis Software(1992;Nation al Biosciences Inc,Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムを用いて設計され、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有するか、或いは約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールする場合もある。その方法は、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域内に適当なフラグメントを生成する。その後そのフラグメントは、分子間連結反応により環状にされ、ＰＣＲ鋳型として用いられる。用いられる可能性のある別の方法は、ヒトの既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントと酵母菌人エクロモソームＤＮＡとをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lagerstrom M et al（1991）PCR Methods Applic 1:111-19）である。捕獲ＰＣＲは、多数の制限酵素消化及び連鎖反応を伴い、操作された二本鎖配列を、ＰＣＲに先行してＤＮＡ分子の未知の部分に配置する。未知の配列を回復するために用いられる可能性のある別の方法は、Parker JD et al(1991;Nucleic Acids Res19:3055-60による方法である。さらに、ある方法はＰＣＲ，入れ子状プライマ並びにPromoterFinder libraryを用いて、ゲノムＤＮＡに歩行することができる(PromoterFinder(登録商標)Clontech,Palo Alto CA)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン／エクソン接合部を見つける際に有用である。完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングするための好適なライブラリは、より長いｃＤＮＡを含むように大きさを選択されたライブラリである。またランダムに初回抗原剌激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５’及び上流領域を含むより大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡをもたらさない場合には特に有効な場合がある。ゲノムライブラリは、５’非翻訳調節領域に伸展するために有用である。毛細管電気泳動法を用いて、配列化或いはＰＣＲ生成物の大きさを解析したり、或いはヌクレオチド配列を確認したりする場合もある。迅速に配列化するためのシステムは、Perkin Elmer,Beckman Instruments(Fullerton CA)或いは他の企業から購入することができる。毛細管シーケンス法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化される（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料、並びにＣＣＤカメラによる放射波長の検出を用いる場合もある。出力／光輝度が適当なソフトウエア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM(Perkin Elmer)）を用いて電気信号に変換され、サンプルを載置することからコンピュータ解析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列化に特に適している。３０分間でＭ１３ファージＤＮＡ.の３５０ｂｐまでの再現配列化が報告されている(Ruiz-Martinez MC e t al(1993)Anal Chem 65:2851-8)。ヌクレオチド配列の発現本発明に従って、ポリペプチド、融合蛋白質、或いはその作用的等価物のフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列が、適当な宿主細胞においてＳＵＲＨの発現をもたらす組換え体ＤＮＡ分子に用いられる場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か、或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を用いて、ＳＵＲＨをクローニングし、発現する場合もある。これは非自然発生コドンを処理するＳＵＲＨ−コードヌクレオチド配列を生成するために有利な場合もあることは当業者には理解されよう。特定の原核或いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、例えば、ＳＵＲＨコード配列発現の割合の増大したり、或いは自然発生配列から生成される転写物ではなく、より長い半減期のような所望の特性を有する組換え体ＲＮＡ転写物を生成することができる(Murray E et al(1989)NucAcids Res 17:477-508)。本発明によるヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾する修正を含む種々の理由によりＳＵＲＨを修正するために処理されることができる。例えば、突然変異が、当分野で周知の技術を用いて導入される場合がある。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの修正、コドン基準の変更、スプライシング変異体の生成等を行うこともできる。本発明の別の実施例に従って、自然、修飾或いは組換え配列コード化ＳＵＲＨは、融合蛋白質をコードするために異種配列に結合されることもできる。例えば、ＳＵＲＨ活性の阻害剤のためのペプチドライブラリをスクリーニングする場合に、それは、市販されている抗体により認識されるキメラＳＵＲＨ蛋白質をコードするために有用な場合もある。また融合蛋白質は、ＳＵＲＨ配列と異種蛋白質配列との間に位置する分割部位を含むように処理されることもでき、それによりＳＵＲＨは分割され、概ね異種部分から離隔して精製されるようになる。本発明の別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＳＵＲＨに対するコード化配列は、全体か或いはその一部分が合成される（Caruthers MH et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23，Horn T et al(1980)Nuc Acids Res S ymp Ser 225-32,etc参照）。別法では、蛋白質自体が、アミノ酸配列の全体或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術(Roberge JY et al(1995)Science 269:202-204)を用いて実行されることができ、自動化合成は、例えばABI 431A Peptide Synthes izer(Perkin Elmer)を製造業者により提供される取扱説明書に従って用いて達成することができる。新しく合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより概ね精製されることができる（例えばCreighton(1983)Proteins，Structures and Mole cular Principles,WH Freeman and Co,New York NY）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸解析及びシーケンス法により確認することができる（例えばEdmandeg radation procedure;Creighton，上記）。さらにＳＵＲＨのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直接合成中に修正されるか、並びにまた他の蛋白質或いはその任意の一部からの配列に化学的方法を適用して結合され、変異体ポリペプチドを生成する場合もある。発現系生物学的活性ＳＵＲＨを発現するために、ヌクレオチド配列コード化ＳＵＲＨ或いはその作用的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコード化配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むベクタ内に挿入される。当業者に周知の方法を用いて、ＳＵＲＨコード化配列及び転写或いは翻訳制御を含む発現ベクタを構成することができる。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎｖｉｖｏ組換え或いはゲノム組換えを含む。そのような技術はSambrook et al（1989）Molecular Clonlng,A Laborato ry Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY and Ausubel FM et al(198 9)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons,New York NY に記載されている。種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＳＵＲＨコード化配列を包含し、発現する場合もある。これらは、限定するわけではないが、組換え体バクテリオファージ、プラスミド、或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母菌発現ベクタと形質転換された酵母菌、ウイルス発現ベクタに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタに形質移入した植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタに形質移入した植物細胞系（例えば、Ｔｉ或いはｐＢＲ３２２プラスミド）、或いは動物細胞系のような微生物を含む。これらの系の「制御素子」或いは「調節配列」は、長さ及び特異性において変化し、ベクタ、エンハンサ、プロモータ並びに３’非翻訳領域の非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞蛋白質と相互作用する場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の転写及び翻訳素子を用いてよい。例えば、バクテリア系においてクローニングする際、Bluescript（登録商標）phagemid(Stratagene,LaJolla CA)或いはp Sport 1(Gibco BRL)のハイブリッド１ａｃＺプロモータ並びにｐｔｒｐ−１ａｃハイブリッド等のような誘導性プロモータを用いることもできる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータが昆虫細胞に用いられる。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショックＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵蛋白質遺伝子）、或いは植物ウイルス（例えば、ウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）由来するプロモータ或いはエンハンサが、ベクタにクローニングされる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスからのプロモータが最も適切である。もしＳＵＲＨの多数の複製を含む細胞株を発生させる必要があるなら、ＳＶ４０或いはＥＢＶに基づくベクタを適当な選択可能マーカと共に用いてもよい。バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＳＵＲＨに対する使用に応じて選択されてもよい。例えば、大量のＳＵＲＨが抗体を誘導するために必要とされるとき、容易に精製される融合蛋白質を高レベルで発現させるベクタが望まれる場合もある。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＳＵＲＨコード化配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッド蛋白質が生成されるBl uescript（登録商標）(Stratagene) のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及び発現ベクタ、ｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster(1989)Ｊ Biol Chem264:5503-5509）等を含む。ｐＧＥＸベクタ（Promega，Madison WI）を用いて、グルタチオン-S-トランスフエラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合蛋白質として異種のポリペプチドを発現してもよい。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性であり、遊離グルタチオンの存在時に溶出により後続されるグルタチオンーアガロースビードへの吸収により分離した細胞から容易に精製することができる。