JP2008516985A - 可溶性ｚｃｙｔｏｒ２１、抗ｚｃｙｔｏｒ２１抗体及び結合パートナー、並びに炎症における使用方法 - Google Patents

可溶性ｚｃｙｔｏｒ２１、抗ｚｃｙｔｏｒ２１抗体及び結合パートナー、並びに炎症における使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和する、可溶性受容体及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体などのＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニストに関する。ＩＬ-１７Ｃは、炎症プロセス及びヒト疾患に関与するサイトカインである。ＺｃｙｔｏＲ２１はＩＬ-１７Ｃの受容体である。本発明は、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体及び結合パートナー、並びにこのような可溶性受容体、抗体及び結合パートナーをＩＬ-１７Ｃと拮抗させる方法を含む。

Description

本発明は、炎症性サイトカインＩＬ-１７Ｃに対するアンタゴニストを提供することにより、これらの必要性に取り組むものである。本発明はさらに、炎症性疾患におけるその使用、並びに関連の組成物及び方法も提供する。
サイトカインは、多くの細胞種の増殖及び分化の調節をはじめとする様々な生物作用を媒介する可溶性の小タンパク質である(例えば、Araiら, Anna. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)参照)。サイトカイン群を構成するタンパク質としては、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、及び他の調節分子が挙げられる。例えば、ヒトインターロイキン-１７は、インターロイキン-６、細胞内接着分子１、インターロイキン-８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びプロスタグランジンＥ２の発現を刺激し、ＣＤ３４＋造血系前駆体から好中球への優先的成熟に役割を果たすサイトカインである(Yaoら, J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiezら, J. Exp. Med. 183:2593 (1996))。
サイトカインと結合する受容体は一般に、高い親和性でサイトカインと結合し、この結合事象を、ある特定の受容体サブユニットの細胞質部分を介して細胞に伝える１以上の内在性膜タンパク質からなる。サイトカイン受容体はそれらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいていくつかの種類に分類されている。
実証されているサイトカイン及びそれらの受容体のin vivo活性は、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニスト、及びサイトカインアンタゴニストの臨床的可能性と必要性を示す。例えば、実証されている炎症性サイトカインファミリーのin vivo活性は、炎症性分子のアンタゴニストの極めて大きな臨床的可能性と必要性を示す。
ゲノム全域の相同性比較により、ＩＬ-１７／ＩＬ-１７Ｒファミリー内に５つのリガンドと４つの受容体パラログが同定された。これらのほとんどのものは、まだ対が見つかっていないオーファンである。ほぼ全てのＩＬ-１７Ｒホモログは複数のスプライス変異体により表され、その結果、選択的細胞外ドメインを生じるので、このファミリー受容体-リガンド対の確立は複雑であった。新たなデータは、ＩＬ-１７と同様にＩＬ-１７Ｃ、ＩＬ-１７Ａ及びＩＬ-１７Ｆは、鼻腔内投与及びマウス肺のアデノウイルス感染により発現される場合に好中球増加症の原因となる炎症性サイトカインであることを示唆する。具体的にいえば、炎症性サイトカインＩＬ-１７ＣはＩＬ-１７と高い程度の配列類似性を有する。ＩＬ-１７は、炎症性応答の誘導又は維持に重要な役割を果たすＴ細胞由来サイトカインである。ＩＬ-１７の発現は活性化されたＴ細胞に限られているが、ＩＬ-１７受容体(ＩＬ-１７Ｒ)は広く発現することが分かっており、この知見はＩＬ-１７の多面発現活性と一致している。ＩＬ-１７ＣはＩＬ-１７と関連があり、およそ２７％のアミノ酸同一性を有する。例えば、Li Hら, “Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C, two new members of the IL-17 cytokine family” PNAS 97(2): 773-8 (2000)参照のこと。サイトカイン誘導研究においてＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡの発現は活性化Ｔ細胞では見られないが、ＩＬ-１７Ｃは単球細胞系統ＴＨＰ-１からの腫瘍壊死因子ａ及びＩＬ-１ｂの放出を刺激し、一方、ＩＬ-１７はこの系に微弱な作用しか持たない。さらに、蛍光活性化セルソーター分析では、ＩＬ-１７ＣがＴＨＰ-１細胞と結合することを示す。ＩＬ-１７ＣはＩＬ-１７アッセイにおいては、活性はなく、また、ヒト繊維芽細胞からのＩＬ-６放出も刺激しないし、ヒトＩＬ-１７受容体細胞外ドメインとも結合しない。このデータは、細胞表面受容体の同族セットによって伝達され得る発現及び炎症性応答のパターンが異なるＩＬ-１７関連サイトカインのファミリーが存在することを示す。ＩＬ-１７ファミリーのメンバーは、関節リウマチや喘息をはじめとする種々の自己免疫疾患及び炎症性疾患の進行に寄与する因子として考えられている。
ＩＬ-１７Ｃの、ＩＬ-１７Ｒファミリーメンバーと結合する能力が研究されている。ＩＬ-１７ＣはＺｃｙｔｏＲ２１(Ｉｌ-１７ＲＥとしても知られる)と特異的に結合することが見出された。従って、本発明者らは、ＺｃｙｔｏＲ２１をＩＬ-１７Ｃの受容体として同定したことをここに報告する。いくつかの自己免疫疾患の効果的な治療法として他のＩＬ-１７ファミリーメンバーの介入も提案されていることから、ＩＬ-１７Ｃ又はＺｃｙｔｏＲ２１の活性を増強する、刺激する、増進させる、遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗させる、又は活性を中和するために、本発明の可溶性受容体及び抗体をアゴニスト又はアンタゴニストなどの免疫調節剤として用いることが有利であると考えられる。本発明は、炎症性サイトカインＩＬ-１７Ｃに対するアンタゴニストを提供することにより、これらの必要性に取り組むものである。本発明はさらに、炎症性疾患におけるその使用、並びに関連の組成物及び方法も提供する。
Ａ)概要
免疫関連疾患及び炎症性疾患は、極めて複雑で、多くの場合、複数の相互連結を持つ生体系路の現れ、又は結果であり、これらの生体系路は通常の生理において、傷害や損傷に対する応答、傷害や損傷の修復の誘導、及び外来生物に対する生得的防御及び獲得防御の具備にとって重要である。これらの通常の生理学的経路が、応答の強度に直接関連するものとして、又は異常な調節若しくは過剰な刺激の結果として、又は自己に対する反応として、又はこれらの組合せとしてさらなる傷害又は損傷を引き起こす場合に疾病や病状が生じる。
これらの疾患の発生は多くの場合、何段階もの経路を含み、複数の異なる生体系／経路を含むことが多いが、これら経路のうち１以上の重要なポイントへの介入が改善効果又は治療効果を持つ場合がある。治療的介入は有害なプロセス／経路の拮抗作用又は有益なプロセス／経路の刺激によって行うことができる。
多くの免疫関連疾患が知られており、広く研究されている。このような疾患としては、免疫介在炎症性疾患(関節リウマチ、免疫介在腎疾患、肝胆管疾患、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、乾癬、及び喘息など)、非免疫介在炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全 疾患、新生物などが挙げられる。
Ｔリンパ球(Ｔ細胞)は、哺乳類の免疫応答の重要な成分である。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)内の遺伝子によりコードされている自己分子と関連している抗原を認識する。この抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片などの表面でＭＨＣ分子とともに提示される。このＴ細胞系は宿主哺乳類の健康を脅かすこれら変性細胞を排除する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞がある。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原-ＭＨＣ複合体を認識した後に盛んに増殖する。ヘルパーＴ細胞はまた、様々なサイトカイン類、すなわちリンホカイン類を分泌し、これらはＢ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及び免疫応答に関与する他の様々な細胞の活性化に中心的な役割を果たす。
体液性免疫応答と細胞性免疫応答双方の中心的な役割はヘルパーＴ細胞の活性化とクローン増殖である。ヘルパーＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)-ＣＤ３複合体と抗原提示細胞の表面上の抗原-ＭＨＣとの相互作用により誘導される。この相互作用は、休止中のヘルパーＴ細胞を細胞周期へ導き(Ｇ０からＧ１への移行)、ＩＬ-２、及び時にはＩＬ-４に対する高親和性受容体の発現をもたらす生物学的事象のカスケードを媒介する。活性化されたＴ細胞は周期的な増殖と分化によってメモリー細胞又はエフェクター細胞へと進行する。
ＴＣＲを媒介とするシグナルの他、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞が放出するサイトカインにより、又は抗原提示細胞上の膜結合分子とＴ細胞との相互作用によって誘導される共刺激を含む。サイトカインＩＬ-１及びＩＬ-６は共刺激シグナルをもたらすことが示されている。また、抗原提示細胞の表面で発現されるＢ７分子とＴ細胞表面で発現されるＣＤ２８分子及びＣＴＬＡ-４分子の間の相互作用もＴ細胞の活性化を果たす。活性化されたＴ細胞は、ＩＣＡＭ-１、インテグリン、ＶＬＡ-４、ＬＦＡ-１、ＣＤ５６などの多数の細胞接着分子を発現する。
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応(ＭＬＲ)におけるＴ細胞の増殖は、化合物の免疫系刺激能の確立された指標である。多くの免疫応答において、炎症性細胞が損傷部位又は感染部位に浸潤する。これらの移動細胞は、罹患組織の組織検査によって判定可能なように、好中球、好酸球、単球又はリンパ球であると考えられる。Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc。
免疫関連疾患は免疫応答を抑制することによって治療することができる。可溶性受容体及び／又は免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体の使用は、免疫介在疾患及び炎症性疾患の治療に有益であると考えられる。免疫応答を阻害する分子を利用して(直接的にはタンパク質、又は抗体アゴニストの使用を介して)免疫応答を阻害し、ひいては免疫関連疾患を改善することができる。
ＩＬ-１７サイトカイン／受容体ファミリーは、免疫応答及び炎症性応答の操作に革新的なアプローチをもたらす、サイトカインネットワーク内の固有のシグナル伝達系を表すようである。よって、本発明は、ＩＬ-１７Ｃと、そのオーファン受容体であるＺｃｙｔｏＲ２１との対形成に基づくものである。
その様なものとして、ＩＬ-１７Ｃ活性のアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体並びにそれに対する抗体などは、それ自体、炎症性疾患の治療処置に、特に喘息又は乾癬の治療におけるＩＬ-１７Ｃのアンタゴニストとして有用である。さらに、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体及びその抗体(抗ヒトＺｃｙｔｏＲ２１モノクローナル抗体及び中和抗体を含む)などのＩＬ-１７Ｃ活性に対するアンタゴニストは、例えば、アトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎、ＩＢＤ、大腸炎、内毒素血症、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、成人性呼吸疾患(ＡＲＤ)、敗血性ショック、多臓器不全、炎症性肺傷害(喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気道過敏症、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、細菌性肺炎など)、乾癬、湿疹、並びに炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病など)、ヘリコバクター・ピロリ(helicobacter pylori)感染、腹腔下癒着及び／又は腹膜炎症(すなわち、感染、損傷を原因とするものなど)の結果としての膿腫、全身性紅斑性狼瘡(ＳＬＥ)、多発性硬化症、全身性硬化症、ネフローゼ症候群、器官同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)、腎臓、肺、心臓などの移植拒絶、連鎖球菌細胞壁(ＳＣＷ)誘発性関節炎、変形性関節症、歯肉炎／歯周炎、ヘルペス角膜炎、癌(前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病など)、脈管形成、再狭窄及び川崎病の治療においてＩＬ-１７Ｃと結合する、IＬ-１７Ｃを遮断する、阻害する、低下させる、IＬ-１７Ｃと拮抗する又はIＬ-１７Ｃを中和するものとして、他の炎症性の治療処置に有用である。
サイトカイン受容体サブユニットは、一般にシグナル伝達に関与するリガンド結合ドメインとエフェクタードメインとを含むマルチドメイン構造を特徴とする。多量体サイトカイン受容体としては、単量体、ホモ二量体(例えば、ＰＤＧＦ受容体αα及びββイソ型、エリスロポエチン受容体、ＭＰＬ［トロンボポエチン受容体］、及びＧ-ＣＳＦ受容体)、ヘテロ二量体(そのサブユニットが各々リガンド結合ドメインとエフェクタードメインを有する)(例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソ型)、並びに機能の異なる成分サブユニットを有する多量体(例えば、ＩＬ-２、IＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、及びＧＭ-ＣＳＦ受容体)がある。いくつかの受容体サブユニットは複数の受容体に共通のものである。例えば、自身のリガンドとは結合できないが、細胞内シグナル伝達ドメインを含むＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ-３受容体及びＧＭ-ＣＳＦ受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、構造と機能に基づいて４つに関連ファミリーのうちの１つに分類される。例えば、クラスＩ造血系受容体は、保存されたシステイン残基とＷＳＸＷＳモチーフを含有するドメインの存在を特徴とする。ある種の造血系受容体には、タンパク質キナーゼドメイン；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン；及び免疫グロブリンドメインを含む、ジスルフィド結合ループを特徴とするさらなるドメインが存在する。サイトカイン受容体の構造については、Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991及びCosman, Cytokine 5:95-106, 1993に概説されている。一般に、生物が新規の生物機能を獲得するための選択圧下で、既存の受容体遺伝子の複製から新規の受容体ファミリーメンバーが生じ、複数の遺伝子ファミリーの存在をもたらすものと考えられている。よって、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、これらの特徴はさらなるファミリーメンバーの単離及び同定に利用することができる。
他の発明の中でも、本発明は、「ＺｃｙｔｏＲ２１」又は「可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１」又は「ｓＺｃｙｔｏＲ２１」と呼ばれる(これらは全て、本明細書では互換的に用いることができる)可溶性受容体、及びＺｃｙｔｏＲ２１サイトカイン受容体に対する中和抗体の新規な使用を提供する。本発明はまた、ヒト炎症性疾患及び自己免疫疾患に用いるための可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドフラグメントと融合タンパク質も提供する。本発明の中和抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体をはじめとする本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体及び可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、大腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫介在腎疾患、肝胆管疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の増長、又は変性性関節疾患などの炎症及び炎症性疾患、並びに本明細書に開示される他の炎症性症状の処置においてＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和するために使用することができる。
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１をコードする例示的ヌクレオチド配列は配列番号１で示され、コードされているポリペプチドは配列番号２で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２をコードする別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号４で示され、コードされているポリペプチドは配列番号５で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３をコードする別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号７で示され、コードされているポリペプチドは配列番号８で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４をコードする別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６をコードする別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号２０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号２１で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０６で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１０７で示される。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１４をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０８に示され、コードされているポリペプチドは配列番号１０９で示される。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ｓ２をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１１２で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１３で示される。
ＺｃｙｔｏＲ２１はＩＬ-１７Ｃ(配列番号１６及び１７)の受容体として機能する。ＺｃｙｔｏＲ２１は単量体としてもホモ二量体又はヘテロ二量体としても働き得る。好ましくは、ＺｃｙｔｏＲ２１はＩＬ-１７Ｃのホモ二量体受容体として働く。ＺｃｙｔｏＲ２１はまた、ＩＬ-１７関連サイトカインのヘテロ二量体受容体サブユニットとしても働き得る。ＩＬ-１７Ａ、ＩＬ-１７Ｂ、ＩＬ-１７Ｃ、ＩＬ-１７Ｄ、ＩＬ-１７Ｅ及びＩＬ-１７Ｆが含まれる。ＺｃｙｔｏＲ２１は、同一所有者の米国特許出願１０／１９２,４３４号、及び同一所有者のＷＩＰＯ公開ＷＯ０３／００６,６０９に開示されており、双方ともその全内容が本明細書に援用される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)をコードするヒトｃＤＮＡクローンに分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号２のアミノ酸残基)の推定シグナル配列、およそ４３１個のアミノ酸残基(配列番号２のアミノ酸残基２４〜４５４；配列番号３)の細胞外リガンド結合ドメイン、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号２のアミノ酸残基４５５〜４７７)の膜貫通ドメイン、及びおよそ１９０個のアミノ酸残基(配列番号２のアミノ酸残基４７８〜６６７)の細胞内ドメインを含む６６７個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームが明らかとなった。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号４で示され、コードされているポリペプチドは配列番号５で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号５のアミノ酸残基１〜２３)の推定シグナル配列、およそ３５３個のアミノ酸残基(配列番号５；配列番号６のアミノ酸残基２４〜３７６)の細胞外リガンド結合ドメイン、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号５のアミノ酸残基３７７〜３９９)の膜貫通ドメイン、及びおよそ１９０個のアミノ酸残基(配列番号５のアミノ酸残基４００〜５８９)の細胞内ドメインを含む５８９個のアミノ酸(配列番号５)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号７で示され、コードされているポリペプチドは配列番号８で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号８のアミノ酸残基１〜２３)の推定シグナル配列、およそ３７３個のアミノ酸残基(配列番号８；配列番号９のアミノ酸残基２４〜３９６)の細胞外リガンド結合ドメイン、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号８のアミノ酸残基３９７〜４１９)の膜貫通ドメイン、及びおよそ１９０個のアミノ酸残基(配列番号８のアミノ酸残基４２０〜６０９)の細胞内ドメインを含む６０９個のアミノ酸(配列番号８)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４」と呼ばれる、天然型可溶性受容体であり得る変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号１１のアミノ酸残基１〜２３)推定シグナル配列とおよそ５１０個のアミノ酸残基(配列番号１１；配列番号１２のアミノ酸残基２４〜５３３)の細胞外リガンド結合ドメインを含む５３３個のアミノ酸(配列番号１１)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号２０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号２１で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号２１のアミノ酸残基１〜２３)の推定シグナル配列、およそ１９２個のアミノ酸残基(配列番号２１のアミノ酸残基４３６〜６２７)の細胞質ドメイン、およそ２１個のアミノ酸残基(配列番号２１のアミノ酸残基４１５〜４３５)の膜貫通ドメイン及びおよそ３９１個のアミノ酸残基(配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４)の細胞外リガンド結合ドメインを含む６２７個のアミノ酸(配列番号２１)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。ＩＬ-１７Ｃ結合ドメイン(又はリガンド結合ドメイン)は、およそ２７９個のアミノ酸残基(配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４)を含む。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ７」と呼ばれる、天然型可溶性受容体であり得る変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号２２で示され、コードされているポリペプチドは配列番号２３で示される。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０６で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１０７で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号１０７のアミノ酸残基１〜２３)の推定シグナル配列、およそ１９２個のアミノ酸残基(配列番号１０７のアミノ酸残基４５９〜６５０)の細胞質ドメイン、およそ２７個のアミノ酸残基(配列番号１０７のアミノ酸残基４５９〜４５８)の膜貫通ドメイン、及びおよそ４１４個のアミノ酸残基(配列番号１０７；配列番号１２２のアミノ酸残基２４〜４３７)の細胞外リガンド結合ドメインを含む６５０個のアミノ酸(配列番号１０７)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。ＩＬ-１７Ｃ結合ドメイン(又はリガンド結合ドメイン)は、およそ２７９個のアミノ酸残基(配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７)を含む。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１４」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１０８で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１０９で示される。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１４をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析により、およそ２３個のアミノ酸残基(配列番号１０９のアミノ酸残基１〜２３)の推定シグナル配列とおよそ３９１個のアミノ酸残基(配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４)の細胞外リガンド結合ドメインとを含む４１４個のアミノ酸(配列番号１０９)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。ＩＬ-１７Ｃ結合ドメイン(又はリガンド結合ドメイン)は、およそ２７９個のアミノ酸残基(配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４)を含む。
「ＺｃｙｔｏＲ２１ｓ２」と呼ばれる遺伝子操作型可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１１２で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１３で示される。
本発明はまた、好ましいＩＬ-１７Ｃ結合領域を含む。好ましい結合領域の例は配列番号１１４で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１５で示される。
好ましい結合領域の別の例は配列番号１１６で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１７で示される。
好ましい結合領域のさらに別の例は配列番号１１８で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１９で示される。
マウスＺｃｙｔｏＲ２１をコードする例示的ヌクレオチド配列は配列番号１３で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１４で示される。マウスＺｃｙｔｏＲ２１の分析により、およそ６３８個のアミノ酸残基(配列番号１４；配列番号１５のアミノ酸残基２６〜６６３)の細胞外リガンド結合ドメインが明らかになった。マウスＺｃｙｔｏＲ２１はマウスＩＬ-１７Ｃの受容体(配列番号１８及び１９)として働く。
マウスＺｃｙｔｏＲ２１変異体をコードする例示的ヌクレオチド配列は配列番号１６０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１６１で示される。マウスＺｃｙｔｏＲ２１の分析により、およそ５６８個のアミノ酸残基(配列番号１６１のアミノ酸残基２４〜５９１)の細胞外リガンド結合ドメインが明らかになった。
マウスＺｃｙｔｏＲ２１をコードする別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１１０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１１１で示される。マウスＺｃｙｔｏＲ２１の分析により、２０１個のアミノ酸残基(配列番号１１１のアミノ酸残基４６１〜６６１)の細胞質ドメイン、２２個のアミノ酸残基(配列番号１１１のアミノ酸残基４３９〜４６０)の膜貫通ドメイン、およそ４１５個のアミノ酸残基(配列番号１１１のアミノ酸残基２４〜４３８)の細胞外リガンド結合ドメインを明らかにした。マウス１Ｌ-１７Ｃ結合ドメイン(又はリガンド結合ドメイン)はおよそ２７５個のアミノ酸残基(配列番号１１１のアミノ酸残基１３６〜４１０)を含む。
「ｍＺｃｙｔｏＲ２１ｓ２」と呼ばれる遺伝子操作型可溶性マウスＺｃｙｔｏＲ２１をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は配列番号１２０で示され、コードされているポリペプチドは配列番号１２１で示される。
ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、ヒト染色体３ｐ２５.３に存在する。
以下に記載するように、本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１又は１１３のいずれかの参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号５の参照アミノ酸配列２４〜５８９と少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号８の２４〜６０９の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％より高い、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号１１の２４〜５３３の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、配列番号１７の２６〜６６３の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、この単離されたポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。
本発明はまた、細胞外ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、この細胞外ドメインは、(ａ)配列番号２のアミノ酸残基２４〜４５４；(ｂ)配列番号３；(ｃ)配列番号５のアミノ酸残基２４〜３７６；(ｄ)配列番号６；(ｅ)配列番号８のアミノ酸残基２４〜３９６；(ｆ)配列番号９；(ｇ)配列番号１１のアミノ酸残基２４〜５３３；(ｈ)配列番号１２；(ｉ)配列番号１４のアミノ酸残基２６〜６６３；又は(ｊ)配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、この単離されたポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。このようなポリペプチドはさらに、細胞外ドメインに対してカルボキシル末端位にある膜貫通ドメインを含んでもよく、この膜貫通ドメインは、(ａ)配列番号２のアミノ酸残基４５５〜４７７；(ｂ)配列番号５のアミノ酸残基３７７〜３９９；又は(ｃ)配列番号８のアミノ酸残基３９７〜４１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドはまた、膜貫通ドメインに対してカルボキシル末端位にある細胞内ドメイン及び場合によって細胞外ドメインに対してアミノ末端位にあるシグナル分泌配列も含み得る。
本発明はまた、変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドも含み、この変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は９５％を超える同一性からなる群から選択される、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のアミノ酸配列との同一性を有し、この変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のアミノ酸配列の間の違いは、保存的アミノ酸置換によるものである。
さらに、本発明はまた、ＩＬ-１７Ｃ(例えば、配列番号１７で示されるようなヒトＩＬ-１７Ｃポリペプチド配列)と結合する、上記に開示されるような単離されたポリペプチドも提供する。このヒトＩＬ-１７Ｃポリヌクレオチド配列は配列番号１６で示される。マウスＩＬ-１７Ｃポリヌクレオチド配列は配列番号１８で示され、対応するポリペプチド(polyepeptide)は配列番号１９で示される。
本発明はまた、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基を含む単離されたポリペプチド及びエピトープも提供する。例示的ポリペプチドとしては、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９を含むか又はそれらからなるポリペプチド、その抗原エピトープ、又はその機能的ＩＬ-１７Ｃ結合フラグメントが挙げられる。さらに、本発明はまた、ＩＬ-１７Ｃと結合する、又はＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、若しくは活性を中和する、上記に開示されるような単離されたポリペプチドも提供する。
本発明はまた変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドも含み、変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は９５％を超える同一性、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性からなる群から選択される、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のアミノ酸残基との同一性を有し、この変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列の間の違いは、１以上の保存的アミノ酸置換によるものである。このような保存的アミノ酸置換は、本明細書に記載されている。さらに、本発明はまた、ＩＬ-１７Ｃと結合する、又はＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、若しくは活性を中和する、上記に開示されるような単離されたポリペプチドも提供する。