その系内で形成される蛋白質は、ヘパリン、トロンビン或いは第ＸＡ因子プロテアーゼ分割部位を含むように設計され、対象のクローニングされたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から放出されることができる。酵母菌、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ並びにＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いてもよい。一般的な方法は、Ausubel et al（supra）and Grant et al（1987 ）Methods in Enzymology 153:516-544に見出される。植物発現ベクタが用いられる場合には、ＳＵＲＨをコードする配列の発現は、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモータ(Brlsson et al(1984)Nature310:511-514)のようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶからのω−リーダ配列（Takamatsu et a l (1987)EMBO J 6:307-311）と共に用いることができる。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ(Coruzzi et al(1984)EMBO J 3:1 671-1680;Broglie et al(1984)Science 224:838-843)或いは熱ショックプロモータ(Winter J and Sinibaldi RM(1991)Results Probl Cell Differ 17:85-105)を用いてもよい。これらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されることができる。これらの技術を再確認する場合には、Hobbs Ｓ o r Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technnology(1992)McGra w Hill New York NY,pp 191-196或いは Weissbach and Weissbach（1988）Metho ds for Plant Molecular Biology，Academic Press,New York NY,pp 421-463を参照されたい。ＳＵＲＨコード化配列を発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。あるそのような系では、autographa californica 核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして用いて、ヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫(Trichoplusia larvae)において外来遺伝子を発現する。ＳＵＲＨコード化配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＳＵＲＨコード化配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり、コート蛋白質の外皮を欠如する組換え体ウイルスが生成される。その後組換え体ウイルスを用いて、ＳＵＲＨが発現されるヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバの幼虫を感染させる（Smith et al(1983)Ｊ Virol 46:584;Engelhard EK et al(19 94),Proc Nat Acad Sci 91:3224-7）。哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＳＵＲＨコード化配列は、後期プロモータ及び３深裂のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域内の挿入の結果、感染した宿主細胞内にＳＵＲＨを発現することができる生存可能ウイルスが生成される（Logan and Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci81:3655-59）。さらにラウス肉腫エンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させてもよい。また特定の開始シグナルもＳＵＲＨコード化配列の有効な転写のために必要とされる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。ＳＵＲＨコード化配列、その開始コドン並びに上流配列が適当な発現ベクタに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながら、コード化配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の転写制御シグナルが与えられるべきである。さらに、開始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなければならない。外来性転写素子及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の起源からなることができる。発現の効率は、使用中の細胞系に適当なエンハンサを含めることにより高められる場合がある（Scharf D et al(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62:Bitt ner et al(1987)Methods in Enzymol 153:516-544）。さらに宿主細胞系は、挿入した配列の発現を修飾することができるように、或いは所望のように発現した蛋白質を処理することができるように選択されてもよい。そのようなポリペプチドの修飾は、限定するわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸エステル化、脂質化或いはアシル化を含む。「プレ蛋白質（prepro）」形態の蛋白質を切断する事後翻訳処理も、正確な挿入、折りたたみ並びにまた機能のために重要である。 CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のような種々の宿主細胞は、そのような事後翻訳活性のために特異の細胞機構及び特性機構を有し、導入された外来蛋白質の正確な修飾及び処理を確実にするように選択されることができる。長期に渡って歩留まりの高い蛋白質の生産を行う場合、安定した発現が望ましい。例えば、ＳＵＲＨコード化配列を安定に発現する細胞株は、複製或いは内在性発現素子のウイルス起源及び選択可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換されことができる。ベクタの導入に後続して、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させる場合もあり、その後選択培地に切り替えられる。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安定して形質転換された細胞の抵抗性凝集塊は、細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。任意の数の選択系を用いて、形質転換される細胞株を回収することができる。これらは、限定するわけではないが、それぞれｔｋ−細胞或いはａｐｒｔ−細胞に用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ及び及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子を含む(Wigler M et al(1977)Cell 11:223 -32;Lowy I et al(1980)Cell 22:817-23)。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を選択のための基剤として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与え、ｎｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え、ａｌｓ及びｐａｔはそれぞれ、クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与える(Wigler M et al(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70;Colbere-Garapin F etal(1981)J Mol Biol 150:1-14:Murry,上記)。さらに選択可能遺伝子を用いる場合もあり、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようになる(Har tman SC and RC Mulligan(1988)ProcNatl Acad Sci 85:8047-51)。アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンを用いて、転換体を同定するのみならず、特異のベクタ系に帰する一過性或いは安定した蛋白質発現の量を定量することもできる(Rhodes CA e t al(1995)Methods Mol Biol 55:121-131)。ポリヌクレオチド配列を含む転換体の同定マーカ遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その存在及び発現が確認されるべきである。例えば、もしＳＵＲＨコード化配列がマーカ遺伝子配列内に挿入されるなら、ＳＵＲＨコード化配列を含む組換え細胞は、マーカ遺伝子機能の不在により同定されることができる。別法では、マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＳＵＲＨ配列と直列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、直列のＳＵＲＨコード化配列の発現も同様に示す。別法では、ＳＵＲＨコード化配列を含み、ＳＵＲＨを発現する宿主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されてもよい。この手順は、限定はしないが、核酸或いは蛋白質の検出並びにまた定量化のための技術に基づく膜、溶液或いはチップを含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び蛋白質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＳＵＲＨコード化配列のプローブ、一部或いはＳＵＲＨ−コード化ヌクレオチドのフラグメントを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅することにより検出されることができる。アッセイに基づく核酸増幅は、ＳＵＲＨＤＮＡ或いはＲＮＡを含む転換体を検出するために、ＳＵＲＨ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマを使用することを伴う。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマ」は、少なくとも約１０ヌクレオチドから６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列を含み、ヌクレオチドをプローブ或いはアンプライマとして用いることができる。ＳＵＲＨの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、蛋白質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いており、当業者には周知である。例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＥ）である。ＳＵＲＨの２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイ（monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合蛋白競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した測定法及び他の測定法は、Hampton R et al(1990,Serological Methods,a Laboratory Manu al ,APS Press,St.Paul MN)及びMaddox DE et al(1983,JExp'Med 158:1211に記載される。幅広い標識及び接合技術は当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸測定法において用いることができる。ＳＵＲＨに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための手段は、標識されたヌクレオチドを用いる、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化或いはＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＳＵＲＨ配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタは当分野において知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、或いはＳＰ６及び標識されたヌクレオチドのような適当なＲＮＡポリメラーゼを加えることによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いる場合もある。これらの手順を実行するためのいくつかの市販のキット或いはプロトコルは、 Pharmacia Biotech(Piscataway NJ),Promega(Madison WI)並びにUS Biochemical Corp(Cleveland OH)のような企業から購入することができる。適当なリポータ分子或いは標識は、その放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、阻害剤、磁気粒子等を含む。そのような標識の使用を開示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号並びに第４，３３６，２４１号を含む。また組換え体免疫グロブリンは、参照して本明細書の一部としている米国特許第４，８１６，５６７号に示されるように生成されることができる。ＳＵＲＨの精製ＳＵＲＨコード化ヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのコードされた蛋白質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることができる。組換え体細胞により生成される蛋白質は、用いられる配列並びにまたベクタにより細胞内に包含されるか或いは分泌される。ＳＵＲＨ含む発現ベクタは、効率的な生成及び原核細胞膜或いは真核細胞膜内へのＳＵＲＨの適当な膜貫通挿入のために設計することができることは当業者には理解されよう。他の組換え体構造を用いて、可溶性蛋白質の精製を容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＳＵＲＨを結合してもよい(Kroll D J et al(1993)DNA Cell Biol 12:441-53、融合蛋白質の含む下記のベクタの議論を参照)。またＳＵＲＨは、蛋白質精製を容易にするために加えられる１つ或いはそれ以上の追加ポリペプチド領域を用いて組換え体蛋白質として発現することもできる。そのような精製を容易にする領域は、限定するわけではないが、固定化金属において精製できるようにするヒスチジンートリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリンにおいて精製できるようにするプロテインＡ領域、並びにＦＬＡＧＳ伸展／親和精製系（Immunex Corp,Seattle WA ）において利用される領域を含む。精製領域とＳＵＲＨとの間にあるＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen,San Diego CA)のような分割可能リンカー配列の含有物は、精製を容易にするために有用である。ＳＵＲＨを含む融合蛋白質の発現のために与える１つのそのような発現ベクタは、核酸コード用６ヒスチジン残基を含み、それにチオレドキシン及びエンテロキナーゼ分割部位が後続する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Porath et al(1992)Protein Expression and Purification 3:263-281に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ）における精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ分割部位は融合蛋白質から蛋白質を精製するための手段を与える。組換え体生成物に加えて、ＳＵＲＨのフラグメントが、固相技術（Stewart et al（1969）Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，S an Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いてペプチド合成することにより生成される場合もある。ｉｎｖｉｔｒｏ蛋白質合成は手動技術或いは自動化を用いて実行されることができる。例えば、Applied Bios ystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer,Foster City CA)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いて、自動化合成を実現してもよい。ＳＵＲＨの種々のフラグメントは化学的に個別に合成されるか、或いは完全長分子を生成するために化学的方法を用いて結合されてもよい。ＳＵＲＨの使用ここで開示されるポリペプチド及びポリヌクレオチド配列の使用に対する合理性は、ＳＵＲＨ及びヒトアイソフォーム、ＳＵＲのラット相同体及びハムスター相同体の中の化学的及び構造的相同性に一部基づいている。ＳＵＲ／Ｋ_ATPチャネル複合体は、神経分泌において役割を果たし、高血糖症及び低血糖症並びに虚血に対する脳の反応に関係する。膵臓においては、血糖濃度とインスリン分泌との間に臨界的な結合が存在する。心臓細胞では、活動電位がＳＵＲに結合するスルフォニル尿素（ＳＵ）化合物により調節される。従って、その後ＳＵＲＨは、疾患の診断及び治療において、限定はしないがタイプＩＩ糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、高血糖症及び低血糖症（ＰＨＨＩを含む）、刺激波動障害（不整脈及び頻脈等）並びにＳＵＲ及びＳＵＲ／Ｋ_ATPチャネル複合体に関連する他の障害のような条件下で用いることができる。いくつかのＳＵ治療は、ＮＩＤＤＭ及び関連する障害の治療において非常に有効であるが、不利な副作用も有する。ＳＵは、大量のグルコース注入及び数日間の入院を必要とする重く、長期化する低血糖症を引き起こすようになる。さらにいくつかのＳＵは、薬物誘導性紅皮症（剥脱性皮膚炎）を含む皮膚障害を引き起こすようになる。それゆえ分離されたＳＵＲＨ蛋白質或いはそのフラグメントは、例えば、より望ましい結合特性、より有効な代謝性半減期或いは従来のＳＵ治療より少ない衰弱性の副作用を有する新規の治療分子のためにスクリーニングするための薬物発見プログラムにおいて標的として有用である。ＳＵＲＨ或いはそのフラグメントを用いて、タゴニスト或いはアンタゴニストのようなＳＵＲＨ或いはそのフラグメントが結合する他の特定の分子を同定することができる。ＳＵＲＨ特異性抗体は、ポリペプチドの発現と関連する状態及び疾患の診断及び治療に対して有効である。ＳＵＲＨを特に認知する抗体を用いて、診断のためのＳＵＲＨを定量することができる。治療用抗体を用いて、ＳＵＲＨ並びにまたＫ_ATPチャネルに関連する疾患或いは状態を治療するために、ＳＵとＳＵＲＨとの間或いはＳＵＲＨとＫ_ATPチャネルとの間の相互作用を遮断或いは変更することができる。いくつかの実施例では、ＳＵＲＨ発現を抑制することが有利な場合もある。突然変異体ＳＵＲＨ配列の発現は、ＳＵＲＨアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより抑制することができる。配列番号：２のＳＵＲＨ核酸配列は、有効な真核発現ベクタ内に組み込まれ、遺伝子治療のために体細胞内に直接投与されることができる。同様に、ｉｎｖｉｔｒｏ生成されるＲＮＡ転写物は、リポソーム内に封入され、リポソームを介して投与されることができる。そのようなベクタ及び転写物は、一時的に機能するか、或いはより長い発現のために宿主染色体ＤＮＡ内に組み込まれる場合もある。被験者内の遺伝的構造のｉｎｖｉｖｏ送達は、標的となる特定の細胞子の先端に発生する。特定の細胞に対する送達は、例えば接種を媒介する細胞特異性受容体を認知する蛋白質性リガンドと核酸とを合成することにより達成される(Wu GY et al(1991)J Biol Chem 266:14338-42参照)。別法では、組み換え体核酸構成物が、局部的な接種及び組み込みのために直接注入されてもよい(Jiao S et a l(1992)Human Gene Therapy 3:21-33)。ＳＵＲＨ抗体ＳＵＲＨ特異抗体は、ＳＵＲＨの発現に関連する状態及び疾患の治療に対して有用である場合がある。そのような抗体は、限定するわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメントを含む場合がある。ダイマー形成物を抑制する抗体のような、抗体を中和することは、診断及び治療に対して特に好ましい。抗体を誘導するためのＳＵＲＨは生物学的活性を必要としない。しかしながら、蛋白質フラグメント或いはオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異な抗体を誘導するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸からなり、好ましくは１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。好ましくは、そのペプチドは自然の蛋白質のアミノ酸配列の一部を模倣し、小さな自然発生した分子の全アミノ酸配列を含む場合がある。ＳＵＲＨアミノ酸の短い伸展は、キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に抗して生成される抗体のような別の蛋白質のアミノ酸と融合される場合もある。当分野で周知の手順がＳＵＲＨに対する抗体を生成するために用いることができる。抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は、ＳＵＲＨ或いは任意の一部、フラグメント、或いは免疫原特性を保持するオリゴペプチドを注入することにより免疫される。宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて、免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバントは、限定するわけではないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質を含む。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム ‐パルヴムが、潜在的に有用なヒトアジュバントである。ＳＵＲＨに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技術は、限定するわけではないが、最初にKoehler and Milstein(1975 Nature 256:495 -497)により記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ko sbor et al(1983)Immunol Today 4:72;Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci 80 :2026-2030)、並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al(1985)Monoclona l Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,New York NY,pp77-96）を含む。さらに「キメラ抗体」の生成のために開発された技術、適当な抗原特異性及び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングが用いられることができる（Morrison et al(1984)Proc Natl Acad S ci 81:6851-6855:Neuberger et al(1984)Nature 312:604-608;Takeda et al(198 5) Nature 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために開示された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＳＵＲＨ特異性一本鎖抗体を生成するために適用されることができる。また抗体は、リンパ球集団においてｉｎｖｉｖｏ生成を誘導することにより、或いは組換え体免疫グロブリンまたはOrlandi et al(1989,Proc Natl Acad Sc i 86:3833-3837及びWinter G and Milstein C(1991;Nature 349:293-299)に開示されるような特異性の高い結合剤のパネルをスクリーニングすることにより生成することもできる。