本発明はさらに、このようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントを提供する。抗体の例としては、中和抗体、ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、及びヒトモノクローナル抗体が挙げられる。例示的抗体フラグメントとしては、Ｆ(ａｂ')2、Ｆ(ａｂ)2、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び最小認識単位が挙げられる。中和抗体は、好ましくは、ＺｃｙｔｏＲ２１と結合して、ＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１の相互作用を遮断する、阻害する、低下させる、相互作用と拮抗する、又は相互作用を中和し、ＺｃｙｔｏＲ２１に対するＩＬ-１７Ｃの結合を遮断する、阻害する、低下させる、結合と拮抗する、又は結合を中和するような抗ＺｃｙｔｏＲ２１中和抗体も本発明に含まれる。すなわち、本発明の中和抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、ＩＬ-１７Ｃ単独と結合するか、又はそれを遮断する、阻害する、低下させる、それと拮抗する、若しくはそれを中和することができるか、あるいはＩＬ-１７Ｃ及び他のサイトカインをまとめて結合するか、又はそれをまとめて遮断する、阻害する、低下させる、それと拮抗する、若しくはそれを中和することができる。本発明はさらに、担体と、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド又は抗体を含む組成物も含む。
さらに、本発明は、医薬として許容される担体と、このような発現ベクターを含む少なくとも１つの発現ベクター又は組換えウイルスとを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、医薬として許容される担体と本明細書に記載のポリペプチド又は抗体とを含む医薬組成物も含む。
本発明はまた、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７若しくは１１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体、又は抗イディオタイプ抗体フラグメントも意図する。抗イディオタイプ抗体の例は、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかからなるポリペプチドを特異的に結合する抗体と結合する。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと免疫グロブリン部分とを含む融合タンパク質も提供する。このような融合タンパク質では、免疫グロブリン部分は、ヒトＦｃフラグメントなどの免疫グロブリン重鎖定常領域であり得る。本発明はさらに、このような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子(例えば、配列番号１２３)を含む。
本発明はまた、可溶性受容体を含む、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体などのＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメインを含むポリペプチドと結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体も提供する。さらに、このような抗体を用いれば、ＩＬ-１７Ｃ(配列番号１７)などのＺｃｙｔｏＲ２１リガンドとＺｃｙｔｏＲ２１受容体との結合と拮抗させることができる。
本発明のこれら及びその他の態様は、下記の詳細な説明を読めば明らかになる。さらに、以下に様々な参照文献が引用されるが、これらはその全内容が本明細書に援用される。
Ｂ)定義
以下の記載では、多くの用語が多用される。本発明の理解を助けるために以下、定義を示す。
本明細書において、「核酸」又は「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)又はリボ核酸(ＲＮＡ)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により生成されるフラグメント、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用により生成されるフラグメントなどのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド(ＤＮＡ及びＲＮＡなど)、若しくは天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのα-鏡像異性形)である単量体、又は双方の組合せからなり得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン又はプリン塩基部分に改変を含み得る。糖修飾としては、例えば、１以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による置換を含み、あるいは糖類をエーテル又はエステル基として官能基化することもできる。さらに、糖部分全体を、アザ糖類及び炭素環式糖類似体などの立体的かつ電気的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式代替物が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合又はこのような結合の類似体により連結され得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。また、「核酸分子」とは、ポリアミド骨格と結合した天然型又は修飾型核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。
「核酸分子の相補体」とは、参照ヌクレオチド配列と比較した場合に相補的なヌクレオチド配列と逆配向を有する核酸分子を指す。例えば、配列５'ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３'は５'ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３'と相補的である。
「縮重ヌクレオチド配列」とは、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較した場合に１以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットは各々Ａｓｐをコードする)。
「構造遺伝子」とは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)へと転写される核酸分子を指し、このｍＲＮＡは次に特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列へと翻訳される。
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された増殖因子をコードするＤＮＡ分子は単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例としては、生物のゲノムに組み込まれていない化学合成された核酸分子がある。特定の種から単離された核酸分子はその種に由来する染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
「核酸分子構築物」とは、人の介入によって天然には存在しない組合せ及び配置を有する核酸断片を含むように改変された一本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
「直鎖ＤＮＡ」は、５'末端及び３'末端を有する非環状ＤＮＡ分子を示す。直鎖ＤＮＡは、酵素切断又は物理的切断による、プラスミドなどの閉環ＤＮＡ分子から調製することができる。
「相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)」とは、逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。一般に、逆転写の誘導には、ｍＲＮＡの部分と相補的なプライマーが用いられる。また、当業者は、このような一本鎖ＤＮＡ分子とその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子を指して「ｃＤＮＡ」という用語を用いる。「ｃＤＮＡ」とはまた、ＲＮＡ鋳型から合成されるｃＤＮＡ分子のクローンも指す。
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を仕向けるヌクレオチド配列である。一般に、プロモーターは遺伝子の５'非コード領域の、構造遺伝子の転写開始部位に近接して配置されている。転写の開始において働くプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする場合が多い。これらのプロモーターエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント(ＤＳＥ； McGeheetら, Mol. Endocrinol. 7:551 (1993))、環状ＡＭＰ応答エレメント(ＣＲＥ)、血清応答エレメント(ＳＲＥ； Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:41 (1990))、グルココルチコイド応答エレメント(ＧＲＥ)、及び他の転写因子の結合部位、例えば、ＣＲＥ／ＡＴＦ(O'Reillyら, J. Biol. Chem. 267:19938 (1992))、ＡＰ２(Yeら, J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質(CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993))及びオクタマー因子(一般に、Watsonら編, Molecular Biology of the Gene, 第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987、及びLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)参照)。プロモーターが誘導プロモーターであるとき、誘導剤に応答して転写速度が高まる。これに対し、プロモーターが構成プロモーターであるとき、その転写速度は誘導剤によっては調節されない。抑制プロモーターもまた知られている。
「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスをはじめとするプロモーター機能及び転写の開始のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは活性を増強し得るか、又は組織特異的活性を付与し得る特定の配列の不在下で検出可能な活性を持っても持たなくてもよい。
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、又はオルガネラで排他的又は優先的に転写可能な細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含み得る。これらの種類の調節エレメントは通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、又は「オルガネラ特異的」様式で発現される遺伝子と関連している。
「エンハンサー」は、転写効率を高めることができる調節エレメントの一種であり、転写開始部位に対するそのエンハンサーの距離又は配向は問わない。
「異種ＤＮＡ」とは、所定の宿主細胞内に本来存在しないＤＮＡ分子、又はＤＮＡ分子集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ(すなわち、外因性ＤＮＡ)と組み合わされている限り、宿主細胞に由来するＤＮＡ(すなわち、内因性ＤＮＡ)を含むことができる。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントと作用可能なように連結されたポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターと作用可能なように連結された内因性遺伝子を含み得る。別の例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、もしそのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く突然変異細胞に導入されれば、異種ＤＮＡであるとみなされる。
「ポリペプチド」は、天然で生成されるものであれ、合成により生成されるものであれ、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基のポリマーである。少なくとも約１０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは一般に「ペプチド」と呼ばれている。
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分も含み得る。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、そのタンパク質を産生する細胞が、タンパク質に付加することができ、細胞の種類によって様々である。タンパク質は、本明細書においてアミノ酸主鎖構造に関して定義され、炭水化物基などの置換基は一般に明示されないが、それでもやはり存在し得る。
非宿主ＤＮＡ分子にコードされているペプチド又はポリペプチドは、「異種」ペプチド又はポリペプチドである。
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自己複製能を有するプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは一般に、ベクターの必須生物機能を欠くことなく測定可能な様式で核酸分子の挿入を可能とする１つ又は小数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定及び選択に用いるのに適当なマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は一般に、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。一般に、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子、及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーター「と作用可能なように連結される」と言われる。同様に、調節エレメント及びコアプロモーターは、もしその調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節するならば、作用可能なように連結されている。
「組換え宿主」は、クローニングベクター又は発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。これに関し、組換え宿主の例として、発現ベクターからＺｃｙｔｏＲ２１を産生する細胞が挙げられる。これに対し、ＺｃｙｔｏＲ２１は、ＺｃｙｔｏＲ２１の「天然の供給源」であり、かつ、発現ベクターを欠く細胞により生産可能である。
「組み込み型形質転換体」は、異種ＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている組換え宿主細胞である。
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、アフィニティーマトリックスと結合するポリペプチドと融合されたＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、大量のＺｃｙｔｏＲ２１を単離する手段となる。
「受容体」とは、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子と結合する細胞会合型タンパク質を示す。この相互作用は、細胞上でリガンド作用を媒介する。受容体は膜結合型であっても、細胞質性であっても、又は核性であってもよく、単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)であっても、多量体(例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ-３受容体、ＧＭ-ＣＳＦ受容体、Ｇ-ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体及びＩＬ-６受容体)であってもよい。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、一般にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインとを含むマルチドメイン構造を特徴とする。ある種の膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内エフェクタードメインが、完全な機能的受容体を含む別個のポリペプチドに存在する。
一般に、リガンドが受容体と結合した結果として、細胞内でエフェクタードメインと他の分子の間の相互作用を生じる、受容体のコンホメーション変化が生じ、次に、細胞の代謝変化がもたらされる。受容体-リガンド相互作用に関連する場合が多い代謝的事象としては、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状ＡＭＰ生産の上昇、細胞カルシウムの可動化、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解が挙げられる。
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、一般的に、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにグリコホスホイノシトール(ｇｐｉ)などの細胞膜に対する他の結合を欠く、リガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製のために提供されるか、又はポリペプチドと基質、又は免疫グロブリン定常領域配列の結合のための部位を提供するアフィニティータグなどの付加的なアミノ酸残基を含み得る。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解によって生じるか、又は選択的にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳された天然の可溶性の対応部分を有する。可溶性受容体は単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は多量体であり得、ここで、多量体受容体は一般に９を超えるサブユニットを含まず、好ましくは６を超えるサブユニットを含まず、最も好ましくは３を超えるサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それぞれ膜アンカリング又はシグナル伝達を提供するのに十分な膜貫通ポリペプチドセグメント及び細胞内ポリペプチドセグメントの部分を欠いている場合には、これらのセグメントを実質的に含まないと言う。サイトカイン受容体の可溶性受容体は一般に、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含む。例えば、代表的な可溶性受容体としては、配列番号３又は１１３で示されるようなＩＬ-１７Ｒの可溶性受容体が挙げられる。既知のサイトカイン受容体配列のうちどの配列が膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含むかを詳細に示すことは、十分当業者の水準の範囲内である。さらに、当業者ならば、遺伝コードを用いて、このような可溶性受容体ポリペプチド(polyptides)をコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチド成分として、そのより大きなポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路に向けるペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするＤＮＡ配列を示す。この大きなポリペプチドは一般に、この分泌経路を移行している間に分泌ペプチドが切り離される。
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、又は自然状態でポリペプチドと会合している他のタンパク質性夾雑物などの細胞成分が実質的に混入していないポリペプチドである。一般に、単離されたポリペプチドの調製物には、高精製型、すなわち、少なくとも約８０％純度、少なくとも約９０％純度、少なくとも約９５％純度、９５％を超える純度、例えば、９６％、９７％、又は９８％以上の純度、又は９９％を超える純度でポリペプチドを含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示す方法の１つとして、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそのゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後に一本のバンドを見出すことによるものがある。しかしながら、「単離された」とは、二量体又は選択的にグリコシル化された、若しくは誘導体化された形態などの選択的物理形態における同じポリペプチドの存在を排除するものではない。
「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」は、ポリペプチド内の位置を表すために本明細書で用いられる。支障がない限り、これらの用語は、近接位置又は相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列又は部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある配列は、その参照配列のカルボキシル末端に近接して位置し、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置していなくてもよい。
「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現はその構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
「スプライス変異体」とは、本明細書において、遺伝子から転写されるＲＮＡの選択的形態を指して用いられる。スプライス変異体は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は多くはないが、別個に転写されたＲＮＡ分子間の選択的スプライシング部位の使用によって天然に生じ、同じ遺伝子から転写されたいくつかのｍＲＮＡを生じる場合もある。スプライス変異体はアミノ酸配列の変化したポリペプチドをコードし得る。スプライス変異体とはまた、本明細書において、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを指して用いられる。
本明細書において、「免疫調節剤」とは、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子など、また、これらの分子の合成類似体を含む。
「相補体／抗相補体対」とは、適当な条件下で非共有結合的に会合した安定な対を形成する非同一部分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプトアビジン)は、相補体／抗相補体対の原型メンバーである。他の相補体／抗相補体対の例としては、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン若しくはエピトープ)対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などが挙げられる。後に、相補体／抗相補体対の解離が望まれる場合には、その相補体／抗相補体対は、好ましくは１０9Ｍ-1未満の結合親和性を有する。
「抗イディオタイプ抗体」とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書において、抗イディオタイプ抗体は、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の可変領域と結合し、従って、抗イディオタイプ抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１のエピトープを模倣する。
「抗体フラグメント」はＦ(ａｂ')2、Ｆ(ａｂ)2、Ｆａｂ'、Ｆａｂなどの抗体の一部である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、完全な抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＺｃｙｔｏＲ２１モノクローナル抗体フラグメントは、ＺｃｙｔｏＲ２１のエピトープと結合する。
また、「抗体フラグメント」とは、特定の抗原に結合する、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド、例えば、軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖及び軽鎖可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結合されている組換え一本鎖ポリペプチド分子(「ｓｖＦｖタンパク質」)、並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位も含む。
「キメラ抗体」とは、囓歯類抗体に由来する可変ドメイン及び相補性決定領域を含む組換えタンパク質であるが、抗体分子の残りの部分は、ヒト抗体に由来する。
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域がマウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト可変ドメインに移されている組換えタンパク質である。ヒトタンパク質に結合するもの、又はヒトタンパク質を中和するものなどの、マウス抗体に由来する、ヒトにおける治療的使用のためのヒト化抗体の構築も、当業者の技術の範囲内である。
本明細書において、「治療薬」とは、治療に有用な複合体を作製するために抗体部分に結合される分子又は原子である。治療薬の例としては、薬剤、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬又は色素、及び放射性同位元素が挙げられる。
「検出可能な標識」は、診断に有用な分子を作製するために抗体部分にコンジュゲートされ得る分子又は原子である。検出可能な標識の例としては、キレート剤、光活性薬、放射性同位元素、蛍光剤、常磁性イオン、又はその他のマーカー部分が挙げられる。
「アフィニティータグ」とは、本明細書において、第二ポリペプチドの精製又は検出のために提供されるか、又は第二ポリペプチドと基質の結合のための部位を提供するために第二ポリペプチドと結合させることができるポリペプチドセグメントを指して用いられる。基本的に、その抗体又は他の特異的結合剤が利用可能であれば、いずれのペプチド又はタンパク質でもアフィニティータグとして使用可能である。アフィニティータグとしては、ポリヒスチジントラック、タンパク質Ａ(Nilssonら, EMBO J. 4:1075 (1985); Nilssonら, Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988))、Ｇｌｕ-Ｇｌｕアフィニティータグ(Grussenmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1952 (1985))、Ｐ物質、ＦＬＡＧペプチド(Hoppら, Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、又は他の抗原エピトープ又は結合ドメインが挙げられる。一般に、Fordら, Protein Expression and Purification 2:95 (1991)参照のこと。アフィニティータグをコードするＤＮＡ分子は商業供給者(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手可能である。
「裸の抗体」は、抗体フラグメントとは対照的に、治療薬と結合されていない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の双方、並びにキメラ及びヒト化抗体などのある種の組換え抗体を含む。
本明細書において、「抗体成分」とは、完全抗体と抗体フラグメントの双方を含む。
「免疫複合体」は、抗体成分と治療薬又は検出可能な標識との複合体である。
本明細書において、「抗体融合タンパク質」とは、抗体成分とＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド成分とを含む組換え分子を指す。抗体融合タンパク質の例としては、ＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメインと、Ｆｃドメインか抗原結合領域かのいずれかを含むタンパク質(例えば、配列番号１２３)が挙げられる。
「標的ポリペプチド」又は「標的ペプチド」は、少なくとも１つのエピトープを含んでなり、かつ、腫瘍細胞又は感染性病原体の抗原を有する細胞などの標的細胞で発現するアミノ酸配列である。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体分子により提示される、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに対するペプチドエピトープを認識し、通常、標的細胞を溶解するか、又はその標的細胞の位置に他の免疫細胞を動員することにより、標的細胞を死滅させる。
「抗原ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子と結合してＴ細胞により認識されるＭＨＣ-ペプチド複合体を形成し、それにより、Ｔ細胞に提示された際に細胞傷害性のリンパ球応答を誘導するペプチドである。よって、抗原ペプチドは適当な主要組織適合性複合体分子と結合し、その抗原と結合する、又はその抗原を発現する標的細胞に対して、細胞溶解又は特異的サイトカインの放出などの細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、抗原提示細胞又は標的細胞上のクラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子に関して結合し得る。
真核生物では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、構造遺伝子の転写を触媒してｍＲＮＡを生成する。核酸分子は、ＲＮＡ転写物が特定のｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含むように設計することができる。このＲＮＡ転写物は「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれ、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子と結合して、ｍＲＮＡ翻訳の阻害をもたらすことができる。
「ＺｃｙｔｏＲ２１に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＺｃｙｔｏＲ２１アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、(ａ)ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の一部と安定な三重らせんを形成し得るか、又は(ｂ)ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重らせんを形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子である。この用語には、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、及びこれらの触媒作用を遂行する核酸分子が含まれる。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
「外部ガイド配列」は、内因性リボザイムであるＲＮアーゼＰを特定の細胞内ｍＲＮＡ種に向けて、ＲＮアーゼＰによるｍＲＮＡの切断をもたらす核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と呼ばれる。
「変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子」とは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を指す。このような変異体としては、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の天然多型、並びに配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子を含む。ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子のさらなる変異体形態として、本明細書に記載のヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子がある。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、その遺伝子が、例えば、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０又は１１２のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はそれらの相補体のいずれかとストリンジェント条件下でハイブリダイズするかどうかを判定することにより同定することができる。
あるいは、変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、配列比較により同定することができる。２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が最大の一致が得られるようにアラインされた際に同一であるならば、その２つのアミノ酸配列は「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が最大の一致が得られるようにアラインされた場合に同一であるならば、その２つのヌクレオチド配列は「１００％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ(Madison, Wisconsin)が制作しているＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報科学コンピューティングサイトに含まれるものなどの標準的なソフトウエアプログラムを用いて行うことができる。最適アライメントを求めることにより２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を比較するための他の方法も当業者に周知である(例えば、Peruski及びPeruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wuら.(編), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)、及びBishop (編), Guide to Human Genome Computing, 第2版 (Academic Press, Inc. 1998)参照)。配列同一性を決定するための特定の方法を次に記載する。
変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子又は変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを同定するために用いられる方法に関係なく、変異体遺伝子によりコードされる変異体遺伝子又はポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体と特異的に結合する能力を機能的に同定することができる。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子又は変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドはまた、本明細書に記載の生物アッセイ又は生化学アッセイを用い、例えばＩＬ-１７Ｃなどそのリガンドと結合する能力を機能的に同定することもできる。
「対立遺伝子変異体」とは、本明細書において、同じ染色体座を占める遺伝子の２以上の選択形態のいずれかを指して用いられる。対立遺伝子変異は、自然状態で突然変異によって生じ、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント(コードされるポリペプチドに変化がない)であってもよいし、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。また、対立遺伝子変異体とは、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を指して用いられる。