またＳＵＲＨに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させることもできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定するわけではないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルファイド架橋を還元することにより発生することができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定することができる（Huse WD et al.(1989)Science 256:1275 -1281）。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合蛋白競合測定法或いは免疫放射測定法のための種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイムノアッセイは典型的には、ＳＵＲＨとその特異抗体との間に複合体を形成すること、並びに複合形成体を測定することを伴う。特異性ＳＵＲＨ蛋白質において２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイが好ましいが、結合蛋白質競合測定法を用いてもよい。これらの測定法は、Maddox DE et al(1983,J Exp M ed 158：1211)に記載される。ＳＵＲＨ特異性抗体を用いる診断測定法特定のＳＵＲＨ抗体を、ＳＵＲＨの発現により特徴をなす状態或いは疾患の診断のために、或いはＳＵＲＨアゴニスト或いはアンタゴニストを用いて治療される患者を監視するための測定法において用いてもよい。ＳＵＲＨのための診断測定法は、抗体及び細胞或いは組織のヒト体液或いは抽出物においてＳＵＲＨを検出するための標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体を、修飾ありなしいずれかで用いてもよい。多くの場合に、ポリペプチド及び抗体は、リポータ分子と共有結合、或いは非共有結合でそれらを結合することにより標識されるであろう。数多くのリポータ分子が知られており、そのうちのいくつかが上述されている。それぞれの蛋白質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いてＳＵＲＨを測定するための種々のプロトコルが当分野で知られている。例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＥ）である。ＳＵＲＨの２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナルに基づくイムノアツセイ（monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合蛋白競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した測定法及び他の測定法は、Maddox DE et al(1983,J Exp Med 158:1211)に記載される。診断のための基準を与えるために、ＳＵＲＨ発現に対する通常或いは標準値が確立されなければならない。これは、動物或いはヒトいずれかの被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合形成体に適した条件下でＳＵＲＨに対する抗体と結合することにより実現される。標準的な複合形成体の量は、既知の量のＳＵＲＨを含む種々の人工膜をバイオプシーを実施した組織からの調節サンプル及び疾患サンプルと比較することにより定量することができる。その後通常サンプルから得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と被検者値との間の偏差が疾患状態の存在を立証する。薬物スクリーニングＳＵＲＨ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメント或いはそのオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものにおいて治療化合物をスクリーニングするために用いることができる。そのような試験に用いられるフラグメントは、溶液中に遊離するか、固体支持体に付着するか、細胞表面上に結合するか、或いは細胞内に配置されてもよい。ＳＵＲＨと試験されている薬剤との間に複合体を結合する形成体が測定されることができる。ＳＵＲＨへの適当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する薬物スクリーニングのための別の技術は、１９８４年９月１３日発行のＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４に記載されており、参照して本明細書の一部としている。要約すると、多数の異なる小さなペプチド試験化合物がプラスチックピン或いはある他の表面のような固体基質上で合成される。ペプチド試験化合物はＳＵＲＨのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＳＵＲＨは当分野で周知の方法により検出される。また実質的に精製されたＳＵＲＨは、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接塗着される。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することができる。また本発明は、ＳＵＲＨを結合することができる中和性抗体が、ＳＵＲＨを結合するための試験化合物と特に競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用することを考慮する。この方法では、抗体を用いて、ＳＵＲＨと１つ或いはそれ以上の抗原性デターミナントを共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチドの使用ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチド或いは任意のその一部は、診断並びにまた治療のために用いることができる。診断で用いる場合、本発明のＳＵＲＨを用いて、ＳＵＲＨの発現に関係する生検された組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量することができる。診断測定法は、ＳＵＲＨの不在、存在、並びに過剰な発現を識別するために、かつ治療介入中にＳＵＲＨレベルの調節を監視するために有用である。オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子並びにＰＮＡが本発明の範囲に含まれる。本発明の別の態様は、ゲノム配列、コード化ＳＵＲＨ或いは密接に関連する分子を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを提供される。非常に特異性の高い領域、例えば５’調節領域内の１０個の独自のヌクレオチド或いは特異性の低い領域、例えば特に３’ 領域の何れかから形成されるプローブの特異性及びハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間或いは低い）は、そのプローブが自然発生ＳＵＲ、アレル或いは関連するシーケンスのみを同定するか否かを確定するであろう。またプローブは、関連する配列の検出のためにも用いることができ、好ましくはこれらのＳＵＲＨコード化配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列に由来するか、或いは自然発生ＳＵＲＨのプロモータ、エンハンサ素子並びにイントロンを含むゲノム配列に由来する。ハイブリダイゼーションプローブは、³²Ｐ或いは³⁵Ｓのような放射性核種を含む種々のリポータグループ或いはアビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性ポスファターゼのような酵素性標識により標識されることができる。ＵＳＲＨＤＮＡに対する特異性ハイブリダイゼーションプローブを生成するための他の手段は、ＳＵＲＨをコードする核酸配列のクローニング、或いはｍＲＮＡを生成するためのベクタ内へのＳＵＲＨ誘導体のクローニングを含む。そのようなベクタは当分野では知られており、市販されており、Ｔ７或いはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射活性標識されたヌクレオチドを付加することによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。診断利用ＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＵＲＨの発現に関連する状態或いは疾患を診断するために用いることもできる。例えばＳＵＲＨをコードするポリヌクレオチド配列は、生検からの体液或いは組織のハイブリダイゼーション或いはＰＣＲアッセイにおいて用いられ、ＳＵＲＨコード化配列発現を検出することができる。そのような定性的或いは定量的方法の形成は、サザン或いはノーザン法、ドットブロット或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック、ピン、チップ及びＥＬＩＳＡ技術を含む。これらの全ての方法は当分野では周知であり、多くの市販の診断キットの基礎となっている。ここで開示されるＳＵＲＨヌクレオチド配列は、炎症及び疾患と関連する活性化及び誘導を検出する測定法にための基準を与える。ＳＵＲＨヌクレオチド配列は、当分野で知られた方法により標識され、ハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適した条件下で患者からの体液或いは組織に加えられることができる。インキュベーション期間の後、もしヌクレオチドが酵素で標識されているなら、サンプルは染料（或いは現像液を必要とする他の標識）を付加的に含む適合性液体を用いて洗浄される。適合性液体を洗い流した後、染料は定量化され、基準と比較される。生検された、或いは抽出されたサンプル内の染料の量が、適合性調節サンプルより著しく高くなるなら、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列を用いてハイブリダイゼーションしており、サンプル内のＳＵＲＨヌクレオチド配列のレベルが高められたということが、関連した疾患が存在することを示す。またそのような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、或いは個々の患者の治療を監視する際に、特定の治療法の有効度を高めることができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＳＵＲＨ発現に対する通常の或いは標準のプロファイルが確立されなければならない。これは、動物或いはヒトのいずれかの正常な被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適した条件下でＳＵＲＨ或いはその一部と結合することにより達成される。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者の場合に得られた値を、同一の実験において行われた一連のＳＵＲＨを希釈したものと比較することにより定量化されることができ、その実験では、既知の量の実質的に精製されたＳＵＲＨが用いられる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＳＵＲＨに関連した疾患に苦しむ患者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と生検値との間の偏差を用いて、疾患の存在が立証される。一度疾患が立証されれば、治療薬が投与され、治療プロファイルが作成される。そのような測定法は、プロファイルの値が正常の或いは標準のパターンに向かっている、或いは回復しているか否かを評価するために、規則的に繰り返されてもよい。有効な治療プロファイルを用いて、数日或いは数ヶ月に渡る治療の有効度を示すことができる。米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，９６５，１８８号に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＳＵＲＨ配列の基礎となるオリゴヌクレオチドに対する付加的な使用法を提供することもできる。そのようなオリゴマーは一般に化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させても、或いは組換え体源から生成されてもよい。オリゴマーは一般に２つのヌクレオチド配列からなり、１つはセンス方向（５’→３’）を有し、他方はアンチセンス方向（３’←５’）を有しており、特異遺伝子或いは状態を同定するために最適化された条件下で用いられる。同一の２つのオリゴマー、入れ子状態のオリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配列を検出し、定量化するために厳密性を欠いた条件下で用いてもよい。さらに、特定の分子の発現を定量化するために用いられることもできる方法は、放射性標識化（radiolabeling）或いはビオチン標識化（biotinylating）ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅（coamplification）実験結果が書き込まれた標準曲線を含む(Melby PC et al(1993)J Immunol Methods 159:235-44;Duplaa C e t al(1993)Anal Biochem 229-36)。多数のサンプルの定量化は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて測定法を実行することによる加速することができ、その実験フォーマットには、対象のオリゴマーが種々の希釈法において与えられ、スペクトル光測定或いは色測定反応が迅速な定量化を実現する。この種の最終的な診断により、医療専門家は、積極的な治療を開始し、状態がさらに悪化するのを防ぐことができるようになる。同様にさらに測定法を用いて、治療中の患者の進行状態を監視することができる。さらに、ここで開示されるヌクレオチド配列は、未だ開発されていない分子生物学技術において用いることもでき、提供された新規の技術は、トリプレットゲノムコード、特定の塩基対相互作用等の現在既に知られているヌクレオチド配列の特性によるものである。治療的使用ＳＵＲをコードする遺伝子に対する相同性及びその発現プロファイルに基づいて、ここで開示されるＳＵＲＨポリヌクレオチドは、ＮＩＤＤＭ、ＰＨＨＩ並びにＳＵＲ並びにまたＫ_ATPチャネルに関連する他の疾患のような疾患の治療のための分子の設計に対する基礎を与えることができる。発現ベクタは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイルスから、また種々の細菌性プラスミドから導出され、標的となる器官、組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を運ぶために用いられる場合がある。当業者には周知の方法を用いて、アンチセンスＳＵＲＨを発現する組換え体ベクタを構成することができる。例えば、Sambrook等(上記)及びAusube l等(上記)に記載される技術を参照されたい。完全長ｃＤＮＡ配列並びにまたその調節素子からなるポリヌクレオチドにより、研究者は遺伝子機能のセンス或いはアンチセンス調整における研究ツールとしてＳＵＲＨを用いることができる（Youssoufian H and HF Lodish 1993 Mol Cel l Biol 13:98-104;Eguchi et al(1991)Annu Rev Biochem 60:631-652）。そのような技術は現在当分野では周知されており、センスオリゴマー或いはアンチセンスオリゴマー、またはより大きなフラグメントが、コード化或いは調節領域に沿った種々の位置から設計されることができる。ＳＵＲＨをコードする遺伝子は、所望のＳＵＲＨヌクレオチドフラグメントを高レベルで発現する発現ベクタを細胞或いは組織に形質移入することにより遮断されるようになる。そのような構成物は、細胞を非翻訳センス或いはアンチセンス配列で満たす。ＤＮＡ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、全ての複製が内因性ヌクレアーゼにより無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し（Mettler I,personal communication）、適当な複製素子がベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。上述のように、遺伝子発現の修飾は、ＳＵＲＨの調節領域、すなわちプロモータ、エンハンサ並びにイントロンに対してアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡを設計することにより得られるようになる。転写開始部位、すなわちリーダ配列の−１０と＋１０領域の間から由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。またアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、三重らせん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。三重らせん対は二重らせんの能力に近くなり、ポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子の結合のために十分に開く。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は、Gee JE et al(In:Huber BE and BI Carr（1994）Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publish ing Co.Mt Kisco NY)に記載された。リボザイムは、ＲＮＡの特異性分割に触媒作用することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイム活性機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特定ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖切断分割が伴う。本発明の範囲内には、特異にしかも有効にＳＵＲＨのヌクレオチド鎖切断分割に触媒作用することができる遺伝子操作されたハンマヘッド状リボザイムを含む。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム分割部位は、配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム分割部位に対して標的分子を走査することにより最初に同定される。一度同定されれば、分割部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを無能にする二次構造機構に対して評価されることができる。また候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドについてハイブリダイゼーションへの実施容易性を試験することにより評価することができる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成に関する当分野で知られた任意の方法により調製されることができる。これらは、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＳＵＲＨをコードするＤＮＡ配列のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ転写により発生させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータと共に広範なベクタ内に組み込まれる場合がある。別法では、アンチセンスｃＤＮＡ構成物は、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に導入されることができる。ＲＮＡ分子を修飾して、細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能な修飾は、限定するわけではないが、分子の５’並びにまた３’末端でのフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステラーゼではなくホスホロチオネート或いは２’Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセチル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された形成体のような従来にはない塩基の含有物によりこれらの全分子に拡張されることができる。細胞或いは組織内のベクタを導入するための方法は、以下に議論する方法及びｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ並びにｅｘｖｉｖｏ治療のために同じく適した方法を含む。ｅｘｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンを繁殖することができ、米国特許第５，３９９，４９３号及び第５，４３７，９９４号に記載されており、参照して本明細書の一部としている。形質移入及びリポソームによる配達は、当業者に周知されている。さらにここで開示されるＳＵＲＨのためのヌクレオチド配列は、未だ開発されていない分子生物学技術において用いることができ、提供される新規の技術は、限定はしないが、トリプレットゲノムコード及び特異塩基対相互作用のような特性を含む、現在既知のヌクレオチド配列の特性による。関連するポリヌクレオチド配列の検出及びマッピングまたＳＵＲＨのための核酸配列を用いて、自然発生ゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを生成することもできる。その配列は、周知の技術を用いて特定のクロモソームに、或いはクロモソームの特異領域にマップ化される。これらは、クロモソームスプレッド（chromosome spread）とのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、フローソートされたクロモソーム標本（flow-sorted chromosomal preparation）、或いはPrice CM(1993;Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ(1991;Trends Genet 7:149-54)に記載されるような、酵母菌人工クロモソーム、細菌性人工クロモソーム、細菌性Ｐ１構造或いは単一クロモソームｃＤＮＡライブラリのような人工クロモソーム構造体を含む。クロモソームスプレッドの蛍光性ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術は、Verma et al(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York NYに記載されている。クロモソーム標本の蛍光性ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的なクロモソームマッピング技術は、付加的な遺伝マップデータと相関性が示される。遺伝子マップデータの例は1994 Genome Issue of Science（265:1981f）に見出すことができる。物理的クロモソームマップ上のＳＵＲＨの位置と特定の疾患（或いは特定の疾患に対する素因）との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と担体或いは感染した個体との間の遺伝子配列における差を検出することができる。クロモソーム標本のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立されたクロモソームマーカを用いるリンケージ解析のような物理的マッピング技術は、遺伝子マップを拡張するために用いることができる。例えば、ヒト遺伝子の配列標識部位用マップ（sequence tagged site based map）が最近Whitehead-MIT Cent er for Genomic Research(Hudson TJ et al(1995)Science 270:1945-1954)により確立された。しばしばマウスのような別の哺乳動物種のクロモソーム（Whiteh ead Institute/MIT Center for Genomic Research，Genetic Map of the Mouse ，Database Release 10,April 28,1995）上の遺伝子の配列は、特定のヒトクロモソームの数或いは腕が未知であっても関連したマーカを明らかにすることができる。新規の配列は、物理的なマッピングによりクロモソーム腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度、毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばAT to 11q22-23 (Gatti et al(1998)Nature 336:577-580)への遺伝的リンケージにより初期状態で局部に制限されれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらに研究するための関連した或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、すなわち正常個体と担体或いは感染個体との間の逆位等によりクロモソーム位置内の差を検出することができる。医薬品組成物本発明は医薬品組成物に関連し、その医薬品組成物は、単独のヌクレオチド、蛋白質、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト或いは阻害剤、または、限定はしないが、緩衝食塩水、デキストロース並びに水を含む任意の無菌の生体活性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少なくとも１つの他の試薬との組み合わせからなる。