「オーソログ」とは、異なる種に由来するポリペプチド又はタンパク質の機能的な対応物である、１つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。オーソログ間の配列の違いは、種分化の結果である。
「パラログ」とは、生物が作り出す、異なってはいるが構造的に関連するタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、及びミオグロビンは互いにパラログである。
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の機能的フラグメントを含む。本発明の範囲内で、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の「機能的フラグメント」とは、本明細書に記載のドメインであるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの一部をコードするか、又は少なくとも抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体と特異的に結合する核酸分子を指す。
標準的な分析方法が不正確なものであるため、ポリマーの分子量及び長さは概数であると理解される。このような値が「約」Ｘ又は「およそ」Ｘとして表される場合、その示されているＸの値は、正確には±１０％であると理解される。
Ｃ)ＺｃｙｔｏＲ２１ポリヌクレオチド又は遺伝子の作出
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、又は１１２のいずれかに基づいたポリヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。これらの技術は標準的かつ十分確立され、商業供給者から入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ausubelら. (編), Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, John Wiley & Sons 1995; Wuら, Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynhら, “Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgtll,” in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (編), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997), pages 47-52参照のこと。
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子をコードする核酸分子もまた、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子又はｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとともにポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて得ることができる。ＰＣＲを用いたライブラリーをスクリーニングするための一般的方法は、例えば、Yuら, “Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries,”、Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (編), Humana Press, Inc., 1993により提供される。さらに、関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる技術は、例えば、Preston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family members,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (編), Humana Press, Inc. 1993に記載される。別法として、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、本明細書に記載の長いオリゴヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列の交互プライミングを用いて核酸分子を合成することによっても得ることができる(例えば、Ausubel (1995)参照)。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術により、少なくとも２キロベース長のＤＮＡ分子を合成する能力が得られる(Adangら, Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambotら, PCR Methods and Applications 2:266 (1993)、Dillonら, “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (編), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993)、及びHolowachukら, PCR Methods Appl. 4:299 (1995))。ポリヌクレオチド合成についての総説としては、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakuraら, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)、及びClimieら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)参照のこと。
Ｄ)ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子変異体の作出
本発明は、本明細書で開示されるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドをコードする、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、様々な核酸分子を提供する。当業者ならば、遺伝コードの縮重から、これらのポリヌクレオチド分子間に著しい配列変異が存在し得ることが容易に分かるであろう。さらに、本発明はまた、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかの受容体ポリペプチドと実質的に相同な少なくとも１つのＺｃｙｔｏＲ２１受容体サブユニットを含む単離された可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体ポリペプチドも提供する。よって、本発明は、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０、又は１１２の縮重ヌクレオチドを含むＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドコード核酸分子、及びそれらのＲＮＡ等価物を意図する。
当業者ならば、遺伝コードの縮重から、これらのポリヌクレオチド分子間に著しい配列変異が存在し得ることが容易に分かるであろう。配列番号７は、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドをコードする全ての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者ならば、配列番号７の縮重配列が、ＴをＵに置き換えて配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかをコードする全てのＲＮＡ配列も提供することが分かるであろう。よって、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１５４〜ヌクレオチド２２２９を含むＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドコード核酸分子、及びそれらのＲＮＡ等価物を意図する。同様に、配列番号６のＺｃｙｔｏＲ２１縮重配列も、ＴをＵに置き換えて配列番号をコードする全てのＲＮＡ配列を提供する。
表１は、縮重したヌクレオチドの位置を示すための一文字コードを示している。「解」は、コード文字により示されるヌクレオチドである。「相補体」とは、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードＹは、Ｃ又はＴのいずれかを示し、その相補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、また、ＧはＣに対して相補的である。
Figure 2008516985
所与のアミノ酸に対してあり得る全てのコドンを含む縮重コドンを表２に示す。
Figure 2008516985
当業者ならば、アミノ酸をコードするあり得る全てのコドンの代表としての縮重コドンを決定する際には、いくらかのあいまいさが入り込むことが分かるであろう。例えば、セリン(ＷＳＮ)の縮重コドンは、ある場合にはアルギニン(ＡＧＲ)をコードすることができ、アルギニン(ＭＧＮ)の縮重コドンは、ある場合にはセリン(ＡＧＹ)をコードすることができる。同様の関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間にも存在する。従って、縮重配列によって包含されるいくつかのポリヌクレオチドが変異体アミノ酸配列をコードする可能性があるが、当業者ならば、配列番号３のアミノ酸配列を参照することにより、そのような変異体配列を容易に確認することができる。変異体配列は、本明細書に記載したように機能性に関して容易に試験することができる。
様々な種が「優先的なコドン利用」を示す。一般に、Granthamら, Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haasら. Curr. Biol. 6:315 (1996)、Wain-Hobsonら, Gene 13:355 (1981)、Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14:3015 (1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158:513 (1982)、Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995)、及びMakrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996)参照のこと。本明細書において、「優先的なコドン利用」又は「優先的なコドン」とは、ある種の細胞に最も頻繁に使用されているタンパク質翻訳コドン、従って、それぞれのアミノ酸をコードするあり得るコドンの有利な１つ又はいくつかの代表例を指す技術用語である(表２参照)。例えば、アミノ酸トレオニン(Ｔｈｒ)は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされ得るが、哺乳類細胞では、ＡＣＣが最もよく使用されるコドンであり、他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルス又は細菌では、違うＴｈｒコドンが好ましい場合がある。特定の種に対する優先的コドンは、当技術分野で公知の種々の方法によって本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。優先的コドン配列を組換えＤＮＡ中へ導入すると、例えば、特定の細胞種又は種内でタンパク質翻訳をより効果的にすることによって、そのタンパク質の産生を増強することができる。従って、本明細書で開示される縮重コドン配列は、当技術分野においてよく用いられ、本明細書で開示される種々の細胞種及び種においてポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先的コドンを含む配列は、種々の種における発現に関して試験及び最適化し、本明細書で開示される機能性に関して試験することができる。
ＺｃｙｔｏＲ２１をコードするｃＤＮＡは、完全若しくは部分的ヒトｃＤＮＡで、又は開示されている配列に基づく縮重プローブの１以上のセットでプロービングするなど、様々な方法によって単離することができる。ｃＤＮＡはまた、本明細書で開示される代表的ヒトＺｃｙｔｏＲ２１配列から設計されたプライマーとともにポリメラーゼ連鎖反応を用い、クローニングすることもできる。さらに、ｃＤＮＡライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができ、目的のｃＤＮＡの発現をＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。
当業者ならば、配列番号１で開示される配列がヒトＺｃｙｔｏＲ２１の１つの対立遺伝子に相当し、対立遺伝子変異及び選択的スプライシングが起こり得ることが分かるであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準的な手順に従い、種々の個体からｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングすることができる。本明細書で開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、サイレント突然変異を含むもの、及び突然変異がアミノ酸配列の変化を生じるものを含め、本明細書で開示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質であるので、本発明の範囲内にある。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの特性を保持する、選択的スプライスｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡ分子も、このようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドであるので、本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当技術分野で公知の標準的手順に従い、種々の個体又は組織に由来するｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプロービングすることによってクローニングすることができる。
上述の方法を用い、当業者ならば、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０若しくは１１２のいずれかと実質的に相同であるか、又は配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７若しくは１１９のいずれかのアミノ酸、又は対立遺伝子変異体をコードし、かつ、野生型ＺｃｙｔｏＲ２１受容体のリガンド結合特性を保持している、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体サブユニットを含む様々なポリペプチドを作製することができる。このようなポリペプチドもまた、一般に本明細書で開示されるような付加的ポリペプチドセグメントを含み得る。
本発明のある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、ストリンジェント条件下で、本明細書で開示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズすることができる。例えば、このような核酸分子は、ストリンジェント条件下で、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０若しくは１１２のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子と、又は配列番号０１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０若しくは１１２のいずれかと相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はそのフラグメントとハイブリダイズすることができる。
一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びｐＨで特定の配列に対して融点より約５℃低くなるように選択する(Ｔm)。Ｔmは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である(所定のイオン強度及びｐＨ下)。ハイブリダイゼーション後、ストリンジェント条件下、又は高ストリンジェント条件下で核酸分子を洗い流し、ハイブリダイズしていない核酸分子を除去する。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubelら, (編), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (編), Guide to Mplecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987);及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990) 参照のこと。ＯＬＩＧＯ ６.０ (LSR; Long Lake, MN)やＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４.０ (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)などの配列解析ソフト、並びにインターネット上のサイトが、使用者が定義した基準に基づき、所与の配列を解析し、Ｔmを算出するためのツールとして利用可能である。特定のポリヌクレオチドハイブリッドとともに用いるアダプトハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、十分当業者の能力の範囲内である。
本発明はまた、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７若しくは１１９のいずれかのポリペプチド、又はそれらのオーソログと実質的に類似する配列同一性を有する単離されたＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドも提供する。「実質的に類似する配列同一性」とは、本明細書において、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７若しくは１１９のいずれかで示される配列、又はそれらのオーソログと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９５％を超える配列同一性を有するポリペプチドを指して用いられる。例えば、変異体及びオーソログＺｃｙｔｏＲ２１受容体を用いて、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１に対する免疫応答を生じさせ、それに対する交差反応性抗体を作製することができる。このような抗体は本明細書に記載のようにヒト化及び修飾することができ、乾癬、乾癬性関節炎、ＩＢＤ、大腸炎、内毒素血症の治療的処置、並びに本明細書に記載のタンパク質の治療適用に用いることができる。
本発明はまた、コードされているポリペプチドと配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列との間の類似性の判定、及びハイブリダイゼーションアッセイという２つの基準を用いて同定することができるＺｃｙｔｏＲ２１変異体核酸分子も意図する。このようなＺｃｙｔｏＲ２１変異体としては、(１)洗浄ストリンジェンシーが５５〜６５℃で０.１％ＳＤＳを含む０.５×〜２×ＳＳＣに相当するストリンジェント洗浄条件下で、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０又は１１２のヌクレオチド配列(又はその相補体)を有する核酸分子とハイブリダイズを維持し、及び(２)配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。あるいは、ＺｃｙｔｏＲ２１変異体は、(１)洗浄ストリンジェンシーが５５〜６５℃で０.１％ＳＤＳを含む０.１×〜０.２×ＳＳＣに相当する高ストリンジェント洗浄条件下で、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０又は１１２のヌクレオチド配列(又はその相補体)を有する核酸分子とハイブリダイズを維持し、及び(２)配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として同定することができる。
配列同一性割合(％)は慣用方法によって決定される。例えば、Altschulら., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)参照のこと。要するに、２つのアミノ酸配列を、ギャップ・オープニング・ペナルティー１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー１、及び表３(アミノ酸は標準的な一文字コードによって示される)に示されるようなHenikoff及びHenikoff(同書)の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いて、そのアラインメントスコアが最適となるようにアラインする。次に、同一性割合(％)を、(［マッチ総数］／［長い方の配列の長さ＋２つの配列をアラインするのに長い方の配列に導入したギャップ数］)(１００)として計算する。
Figure 2008516985
当業者ならば、２つのアミノ酸配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することが分かるであろう。Pearson及びLipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるアミノ酸配列と推定ＺｃｙｔｏＲ２１変異体のアミノ酸配列が共有している同一性のレベルを調べるのに好適なタンパク質アライメント法である。このＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)及びPearsonn, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)によって記載されている。要するに、ＦＡＳＴＡではまず、保存的アミノ酸置換、挿入、又は欠失を考慮せずに、クエリ配列(例えば、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれか)と最高密度の同一性(ｋｔｕｐ変数が１である場合)又は対の同一性(ｋｔｕｐ＝２である場合)のいずれかを有するテスト配列が共有している領域を同定することによって配列類似性を特定する。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域を、アミノ酸置換マトリックスを用い、全アミノ酸対の類似性を比較することにより再評価し、領域の末端を、最高のスコアに寄与する残基のみを含むよう「トリミング」する。「カットオフ」値(配列長及びｋｔｕｐ値に基づいて所定の式により計算)よりも高いスコアを有する領域がいくつか存在する場合には、トリミングした初期領域を、それらの領域がギャップを用いてだいたいのアラインメントを形成するように連結可能であるかどうかを判定すべく検討する。最終的に、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域を、Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48：444, 1970； Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26：787, 1974)の改変法を用いてアラインし、これによりアミノ酸の挿入及び欠失が考慮できる。ＦＡＳＴＡ 解析のパラメーター例としては、Ｋｔｕｐ＝１、ギャップ・オープニング・ペナルティー＝１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー＝１、及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 , Meth. Enzymol. 183：63(1990)に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル(「ＳＭＡＴＲＩＸ」)を改変することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入することができる。
また、ＦＡＳＴＡは、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するために使用することもできる。ヌクレオチド配列の比較のためには、ｋｔｕｐ値は、上記のような他のパラメーターを用いて、１〜６、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３であり得る。
本発明は、本明細書で開示されるアミノ酸配列と比較して、保存されたアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかの１以上のアミノ酸置換であって、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列のアルキルアミノ酸がアルキルアミノ酸に置換され、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列の芳香族アミノ酸が芳香族アミノ酸に置換され、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列の硫黄含有アミノ酸が硫黄含有アミノ酸に置換され、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列のヒドロキシ含有アミノ酸がヒドロキシ含有アミノ酸に置換され、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列の酸性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換され、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列の塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されるか、又はＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸配列の二塩基性モノカルボン酸アミノ酸が二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に置換された、アミノ酸置換を含む変異体を得ることができる。一般アミノ酸では、例えば、「保存的アミノ酸置換」は次の各群内のアミノ酸間の置換により例示される：(１)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、(２)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、(３)セリン及びトレオニン、(４)アスパラギン酸及びグルタミン酸、(５)グルタミン及びアスパラギン、並びに(６)リシン、アルギニン及びヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２の表は、タンパク質配列セグメントの約２,０００のローカル・マルチプル・アライメントから得られたアミノ酸置換マトリックスであり、５００群を超える関連タンパク質の保存性の高い領域を表す(Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。よって、このＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用い、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義することができる。化学的特性だけに基づいてアミノ酸置換を設計することもできるが(上述の通り)、「保存的アミノ酸置換」とは、好ましくは、-１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換が０、１、２、又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする場合、その置換は保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１(例えば、１、２又は３)のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とするが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２(例えば、２又は３)のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする。ＺｃｙｔｏＲ２１の特定の変異体は、対応するアミノ酸配列(例えば、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９)と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％を超える、例えば、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有することを特徴とし、アミノ酸配列におけるこの変異は、１以上の保存的アミノ酸置換によるものである。
ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子における保存的アミノ酸変化は、例えば、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０又は１１２に挙げられているヌクレオチドとヌクレオチドを置換することにより導入することができる。このような「保存的アミノ酸」変異体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応などを用いた突然変異誘発などによって得ることができる(Ausubel (1995); and McPherson (編), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (JRL Press 1991)参照)。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体と特異的に結合する能力によって同定することができる。
本発明のタンパク質はまた、非天然型アミノ酸残基も含み得る。非天然型アミノ酸としては、限定されるものではないが、トランス-３-メチルプロリン、２,４-メタノプロリン、シス-４-ヒドロキシプロリン、トランス-４-ヒドロキシプロリン、Ｎ-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３-及び４-メチルプロリン、３,３-ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ-ロイシン、ノルバリン、２-アザフェニルアラニン、３-アザフェニルアラニン、４-アザフェニルアラニン、及び４-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。非天然型アミノ酸残基をタンパク質に導入するためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いてナンセンス突然変異が抑制されるin vitro系が使用可能である。アミノ酸の合成及びｔＲＮＡのアミノアシル化のための方法は、当技術分野で公知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、一般に、大腸菌(E. coli)Ｓ３０抽出液と市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製する。例えば、Robertsonら, J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellmanら, Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chungら, Science 259:806 (1993)、及びChungら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)参照のこと。
第二の方法では、翻訳は、突然変異ｍＲＮＡと化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより、アフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞で行う(Turcattiら, J. Biol Chem. 271:19991 (1996))。第三の方法では、大腸菌細胞を、置換しようとする天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下、及び所望の非天然型アミノ酸(例えば、２-アザフェニルアラニン、３-アザフェニルアラニン、４-アザフェニルアラニン、又は４-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。非天然型アミノ酸は、タンパク質のその天然対応物の位置に組み込まれる。Koideら, Biochem. 33:7470 (1994)参照のこと。天然型アミノ酸残基は、in vitro化学修飾により、非天然種に変換することができる。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせて置換範囲をさらに拡大することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395 (1993))。
限定された数の、非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、非天然型アミノ酸、及び本来のものでないアミノ酸が、ＺｃｙｔｏＲ２１アミノ酸残基により置換可能である。
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989)、Bassら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)、Coombs and Corey, “Site- Directed Mutagenesis and Protein Engineering,” in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (編), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998))など、当技術分野で公知の手順に従って同定することができる。後者の技術では、分子の残基ごとに単一のアラニン突然変異を導入し、得られた突然変異分子の生物活性を調べ、その分子の活性に重要なアミノ酸残基を特定する。また、Hiltonら, J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)も参照のこと。
ＺｃｙｔｏＲ２１リガンド結合領域をさらに定義するために配列解析を用いることができるが、ＺｃｙｔｏＲ２１結合活性(ＺｃｙｔｏＲ２１とＩＬ-１７Ｃとの結合、又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体との結合など)に役割を果たすアミノ酸はまた、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識などの技術により判定される、物理的構造解析によって判定することもできる。例えば、de Vosら, Science 255:306 (1992)、Smithら, J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、及びWlodaverら, FEBS Lett. 309:59 (1992)参照のこと。
複数のアミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53 (1988))又はBowie and Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))に開示されているものなど、公知の突然変異誘発及びスクリーニング法を用いて作出及び試験することができる。要するに、これらの筆者は、ポリペプチドにおいて２以上の位置を無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、この突然変異誘発ポリペプチドを配列決定して、各位置において許容される置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用可能な他の方法として、ファージディスプレー(例えば、Lowmanら, Biochem. 30:10832 (1991)、Ladnerら, 米国特許第５,２２３,４０９号、Huse, 国際公開公報第ＷＯ９２／０６２０４号、及び領域特異的突然変異誘発(Derbyshireら, Gene 46:145 (1986)、及びNerら, DNA 7:127 (1988)) がある。さらに、ビオチン又はＦＩＴＣで標識したＺｃｙｔｏＲ２１は、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドの発現クローニングのために使用することができる。
開示されているＺｃｙｔｏＲ２１ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体はまた、Stemmer, Nature 370:389 (1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、及び国際公開公報第ＷＯ９７／２００７８号に開示されているようなＤＮＡシャッフリングによって作出することもできる。要するに、親ＤＮＡのランダムフラグメンテーションによりin vitro相同組換えを行った後、ＰＣＲを用いた再組立てによって無作為に導入された点突然変異を生じさせることによって変異体ＤＮＡ分子を作出する。この技術は、プロセス中にさらなる変動性を導入するため、対立遺伝子変異体又は異種由来のＤＮＡ分子などの親ＤＮＡ分子の系統を用いることで改変することができる。所望の活性に関して選択又はスクリーニングを行った後、突然変異誘発とアッセイをさらに繰り返すことで、所望の突然変異に関して選択すると同時に有害な変化に対しても選択をかけることで配列の急速な「進化」がもたらされる。
本明細書で開示されるような突然変異誘発法は、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するためにハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることができる。生物学的に活性なポリペプチド、又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、最新の装置を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、目的のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な判定が可能となり、未知の構造のポリペプチドに当てはめることができる。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの「機能的フラグメント」及びこのような機能的フラグメントをコードする核酸分子も含む。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために、核酸分子の通例の欠失分析を行うことができる。一例として、配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０又は１１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子をＢａｌ３１ヌクレアーゼで切断して一連の入れ子状態(nested)の欠失を得ることができる。次に、これらのフラグメントを適当なリーディングフレームで発現ベクターに挿入し、発現したポリペプチドを単離し、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体との結合能に関して試験する。エキソヌクレアーゼ切断のもう１つの例としては、所望のフラグメントの産生を特定するために、欠失又は終結コドンを導入するためのオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用することである。あるいは、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて合成することができる。
この一般的アプローチは、インターフェロンのいずれかの末端又は両末端の切断についての研究により例示され、Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)により要約されている。さらに、例えば、タンパク質の機能解析のための標準的な技術は、Treuterら, Molec. Gen. genet. 240:113 (1993)、Contentら, “Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon,” in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (編), pages 65-72 (Nijhoff 1987)、Herschman, “The EGF Receptor,” in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boyntonら, (編) pages 169-199 (Academic Press 1985)、Coumailleauら, J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunagaら, J. Biol Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchiら, Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、及びMeiselら, Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)によって記載されている。
本発明はまた、本明細書で開示されるアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を有するＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の機能的フラグメントも意図する。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、上述のように、開示されているヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変異体遺伝子を同定するための別のアプローチとしては、可能性のある変異体ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子をコードする核酸分子が配列番号１、４、７、１０、１３、２０、２２、１０６、１０８、１１０、又は１１２などのヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズすることができるかどうかを判定することである。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの機能的フラグメント、抗原エピトープ、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドのエピトープ担持部分、及びこのようなＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの機能的フラグメント、抗原エピトープ、エピトープ担持部分をコードする核酸分子の使用も含む。例えば、このようなＺｃｙｔｏＲ２１フラグメントとしては、配列番号１１５、１１７又は１１９によりコードされるポリペプチドを含む。これらのフラグメントはＺｃｙｔｏＲ２１の結合ドメインをコードし、ＩＬ-１７Ｃと結合する、ＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和する抗体及び結合パートナーを作出する際に用いるためのポリペプチドを作出するために使用される。本明細書で定義されるような「機能的」ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド又はそのフラグメントは、ＩＬ-１７Ｃの炎症、増殖又は分化活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和するその能力、特殊な細胞機能を誘導又は阻害するその能力、あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、細胞、又はＩＬ-１７Ｃと特異的に結合するその能力を特徴とする。本明細書で従前に記載したように、ＺｃｙｔｏＲ２１は本明細書に記載されるような固有のサイトカイン受容体構造及びドメインを特徴とする。よって、本発明はさらに、(ａ)上記の１以上のドメインを含むポリペプチド分子、及び(ｂ)これらドメインの１以上を含む機能的フラグメントを包含する融合タンパク質の使用も意図する。この融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、ＩＬ-１７ＲＡ、ＩＬ-１７ＲＢ、ＩＬ-１７ＲＣ、ＩＬ-１７ＲＤ、ＩＬ-１７ＲＥなどの別のサイトカイン受容体が寄与するものであってもよいし、あるいは、融合タンパク質の分泌を促す非天然かつ／又は無関連の分泌シグナルペプチドが寄与するものであってもよい。
本発明はまた、本明細書に記載のＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドのエピトープ担持部分を含むポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。このようなフラグメント又はペプチドは、完全タンパク質が免疫原として用いられる場合に抗体応答を惹起するタンパク質部分である「免疫原性エピトープ」を含んでもよい。免疫原性エピトープ担持ペプチドは、標準的な方法を用いて同定することができる(例えば、Geysenら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)参照)。
これに対し、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である「抗原エピトープ」を含んでもよい。ある特定のエピトープは、直鎖アミノ酸又はアミノ酸の連続ストレッチからなり、このようなエピトープの抗原性は、変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣することができる比較的短い合成ペプチドをタンパク質に対する抗体の産生を刺激するために使用することができることは、当技術分野において公知である(例えば、Sutcliffeら, Science 219：660 (1983)参照)。従って、本発明の抗原エピトープ担持ペプチド、抗原ペプチド、エピトープ、及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生じさせるために、並びに中和型の、また、ＩＬ-１７Ｃと結合する、ＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和することができる抗ＺｃｙｔｏＲ２１モノクローナル抗体を同定及びスクリーニングするために有用である。本発明のこのような中和モノクローナル抗体はＺｃｙｔｏＲ２１抗原エピトープと結合することができる。配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかの中で最も抗原性の高い領域を決定するためにHopp/Woods親水性プロフィールを使用することができる(Hoppら, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986及びTriquierら, Protein Engineering 11:153-169, 1998)。このプロフィールはスライドする６残基のウィンドウに基づくものである。埋め込まれているＧ、Ｓ、及びＴ残基と露出しているＨ、Ｙ、及びＷ残基は無視された。ＺｃｙｔｏＲ２１においても、当業者ならばこれらの領域を決定することができる。さらに、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｅａｎプログラム(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を用いるなど、Jameson-Wolfプロットによって推定されるような、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７又は１１９のいずれかの中のＺｃｙｔｏＲ２１抗原エピトープは、好ましい抗原エピトープとして働き、そして当業者により決定することができる。この解析の結果は、配列番号１１５(「抗原ペプチド１」)、１１７(「抗原ペプチド２」)、１１９(「抗原ペプチド３」、及び配列番号６の次のようなアミノ酸配列：アミノ酸５１〜５９(「抗原ペプチド４」)、アミノ酸７２〜８３(「抗原ペプチド５」)、９１〜９７(「抗原ペプチド６」)、アミノ酸１７４〜１８０(「抗原ペプチド７」)、及びアミノ酸２４２〜２４６(「抗原ペプチド８」)が好適な抗原ペプチドを提供することを示した。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１に対する抗体を作出するための抗原ペプチド１〜８のいずれか１つ、又はそのいずれかの部分的組合せの使用を意図する。本発明はまた、抗原ペプチド１〜８の少なくとも１つを含むポリペプチドも意図する。例えば、本発明の抗体アンタゴニストを作出する上で有用なポリペプチドを作出するためには、抗原ペプチド１と２を組み合わせればよい。
好ましい実施形態では、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、例えばＺｃｙｔｏＲ２１及びＩＬ-１７Ｃとのリガンド-受容体結合に重要である、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、２１、２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、又は１１９のいずれかの残基を含む。最も好ましくは、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、配列番号１１５、１１７、又は１１９のいずれかの残基を含む。
抗原エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書で開示されるアミノ酸配列の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１５個のアミノ酸、又は約１５〜約３０個のアミノ酸を含み得る。このようなエピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの断片化によって、又は化学的ペプチド合成によって作出することができる。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレーによって選択することができる(例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993)、及びCorteseら, Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)参照)。エピトープを同定し、エピトープを含む小ペプチドから抗体を作製するための標準法は、例えば、Mole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (編), pages 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992)、Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,”in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (編), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)、及びColiganら (編), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1 - 9.3.5及びpages 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)により記載されている。
変異体及び融合タンパク質を含むＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドに関して、当業者ならば、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする完全縮重ポリヌクレオチド配列を容易に作出することができる。さらに、当業者ならば、標準的なソフトを用いて、本明細書に記載のヌクレオチド配列とアミノ酸配列に基づき、ＺｃｙｔｏＲ２１変異体を考案することができる。
Ｅ)ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの産生
全長ポリペプチド；可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体；全長受容体；受容体フラグメント(例えば、リガンド-結合フラグメント及び抗原エピトープ)、機能的フラグメント、及び融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、慣用方法に従って組換え宿主細胞で産生させることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子を発現させるためには、そのポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおける転写発現を制御する調節配列と作用可能なように連結させ、次に、宿主細胞へ導入しなければならない。プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列の他、発現ベクターは翻訳調節配列及び発現ベクターを有する細胞の選択に好適なマーカー遺伝子を含むことができる。
真核細胞における外来タンパク質の産生に好適な発現ベクターは一般に、(１)細菌宿主における増殖及び発現ベクターの発現をもたらすための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物ＤＮＡエレメント；(２)プロモーターなど、転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡエレメント；及び(３)転写終結／ポリアデニル化配列など、転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメントを含む。上述のように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせる分泌配列をコードするヌクレオチド配列も含み得る。例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１発現ベクターは、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子と、いずれかの分泌遺伝子に由来する分泌配列とを含んでなってよい。
本発明のＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質は、哺乳類細胞で発現させることができる。好適な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞(Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７)、ヒト胚腎細胞(２９３-ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３)、ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ-２１、ＢＨＫ-５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０３１４)、イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ-Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１；ＣＨＯ ＤＧ４４(Chasinら, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986))、ラット下垂体細胞(ＧＨ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２)、ＨｅＬａ Ｓ３細胞(ＡＴＣＣ ＣＣＬ２.２)、ラット肝細胞腫細胞(Ｈ-４-ＩＩ-Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８)ＳＶ４０形質転換腎細胞(ＣＯＳ-１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０)及びマウス胚細胞(ＮＩＨ-３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８)が挙げられる。
哺乳類宿主では、転写及び翻訳調節シグナルは哺乳類のウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなどに由来するものであってよく、ここでは、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と会合している。好適な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシン、及びメタロチオネイン遺伝子から得ることもできる。
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好適な真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター(Hamerら, J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982))、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター(McKnight, Cell 31:355 (1982))、ＳＶ４０初期プロモーター(Benoistら, Nature 290:304 (1981))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gormanら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6111 (1982))、サイトメガロウイルスプロモーター(Foeckingら, Gene 45:101 (1980))、及びマウス哺乳類腫瘍ウイルスプロモーター(一般に、Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Clelandら (編), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) 参照)が挙げられる。
あるいは、バクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの原核生物プロモーターを、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターにより調節される場合(Zhouら, Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)、及びKaufmanら, Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991))、哺乳類細胞においてＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子発現を制御するために使用することもできる。
ある特定の実施形態では、ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体ポリペプチド、又はＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドのフラグメントをコードするＤＮＡ配列は、一般に、発現ベクター内で、転写プロモーター及びターミネーターをはじめとする、発現に必要な他の遺伝子エレメントと作用可能なように連結されている。ベクターはまた１以上の選択マーカー及び１以上の複製起点を含む場合が多いが、当業者ならば、特定の系において、選択マーカーは別のベクター上に提供されてもよく、また、外因性ＤＮＡの複製を宿主細胞ゲノムへの組み込みにより提供されてもよいことが分かるであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他のエレメントの選択は、当業者の水準の範囲内の通常の設計事項である。このようなエレメントの多くは文献に記載されており、商業供給者から入手可能である。可溶性受容体複合体の複数の成分は個々の発現ベクターに同時トランスフェクトすることもできるし、あるいは単一の発現ベクターに含めることもできる。タンパク質複合体の複数の成分を発現させるこのような技術は当業者で周知である。
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロプロジェクティル媒介送達、エレクトロポレーションなどをはじめとする様々な標準的技術を用いて宿主細胞に導入することができる。これらのトランスフェクションされた細胞を選択及び増殖させ、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供することができる。ベクターを真核細胞に導入する技術及びこのような安定な形質転換体を優性選択マーカーを用いて選択する技術は、例えば、Ausubel (1995)及びMurray (編), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)によって記載されている。
例えば、１つの好適な選択マーカーとして、抗生物質ネオマイシンに対して耐性を与える遺伝子がある。この場合、選択は、Ｇ-４１８などのネオマイシン系薬剤の存在下で行われる。また、選択系を用いて、目的遺伝子の発現レベルを増大することもでき、当該プロセスは「増幅」と呼ばれる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下で形質転換体を培養した後、導入遺伝子の高レベルの産物を産生する細胞を選択するために選択剤の量を増やすことにより行う。好適な増幅選択マーカーとしては、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)がある。他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)も使用することができる。あるいは、緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質(ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ ＭＨＣ、胎盤アルカリ性ホスファターゼなど)などの表現型の変化を導入するマーカーを用い、ＦＡＣＳソーティング又は磁性ビーズ分離技術などの手段により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別することもできる。
ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドはまた、ウイルス送達系を用い、培養哺乳類細胞によって産生させることもできる。この目的のウイルスの例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)が挙げられる。アデノウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスは、現在のところ最もよく研究されている、異種核酸送達用の遺伝子導入ベクターである(総説としては、Beckerら, Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)、及びDouglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)参照)。このアデノウイルス系の利点としては、比較的大きなＤＮＡインサート収容力、高力価までの増殖能、広範な哺乳類細胞種への感染能、及び種々のプロモーターを含む多数の利用可能なベクターと併用可能である柔軟性が挙げられる。
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、異種ＤＮＡの大きなインサート(最大７ｋｂ)を収容することができる。これらのインサートは、直接連結により、又は同時トランスフェクトプラスミドとの相同組換えにより、ウイルスＤＮＡに組み込むことができる。１つの選択肢として、ウイルスベクターから必須Ｅ１遺伝子を欠失させるというものがあり、この結果、Ｅ１遺伝子が宿主細胞によって提供されない限り、複製能が生じない。例えば、アデノウイルスベクター感染ヒト２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５７３、４５５０４、４５５０５)は、かなりの量のタンパク質を得るために、接着細胞として増殖させても、あるいは比較的高細胞密度の懸濁培養物として増殖させてもよい(Garnierら, Cytotechnol. 15:145 (1994) 参照)。
ＺｃｙｔｏＲ２１はまた、鳥類、真菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞などの他の高等真核細胞で発現させることもできる。バキュロウイルス系は、クローニングされたＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子を昆虫細胞に導入するために効率的な手段となる。好適な発現ベクターとしては、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)に基づくものがあり、ショウジョウバエ(Drosophila)熱ショックタンパク質(ｈｓｐ)７０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス前初期遺伝子プロモーター(ｉｅ-１)及び遅延型初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、及びショウジョウバエ・メタロチオネインプロモーターなどの周知のプロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第二の方法では、Luckow (Luckowら, J. Virol. 67:4566 (1993))が記載しているトランスポゾンに基づく系を用いる。導入ベクターを用いるこの系は、ＢＡＣ-ｔｏ-ＢＡＣキット(Life Technologies, Rockville, MD)として販売されている。この系は、「バクミド」と呼ばれる大きなプラスミドとして大腸菌内で維持されているバキュロウイルスゲノム中に、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動させるためのＴｎ７トランスポゾンを含む導入ベクターＰＦＡＳＴＢＡＣ(Life Technologies)を用いる。Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:911 (1990)、Bonningら, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、及びChazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)参照のこと。さらに、導入ベクターは、発現されるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドのＣ末端又はＮ末端においてエピトープタグ、例えば、Ｇｌｕ-Ｇｌｕエピトープタグ(Grussenmeyerら, Proc. Nat'l Acad. Sci 82:7952 (1985))をコードするＤＮＡとのインフレーム融合を含み得る。当技術分野で公知の技術を用い、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子を含む導入ベクターを大腸菌へ形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる分断ｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドをスクリーニングする。次に、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡを、常法を用いて単離する。
例としてのＰＦＡＳＴＢＡＣベクターは、相当な程度、改変することができる。例えば、多核体プロモーターを除去し、バキュロウイルス感染初期に発現され、分泌タンパク質の発現に有利であることが示されているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Ｐｃｏｒ、ｐ６.９又はＭＰプロモーターとしても知られる)で置換することができる(例えば、Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonningら, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、及びChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)参照のこと。このような導入ベクター構築物においては、短型又は長型の塩基性タンパク質プロモーターが使用可能である。さらに、導入ベクターは、天然型のＺｃｙｔｏＲ２１分泌シグナル配列を昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列に置換して構築することもできる。天然型ＺｃｙｔｏＲ２１分泌シグナル配列の置換のための構築物では、例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(ＥＧＴ)、ミツバチのメリチン(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA)、又はバキュロウイルスｇｐ６７(PharMingen: San Diego, CA)に由来する分泌シグナル配列を使用することができる。
この組換えウイルス又はバクミドは宿主細胞をトランスフェクトするために用いられる。好適な昆虫宿主細胞としては、Ｓｆ９(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)、Ｓｆ２１ＡＥ、及びＳｆ２１(Invitrogen Corporation; San Diego, CA)などのヨトウガ(Spodoptera frugiperda)のさなぎ卵巣細胞系統ＩＰＬＢ-Ｓｆ-２１由来の細胞系統、並びにDrosophila Schneider-２細胞、及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来のＨＩＧＨ ＦＩＶＥＯ細胞系統(Invitrogen)が挙げられる(米国特許第５,３００,４３５号)。これらの細胞を増殖及び維持するためには市販の血清フリー培地を用いることができる。好適な培地としては、Ｓｆ９細胞用としてはＳｆ９００ＩＩ(商標)(Life Technologies)又はＥＳＦ ９２１(商標)(Expression System)、また、T. ni細胞用としてはＥｘ-ＣｅｌｌＯ４０５(商標)(JRH Biosciences, Lenexa, KS)又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯ(商標)(Life Technologies)がある。組換えウイルスを用いる場合には、細胞は一般に、およそ２〜５×１０5細胞から１〜２×１０6細胞の接種密度まで増殖させ、この時に、多重感染度(ＭＯＩ)０.１〜１０、より一般には３付近で組換えウイルス原液を加える。
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を生産するための確立された技術は、Baileyら, “Manipulation of Baculovirus Vectors,”in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (編), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991)により、Patelら, “The baculovirus expression system,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら (編), pages 205-244 (Oxford University Press 1995)により、Ausubel (1995) pages 16-37と16-57により、Richardson (編), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)、及びLucknow, “Insect Cell Expression Technology,” in Protein Engineering: Principles and practice, Clelandら (編), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)により示されている。