これらの任意の分子は、単独で、或いは医薬品添加物或いは製薬的に許容可能な担体と混合される医薬品組成物において、他の医薬品、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与されることができる。本発明の一実施例では、製薬的許容担体は製薬的に不活性である。医薬品組成物の投与医薬品組成物は、限定はしないが、ヒト及び家畜を含む治療を要する任意の被検者に投与されることができる。医薬品組成物の投与は、経口的に或いは非経口的に行われる。非経口配達の方法は、局所的な、動脈内（直接腫瘍への）投与、筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、クモ膜下投与、心室内投与、静脈内投与、腹膜内投与、鼻腔内投与を含む。活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができるプレパレート内への活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤からなる適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関する技術の詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」(Maack Publishi ng Co.Easton PA)の最新版に見出される。経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量において当分野で周知の製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により、医薬品組成物は、患者が経口摂取するために、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができる。経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合して、選択によってはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理することにより得ることができる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも、或いは他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、並びにアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、及びゼラチン及びコラーゲンのような蛋白質のような炭水化物或いは蛋白質フィルタである。必要なら、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングを被着され、その濃縮糖液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液並びに適当な有機溶剤あるいは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が、製品識別、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣錠コーティングに加えられる場合もある。経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌め式のプッシュフィットカプセル剤、並びにゼラチン、及びグリコール或いはソルビトールのようなコーティングからなる緩く封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのようなフィルタ或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに必要なら安定化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトシールカプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いて用いなくてもよいが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内の溶解或いは懸濁されている場合がある。非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注入するために、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性の注入懸濁液として調製される場合もある。適当な親油性溶剤或いは賦形剤は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。さらに、懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加させる適当な安定化剤或いは薬剤を含むこともできる。局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。製造及び保管本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或いは凍結乾燥処理による方法で製造される。医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩類は、対応する遊離塩基形である水性或いはプロトン性溶剤における可溶性を高める傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用に先だって緩衝剤と結合されたｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトールの状態の凍結乾燥粉末である。許容可能な担体内に調剤された本発明の化合物からなる医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条件の治療のためにラベルを貼るようにする。ＳＵＲＨの投与の場合、そのようなラベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。製薬的に有効な投与量本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすための有効な量において含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の能力内で果たし得るものである。任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおいて最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路が達成される。その後そのような情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経路を確定することができる。製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する蛋白質或いはその抗体、アンタゴニスト、或いは阻害剤の量のことである。そのような化合物の治療への有効度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きな治療誘導性を表す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに投与するために量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度、並びに投与経路によりこの範囲内で変化する。厳密な投与量は、治療される患者を診察する個々の医師により選択される。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或いは所望の効果を維持したりする。考慮されてもよいさらに別の要因は、疾患の過酷さ、例えば腫瘍の大きさ及び場所、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する抵抗性／反応を含む。特定の製薬の半減期及びクリアランス率により、３〜４日毎、毎週、或いは４週間毎に一度、活性が持続する医薬品組成物が投与されてもよい。通常の投与量は、投与の経路にもよるが、０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び配達の方法に関する手引きは、一般に科学文献で入手できる。米国特許第４．６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号或いは第５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、蛋白質或いはその阻害剤ではなく、ヌクレオチドのための異なる剤形を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチド或いはポリペプチドに配達は特定の細胞、状態、位置等に対して特異であろう。以下の例は、本発明を例示するために与えられるが、本発明を制限するためのものではない。産業上の利用可能性ＩｃＤＮＡライブラリ構成 BRAINT03ｃＤＮＡライブラリは２６歳男性から除去された正常な脳組織から構成された(lot#0003:Mayo Clinic,Rochester MN)。凍結した組織はB rinkmann Homogenizer Polytron PT-3000(Brinkmann Instruments,Westbury NJ) を用いて均質化され、溶解された。試薬及び抽出生成物がStratagene RNA Isola tion Kit(Cat.#200345:Stratagene)において用いられた。溶解生成物は、周囲温度において２５０００ｒｐｍで１８時間Beckman SW 28rotor in a Beckman L8-7 0M Ultracentrifuge(Beckman Instruments)を用いて５．７ＭＣｓＣＬ緩衝材上で遠心分離された。ＲＮＡは、フェノールクロロフォルムｐＨ８．０を用いて一度、酸性フェノールｐＨ４．０を用いて一度抽出され、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５体積のメタノールを用いて沈殿させ、水及び３７℃で１５分間処理されたデオキシリボヌクレアーゼ内で再懸濁された。ＲＮＡはQiagen Oligotex kit(QIAGEN Inc.Chatsworth CA)を用いて分離され、ｃＤＮＡライブラリを構成するために用いられた。ＲＮＡは、cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Cat.#18248-013:Gibco/BRL) に対するSuperScript Plasmid Systemにおける推奨プロトコルに従って処理された。ｃＤＮＡはSepharose CL4B column(Cat.#275105．Pharmacia)上で分割され、４００ｂｐを加えるそのｃＤＮＡはpSport１に結合された。その後プラスミド pSportＩはDH5a^TM形質転換受容性細胞内に形質転換された(Cat.#18258-012 Gibc o/BRL)。ＩＩｃＤＮＡクローンの分離及び配列化プラスミドＤＮＡは細胞から遊離され、Miniprep Kit(Cat.#77468;Advanced G enetic Technologies Corporation.Gaithersburg MD)を用いて形成された。このキットは、９６０の精製に対する試薬を有する９６ウェルブロックからなる。推奨プロトコルを用いたが以下の点が異なる。１）９６ウェルは、２５ｍｇ／Ｌのカルビンシリン及び０．４％のグリセロールを有する１ｍｌのみの無菌のTerrific Broth(Cat.#22711.LIFE TEC HNOLOGIES^TM.Gaithersburg MD)をそれぞれ満たされた。２）ウェルは接種され、その後６０μｌの溶解バッファを用いて溶解させた後、細菌が２４時間培養された。３）５分間Beckman GS-6R＠:2900rpmを用いる遠心分離ステップが実行され、その後ブロックの含有物が一次フィルタプレートに加えられた。４）ＴＲＩＳバッファにイソプロパノールを加える付加的なステップは実行されなかった。プロトコルの最後のステップを終了した後、サンプルは保管のためにBeckman９６ −ウェルブロックに移された。ｃＤＮＡは、４つのPeltier Thermall Cyclers(PTC200:MJ Research.Watertow n MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing systems(Perkin Elmer)を組み合わせたHamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を用いるSanger F and AR Coulson(1975;J Mol Biol 94:441f)の方法により配列化され、読み枠が画定された。ＩＩＩｃＤＮＡクローン及びその推定蛋白質の相同性検索各ｃＤＮＡはApplied Biosystemsにより開発された検索アルゴリズムを用いて GenBank内の配列と比較され、INHERIT^TM670 Sequence Analysis System内に組み込まれた。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language(TRW Inc.L os Angeles CA)を用いて、相同性の領域を確定した。配列比較がいかに実行されるかを確定する３つのパラメータはウインドウサイズ、ウインドウオフセット並びに誤差許容量である。これらの３つのパラメータの組み合わせを用いて、ＤＮＡデータベースは問合わせ配列に相同性を有する領域を含む配列を検索され、適当な配列が初期値で与えられる。その後、これらの相同性領域はドットマトリクス相同性プロットを用いて試験され、相同性の領域と偶然の一致とを区別した。Smith-Waterman配列を用いて、相同性検索の結果を表示した。ペプチド及び蛋白質配列相同性は、ＤＮＡ配列相同性に用いられる方法と同様の方法を用いるINHERIT^TM670 Sequence Analysis Systemを用いて確認された。P attern Specification Language及びパラメータウインドウを用いて、初期値で与えられた相同性の領域を含む配列に対する蛋白質データベースを検索した。ドットマトリクス相同性プロットが試験され、著しい相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)J Mol Evol 36:290-3 00;Altschul，SF et al(1990)J Mol Biol 215:403-10)を表すＢＬＡＳＴを用いて、局部配列を検索した。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方の配列を生成し、配列類似性を確定する。配列の局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは特に厳密な一致の判定或いは相同性の同定時に有効である。ＢＬＡＳＴは間隙を含まない一致に対して有効である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位はHigh-scoring Segment Pair(HSP)である。ＨＳＰは、任意であるが、等しい長さを有する２つの配列フラグメントからなり、その長さの配列は局部的に最大であり、しかも配列スコアは使用者により設定される閾値或いはカットオフスコアを満足するか或いはそれを超えるものである。ＢＬＡＳＴアプローチは、問合せ配列とデータベース配列との間のＨＳＰを検索し、見出されたあらゆる一致の統計的有意性を評価し、かつ使用者により選択された有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列との一致を報告するために統計的に有意な閾値を確立する。Ｅは、全データベース検索の環境内でＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）の機会が生じる予想頻度の上限として解釈される。データベース配列との一致がＥを満足するものが、プログラム出力で報告される。ＩＶノーザン解析遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜に対する標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、上記）。ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993 and 1990上記）を用いる類推コンピュータ技術（analogous compu tertechnique）を用いて、GenBank或いはLIFESEQ^TMdataba se(Incyte，Palo Alto CA)のようなヌクレオチドデータベース内の同一の或いは関連する分子を検索する。多数の膜を用いるハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらに、コンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致、或いは相同と分類されるか否かを確定することができる。検索の基準は、％配列密度×％最大ＢＬＡＳＴスコア／１００として定義される積スコアであり、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２％の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性を有する分子は通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。検索の結果は、ＳＵＲＨコード化配列が発生するライブラリのリストとして報告された。またＳＵＲＨコード化配列の存在量及び存在比も報告された。存在量は、特定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に再現される回数を直接表し、存在比は、ｃＤＮＡライブラリ内で転写された配列の全数の存在量を割った値である。Ｖ完全長或いは回復調節素子に対するＳＵＲＨの伸展ＳＵＲＨをコードする核酸配列（配列番号：２）を用いて、部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸展するための、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマを設計する。１つのプライマを合成して、アンチセンス方向（ＸＬＲ）に伸展を開始し、他のプライマを合成して、センス方向（ＸＬＦ）に配列を伸展する。プライマにより、既知のＳＵＲＨコード化配列の伸展が、対象の領域に対する新規で未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させるようになる（米国特許出願第０８／４８７，１１２号）。初期プライマは、OLIGO(登録商標)4.06 Primer Analysis Software(National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さ２２−３０のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で標的配列にアニーリングする。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドのあらゆる伸長は避けられる。起源の選択されたｃＤＮＡライブラリ或いはヒトゲノムライブラリを用いて配列を伸展する。後者は５’上流領域を得るのに最も有効である。さらに伸展が必要或いは要求される場合には、追加のプライマの組が既知領域をさらに伸展させるために設計される。 XL-PCR kit(Perkin Elmer)用の取扱説明書に従って、完全に酵素及び反応混合物を混合することにより、高い忠実度を有する増幅が得られる。各プライマを４０ｐｍｏｌで、かつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始するとき、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Research，Watertown MA)及び以下のパラメータを用いて実行される。ステップ１１分間９４℃（初期変性）ステップ２１分間６５℃ ステップ３６分間６８℃ ステップ４１５秒間９４℃ ステップ５１分間６５℃ ステップ６７分間６８℃ ステップ７さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返しステップ８１５秒間９４℃ ステップ９１分間６５℃ ステップ１０７分１５秒間６８℃ ステップ１１１２サイクル間ステップ８−１０の繰返しステップ１２８分間７２℃ ステップ１３４℃（保持）反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロースミニゲルにおける電気泳動により解析され、反応物が配列の伸展に成功したかを判定する。最も大きな生成物が含むと考えられる帯が選択され、そのゲルが切除された。さらに精製は、QIA Qu ick^TM(QIAGEN Inc.)のような市販のゲル抽出方法を使用することを伴う。ＤＮＡの回復の後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて、再連結及びクローニングを容易にするブラントエンドを生成する一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを切り取る。エタノール沈殿の後、その生成物は１３μｌの結合緩衝剤中に再溶解される。１μｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが加えられ、その混合物は、１６℃で２〜３時間或いは一晩の間室温でインキュベートされる。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質）が３μｌの結合混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養される（Sambrook J et等、上記）。３７℃で１時間インキュベートした後、全形質転換混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani(LB)-agar(Sambrook J等、上記) 上で培養される。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の無菌の９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に配置される１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養される。翌日、５μｌの各一晩おいた培養株が非無菌の９６ウエルプレートに移入され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイ内に移入される。ＰＣＲ増幅の場合、伸展反応のために用いられる、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライマ並びに１つ或いは両方の遺伝子特異性プライマを含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられる。増幅は以下の条件を用いて実行される。ステップ１６０秒間９４℃ ステップ２２０秒間９４℃ ステップ３３０秒間５５℃ ステップ４９０秒間７２℃ ステップ５さらに２９サイクル間ステップ２−４の繰返しステップ６１８０秒間７２℃ ステップ７４℃（保持）ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理される。ＰＣＲ生成物の大きさは、起源の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローンが選択され、プラスミドに結合され、配列される。ＶＩ標識化及びハイブリダイゼーションプローブの使用配列番号：２から導出されるハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4. 06(National Biosciences)のような業界で用いられるソフトウエアにより設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシントリホスターゼ(Amersham，Chicago IL)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN( 登録商標)，Boston MA)とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine resin column(Pharmacia)を用いて実質的に精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０⁷カウント／分含む部分は、以下のエンドヌクレアーゼの１つ(Ase I,Bgl IlEco RI,Pst I.Xba1．or Pvu II;DuPont NEN( 登録商標))で消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜に基づくハイブリダイゼーション解析において用いられる。各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに分割され、ナイロン膜(N ytran Plus，Schleicher & Schuell，Durham NH)に転写される。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間実行される。非特異性シグナルを除去するために、ブロットは、０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にで順次洗浄される。XOMAT AR^TM film(Kodak，Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette（Molecular Dy namics，Synnyvale CA）内でブロットに暴露された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。ＶＩＩアンチセンス分子ＳＵＲＨをコードするヌクレオチド配列或いはその任意の一部を用いて、自然発生ＳＵＲＨのｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏ発現を抑制する。