酵母細胞を含む真菌細胞も、本明細書に記載の遺伝子を発現させるために使用することができる。これに関して特に注目される酵母種としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、及びピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)が挙げられる。酵母で発現させるのに好適なプロモーターとしては、ＧＡＬ１(ガラクトース)、ＰＧＫ(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、ＡＤＨ(アルコールデヒドロゲナーゼ)、ＡＯＸ１(アルコールオキシダーゼ)、ＨＩＳ４(ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ)由来のプロモーターなどが挙げられる。多くの酵母クローニングベクターが設計され、容易に入手可能である。これらのベクターとして、ＹＩｐに基づくベクター(ＹＩｐ５など)、ＹＲｐベクター(ＹＲｐ１７など)、ＹＥｐベクター(ＹＥｐ１３など)及びＹＣｐベクター(ＹＣｐ１９など)がある。Ｓ.セレビシエ細胞を外因性ＤＮＡで形質転換し、それらから組換えポリペプチドを生産するための方法は、例えば、Kawasaki, 米国特許第４,５９９,３１１号、Kawasakiら, 米国特許第 ４,９３１,３７３号、Brake, 米国特許第４,８７０,００８号、Welchら, 米国特許第５,０３７,７４３号、及びMurrayら, 米国特許第４,８４５,０７５号に記載される。形質転換細胞は、選択マーカー、一般には、薬剤耐性又は特定の栄養素(例えば、ロイシン)の不在下での増殖能により判定される表現型によって選択される。サッカロミセス・セレビシエで用いるのに好適なベクター系としては、Kawasakiら(米国特許第４,９３１,３７３号)により開示されているＰＯＴ１ベクター系があり、このベクターにより、グルコース含有培地で増殖させることで形質転換細胞の選択が可能となる。酵母で用いるためのさらなる好適なプロモーター及びターミネーターとしては、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasaki, 米国特許第４,５９９,３１１号、Kingsmanら, 米国特許第４,６１５,９７４号、及びBitter, 米国特許第４,９７７,０９２号参照)及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するものがある。米国特許第４,９９０,４４６号、同第５,０６３,１５４号、同第５,１３９,９３６号、及び同第４,６６１,４５４号も参照のこと。
ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula Polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギレルモンジー(Pichia guillermondii)及びカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)をはじめとする他の酵母のための形質転換系も当技術分野で公知である。例えば、Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986)、及びCregg, 米国特許第４,８８２,２７９号参照のこと。アスペルギルス細胞も、McKnightら.米国特許第４,９３５,３４９号に方法に従って用いることができる。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Suminoら, 米国特許第５,１６２,２２８号により開示されている。アカパンカビ属(Neurospora)を形質転換する方法は、Lambowitz, 米国特許第４,４８６,５３３号により開示されている。
例えば、組換えタンパク質生産用の宿主としてピキア・メタノリカの使用は、Raymond,米国特許第５,７１６,８０８号、Raymond, 米国特許第５,７３６,３８３号、Raymondら, Yeast 14:11-23 (1998)、及び国際公開公報第ＷＯ９７／１７４５０号、同第ＷＯ９７／１７４５１号、同第ＷＯ９８／０２５３６号、及び同第ＷＯ９８／０２５６５号に開示されている。Ｐ.メタノリカの形質転換に用いるＤＮＡ分子は、一般に、二本鎖の環状プラスミドとして調製され、好ましくは、形質転換前に線状化される。Ｐ.メタノリカにおけるポリペプチド生産では、プラスミドのプロモーター及びターミネーターは、Ｐ.メタノリカ・アルコール利用遺伝子(ＡＵＧ１又はＡＵＧ２)などのＰ.メタノリカ遺伝子のものであってよい。他の有用なプロモーターとしては、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(ＤＨＡＳ)、ギ酸デヒドロゲナーゼ(ＦＭＤ)、及びカタラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子が挙げられる。このＤＮＡの宿主染色体への組み込みを助けるためには、両末端で宿主ＤＮＡ配列によりフランキングされたプラスミドの全発現セグメントを有していることが好ましい。ピキア・メタノリカで用いるのに好適な選択マーカーは、ホスホリボシル-５-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(ＡＩＲＣ；ＥＣ４.１.１.２１)をコードし、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能とするＰ.メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最小限にすることが望ましい大規模工業法では、両メタノール利用遺伝子(ＡＵＧ１及びＡＵＧ２)を欠失させた宿主細胞を使用することができる。分泌タンパク質の生産に関しては、宿主細胞は液胞プロテアーゼ遺伝子(ＰＥＰ４及びＰＲＢ１)に欠陥があってもよい。Ｐ.メタノリカ細胞への、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を助けるために、エレクトロポレーションを用いる。Ｐ.メタノリカ細胞は、電界強度が２.５〜４.５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは、約３.７５ｋＶ／ｃｍであって、時定数(ｔ)が１〜４０ミリ秒、最も好ましくは、約２０ミリ秒である、指数関数的に減衰するパルス電場を用いたエレクトロポレーションにより形質転換することができる。
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、無傷な植物組織、又は単離された植物細胞にも導入することができる。発現ベクターを植物組織に導入する方法としては、直接的感染、又は植物組織とアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)との同時培養、マイクロプロジェクティル媒介送達、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーションなどが挙げられる。例えば、Horschら, Science 227:1229 (1985)、Kleinら, Biotechnology 10:268 (1992)、及びMikiら, “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,” in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glickら (編), pages 67-88 (CRC Press, 1993)参照のこと。
あるいは、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子は、原核生物宿主細胞でも発現させることができる。原核生物宿主でＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを発現させるために使用することができる好適なプロモーターは当業者に周知であり、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのＰR及びＰLプロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ-ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡ、及びｌａｃＺプロモーター、枯草菌(B. subtilis)のプロモーター、バクテリオファージのプロモーター、桿菌(Bacillus)、放線菌(streptomyces)のプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol 1:277 (1987)、Watsonら, Molecular Biology of the Gene, 第4版 (Benjamin Cummins 1987)、及びAusubelら (1995)によって概説されている。
好適な原核生物宿主としては、大腸菌及び枯草菌(Bacillus subtilus)が挙げられる。好適な大腸菌株としては、ＢＬ２１(ＤＥ３)、ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ２１５１、及びＥＲ１６４７が挙げられる(例えば、Brown (編), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)参照)。好適な枯草菌株としては、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０、及びＢ１７０が挙げられる(例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods,” in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (編) (IRL Press 1985) 参照)。
大腸菌などの細菌でＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを発現させる場合、このポリペプチドは細胞質に、一般には可溶性顆粒として保持させることもできるし、あるいは細菌分泌配列によって原形質周辺の空間に向けることもできる。前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えば、グアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性させる。次に、変性されたポリペプチドを、尿素溶液及び還元・酸化グルタチオンの組合せに対して透析した後に、緩衝生理食塩水溶液に対して透析するなど、変性剤を希釈することにより再折りたたみ及び二量体化することができる。後者の場合、ポリペプチドは、細胞を破壊して(例えば、音波処理又は浸透圧ショックによる)、原形質周辺空間の内容物を放出させ、タンパク質を回収することにより、原形質周辺空間から可溶かつ機能的形態で回収することができ、これにより、変性及び再折りたたみの必要がなくなる。
原核生物宿主においてタンパク質を発現させる方法は当業者に周知である(例えば、Williamsら, “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら (編), page 15 (Oxford University Press 1995), Wardら, “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、及びGeorgiou, “Expression of Proteins in Bacteria,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Clelandら (編), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)参照)。
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫、及び植物細胞に導入する標準法は、例えば、Ausubel (1995)によって示されている。
哺乳類細胞系により産生される外来タンパク質を発現及び回収する一般法は、例えば、Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Clelandら (編), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)によって示されている。細菌系により産生されるタンパク質を回収する標準技術は、例えば、Grisshammerら, “Perification of over-produced proteins from E. coli cells,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら (編), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)によって示されている。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson (編), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)によって示されている。
別法として、本発明のポリペプチドは、全面的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合又は従来の液相合成によって合成することもできる。これらの合成方法は当業者に周知である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)、Stewartら, “Solid Phase Peptide Synthesis” (第2版), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)、Athertonら, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields and Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis,” Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)、及びLloyd-Williamsら, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997) 参照)。「天然化学ライゲーション」及び「発現タンパク質ライゲーション」などの全面的化学合成戦略の変形も標準的である(例えば、Dawsonら, Science 266:776 (1994)、Hackengら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997)、Muirら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998)、及びSeverinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998) 参照)。
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、又は１１９のいずれかの少なくとも６、少なくとも９、又は少なくとも１５の隣接するアミノ酸残基を含む。一例としては、ポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、又は１１９のいずれかの少なくとも６、少なくとも９、又は少なくとも１５の隣接するアミノ酸残基を含み得る。本発明のある特定の実施形態では、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の２０、３０、４０、５０、１００、又はそれを超える隣接する残基を含む。このようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー及びプローブとして有用である。
さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド及びそのフラグメントは、より高等な真核細胞では、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は多量体として発現し得る。このような細胞を用い、少なくとも１つのＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド(「ＺｃｙｔｏＲ２１を含む受容体」又は「ＺｃｙｔｏＲ２１を含む受容体ポリペプチド」)を含むＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体ポリペプチドを産生することができるか、又はスクリーニング系においてアッセイ細胞として用いることができる。本発明の一態様では、ＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメインを含む本発明のポリペプチドは培養細胞によって産生され、この細胞を用いて、天然リガンドであるＩＬ-１７Ｃ、又はさらに天然リガンドのアゴニスト及びアンタゴニストを含む受容体のリガンドをスクリーニングする。このアプローチを要約すると、受容体をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝エレメント(例えば、転写プロモーター)と組み合わせ、得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。そのＤＮＡを発現し、機能的受容体を産生する細胞を選択し、様々なスクリーニング系で用いる。単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体複合体の各成分は、同じ細胞で発現させることができる。さらにまた、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体受容体複合体の各成分は、上記のような複合体の構築及び形質転換体のスクリーニングを可能とするため、膜貫通ドメイン又は他の膜融合部分と融合させることもできる。
本発明のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストポリペプチド(polyepeptides)及び抗体をアッセイするために、ＺｃｙｔｏＲ２１を含む受容体又はＩＬ-１７Ｃと結合することが分かっている他の受容体を発現させ、受容体介在シグナルを伝達する際に用いるのに好適な哺乳類細胞としては、ＺｃｙｔｏＲ２１と機能的複合体を形成し得る他の受容体サブユニットを発現する細胞が挙げられる。また、発現させる受容体と同じ種に由来する細胞を用いることも好ましい。好ましい実施形態では、その細胞は、増殖のために外から供給した造血系増殖因子に依存する。この種の好ましい細胞系統としては、ＧＭ-ＣＳＦ依存性ヒト白血病細胞系統であるヒトＴＦ-Ｉ細胞系統(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-２００３)とＡＭＬ-１９３細胞系統(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９５８９)、及びＩＬ-３依存性マウスＢ細胞前駆体系統であるＢａＦ３(Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, (1985))が挙げられる。他の細胞系統としては、ＢＨＫ、ＣＯＳ-１及びＣＨＯ細胞がある。好適な宿主細胞は、必要な受容体サブユニット、又は所望の細胞応答に必要な他の細胞成分を産生するように遺伝子操作することができる。このアプローチは、いずれの種に由来する受容体サブユニットでも発現するように細胞系統を遺伝子操作することができ、それにより、種の特性に起因する潜在的な限界を克服することができるので有利である。ヒト受容体ｃＤＮＡの種オーソログ(species ortholog)をクローニングし、そして同種由来の細胞系列に使用することができる。例えば、マウスｃＤＮＡをＢａＦ３細胞系列に使用することができる。従って、ＧＭ-ＣＳＦ又はＩＬ-３などの１つの造血系増殖因子に依存する細胞系統は、ＩＬ-１７ＣなどのＺｃｙｔｏＲ２１受容体を介して作用する別のサイトカインに依存するように遺伝子操作することができる。
機能的受容体を発現する細胞はスクリーニングアッセイで用いられる。当技術分野では、様々な好適なアッセイが公知である。これらのアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づくものである。このようなアッセイの１つとして、細胞増殖アッセイがある。細胞を試験化合物の存在下又は不在下で培養し、例えば、トリチウム化チミジンの組み込みを測定するか、又は３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)の代謝分解に基づく比色定量アッセイにより細胞増殖を検出する(Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, (1983))。別のアッセイ形式では、レポーター遺伝子を発現させるようにさらに操作した細胞を用いる。このレポーター遺伝子は、受容体関連経路に応答するプロモーターエレメントと連結され、このアッセイでは、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関して好ましいプロモーターエレメントは、ＮｆＫＢ応答性プロモーターである。さらに、血清応答エレメント、すなわちＳＲＥも使用可能であろう。例えば、Shawら, Cell 56:563-572, (1989)参照のこと。好ましいこのようなレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子がある(de Wetら, .Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987))。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法を用い、発光により検出される(例えば、Baumgartnerら, J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994); Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993)。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Promega Corp., Madison, WIから市販されている。この種の標的細胞系統は、化学物質ライブラリー、細胞馴化培地、真菌培養液、土壌サンプル及び水サンプルなどをスクリーニングするために使用することができる。もう１つのアッセイでは、リガンドの結合及び受容体の活性化に応答した細胞シグナル伝達経路(転写因子、キナーゼなど)のリン酸化を検出する。例えば、リガンドを産生する細胞を同定するために、標的細胞について、細胞馴化培地サンプルのバンクをアッセイすることができる。次に、陽性細胞を用い、哺乳類発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをプールに分け、宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。その後、トランスフェクト細胞から得られた培地サンプルをアッセイした後、プールに分け、再びトランスフェクトし、継代培養を行い、陽性細胞を再アッセイし、そのリガンドをコードするクローニングｃＤＮＡを単離する。
本発明により提供されるさらなるスクリーニングアプローチとしては、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を含む。これらのハイブリッドポリペプチドは、２つの一般種に属す。第一種では、ＺｃｙｔｏＲ２１の細胞内ドメインは、第二の受容体のリガンド結合ドメインと連結されている。第二種のハイブリッド受容体ポリペプチドは、ＺｃｙｔｏＲ２１の細胞外(リガンド結合)ドメイン(例えば、配列番号３、配列番号５のアミノ酸残基２４〜３７６、配列番号８のアミノ酸残基２４〜３９６、配列番号１２、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号２２、配列番号１２２、配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、又は配列番号１１９)を、第二の受容体、好ましくは、造血系サイトカイン受容体の細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインとともに含む。本発明のこの第二種の受容体のハイブリッドＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体は、この第二の受容体によって伝達されるシグナルに応答し得ることが知られている細胞で発現される。それとともに、これら２種のハイブリッド受容体により、ＩＬ-１７Ｃを検出するアッセイの開発のために応答性のある細胞種が同定可能となる。さらに、このような細胞をＩＬ-１７Ｃの存在下で用いれば、競合型アッセイで本発明の可溶性受容体アンタゴニストをアッセイすることができる。このようなアッセイでは、本発明の可溶性受容体の存在下でＩＬ-１７Ｃの増殖又はシグナル伝達活性が低下すれば、アンタゴニスト活性が実証される。さらにまた、ＺｃｙｔｏＲ２１-可溶性受容体結合アッセイ、及び細胞に基づくアッセイを用いて、可溶性受容体がＩＬ-１７Ｃと結合する、ＩＬ-１７Ｃ活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、又は活性を中和するかどうかを評価することができる。
Ｆ)ＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質及びコンジュゲートの作出
ＺｃｙｔｏＲ２１類似体の１つの一般種は、本明細書で開示されるアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。ＺｃｙｔｏＲ２１類似体のもう１つの一般種は、以下に記載するような、抗イディオタイプ抗体及びそのフラグメントにより提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体も類似体として使用可能である(例えば、Monfardiniら, Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)参照)。抗イディオタイプＺｃｙｔｏＲ２１抗体の可変ドメインはＺｃｙｔｏＲ２１を模倣しているので、これらのドメインはＺｃｙｔｏＲ２１結合活性を提供することができる。抗イディオタイプ触媒抗体を作出する方法は当業者に公知である(例えば、Joronら, Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992)、Fribouletら, Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994)、及びAvalleら, Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)参照)。
ＺｃｙｔｏＲ２１類似体を同定するもう１つのアプローチは、コンビナトリアルライブラリーの使用により提供される。ファージディスプレー及び他のコンビナトリアルライブラリーを構築及びスクリーニングする方法は、例えば、Kayら, Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)、Verdine, 米国特許第５,７８３,３８４号、Kayら, 米国特許第５,７４７,３３４号、及びKauffmanら, 米国特許第５,７２３,３２３号によって示されている。
ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドはin vivo及びin vitro双方の使用を含む。一例として、可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ２１を細胞培養培地に加えると、培養細胞によって産生されるＺｃｙｔｏＲ２１リガンド(すなわち、ＩＬ-１７Ｃ)の作用を阻害することができる。
ＺｃｙｔｏＲ２１の融合タンパク質を用いれば、組換え宿主内でＺｃｙｔｏＲ２１を発現させ、産生されたＺｃｙｔｏＲ２１を単離することができる。以下に記載するように、特定のＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質は、診断及び治療における使用も含む。融合タンパク質の一種は、組換え宿主細胞からＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを導くペプチドを含む。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを真核生物宿主細胞の分泌経路に向けるため、ＺｃｙｔｏＲ２１発現ベクターに、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる)が提供される。分泌シグナル配列はＺｃｙｔｏＲ２１に由来するものであってもよいが、好適なシグナル配列は別の分泌タンパク質に由来してもよいし、又はde novo合成されてもよい。この分泌シグナル配列は、２つの配列が適切なリーディングフレーム内で連結されるようにＺｃｙｔｏＲ２１コード配列と作用可能なように連結され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に向けられるように配置される。分泌シグナル配列は一般に、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５'側に置かれるが、ある特定の分泌シグナル配列は目的のヌクレオチド配列のどこに配置してもよい(例えば、Welchら, 米国特許第５,０３７,７４３号； Hollandら, 米国特許第５,１４３,８３０号参照)。
ＺｃｙｔｏＲ２１又は哺乳類細胞によって産生される別のタンパク質(例えば、米国特許第５,６４１,６５５号に記載されているような組織型プラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列)の分泌シグナル配列は、組換え哺乳類宿主におけるＺｃｙｔｏＲ２１の発現に有用であるが、酵母細胞での発現には、酵母シグナル配列が好ましい。好適な酵母シグナル配列の例としては、酵母接合フェロモンα因子(ＭＦαＩ遺伝子によりコード)、インベルターゼ(ＳＵＣ２遺伝子によりコード)、又は酸性ホスファターゼ(ＰＨＯ５遺伝子によりコード)に由来するものがある。例えば、Romanosら, “Expression of Cloned Genes in Yeast,” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 第2版, Glover and Hames (編), pages 123-167 (Oxford University Press 1995)参照のこと。
ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、配列番号６を含むポリペプチド、又は非ヒト受容体の対応領域をコードする末端切断型ＤＮＡを発現させることにより作製することができる。これらの細胞外ドメインポリペプチドは膜貫通ポリペプチドセグメントと細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態で作製されるのが好ましい。宿主細胞からのこの受容体ドメインの輸送を仕向けるため、この受容体ＤＮＡを、ｔ-ＰＡ分泌ペプチドなどの分泌ペプチドをコードする第二のＤＮＡセグメントと連結する。分泌された受容体ドメインの精製を容易にするため、ポリ-ヒスチジンタグ、Ｐ物質、Ｆｌａｇ(商標)ペプチド(Hoppら, Biotechnology 6: 1204-1210, (1988); Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手可能)、又はそれに対する抗体若しくは他の特異的結合剤が利用可能な別のポリペプチド若しくはタンパク質などのＣ末端延長部を受容体ポリペプチドに融合させることができる。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメイン由来のＺｃｙｔｏＲ２１抗原エピトープも、上記のように作製することができる。
別のアプローチでは、ＺｃｙｔｏＲ２１の受容体細胞外ドメイン又は他のサイトカイン受容体成分を、免疫グロブリン重鎖定常領域、一般には、２つの定常領域ドメインとヒンジ領域を含むが可変領域を欠くＦcフラグメントとの融合物として発現させることができる(Sledziewski, AZら, 米国特許第６,０１８,０２６号及び同第５,７５０,３７５号参照)。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは、このような融合物を含む。このような融合物の１つが配列番号１００と１０２、及び１２３と１２４で示されている。このような融合物は一般に、Ｆｃ部分が互いにジスルフィド結合され、２つの受容体ポリペプチドが互いに近接して並んでいる多量体分子として分泌する。
この種の融合物は、in vitroアッセイツールとして同族リガンドを溶液からアフィニティ-精製するために使用することができ、リガンドのタイターを特異的に決定することによりin vitroでシグナルを妨害、阻害、又は低減するために使用でき、そして、非経口的に投与して循環しているリガンドを結合し、そして循環系から当該リガンドを排除することにより、in vivoにいおいてアンタゴニストとして使用することができる。リガンドを精製するためには、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｉｇキメラを、受容体-リガンド結合を促進する条件(一般に、生理状態付近の温度、ｐＨ、及びイオン強度)のもとで、リガンドを含有するサンプル(例えば、細胞馴化培養培地又は組織抽出液)に加える。このキメラ-リガンド複合体を、次に、固相支持体(例えば、不溶性樹脂ビーズ)に固定化したＡタンパク質を用いた混合物により分離する。次に、このリガンドを、塩又はｐＨ勾配などの従来の化学技術を用いて溶出させる。別法として、キメラ自体を固相支持体と結合させ、上記のように結合及び溶出を行ってもよい。これらのキメラは、血清アミロイドＡ(ＳＡＡ)、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)などの急性期応答をはじめとする炎症性応答を調節するためにin vivoに用いてもよい。高い結合親和性を有するキメラを非経口投与する(例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注射による)。循環中の分子がリガンドと結合し、通常の生理学的プロセスにより循環から排除される。アッセイで用いるためには、これらのキメラをＦｃ領域を介して支持体と結合させ、ＥＬＩＳＡ形式で用いる。
本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１と結合パートナーの単離を助けるためには、リガンド結合受容体(又は抗体、相補体／抗相補体対の一方のメンバー)又はその結合フラグメントと、市販のバイオセンサー装置(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を用いるアッセイ系が有利に使用できる。このような受容体、抗体、相補体／抗相補体対の一方のメンバー又はフラグメントは、受容体チップの表面に固定化されている。この装置の使用については、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991及びCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993に開示されている。受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用い、フローセル内の金フィルムに付着しているデキストラン繊維と共有結合されている。試験サンプルをこのセルに通す。リガンド、エピトープ、又は相補体／抗相補体対の対応メンバーがサンプル中に存在する場合、それはそれぞれ固定化された受容体、抗体又はメンバーと結合し、媒体の屈折率に変化を生じ、これが金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系により、オン速度及びオフ速度の決定が可能となり、それから結合親和性が計算でき、結合の化学量の評価が可能となる。あるいは、リガンド／受容体結合は、ＳＥＬＤＩ(商標)技術(Ciphergen, Inc. Palo Alto, CA)を使用して解析することができる。さらに、上記のＢＩＡＣｏｒＥ技術は、異なるモノクローナル抗体がＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド上の同じ又は異なるエピトープに結合するかどうかを決定する競合実験に使用することができ、それ自体、ＩＬ-１７Ｃと結合し、ＩＬ-１７Ｃを遮断し、阻害し、低下させ、ＩＬ-１７Ｃと拮抗し、又はＩＬ-１７Ｃを中和する本発明の中和抗体のエピトープマッピングを助けるために使用さできる。