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ方法を用いる。例えば、第１Ａ図−第１Ｍ図に示されるＳＵＲＨのコード化配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、自然発生ＳＵＲＨの発現を抑制する。相補性オリゴヌクレオチドは、第１Ａ図 −第１Ｍ図に示される最も独特な５'配列から設計され、リボソームが結合するのを防ぐことによりＳＵＲＨ転写物の翻訳を抑制するために用いられる。配列番号：２のリーダ配列及び５’配列の適当な一部を用いるとき、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図−第１Ｍ図に示されるようなポリペプチドのシグナル或いは初期コード化配列に翻訳する領域に及ぶ任意の１５−２０ヌクレオチドを含む。ＶＩＩＩＳＵＲＨの発現ＳＵＲＨの発現は、適当なベクタ内にｃＤＮＡをサブクローニングし、ベクタを宿主細胞に形質移入することにより実現される。この場合に、ｃＤＮＡライブラリの発生のために以前に用いられたクローニングベクタｐＳｐｏｒｔを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内にＳＵＲＨ配列を発現する。クローニング部位の上流では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配列が後続する。直後に続くこれらの８残基は、初回抗原刺激及び転写のために有用な遺伝子操作されたバクテリオファージプロモータ及びクローニングのためのＥｃｏＲＩを含むいくつかの独自の制限部位である。標準的な方法を用いてＩＰＴＧを有する分離され、形質移入されたバクテリアストレーンの誘導は、β−ガラクトシダーゼの最初の７残基、「リンカー」の約１５残基並びにｃＤＮＡ内にコードされるペプチドに対応する融合蛋白質を生成するであろう。ｃＤＮＡクローン挿入が概ねランダムなプロセスで発生するため、含まれるｃＤＮＡが適当に翻訳するために正確なフレーム内に存在することが３回中１回ある。もしｃＤＮＡが適当な読み枠内に存在しないなら、ｉｎｖｉｔｒｏ変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ或いはリョクトウヌクレアーゼによる消化、または適当な長さのオリゴヌクレオチドリンカーの封入を含む周知の方法により適当な数の塩基を欠失或いは挿入することにより得られることができる。ＳＵＲＨｃＤＮＡは、特定の宿主において蛋白質を発現するために有用であることが知られている他のベクタ内にシャトルすることができる。クローン部位及び標的ｃＤＮＡの両端における伸展部にハイブリダイゼーションするのに十分なＤＮＡのセグメント（約２５塩基）を含むオリゴヌクレオチドプライマは標準的な方法により化学的に合成されることができる。その後これらのプライマを用いて、ＰＣＲにより所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。その結果生じた遺伝子セグメントは、標準的な条件下で適当な制限酵素を用いて消化され、ゲル電気泳動により分離されることができる。別法では、同様の遺伝子セグメントは適当な制限酵素を有するｃＤＮＡの消化により生成されることができる。適当なプライマを用いて、２つ以上の遺伝子からのコード用配列のセグメントが互いに結合され、適当なベクタ内にクローニングされることができる。そのようなキメラ配列の構成により発現を最適化することができる。そのようなキメラ分子のための適切な発現宿主は、限定はしないが、Chinese Hamster Ovary(CHO)及びヒト２９３細胞のような哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、サッカラムセス−セレビジエのようなコード菌細胞並びにE.coliのような細菌を含む。これらの各細胞系において、有用な発現ベクタは、細菌内において繁殖できるようにする複製の起源及び細菌内においてプラスミドを選択できるようにするβ−ラクタマーゼ耐抗生物質遺伝子のような選択可能標識を含む。さらに、そのベクタは形質移入した真核宿主細胞内で選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能標識を含む場合もある。真核発現宿主において用いるためのベクタは、それが対象のｃＤＮＡの一部でない場合には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡ処理用素子を必要とする場合もある。さらにそのベクタは遺伝子発現を増加するプロモータ或いはエンハンサを含む場合がある。そのようなプロモータは宿主特異性及びＣＨＯ細胞に対するＭＭＴＶ、ＳＶ４０並びにメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対するｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、並びにＴ７プロモータ、酵母菌に対するアルファ分子、アルコールオキシダーゼ並びにＰＧＨプロモータを含む。ラウス肉腫ウィルスエンハンサのような転写エンハンサが、哺乳類宿主細胞内に用いられる場合もある。組み換え体細胞の相同性培養は、標準的な培養方法を介して得られる。ＳＵＲＨを含む細胞からの細胞分割は、全細胞の多様化及び分画遠心分離による細胞成分分画の分離により、界面活性剤を加えることにより、或いは当分野において周知の他の方法により行われる。これらの分割は以下の測定法に直接用いることができる。ＩＸＳＵＲＨ活性ＳＵＲＨをＳＵ結合活性或いはその生物学的活性フラグメントが結合蛋白質競合測定法において測定されることができる。5-[¹²⁵I]iodo-2-hydroxyglyburide(¹²⁵ I-HGB;Nelson et al(1992)J Biol Chem 267:14928-14933)の競合結合及びＳＵＲＨに対する標識されないＳＵが、その後結合¹²⁵Ｉ−ＨＧＢをその蛋白質にＵＶ−架橋結合することにより測定される。界面活性剤可溶化或いは枠結合ＳＵＲＨ、またはＳＵＲＨの可溶性フラグメントが平衡状態になるまで、標識されないＳＵの濃度及び¹²⁵Ｉ−ＨＧＢの所定の濃度を変更することによりインキュベートされる。部分標本が３１２nmで照射されＳＵＲＨ結合１２５Ｉ−ＨＧＢをその蛋白質に架橋結合する。照射された蛋白質サンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。そのゲルは乾燥され、オートラジオグラフィに曝される。¹²⁵Ｉ−標識化ＳＵＲＨに対応するゲルが乾燥したゲルから切除され、その放射能がガンマ放射線カウンタにおいて定量される。種々の濃度の標識されないＳＵを用いて得られたデータは、Nelson et al（上記）に記載される式を用いてその数、親和性並びにＳＵＲＨと候補ＳＵリガンドとの関係に対する値を計算するために用いられる。ＸＳＵＲＨ特異性抗体の生成ＰＡＧＥ電気泳動(Sambrook)を用いて実質的に精製されたＳＵＲＨを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて抗体を生成する。ＳＵＲＨから翻訳されたアミノ酸配列は、DNAStarsoftware(DNAStar Inc)を用いて解析され、免疫原性の高い領域と対応するオリゴポリペプチドの領域が判別され、当業者に知られた手段により抗体を取り出すために用いられる。Ｃ−末端付近にある、或いは親水性領域内にある適当なエピトープを選択するための解析は、Ausubel FM（上記）に記載される。典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 4 31Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（MBS: Ausubel FM等）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH， Sigma)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いて免疫される。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡを用いて遮断し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射線ヨウ化されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、アンチペプチド活性のために試験される。ＸＩ特異抗体を用いる自然発生ＳＵＲＨの精製自然発生或いは組み換え体ＳＵＲＨは、ＳＵＲＨに対して特異性の抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムは、ＳＵＲＨ抗体をCnBr-activated Sepharose(Pharmacia Biotech)のような活性化されたクロマトグラフ樹脂に競合接合することにより構成される。結合の後、樹脂は遮断され、製造業者の取扱説明書に従って製造される。ＳＵＲＨを含む細胞からの細胞分割は、全細胞の可溶化及び分画遠心分離による細胞成分分画の分離により、界面活性剤を加えることにより、或いは当技術分野において周知の他の方法により行われる。分割されたＳＵＲＨ−含有生成物は、免疫親和性カラム上を通過し、そのカラムがＳＵＲＨの選択吸収を可能にする条件下で洗浄される(例えば、界面活性剤存在下の高イオン強度バッファ)。そのカラムは、抗体／ＳＵＲＨ結合を分裂させる条件下（例えばｐＨ２−３或いは尿素またはチオシアネイトイオンのような高濃度のカオトロープのバッファ）で溶離されＳＵＲＨが精製される。以上の明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部としている。本発明の記載された方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、本発明はそのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入ることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者コールマン、ロジャーアメリカ合衆国カリフォルニア州94041・マウンテンビュー・＃２・マリポーザ 260

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを有する実質的に精製されたポリペプチド。２．請求項１のポリペプチドをコードする分離され、かつ精製されたポリヌクレオチド配列。３．配列番号：２の核酸配列或いはその変異体を含む分離されたポリヌクレオチド配列。４．前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチドＴ₂₇₈₀からヌクレオチドＡ₂₉₂₃まで伸展する配列番号：２の一部を含むことを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド配列。５．配列番号：２或いはその変異体に相補性を有する分離されたポリヌクレオチド配列。６．配列番号：２に対する厳密性の条件下でハイブリダイゼーションする分離されたポリヌクレオチド配列。７．配列番号：２或いはそのフラグメントを含むハイブリダイゼーションプローブ。８．請求項４のポリヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ。９．請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクタ。１０．請求項９の発現ベクタを含む組換え体宿主細胞。１１．配列番号：１のポリペプチド或いはそのフラグメントを精製するための方法であって、ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１０の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）宿主細胞培養からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法。１２．製薬的に許容可能な医薬品添加物と共に配列番号：１のポリペプチドを含む医薬品組成物。１３．請求項１のポリペプチドに特に結合する精製された抗体。１４．請求項１のポリペプチドの活性を特に調節する精製されたアゴニスト。１５．請求項１のポリペプチドの活性を特に調節する精製されたアンタゴニスト。１６．生物学的サンプルにおけるスルフォニル尿素受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、ａ）請求項７のプローブを核酸材料にハイブリダイゼーションし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が前記生物学的サンプル内のスルフォニル尿素受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの存在と相関がある、該検出過程とを有することを特徴とする方法。１７．ハイブリダイゼーション前に、生物学的サンプルの核酸材料がポリメラーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。