また、リガンド結合受容体ポリペプチドは、当技術分野において公知の他のアッセイ系で使用することができる。このような系は、結合親和性の決定のためのスキャッチャード分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949参照)及び熱量測定アッセイ(Cunninghamら, Science 253:545-48, 1991; Cunninghamら, Science 245:821-25, 1991)を含む。
本発明はさらに、１以上のポリペプチド融合物を含む様々な他のポリペプチド融合物及び関連の多量体タンパク質も提供する。例えば、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体は、米国特許第５,１５５,０２７号及び同第５,５６７,５８４号に開示されているように二量体形成タンパク質との融合物として作製することができる。これに関して好ましい二量体形成タンパク質としては、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、ＩｇＧγ１、及びヒトκ軽鎖が挙げられる。免疫グロブリン可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１融合物は、様々な多量体ＺｃｙｔｏＲ２１受容体類似体を産生するように遺伝子操作された細胞で発現させることができる。特定の細胞、組織、又は高分子(例えば、コラーゲン、又はＺｃｙｔｏＲ２１リガンド、ＩＬ-１７Ｃを発現する細胞)をターゲッティングするために補助的ドメインを可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体と融合させることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは、 精製及びドメインのターゲッティングのためのアフィニティータグなどの２つ以上の部分と融合させることができる。ポリペプチド融合物はまた、特にドメインの間に１以上の切断部位を含むことができる。Tuanら, Connective Tissue Research 34:1-9, 1996参照のこと。
細菌細胞では、発現したタンパク質の毒性を軽減するため、また、安定性を高めるため、また回収率を向上させるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させるのが望ましい場合が多い。例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させることができる。グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ融合タンパク質は一般に可溶性であり、固定化グルタチオンカラムで大腸菌溶解液から容易に精製可能である。同様のアプローチにおいて、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質はアミロース樹脂カラムを用いて単離することができ、一方、末端切断型Ａタンパク質遺伝子のＣ末端を含む融合タンパク質はＩｇＧ-セファロースを用いて精製することができる。細菌細胞において融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するための確立された技術は、例えば、Williamsら, “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Prasmid Vectors and Perification of Specific Polyclonal Antibodies,”in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 第2版, Glover and Hames (編), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)によって記載されている。さらに、市販の発現系も利用可能である。例えば、ＰＩＮＰＯＩＮＴ Ｘａタンパク質精製系(Promega Corporation; Madison, WI)は、発現の過程でビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を、アビジンを含む樹脂を用いて単離する方法を提供する。
原核細胞又は真核細胞いずれかにより発現される異種ポリペプチドを単離するのに有用なペプチドタグとしては、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート樹脂に対して親和性を有する)、ｃ-ｍｙｃタグ、カルモジュリン結合タンパク質(カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離されたもの)、Ｐ物質、ＲＹＩＲＳタグ(抗ＲＹＩＲＳ抗体と結合する)、Ｇｌｕ-Ｇｌｕタグ、及びＦＬＡＧタグ(抗ＦＬＡＧ抗体と結合する)が挙げられる。例えば、Luoら, Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morgantiら, Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)、及びZhengら, Gene 186:55 (1997)参照のこと。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)から入手可能である。
融合タンパク質のもう１つの形態は、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと、免疫グロブリン重鎖定常領域、一般に、２つ又は３つの定常領域ドメインとヒンジ領域を含むが可変領域を欠くＦcフラグメントとを含む。一例として、Changら, 米国特許第５,７２３,１２５号では、ヒトインターフェロンとヒト免疫グロブリンＦcフラグメントとを含む融合タンパク質が記載されている。このインターフェロンのＣ末端は、ペプチドリンカー部分によりＦcフラグメントのＮ末端に連結されている。ペプチドリンカーの一例として、免疫学的に不活性なＴ細胞不活性配列を主として含むペプチドがある。ペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列：ＧＧＳＧＧ ＳＧＧＧＧ ＳＧＧＧＧ Ｓ(配列番号２５)を有する。この融合タンパク質において、Ｆｃ部分の例としては、溶液中で安定であり、かつ、成分活性化作用がほとんどないか、又は全くない、ヒトγ４鎖がある。よって、本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１部分とヒトＦcフラグメントとを含んでなり、そのＺｃｙｔｏＲ２１部分のＣ末端が、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２のアミノ酸配列を含むペプチドなどのペプチドリンカーを介してＦｃフラグメントのＮ末端と結合されている、ＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質を意図する。このＺｃｙｔｏＲ２１部分は、ＺｃｙｔｏＲ２１分子又はそのフラグメントであってよい。例えば、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)(配列番号１００)、配列番号６とＦｃフラグメント(配列番号１０２)、配列番号１２２とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)、配列番号１０９とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)、配列番号１１３とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)(配列番号１２４)、配列番号１１５とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)、配列番号１１７とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)、及び配列番号１１９とＦｃフラグメント(例えば、ヒトＦｃフラグメント)を含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１とＦｃドメインの間に含まれてよい。さらに、天然型ＺｃｙｔｏＲ２１リーダーの代わりに別の分泌リーダーを用いてもよい。
当業者ならば、本明細書で開示されるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドがいくつかの異なるＦｃドメイン(例えば、Ｆｃ４、Ｆｃ５、Ｆｃ１０又は他のいずれかのその変異体)と融合可能であることも分かるであろう。
もう１つの変形形態では、ＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質は、ＩｇＧ配列、そのＩｇＧ配列のアミノ末端に共有結合されたＺｃｙｔｏＲ２１部分、及びそのＺｃｙｔｏＲ２１部分のアミノ末端に共有結合されたシグナルペプチドを含んでなり、ここで、このＩｇＧ配列は次のような順序で次のようなエレメントからなる：ヒンジ領域、ＣＨ2ドメイン、及びＣＨ3ドメイン。よって、このＩｇＧ配列はＣＨ1ドメインを欠いている。ＺｃｙｔｏＲ２１部分は、本明細書に記載されるように、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドとの結合能などのＺｃｙｔｏＲ２１活性を示す。抗体部分と非抗体部分の双方を含む融合タンパク質を産生するためのこの一般アプローチは、LaRochelleら, ＥＰ７４２８３０(ＷＯ９５／２１２５８)によって記載されている。
ＺｃｙｔｏＲ２１部分とＦｃ部分を含む融合タンパク質は、例えば、in vitroアッセイツールとして使用することができる。例えば、生体サンプル中のＺｃｙｔｏＲ２１リガンドの存在は、ＺｃｙｔｏＲ２１部分を用いてリガンドを固相支持体に結合させ、Ａタンパク質又は抗Ｆｃ抗体などの高分子を用いて融合タンパク質を固相支持体に結合させるというように、ＺｃｙｔｏＲ２１-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出することができる。このような系を用いれば、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンド、例えばＩＬ-１７Ｃの、その受容体への結合に干渉するアゴニスト及びアンタゴニストを同定することができる。
抗体融合タンパク質の他の例としては、抗原結合ドメインと、ＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメインを含むＺｃｙｔｏＲ２１フラグメントとを含むポリペプチドが挙げられる。このような分子を用いれば、ＺｃｙｔｏＲ２１結合活性の利益として、特定の組織をターゲッティングすることができる。
本発明はさらに、様々な他のポリペプチド融合物を提供する。例えば、生物機能を付与するドメインの一部又は全体を、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１とサイトカイン受容体ファミリーの別のメンバーに由来する、機能的に同等なドメインの間で入れ替えることができる。ポリペプチド融合物を組換え宿主細胞で発現させ、様々なＺｃｙｔｏＲ２１融合物類似体を産生させることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは、精製及びターゲッティングドメインのためのアフィニティータグなど、２つ以上の部分又はドメインと融合させることができる。ポリペプチド融合物はまた、特にドメイン間に１以上の切断部位を含んでもよい。例えば、Tuanら, Connective Tissue Research 34:1 (1996)参照のこと。
融合タンパク質は、当業者に公知の方法で、融合タンパク質の各成分を調製し、それらを化学的にコンジュゲートさせることによって作製することができる。あるいは、融合タンパク質の両成分を適切なリーディングフレーム内にコードするポリヌクレオチドを公知の技術を用いて作製し、本明細書に記載の方法によって発現させることができる。融合タンパク質の酵素的切断及び化学的切断のための一般法は、例えば、Ausubel (1995) pages 16-19と16-25によって記載されている。
ＺｃｙｔｏＲ２１結合ドメインはさらに、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドアゴニストの推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識などの技術により判定される、物理的構造解析によって同定することもできる。例えば、de Vosら, Science 255:306 (1992)、Smithら, J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、及びWlodaverら, FEBS Lett. 309:59 (1992)参照のこと。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドがポリマーと結合されている、化学修飾ＺｃｙｔｏＲ２１組成物も意図する。例としてのＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２のいずれかを含むポリペプチドなど、機能的膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチドである。一般に、このポリマーは水溶性であるので、生理学的環境などの水性環境中でＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートは沈殿しない。好適なポリマーの一例としては、アシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドなど、単一の反応性基を有するように修飾されたものがある。このように、重合度は制御可能である。反応性アルデヒドの一例としては、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそのモノ-(Ｃ１-Ｃ１０)アルコキシ、若しくはアリールオキシ誘導体がある(例えば、Harrisら, 米国特許第５,２５２,７１４号参照)。ポリマーは分枝型であっても非分枝型であってもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いてＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートを作製することもできる。
治療に用いるＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートは、医薬として許容される水溶性ポリマー部分を含んでもよい。好適な水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、モノメトキシ-ＰＥＧ、モノ-(Ｃ１-Ｃ１０)アルコキシ-ＰＥＧ、アリールオキシ-ＰＥＧ、ポリ-(Ｎ-ビニルピロリドン)ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、又はその他の炭水化物系ポリマーが挙げられる。好適なＰＥＧは、約６００〜約６０,０００の分子量、例えば、５,０００、１２,０００、２０,０００及び２５,０００などを有し得る。ＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートはまた、このような水溶性ポリマーの混合物を含んでもよい。
ＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートの一例は、ＺｃｙｔｏＲ２１部分と、ＺｃｙｔｏＲ２１部分のＮ末端に結合されたポリアルキルオキシドとを含む。ＰＥＧは、１つの好適なポリアルキルオキシドである。一例として、ＺｃｙｔｏＲ２１はＰＥＧで修飾することができ、これは「ペグ化」として知られるプロセスである。ＺｃｙｔｏＲ２１のペグ化は、当技術分野で公知のペグ化反応のいずれによって行ってもよい(例えば、ＥＰ０１５４３１６、Delgadoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、及びFrancisら, Int J Hematol 68:1 (1998)参照)。例えば、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行うことができる。別のアプローチでは、ＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートは、ＰＥＧの末端ヒドロキシ基又はアミノ基が活性化リンカーに置換されている活性化ＰＥＧを縮合させることによって形成される(例えば、Karasiewiczら, 米国特許第５,３８２,６５７号参照)。
アシル化によるペグ化は一般に、ＰＥＧの活性エステル誘導体をＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと反応させることを必要とする。活性化ＰＥＧエステルの一例としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドへとエステル化されたＰＥＧがある。本明細書において、「アシル化」には、ＺｃｙｔｏＲ２１と水溶性ポリマーの間の、アミド、カルバメート、ウレタンなどの結合型が含まれる。アシル化によりペグ化ＺｃｙｔｏＲ２１を作製する方法は、一般に、(ａ)ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドとＰＥＧ(ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど)を、１以上のＰＥＧ基をＺｃｙｔｏＲ２１に結合させる条件下で反応させる工程、及び(ｂ)反応生成物を得る工程、を含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：ＺｃｙｔｏＲ２１の比率が大きくなるほど、ポリペグ化ＺｃｙｔｏＲ２１生成物の割合が大きくなる。
アシル化によるペグ化の生成物は、一般に、リシンε-アミノ基がアシル結合基を介してペグ化されているポリペグ化ＺｃｙｔｏＲ２１生成物である。接続結合の一例はアミドである。一般に、得られるＺｃｙｔｏＲ２１は、少なくとも９５％モノ、ジ、又はトリペグ化されるが、反応条件によってはより高い程度のペグ化を有する種も形成することができる。ペグ化種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの標準的精製法を用いて非コンジュゲートＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドから分離することができる。
アルキル化によるペグ化は一般に、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＺｃｙｔｏＲ２１を反応させることを含む。ＰＥＧ基は-ＣＨ2-ＮＨ基を介してポリペプチドと結合させることができる。
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントは、当技術分野における方法及び本明細書に記載の方法を用いてペグ化することができる。
モノペグ化生成物を作製するための還元的アルキル化による誘導体化では、誘導体化に利用可能な異なる種類の第一級アミノ基の反応性の違いを利用する。一般に、この反応は、リシン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα-アミノ基との間のｐＫａの違いを利用することができるｐＨで行う。このような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含む水溶性ポリマーの、タンパク質への結合が制御される。ポリマーとのコンジュゲーションは、リシン側鎖アミノ基などの他の反応性基を大きく修飾せずに、タンパク質のＮ末端で優先的に起こる。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１モノポリマーコンジュゲートの実質的に均質な調製を提供する。
モノポリマーＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲート分子の実質的に均質な集団を作製するための還元的アルキル化は、(ａ)ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと反応性ＰＥＧを、ＺｃｙｔｏＲ２１のアミノ末端においてα-アミノ基の選択的修飾を可能とするのに好適なｐＨの還元的アルキル化条件下で反応させる工程、及び(ｂ)反応生成物を得る工程、を含み得る。還元的アルキル化に用いる還元剤は、水溶液中で安定であり、かつ、還元的アルキル化の初期段階で生じたシッフ塩基のみを還元できなければならない。還元剤の例としては、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、及びピリジンボランが挙げられる。
モノポリマーＺｃｙｔｏＲ２１コンジュゲートの実質的に均質な集団に関して、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分の、ＺｃｙｔｏＲ２１のＮ末端への選択的結合を可能とするものである。このような反応条件は、一般に、リシンアミノ基とＮ末端のα-アミノ基の間にｐＫａの違いをもたらす。このｐＨはまた、使用するタンパク質に対するポリマーの比にも影響を及ぼす。一般に、ｐＨが低ければ、タンパク質に対してより大過剰のポリマーが望ましいが、これはＮ末端のα-基の反応性が小さいほど、最適条件に達するのにより多くのポリマーが必要とされるからである。ｐＨが高ければ、より多くの反応性基が利用できるので、ポリマー：ＺｃｙｔｏＲ２１は大きくする必要はない。一般に、このｐＨは３〜９、又は３〜６の範囲にある。この方法は、ＺｃｙｔｏＲ２１含有ホモ二量体、ヘテロ二量体又は多量体可溶性受容体コンジュゲートを作製するために使用可能である。
考慮すべきもう１つの要因として、水溶性ポリマーの分子量がある。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合し得るポリマー分子の数は少なくなる。ペグ化反応の場合、典型的な分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、又は約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマー対ＺｃｙｔｏＲ２１のモル比は、一般に、１：１〜１００：１の範囲である。一般に、水溶性ポリマー対ＺｃｙｔｏＲ２１のモル比は、ポリペグ化については１：１〜２０：１であり、モノペグ化については１：１〜５：１である。
ポリペプチドと水溶性ポリマー部分とを含むコンジュゲートを作製する一般法は当技術分野で公知である。例えば、Karasiewiczら, 米国特許第５,３８２,６５７号、Greenwaldら, 米国特許第５,７３８、８４６号、Nieforthら, Clin. Pharmacol Ther. 59:636 (1996)、Monkarshら, Anal. Biochem. 247:434 (1997)参照のこと。この方法を、ＺｃｙｔｏＲ２１含有ホモ二量体、ヘテロ二量体又は多量体可溶性受容体コンジュゲートを作製するために使用することができる。
本発明は、本明細書に記載の可溶性受容体又は抗体などのペプチド又はポリペプチドを含む組成物を意図する。このような組成物はさらに、担体を含み得る。担体は通常の有機担体又は無機担体であってよい。担体の例としては、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、コーン油などが挙げられる。
Ｇ)ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、夾雑高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して少なくとも約８０％の純度まで、少なくとも約９０％の純度まで、少なくとも約９５％の純度、又は９５％を超える、例えば９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える純度まで精製することができ、感染性病原体及び発熱性因子を含まない。本発明のポリペプチドはまた、薬学的に純粋な状態、すなわち、９９.９％を超える純度まで精製することもできる。ある特定の調製物では、精製されたポリペプチドは実質的に他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを含まない。
天然供給源(例えば、ヒト組織源)から精製されたＺｃｙｔｏＲ２１、合成ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、並びに組換え宿主細胞から精製された組換えＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド及び融合ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの調製物を得るためには、分画及び／又は通常の精製方法を使用することができる。一般に、サンプルの分画には、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出を使用することができる。精製工程の例としては、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。好適なクロマトグラフィー用媒体としては、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが挙げられる。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好適である。クロマトグラフィー用媒体の例としては、フェニル-セファロースＦＦ(Pharmacia)、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０(Toso Haas, Montgomeryville, PA)、オクチル-セファロース(Pharmacia)などの、フェニル基、ブチル基、又はオクチル基で誘導体化された媒体；又はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１(Toso Haas)などのポリアクリル系樹脂が挙げられる。好適な固体支持体としては、ガラスビーズ、シリカ系樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物部分によりタンパク質の付着を可能にする反応性基で修飾してもよい。
カップリング化学の例としては、臭化シアン活性化、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体が挙げられる。これらの及びその他の固相媒体は、当技術分野で周知であり、広く使用されており、商業供給者から入手可能である。ポリペプチドの単離及び精製のための特定の方法の選択は、通常の設計事項であり、１つには、選択された支持体の特性によって決定される。例えば、Affinity Chromatograpy： Principles & Methods, (Pharmacia LKB Biotechnology, 1988)、及びDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)参照のこと。
ＺｃｙｔｏＲ２１の単離及び精製のその他の変形形態も、当業者ならば考案することができる。例えば、以下に記載のように得られる抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体を用いれば、免疫アフィニティー精製により大量のタンパク質を単離することができる。
本発明のポリペプチドはまた、特定の特性を利用することによって単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着(ＩＭＡＣ)クロマトグラフィーを用い、ヒスチジンに富んだタンパク質、例えばポリヒスチジンタグを含むものなどを精製することができる。要するに、まず、ゲルに二価金属イオンを持たせ、キレートを形成する(Sulkowski, Trends in Biochem. 3：1, (1985))。ヒスチジンに富んだタンパク質を、使用される金属イオンに応じた種々の親和性でこのマトリックスに吸着させ、競合的溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート剤の使用により溶出させる。その他の精製方法としては、レクチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が挙げられる(M. Deutscher, (編), Meth. Enzymol. 182:529 (1990))。本発明のさらなる実施形態では、精製を促進するために、目的のポリペプチドとアフィニティータグ(例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン)の融合物を構築することができる。さらに、アフィニティークロマトグラフィーを使用することによりＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメインのリガンド結合特性を、例えばＺｃｙｔｏＲ２１含有可溶性受容体の精製のために利用することができ、当該アフィニティクロマトグラフィーにおいて、ＩＬ-１７Ｃリガンドがカラムに結合され、そしてＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体が結合され、その後、標準的なクロマトグラフィー法を用いて溶出される。
ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、上記のような化学合成によって作製することもできる。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドは単量体であっても多量体であってもよく、グリコシル化されていてもされていなくてもよく、ペグ化されていてもされていなくてもよく、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても含んでいなくてもよい。
Ｈ)ＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質に対する抗体の作製
ＺｃｙｔｏＲ２１に対する抗体は、例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１発現ベクターの産物又は天然供給源から単離されたＺｃｙｔｏＲ２１を抗原として用いて得ることができる。特に有用な抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１と「特異的に結合」する。抗体が次の２つの特性：(１)抗体が結合活性の閾値レベルでＺｃｙｔｏＲ２１と結合すること、及び(２)抗体がＺｃｙｔｏＲ２１に関連するポリペプチドとは有意に交差反応しないこと、のうち少なくとも１つを示すならば、その抗体は特異的に結合するとみなされる。
第一の特徴に関して、抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、ペプチド又はエピトープと、１０6Ｍ-1以上、好ましくは、１０7Ｍ-1以上、より好ましくは、１０8Ｍ-1以上、最も好ましくは、１０9Ｍ-1以上の結合親和性(Ｋａ)で結合するならば、それらの抗体は特異的に結合する。抗体の結合親和性は、当業者ならば、例えば、スキャッチャード分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949))によって容易に判定することができる。第二の特徴に関しては、抗体は、例えば、標準的なウエスタンブロット分析を用いて、ＺｃｙｔｏＲ２１を検出するが、現在既知のポリペプチドは検出しないならば、それらの抗体は関連のポリペプチド分子と有意に交差反応しない。既知の関連ポリペプチドの例としては、既知の関連サイトカイン受容体が挙げられる。
抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、抗原性ＺｃｙｔｏＲ２１エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドを用いて作製することができる。本発明の抗原性エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、若しくは１２２のいずれか、又は本明細書で開示される他のアミノ酸配列内に含まれる少なくとも９個、又は１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。しかしながら、３０〜５０個の、又は本発明のポリペプチドの完全アミノ酸配列以内の長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列のさらに長い部分を含むペプチド又はポリペプチドも、ＺｃｙｔｏＲ２１と結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を示すように選択することが望ましい(すなわち、この配列は相対的に親水性の残基を含み、疎水性の残基は一般に避けられる)。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列も抗体作製に望ましい場合がある。
一例として、ＺｃｙｔｏＲ２１中の可能性のある抗原部位は、LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI)のＰＲＯＴＥＡＮプログラム(バージョン３.１４)により実行されるようなJameson-Wolf 法, Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988)を用いて同定された。当該分析においてデフォルトのパラメーターを使用した。
Jameson-Wolf法は、タンパク質構造予測に関する６つの主要サブルーチンを組み合わせることで可能性のある抗原決定基を予測する。簡単にいうと、まずHopp-Woods法、Hoppら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)を用い、最大局部親水性に相当するアミノ酸配列を特定した(パラメーター：平均７残基)。第二段階では、Eminiの方法、Eminiら, J. Virology 55:836 (1985)を用いて表面確率を算出した(パラメーター：表面決定閾値(０.６)＝１)。第三に、Karplus-Schultz法、Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985)を用い、主鎖の柔軟性を予測した(パラメーター：柔軟性閾値(０.２)＝１)。この分析の第四及び第五段階では、Chou-Fasman, Chou, “Prediciton of Protein Structurel Classes from Amino Acid Composition,” in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (編), pages 549-586 (Plenum Press 1990)、及びGarnier-Robson, Garnierら, J. Mol. Biol. 120:97 (1978)の方法を用い、このデータに二次構造予測を適用した(Chou-Fasmanパラメーター：コンフォメーション表＝６４タンパク質；α領域閾値＝１０３；β領域閾値＝１０５；Garnier-Robsonパラメーター：α及びβ決定定数＝０)。第六のサブルーチンでは、柔軟性パラメーターとヒドロパシー／溶媒アクセシビリティー因子を組み合わせて、「抗原指数」と呼ばれる表面輪郭数値(surface contour value)を決定した。最後に、内部領域に対する表面領域の移動性からくる付加的な自由エネルギーを考慮するため、個々のピーク値の２０、４０、６０、又は８０％を加算することで主要表面ピークを大きくする、ピーク拡大関数を当該抗原指数に当てはめた。しかし、らせん領域は柔軟性が小さい傾向にあるので、らせん領域に存在する主要ピークにはこの計算を適用しなかった。Hopp/Woods親水性プロフィールを用い、配列番号６内の最も抗原性の高い領域を決定することができる(Hoppら, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986及びTriquierら, Protein Engineering 11:153-169, 1998)。このプロフィールは、スライドする６残基ウィンドウに基づくものである。埋め込まれているＧ、Ｓ、及びＴ残基と露出しているＨ、Ｙ、及びＷ残基は無視された。さらに、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｅａｎプログラム(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を用い、Jameson-Wolfプロットによって推定されるような、配列番号６内のＺｃｙｔｏＲ２１抗原エピトープは好ましい抗原エピトープとして働き、当業者により決定することができる。このような抗原エピトープとしては、配列番号１１５(「抗原ペプチド１」)、１１７(「抗原ペプチド２」)、１１９(「抗原ペプチド３」が挙げられ、配列番号６の次のようなアミノ酸配列：アミノ酸５１〜５９(「抗原ペプチド４」)、アミノ酸７２〜８３(「抗原ペプチド５」)、９１〜９７(「抗原ペプチド６」)、アミノ酸１７４〜１８０(「抗原ペプチド７」)、及びアミノ酸２４２〜２４６(「抗原ペプチド８」)が好適な抗原ペプチドを提供する。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１に対する抗体を作出するための、又は本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニング若しくは同定するための手段としての、抗原ペプチドＸ〜Ｙのいずれか１つの使用を意図する。本発明はまた、抗原ペプチド１〜５の少なくとも１つを含むポリペプチドも意図する。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１に対する抗体を作出するため、並びに中和性であり、かつ、ＩＬ-１７Ｃを結合する、又はＩＬ-１７Ｃの活性を遮断する、阻害する、低下させる、活性と拮抗する、若しくは活性を中和することができる抗ＺｃｙｔｏＲ２１モノクローナル抗体を同定及びスクリーニングするための、本明細書に記載の抗原ペプチド又はエピトープのいずれかの使用を意図する。
さらに、好適な抗原は、上で記載されたＺｃｙｔｏＲ２１サイトカイン結合ドメイン又は細胞外ドメインを、他のサイトカイン細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ又はＩＩサイトカイン受容体ドメイン、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１異種二量体又は多量体ポリペプチドなどを形成することができるドメインなどと組み合わせて含むＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドも含む。
組換えＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質又は天然供給源から単離されたＺｃｙｔｏＲ２１に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。例えば、Greenら, “Production of Polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protocols (Manson, 編), pages 1-5 (Humana Press 1992)、及びWilliamsら, “Expression of foreign Proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら (編), page 15 (Oxford University Press 1995)参照のこと。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン(水酸化アルミニウム)又はフロイントの完全若しくは不完全アジュバントなどのアジュバントの使用によって増強することができる。免疫化に有用なポリペプチドにはまた、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド又は免疫グロブリンを含むその一部とマルトース結合タンパク質との融合物などの融合ポリペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫原は全長分子であってもその一部であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、このような部分は、免疫化のため、高分子担体(キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)又は破傷風毒素など)と結合又は連結するのが有利であり得る。
ポリクローナル抗体は一般に、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、又はヒツジなどの動物において作製されるが、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、ヒト以外の霊長類抗体に由来してもよい。診断上及び治療上有用な抗体をヒヒにおいて作製するための一般技術は、例えば、Goldenbergら, 国際特許公報第ＷＯ９１／１１４６５号、及びLosmanら, Int. J. Cancer 46:310 (1990)に示されている。
あるいは、モノクローナル抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体も作製可能である。特定の抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって得ることができる(例えば、Kohlerら, Nature 256:495 (1975)、Coliganら (編), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [“Coligan”]、Picksleyら, “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら (編), page 93 (Oxford University Press 1995) 参照)。
要するに、モノクローナル抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清サンプルを取り出すことにより抗体産生の有無を確認し、脾臓を取り出してＢリンパ球を得、このＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作出し、ハイブリドーマをクローニングし、その抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、その抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックから得られる。この技術では、内因性の重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞系系列から作成されたにマウス系統にヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントが導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いれば、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマが作出できる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Greenら, Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonbergら, Nature 368:856 (1994)、及びTaylorら, Int. Immun. 6:519 (1994)によって記載されている。
モノクローナル抗体は、様々な十分に確立された技術によりハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。このような単離技術としては、タンパク質Ａセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる(例えば、Coligan, pages 2.7.1-2.7.12及びpages 2.9.1-2.9.3; Bainesら, “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)参照)。
特定の使用では、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体のフラグメントを作製することが望ましい場合がある。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解によって得ることができる。抗体フラグメントは、常法により、完全抗体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。一例として、抗体フラグメントは、Ｆ(ａｂ')2で示される５Ｓフラグメントが得られるペプシンによる抗体の酵素的切断によって作製することができる。このフラグメントを、チオール還元剤を用いてさらに切断し、３.５Ｓ Ｆａｂ'一価フラグメントを得ることができる。所望により、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のための遮断基を用いて行うことができる。別法として、ペプシンを用いた酵素的切断では、２つの一価Ｆａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントが直接得られる。これらの方法は、例えば、Goldenberg, 米国特許第４,３３１,６４７号、Nisonoffら, Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)、Edelmanら, in Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)、及びColigan, pages 2.8.1-2.8.10及び2.10.-2.10.4によって記載されている。
抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝学的技術などは、それらのフラグメントが、完全抗体によって認識される抗原と結合する限り、使用可能である。
例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶH鎖とＶL鎖の会合を含む。Inbarら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)によって記載されているように、この会合は非共有性のものであってもよい。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結するか、又はグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することもできる(例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)参照)。
Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されたＶH鎖とＶL鎖を含んでもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質(ｓｃＦｖ)は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶHドメイン及びＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって作製される。この構造遺伝子は発現ベクター内に挿入され、この発現ベクターは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。これらの組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有するポリペプチド単鎖を合成する。ｓｃＦｖを作製する方法は、例えば、Whitlowら, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)によって記載されている(また、Birdら, Science 242:423 (1988), Ladnerら, 米国特許第４,９４６,７７８号、Packら, Bio/Technology 11:1271 (1993)、及びSandhu, 前掲も参照)。
一例として、ｓｃＦＶは、in vitroでリンパ球をＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドに曝し、ファージ又は類似のベクター中の抗体ディスプレーライブラリーを選択する(例えば、固定化又は標識ＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質又はペプチドの使用により)ことにより得ることができる。可能性のあるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド結合ドメインを有する遺伝子コードポリペプチドは、ファージ上(ファージディスプレー)又は大腸菌などの細菌上に提示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレーライブラリーを用い、リガンド若しくは受容体、生体高分子若しくは合成高分子、又は有機若しくは無機物質などのタンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーを作出及びスクリーニングするための技術は当技術分野で公知であり(Ladnerら, 米国特許第５,２２３,４０９号、Ladnerら, 米国特許第４,９４６,７７８号、Ladnerら, 米国特許第５,４０３,４８４号、Ladnerら, 米国特許第５,５７１,６９８号、及びKayら, Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))、ランダムペプチドディスプレーライブラリー及びこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)、Invitrogen Inc. (San Diego, CA)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)、及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)から市販されている。ランダムペプチドディスプレーライブラリーを、本明細書で開示されるＺｃｙｔｏＲ２１配列を用いてスクリーニングし、ＺｃｙｔｏＲ２１と結合するタンパク質を同定することができる。
別の形態の抗体フラグメントとして、単一の相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド(「最小認識単位」)は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより作製される(例えば、Larrickら, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodie,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterら (編), page 166 (Cambridge University Press 1995)、及びWardら, “Gnnetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birchら, (編), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照)。
あるいは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体から誘導することもできる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からヒト可変ドメインへ移すことによって作製される。次に、ヒト抗体の典型的残基が、マウス対応物のフレームワーク領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することで、マウス定常領域の免疫原性に付随する潜在的な問題がなくなる。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般技術は、例えば、Orlandiら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技術は、例えば、Jonesら, Nature 321:522 (1986), Carterら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:431 (1992)、Singerら, J. Immun. 150:2844 (1993)、Sudhir (編), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Clelandら (編), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、及びQueenら, 米国特許第５,６９３,７６２号(1997)によって記載されている。
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントは、当技術分野における、また、本明細書に記載される方法を用いてペグ化することができる。
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な技術を用い、動物を抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントで免役することにより作製することができる。例えば、Greenら, “Production of Polyclonal Antisera,” in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (編), pages 1-12 (Humana Press 1992)参照のこと。また、Coligan, pages 2.4.1-2.4.7も参照のこと。あるいは、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、上記のように、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて作製することができる。もう１つの例として、ヒト化抗イディオタイプ抗体又はヒト以外の霊長類の抗イディオタイプ抗体も、上記の技術を用いて作製することができる。抗イディオタイプ抗体を作製する方法は、例えば、Irie, 米国特許第５,２０８,１４６号、Greeneら, 米国特許第５,６３７,６７７号、及びVarthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)によって記載されている。
抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は検出可能な標識とコンジュゲートして、抗ＺｃｙｔｏＲ２１免疫複合体を形成することができる。好適な検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識又は金コロイドが挙げられる。このような検出可能なよに標識された免疫複合体を作製及び検出する方法は当業者に周知であり、以下にさらに詳しく記載する。
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位元素であり得る。本発明の目的に特に有用な同位元素としては、3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ及び14Ｃがある。
また、抗ＺｃｙｔｏＲ２１免疫複合体は、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識抗体の存在は、免疫複合体を適切な波長の光に曝し、生じた蛍光を検出することによって判定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ-フタルデヒド及びフルオレスカミンが挙げられる。
あるいは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１免疫複合体は、抗体成分を化学発光化合物とカップリングさせることによって検出可能なように標識することもできる。化学発光タグ付き免疫複合体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって検出される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ２１免疫複合体を標識することができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める生物系において見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより判定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。
あるいは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１免疫複合体は、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体成分を酵素と連結させることにより検出可能なように標識することができる。抗ＺｃｙｔｏＲ２１酵素コンジュゲートは適当な基質の存在下でインキュベートされると、酵素部分がその物質と反応して、例えば、分光光度的手段、蛍光測定的手段又は視覚的手段によって検出可能な化学部分を生成する。多重特異的免疫複合体を検出可能に標識するために使用可能な酵素の例としては、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
当業者ならば、本発明に従って使用可能な他の好適な標識については承知している。マーカー部分と抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体との結合は、当技術分野で公知の標準的技術を用いて果たすことができる。これに関して典型的な方法が、Kennedyら, Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schursら, Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shihら, Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)、Steinら, Cancer Res. 50:1330 (1990)、及びColigan, 前掲によって記載されている。
さらに、免疫化学的検出の利便性及び多面性は、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンとコンジュゲートされた抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体を用いることで増強することができる(例えば、Wilchekら (編), “Avidin-Biotin Technology,”Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990)、及びBayerら, “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (編), pages 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992)参照)。
イムノアッセイを実施するための方法は充分に確立されている。例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (編), pages 180-208, (Cambridge University Press, 1995)、Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (編), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、及びDiamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)参照のこと。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子発現に関する免疫診断アッセイを実施するためのキットも意図する。このようなキットは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントを含む少なくとも１つの容器を含む。キットはまた、ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントの存在を示し得る１以上の試薬を含む第二の容器を含んでもよい。このような指示試薬としては、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、金コロイドなどのような検出可能な標識が挙げられる。また、キットは、ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は抗体フラグメントが、ＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質を検出するために用いられることを使用者に知らせるための手段を含んでもよい。例えば、説明書に、同梱されている抗体又は抗体フラグメントがＺｃｙｔｏＲ２１を検出するために使用可能であることを記してもよい。この書類は容器に直接貼付することもできるし、あるいは同梱添付の形で提供することもできる。
Ｉ)ＩＬ-１７ＣへのＺｃｙｔｏＲ２１の結合に拮抗する抗ＺｃｖｔｏＲ２１抗体の使用
本明細書において有用な抗体を作製又は選択するためのもう１つの技術として、in vitroでリンパ球を、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体ポリペプチド又はそのフラグメント、例えば抗原エピトープなどに曝し、ファージ又は類似のベクターにおける抗体ディスプレーライブラリーを選択する(例えば、固定化又は標識可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体ポリペプチド又は抗原エピトープなどのそのフラグメントの使用による)というものがある。可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体ポリペプチド又は抗原エピトープなどのそのフラグメントなどの可能性のある結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上(ファージディスプレー)又は大腸菌などの細菌上に提示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレーライブラリーを用い、リガンド若しくは受容体、生体高分子若しくは合成高分子、又は有機若しくは無機物質などのタンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーを作出及びスクリーニングするための技術は当技術分野で公知であり(Ladnerら, 米国特許第５,２２３,４０９号、Ladnerら, 米国特許第４,９４６,７７８号、Ladnerら, 米国特許第５,４０３,４８４号、及びLadnerら, 米国特許第５,５７１,６９８号)、ランダムペプチドディスプレーライブラリー及びこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Clontech (Palo Alto, CA)、Invitrogen Inc. (San Diego, CA)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)、及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)から市販されている。ランダムペプチドディスプレーライブラリーは、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体ポリペプチド又は本明細書で開示される抗原エピトープポリペプチド配列などのそのフラグメントを用いてスクリーニングし、ＺｃｙｔｏＲ２１を含む受容体ポリペプチドと結合するタンパク質を同定することができる。可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は、細胞にタグを付けるため、また、アフィニティー精製により相同ポリペプチドを単離するために使用することができ、それらは薬剤、毒素、放射性核種などに直接的又は間接的にコンジュゲートすることができる。これらの結合ポリペプチドはまた、発現ライブラリーをスクリーニングし、活性を中和するため、例えば、ＩＬ-１７Ｃと結合する、又はＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１の間の相互作用、又はウイルスの受容体への結合を遮断する、阻害する、低下させる、結合と拮抗する、若しくは活性を中和するためなどの分析方法に使用することもできる。これらの結合ポリペプチドはまた、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドの循環レベルを測定するため、また、根底にある病状又は疾患のマーカーとしての可溶性又は不溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体を検出又は定量するための診断アッセイに使用することができる。これらの結合ポリペプチドは、「アンタゴニスト」ととして、in vitro及びin vivoにおいて、可溶性又は膜結合型のＺｃｙｔｏＲ２１単量体受容体又はＺｃｙｔｏＲ２１ホモ二量体、ヘテロ二量体又は多量体ポリペプチドの結合(例えば、リガンドに対する)及びシグナル伝達を遮断又は阻害する働きをすることができる。この場合も、これらの結合ポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ２１単量体受容体又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１ホモ二量体、ヘテロ二量体若しくは多量体ポリペプチドとして働き、ＩＬ-１７Ｃ活性並びに受容体活性又はタンパク質結合の阻害に有用である。本発明の天然受容体複合体に対して生じた抗体、及びＺｃｙｔｏＲ２１エピトープ結合抗体、及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１中和モノクローナル抗体はＺｃｙｔｏＲ２１に対してより特異的に働き、ＩＬ-１７Ｃを阻害することができるので、好ましい実施形態であり得る。さらに、本発明の抗体の抗原活性及び結合活性は、ＩＬ-１７Ｃ、及びＺｃｙｔｏＲ２１含有可溶性受容体の存在下でＩＬ-１７Ｃ増殖、シグナル捕捉、ルシフェラーゼ、リンタンパク質、又は結合アッセイ、及び本明細書に記載の他の生物又は生化学アッセイにおいてアッセイすることができる。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体ポリペプチド(例えば、配列番号２、５、８、１１、１４、２１、２３、１０７、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２に対する抗体)に対する抗体、又は抗原エピトープなどのそのフラグメントは、in vivoにおいてＩＬ-１７Ｃの炎症作用を阻害するため；乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、大腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫介在腎疾患、肝胆管疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、又は変性性関節疾患及び本明細書で開示される他の炎症性症状などの炎症及び炎症性疾患に対する治療的使用のため；ＺｃｙｔｏＲ２１受容体を発現する細胞にタグを付けるため；アフィニティー精製により可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドを単離するため；可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイのため；根底にある病状又は疾患のマーカーとしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体を検出又は定量するため；ＦＡＣＳを用いる分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするため；ＩＬ-１７Ｃアゴニストとして働き得る抗イディオタイプ抗体を作製するため；そして中和抗体又はアンタゴニストとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＺｃｙｔｏＲ２１受容体に結合し、その活性を遮断、阻害、低減、又は拮抗作用するか、或いはＩＬ-１７Ｃに結合し、その活性を遮断、阻害、低減、又は拮抗作用するために使用可能である。好適な直接的タグ又は標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、ビオチン、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などが挙げられ、間接的タグ又は標識としては、ビオチン-アビジン又は介在物としての他の相補体／抗相補体対の使用を特徴とするものであり得る。本発明の抗体はまた、薬剤、毒素、放射性核種などに直接又は間接的にコンジュゲートしてもよく、これらのコンジュゲートはin vivoにおける診断又は治療用途に使用することができる。さらに、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドに対する抗体、又はそのフラグメントは、in vitroにおいて変性又は非変性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチド又はそのフラグメントを検出するために、アッセイ、例えば、ウエスタンブロット又は当技術分野で公知の他のアッセイで用いることができる。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体、又は可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ホモ二量体、ヘテロ二量体若しくは多量体受容体ポリペプチドに対する抗体は、対応する受容体を発現する細胞にタグを付け、それらの発現レベルをアッセイするため、アフィニティー精製のため、受容体ポリペプチドの循環レベルを測定するための診断アッセイ、蛍光活性化細胞選別を用いる分析法で有用である。さらに、二価抗体、及び抗イディオタイプ抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンド、ＩＬ-１７Ｃの作用を模倣するため、アゴニストとして使用してもよい。
本明細書の抗体はまた、薬剤、毒素、放射性核種などに直接的又は間接的にコンジュゲートすることもでき、これらのコンジュゲートはin vivoにおいて診断又は治療用途に使用することができる。例えば、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体又は可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ホモ二量体、ヘテロ二量体又は多量体受容体ポリペプチドを認識する抗体又は結合ポリペプチドを用いて、対応する抗相補体分子(すなわち、ＺｃｙｔｏＲ２１含有可溶性又は膜結合受容体)を発現する組織又は器官を特定又は処置することもできる。より具体的には、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドに対する抗体、又はその生物活性フラグメント又は部分を検出可能な分子又は細胞傷害性分子と結合させ、ＺｃｙｔｏＲ２１を発現する癌などのＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類へ送達することができる。
好適な検出可能分子は、「結合ポリペプチド」(上記で開示される結合ペプチド)などの、ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体ポリペプチドと結合するポリペプチド、抗体、又はその生物活性フラグメント若しくは部分と直接的又は間接的に結合させてもよい。好適な検出可能分子としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などが挙げられる。好適な細胞傷害性分子は、このポリペプチド又は抗体と直接的又は間接的に結合させてもよく、細菌又は植物毒素(例えば、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンなど)、並びに治療用放射性核種、例えばヨウ素-１３１、レニウム-１８８又はイットリウム-９０などが挙げられる(ポリペプチド又は抗体に直接結合させるか、例えば、キレート部分を介して間接的に結合させる)。結合ポリペプチド又は抗体はまた、アドリアマイシンなどの細胞傷害剤とコンジュゲートさせてもよい。検出可能な分子又は細胞傷害性分子の間接的結合に関しては、検出可能な分子又は細胞傷害性分子は、相補体／抗相補体対の一方とコンジュゲートさせることができ、この場合、もう一方は、結合ポリペプチド又は抗体部分と結合されている。これらの目的では、ビオチン／ストレプトアビジンが相補体／抗相補体対の典型例である。
もう１つの実施形態では、結合ポリペプチド-毒素融合タンパク質又は抗体-毒素融合タンパク質は、標的細胞又は組織の阻害又はアブレーション(例えば、癌細胞又は組織の処置のため)に使用することができる。あるいは、結合ポリペプチドが多重機能的ドメイン(すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメインとテーゲッティングドメイン)を有する場合には、ターゲッティングドメインのみを含む融合タンパク質が、検出可能な分子、細胞傷害性分子又は相補的分子を目的の細胞又は組織種に向けるために好適であり得る。単一のドメインのみを含む融合タンパク質が相補的分子を含む場合には、抗相補的分子を検出可能な分子又は細胞傷害性分子にコンジュゲートすることができる。よって、このようなドメイン-相補的分子融合タンパク質は、一般的抗相補的検出可能／細胞傷害性分子コンジュゲートの細胞／組織特異的送達用の、一般的ターゲッティングビヒクルとなる。
もう１つの実施形態では、ＺｃｙｔｏＲ２１結合ポリペプチド-サイトカイン又は抗体-サイトカイン融合タンパク質は、その結合ポリペプチド-サイトカイン又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１受容体抗体が過増殖性細胞をターゲッティングする場合には、標的組織(例えば、脾臓癌、膵臓癌、血液癌、リンパ癌、結腸癌、及び骨髄癌)のin vivo死滅を促進するために使用することができる(一般に、Hornickら, Blood 89:4437-47, 1997参照)。記載されている融合タンパク質は、サイトカインを所望の作用部位にターゲッティングすることを可能とし、それにより、サイトカインの高い局部的濃度が得られる。好適な抗ＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体又は多量体抗体は望ましくない細胞又は組織(すなわち、腫瘍又は白血病)をターゲッティングし、融合したサイトカインがエフェクター細胞による標的細胞溶解の増強を媒介する。この目的で好適なサイトカインとしては、例えば、インターロイキン２及び顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)が挙げられる。
あるいは、本明細書に記載のＺｃｙｔｏＲ２１受容体結合ポリペプチド又は抗体融合タンパク質は、ＺｃｙｔｏＲ２１受容体により媒介されるアポトーシス経路を直接刺激することにより、標的組織のin vivo死滅を促進するために使用することができ、その結果として、ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体を発現する過増殖性細胞の細胞死が起こる。
Ｊ)ＺｃｙｔｏＲ２１活性を有するポリペプチド又はＺｃｖｔｏＲ２１に対する抗体の治療的使用
ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドＩＬ-１７Ｃを結合させ、そうして、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドと内因性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体との結合を妨げることにより、免疫系を調節するために可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１活性を有するアミノ酸配列を用いることができる。また、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体などのＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニストを用いても、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンドと内因性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体との結合を阻害することにより、免疫系を調節することができる。よって、本発明は、ＺｃｙｔｏＲ２１活性を有するタンパク質、ポリペプチド、及びペプチド(例えば、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドフラグメント、ＺｃｙｔｏＲ２１類似体(例えば、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗イディオタイプ抗体)、及びＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質など)を、当該ポリペプチドの十分な量がないか又は過剰なＺｃｙｔｏＲ２１リガンドを産生する被験者へ使用することを含む。ＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニスト(例えば、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体)はまた、過剰なＺｃｙｔｏＲ２１リガンド又はＺｃｙｔｏＲ２１のいずれかを産生する被験者を治療するために使用することもできる。好適な被験者としては、ヒトなどの哺乳類が挙げられる。例えば、このようなＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、大腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫介在腎疾患、肝胆管 疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、又は変性性関節疾患及び本明細書で開示される他の炎症性症状などの、炎症及び炎症性疾患の治療において、ＩＬ-１７Ｃと結合し、又はＩＬ-１７Ｃを遮断、阻害、低下、拮抗、又は中和する上で有用である。
好ましい実施形態では、可溶性受容体形態のＺｃｙｔｏＲ２１(配列番号３、６、９、１２、１５、２１、２３、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２)は、in vivoにおいてＩＬ-１７Ｃと結合し、ＩＬ-１７Ｃを遮断、阻害、低下、拮抗、又は中和する単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は多量体である。このようなＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は多量体に対する抗体及び結合ポリペプチドはまた、ＺｃｙｔｏＲ２１活性のアンタゴニストとして、また、本明細書に記載されるＩＬ-１７Ｃとしても働く。
よって、本発明の特定の実施形態は、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚症状、関節リウマチ、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、クローン病、憩室症、喘息、膵炎、Ｉ型糖尿病(ＩＤＤＭ)、膵臓癌、膵炎、グレーブス病、結腸及び腸癌、自己免疫疾患、敗血症、器官又は骨髄移植；内毒素血症、外傷、外科術又は感染による炎症；アミロイド症；脾腫；移植片対宿主病などの炎症性疾患及び免疫疾患又は症状；炎症の阻害、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞又はリンパ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞(Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞を含む)の増殖の低下、病原体又は抗原に対する免疫応答の抑制、又はＩＬ-１７Ｃ若しくは別のＩＬ-１７ファミリーのメンバー若しくはサイトカインの阻害が望まれる他の場合におけるアンタゴニストととしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の使用に向けられる。
さらに、本明細書に記載のＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと結合する可溶性受容体などの抗体又は結合ポリペプチド、及びＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドそれ自体は、次の場合に有用である。
１)外傷、組織損傷、外科術、敗血症又は感染、及び喘息、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、慢性大腸炎、脾腫、関節リウマチ、再発性急性炎症性症状(例えば、結核)などの慢性炎症性疾患の結果としての急性炎症、炎症の治療、並びにアミロイド症、アテローム性動脈硬化症、キャッスルマン症、喘息、及び急性期応答の誘導に関連する他の疾病の治療における、ＩＬ-１７Ｃ又はＩＬ-１７Ｃ受容体(例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１)いずれかを介したシグナルの遮断、阻害、低下、拮抗又は中和。
２)ＩＤＤＭ、多発性硬化症(ＭＳ)、全身性紅斑性狼(ＳＬＥ)、重症筋無力症、関節リウマチ、及びＩＢＤなどの自己免疫疾患の治療における、免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)におけるシグナル伝達を回避又は阻害ための、ＩＬ-１７Ｃ又はＩＬ-１７Ｃ受容体(例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１)いずれかを介したシグナル伝達の遮断、阻害、低下、拮抗又は中和。あるいは、ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体に対するモノクローナル抗体(ＭＡｂ)などの抗体はまた、自己免疫疾患の治療を目的に望ましくない免疫細胞を根絶するためのアンタゴニストとして使用することもできる。喘息、アレルギー及び他のアトピー性疾患は、免疫応答の阻害又は有害な細胞の根絶のため、例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１結合ドメイン(配列番号１１５、１１７又は１１９に記載の通り)に対する本発明のＭＡｂで治療することができる。また、本発明の可溶性受容体、ポリペプチド及び抗体を用い、ＺｃｙｔｏＲ２１によるシグナル伝達の遮断、阻害、低下、又は中和は、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病にも利益を与え得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵炎、及び膵臓癌で利益が得られうる。
ＺｃｙｔｏＲ２１は、拮抗性ＭＡｂが癌増殖を阻害し、免疫介在死滅をターゲッティングする癌のＭＡｂ治療の標的として役立ち得る(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998)。可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１に対するＭＡｂはまた、糸球体硬化症、膜性神経障害、アミロイド症(他の組織の中でも腎臓を侵す)、腎臓動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の繊維増殖性疾患、並びにＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病(ＮＩＤＤＭ)、腎腫瘍及び他の疾患に関連する腎不全などの腎症の治療にも有用であり得る。
３)ＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、関節リウマチ、及びＩＢＤなどの自己免疫疾患の治療における、ＩＬ-１７Ｃ受容体(例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１)を介したシグナル伝達の刺激、促進、増強又は誘導。抗ＺｃｙｔｏＲ２１中和抗体及びモノクローナル抗体は、リンパ球又は他の免疫細胞に、分化、増殖の変更、又は自己免疫を改善するサイトカイン又は細胞表面タンパク質の産生の変化のシグナルを送ることができる。特に、サイトカイン分泌の交互パターンに対するＴ-ヘルパー細胞の応答の調節は自己免疫応答を偏向させ、疾病を改善することができる(Smith JAら, J. Immunol. 160:4841-4849, 1998)。同様に、アゴニスト性の抗可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体及び多量体モノクローナル抗体を用い、喘息、アレルギー及びアトピー製疾患に関与する免疫細胞にシグナルを送り、それを根絶し、排除することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１を介したシグナル伝達ではまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾患に利益が得られる。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵炎、及び膵臓癌でも利益が得られる。ＺｃｙｔｏＲ２１は、シグナル伝達ＭＡｂが癌の増殖を阻害し、免疫介在死滅をターゲッティングする膵臓癌のＭＡｂ治療のための標的として役立ち得る(Tutt, ALら, J Immunol. 161: 3175-3185, 1998)。同様に、腎細胞癌も、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体で治療することができる。
本明細書に記載の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを用い、上記のような自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵炎及び腎不全の治療において、ＩＬ-１７Ｃと結合し、ＩＬ-１７Ｃ活性を遮断、阻害、低下、拮抗、又は中和することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１ｓ２(配列番号１１３)などの可溶型のＺｃｙｔｏＲ２１を用い、Ｔｈ細胞が介在する抗体応答を促進することができ、かつ／又はリンパ球又は他の免疫細胞によるＩＬ-４又は他のサイトカインの産生を促進することができる。
本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有受容体は、ＩＬ-１７Ｃのアンタゴニストとして有用である。このようなアンタゴニスト作用は、ＩＬ-１７Ｃの直接的中和又は結合により果たされ得る。アンタゴニスト的使用の他、本発明の可溶性受容体は、体内の種々の組織、器官、及び細胞にリガンドを輸送するため、ＩＬ-１７Ｃと結合し、ＩＬ-１７Ｃサイトカインのための担体タンパク質として働き得る。本発明の可溶性受容体はそれ自体、可溶性受容体-リガンド複合体を、組織、特定の免疫細胞、又は腫瘍などの特定の部位に仕向ける分子、ポリペプチド又は化学部分と融合又は結合させることができる。例えば、急性感染症又は数種の癌では、ＩＬ-１７Ｃの作用により、炎症及び局部的急性期反応タンパク質の誘導の結果として利益が得られる。よって、本発明の可溶性受容体を用い、ＩＬ-１７Ｃの作用を特異的に指示することができる。Cosman, D. Cytokine 5:95-106, 1993;及びFernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000参照のこと。
さらに、本発明の可溶性受容体を用い、ＩＬ-１７Ｃを分解若しくはクリアランスから安定化させること、又はこのリガンドを体内のある作用部位にターゲッティングすることにより、ＩＬ-１７Ｃを安定化させ、ＩＬ-１７Ｃのバイオアベイラビリティ、治療寿命、及び／又は有効性を高めることができる。例えば、天然型ＩＬ-６／可溶性ＩＬ-６Ｒ複合体は１Ｌ-６を安定化し、ｇｐ１３０受容体を介してシグナル伝達することができる。Cosman, D. 前掲、及びFernandez-Botran, R. 前掲参照のこと。さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１は、リガンド／可溶性受容体複合体を含むように、ＩＬ-１７Ｃなどの同族リガンドと組み合わせることもできる。このような複合体を用い、相手の受容体サブユニットを提示する細胞からの応答を刺激することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１／リガンド複合体の細胞特異性は、リガンド単独を投与した場合に見られるものとは異なる。さらに、これらの複合体は、半減期、用量／応答及び器官又は組織特異性への影響など、明瞭な薬剤動態適性を有し得る。よって、ＺｃｙｔｏＲ２１／ＩＬ-１７Ｃ複合体は、免疫応答を増強する、若しくはメサンギウム細胞を刺激する、又は肝細胞を刺激するアゴニスト活性を有し得る。あるいは、シグナル伝達サブユニットを発現する組織でのみ、複合体とのヘテロ二量体形成は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対する応答と同様の影響を受け得る(Hirota H.ら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. in Thomason, A. (編) “The Cytokine Handbook”, 第3版, p. 208-209)。ＩＬ-１２及びＣＮＴＦに対する可溶性受容体／サイトカイン複合体は同様の活性を示す。
さらに、炎症は、侵入してくる病原体をかわすための生物による防御応答である。炎症は、多くの細胞メディエーター及び体液メディエーターを含むカスケードとしての事象である。一方、炎症性応答の抑制は宿主を免疫不全状態としてしまうが、抑制されないままであると、炎症は、慢性炎症性疾患(例えば、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患など)、敗血性ショック及び多臓器不全をはじめとする重篤な合併症をもたらしかねない。重要なことに、これらの多様な病態が共通の炎症性メディエーターを有する。炎症を特徴とする疾患の集合体は、ヒトの罹患率及び死亡率に大きな影響を有する。従って、ＺｃｙｔｏＲ２１などの抗炎症性タンパク質、及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体が、喘息及び自己免疫に対するアレルギー及び敗血性ショックからの膨大な数のヒト及び動物疾患の重要な治療可能性を持ち得ることは明らかである。
１.関節炎
変形性関節症、関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節などをはじめとする関節炎は、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性ポリペプチド及びＭＡｂなどの抗炎症性タンパク質の治療的使用から利益を得ると考えられる一般的な炎症性症状である。例えば、関節リウマチ(ＲＡ)は、全身に影響を及ぼす全身性疾患であり、関節炎で最も多い形態の１つである。これは、関節内層の膜の炎症を特徴とし、これが、疼痛、硬直、火照り、発赤、及び腫脹を引き起こす。炎症細胞は、骨及び軟骨を切断し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節の内層、すなわち滑膜は、骨及び軟骨に侵入し、かつ損傷を与えて、その他の生理学的作用の中でも、関節の劣化及び激痛を引き起こし得る。関与している関節は、その形状及び配列を失って、疼痛を生じ、動作が悪くなる。
関節リウマチ(ＲＡ)は、特に炎症及びその後の組織損傷を特徴とする免疫介在疾患であり、重篤な障害及び死亡率の増大を引き起こす。これらのリウマチ様関節では、種々のサイトカインが局所的に産生される。多くの研究で、２つのプロトタイプの炎症性サイトカインであるＩＬ-１及びＴＮＦ-αが、滑膜の炎症に、また、進行性の関節破壊に関与する機構に重要な役割を果たすことが証明された。実際に、ＲＡ患者にＴＮＦ-α及びＩＬ-１阻害剤を投与すると、臨床的及び生物学的な炎症徴候の劇的な改善、並びに骨浸食及び軟骨破壊の放射線学的徴候の減少に至った。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、相当な割合の患者がこれらの薬剤に応答せず、このことは、その他のメディエーターも関節炎の病態生理に関与することを示唆している(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2)：135-149, 2002)。これらのメディエーターの１つはＩＬ-１７Ｃであり、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は結合パートナーなどのＩＬ-１７Ｃと結合するか、又はＩＬ-１７Ｃを阻害する分子はそれ自体、関節リウマチ及びその他の関節炎疾患の炎症を軽減するための有用な治療として役立ち得る。
当技術分野において公知の関節リウマチのためのいくつかの動物モデルがある。例えば、コラーゲン誘導関節炎(ＣＩＡ)モデルでは、マウスがヒト関節リウマチに非常によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡは、ＲＡと同様の免疫学的及び病理学的特徴を共有するので、これが潜在的なヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。ＣＩＡモデルは、発症のために、免疫応答と炎症応答の両方に依存する周知のマウスモデルである。免疫応答は、抗原として与えられるコラーゲンに応答したＢ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生を引き起こす。炎症段階は、これらの抗体のいくつかがマウスの天然コラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化する結果としての、炎症メディエーターによる組織応答の結果である。ＣＩＡモデルを使用することの利点は、病原の基本的機構が既知であるということである。ＩＩ型コラーゲン上の、関連したＴ細胞及びＢ細胞エピトープが同定されており、免疫が介在する関節炎に関連した種々の免疫学的な(例えば、遅延型過敏症及び抗コラーゲン抗体)、及び炎症性の(例えば、サイトカイン、ケモカイン、及びマトリックス分解酵素)パラメーターが決定されているので、ＣＩＡモデルにおいて試験化合物の有効性を評価するために使用することができる(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3：407-20, 1999； Williamsら, Immunol. 89：9784-788, 1992； Myersら, Life Sci. 61：1861-78, 1997；及びWangら, Immunol. 92：8955-959, 1995)
これらのＣＩＡモデルのマウスに対する、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ４又は他のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性及び融合タンパク質などの可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有ポリペプチド(ＺｃｙｔｏＲ２１)の投与は、疾患の症状を改善し、経過を変えるために用いられるＩＬ-１７Ｃに対するアンタゴニストとしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の使用を評価するために使用される。さらに、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体によるＩＬ-１７Ｃの阻害を示す結果は、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又はそれに対する中和抗体などの他のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストを用いても疾患の症状を改善し、経過を変えることができるという概念の証明となる。さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ４又は他のＩＬ-１７Ｃ可溶性受容体(例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１；配列番号３、６、９、１２、１５、２１、２３、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２)及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、及び融合タンパク質などの可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有ポリペプチドの全身投与又は局所投与は、ＲＡにおける炎症性応答を抑制する可能性がある。限定されるものではないが、例を挙げれば、マウス１個体当たり１０〜１００μｇの可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃを注射すると(１週間に１〜数回、限定されるものではないが最大４週間、皮下、腹腔内又は筋肉内投与経路)、疾病スコア(パウ(paw)スコア、炎症又は疾患の発生率)を有意に引き下げることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ投与の開始時期に応じて(例えば、コラーゲンの感作前又は感作時、又は２回目のコラーゲン感作の後のいずれかの時点(疾病がすでに進行していた時点も含む))、ＺｃｙｔｏＲ２１は、関節リウマチを予防するとともに、その進行を防ぐ上で有効であり得る。他の可能性のある治療薬としては、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、又は抗ＩＬ-１７Ｃ抗体若しくは結合パートナーなどが挙げられる。
２.内毒素血症
内毒血症は、細菌及び他の感染症病原体、敗血症、毒性ショック症候群などの感染因子、又は日和見感染した免疫不全患者などからよく起こる重篤な症状である。本発明のＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド及び抗体などの治療的に有用な抗炎症性タンパク質は、ヒト及び動物の内毒素血症を予防及び治療する際の助けとなり得る。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は結合パートナーは、内毒素血症の炎症及び病理学的作用を軽減するために有用な治療薬として役立ち得る。
リポ多糖(ＬＰＳ)により誘導される内毒素血症は、感染性疾患において病理学的作用を生じる炎症性メディエーターの多くに関与し、齧歯類でのＬＰＳ誘導内毒素血症は、潜在的な炎症性又は免疫調節性の薬剤の薬理作用を研究するために広く使用され、かつ許容されるモデルである。グラム陰性菌が産生するＬＰＳは、肺血性ショックの病因の主要な原因因子である(Glausnerら, Lancet 338：732, 1991)。ショック様状態は、ＬＰＳを動物に単回注射することによって実験的に実際に誘導することができる。ＬＰＳに応答する細胞によって産生される分子は、直接的又は間接的に病原体をターゲッティングすることができる。これらの生物応答は、宿主を病原体の侵入から保護するが、害もまた生じることがある。従って、先天性免疫の強力な刺激は、重篤なグラム陰性菌感染の結果として生じ、サイトカイン及び他の分子の過剰な産生、並びに発熱、低血圧、播種性血管内血液凝固、及び多臓器不全を特徴とする致命的症候群である敗血性ショック症候群の発症を引き起こす(Dumitruら, Cell 103：1071-1083, 2000)。
これらのＬＰＳの有毒作用は、大部分が多くの炎症性メディエーターの放出を引き起こすマクロファージの活性化に関するものである。中和抗ＴＮＦ抗体の投与によるＬＰＳ毒性の予防によって示されるように、これらのメディエーターの中で、ＴＮＦは重要な役割を果たすと思われる(Beutlerら, Science 229：869, 1985)。大腸菌ＬＰＳをＣ５７Ｂ１／６マウスへ注射することで、注射後の約２時間で循環中のＩＬ-６、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１、及び急性期タンパク質(例えば、ＳＡＡ)に有意な上昇が見られることは、十分確認されたことである。これらのメディエーターに対する受動免疫は、死亡率の減少という結果をもたらし得るので、ＬＰＳの毒性は、これらのサイトカインによって媒介されるものと思われる(Beutlerら, Science 229：869, 1985)。敗血性ショックの予防及び／又は処置のための潜在的な免疫介入戦略としては、抗ＴＮＦ ｍＡｂ、ＩＬ-１受容体アンタゴニスト、ＬＩＦ、ＩＬ-１０、及びＧ-ＣＳＦを含む。
これらのＬＰＳ誘導モデルに対する、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ５、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ１０又は他のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性及び融合タンパク質などの、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１含有ポリペプチドの投与は、ＬＰＳにより誘導された疾患の症状を改善し、経過を変えるためのＺｃｙｔｏＲ２１の使用を評価するために使用することができる。さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１によるＩＬ-１７Ｃの阻害を示す結果は、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又はそれに対する抗体などの他のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストを用いても、ＬＰＳにより誘導されたモデルにおいて症状を改善し、疾病経過を変えることができるという概念の証明となる。このモデルでは、ＬＰＳ注射によるＩＬ-１７Ｃの誘導及びＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドによる疾患治療の可能性が示される。ＬＰＳは、内毒素血症の病理に関与する可能性のある炎症性因子の産生を誘導することから、アンタゴニストＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドによる、ＩＬ-１７Ｃ活性又は他の炎症性因子の中和は、内毒素ショックなどにおいて見られる内毒素血症の症状を軽減するために使用することができる。他の可能性のある治療薬としては、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、又は結合パートナーなどが挙げられる。
３.炎症性腸疾患ＩＢＤ
米国では、約５００,０００人が、結腸及び直腸のいずれか(潰瘍性大腸炎)、又は小腸及び大腸の両方(クローン病)に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患(ＩＢＤ)に罹患している。これらの疾患の病因は不明であるが、これらには罹患組織の慢性的な炎症を含む。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、又はは、ＩＢＤ及び関連疾患の炎症及び病理学的作用を軽減するために有用な治療薬として役立ち得る。
潰瘍性大腸炎(ＵＣ)は、一般に結腸と呼ばれている大腸の炎症性疾患であり、結腸の粘膜又は最内層の炎症及び潰瘍形成を特徴とする。この炎症は、結腸を頻繁に空にして下痢を生じさせる。症状としては、軟便、並びに関連の異常な痙攣、発熱、及び体重減少が挙げられる。ＵＣの正確な原因は知られていないが、最近の調査では、身体の本来の防御が、その身体を異物とみなし(「自己免疫反応」)、体内のタンパク質に対して働くということが示唆される。おそらく、これらが腸内の細菌タンパク質に似ているので、これらのタンパク質は、炎症プロセスを生じ、又は刺激して、結腸の内面を破壊し始める。結腸の内面が破壊されると、潰瘍が生じ、粘液、膿汁、及び血液が放出される。この疾患は、通常直腸領域で始まり、やがては大腸全体に拡大する。炎症が繰り返し起こることで、瘢痕組織を伴う小腸及び直腸壁の肥厚に至る。結腸組織の死滅又は敗血症は重篤な疾患を引き起こす。潰瘍性大腸炎の症状の重篤度は様々であり、これらの発症は段階的である場合もあるし、突然である場合もある。呼吸器感染又はストレスを含む多くの因子によって発作が起こる場合もある。
現在利用できるＵＣの治療法はないが、処置としては、結腸内面の異常な炎症プロセスを抑制することに焦点が当てられている。この疾病の処置には、疾患を治療コルチコステロイド免疫抑制薬(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、及びメトトレキサート)及びアミノサリチル酸塩を含む治療薬が利用できる。しかし、コルチコステロイド及びアザチオプリンなどの免疫抑制薬の長期使用は、骨細り、白内障、感染、並びに肝臓及び骨髄への影響を含む深刻な副作用を生じるおそれがある。現行治療法が良好でない患者においては、外科術も１つの選択肢となる。外科術は、結腸全体及び直腸の摘出を含む。
部分的に慢性潰瘍性大腸炎を模倣することができるいくつかの動物モデルがある。最も広く用いられているモデルは、オキサゾロン及び２,４,６-トリニトロベンスルホン酸／エタノール(ＴＮＢＳ)により誘導される大腸炎モデルであり、これは、大腸に慢性炎症と潰瘍形成を誘導する。オキサゾロン又はＴＮＢＳを直腸内点滴を介して感受性マウスの結腸に導入すると、結腸粘膜にＴ細胞を媒介とする免疫応答が生じ、この場合、大腸壁全域にＴ細胞及びマクロファージの高密度浸潤を特徴とする著しい粘膜炎症に至る。さらに、この組織病理学的像は、進行性の体重減少(消耗)、観血性の下痢、直腸脱、及び大腸壁肥厚の臨床像を伴う(Neurathら, Intern. Rev. Immunol. 19：51-62, 2000)。
もう１つの大腸炎モデルは、デキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)を使用し、観血性の下痢、体重減少、結腸の短化、及び好中球の浸潤を伴う粘膜の潰瘍形成によって現れる急性大腸炎を誘導する。ＤＳＳにより誘導される大腸炎は、組織学的には、リンパ系の過形成、局所の腺窩損傷、及び上皮性潰瘍形成を伴う、粘膜固有層への炎症細胞の浸潤を特徴とする。これらの変化は、上皮でのＤＳＳの有毒作用のために、また、粘膜固有層細胞の食作用並びにＴＮＦ-α及びＩＦＮ-γの産生によって発症すると考えられる。一般に使用されているにもかかわらず、ヒト疾患に対する関連性についてのＤＳＳの機構に関するいくつかの問題は未解決のままである。ＤＳＳは、ＳＣＩＤマウスなどのＴ細胞欠損動物において観察されるので、Ｔ細胞非依存的なモデルであると考えられる。
これらのＴＮＢＳ又はＤＳＳモデルに対する可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は他のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性及び融合タンパク質の投与は、胃腸疾患の症状を改善し、経過を変えるための可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の使用を評価するために使用することができる。さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１によるＩＬ-１７Ｃの阻害を示す結果は、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又はそれに対する抗体などの他のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストを用いても、大腸炎／ＩＢＤモデルにおいて症状を改善し、疾病経過を変えることができるという概念の証明となる。
４.乾癬
乾癬は、７００万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼす慢性的な皮膚症状である。乾癬は新たな皮膚細胞が異常に増殖する場合に起こり、古い皮膚が十分迅速に剥離しなかった場合に皮膚の炎症、腫脹、鱗状班を生じる。最も多い形態である尋常性乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた皮膚の炎症を起こした瘢痕(病斑)を特徴とする。乾癬は、少数のプラークに限られる場合あるし、最も一般的には頭皮、膝、肘、及び体幹に見られる皮膚の中程度〜広範な領域を含む場合もある。乾癬は目に付きやすいが、接触伝染病ではない。疾患の病因は、罹患組織の慢性的な炎症を含む。ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、又は結合パートナーは、乾癬、その他の炎症性皮膚疾患、皮膚及び粘膜のアレルギー、並びに関連疾患の炎症及び病理学的作用を軽減するために有用な治療薬として役立ち得る。
乾癬は、Ｔ細胞を媒介とする炎症性の皮膚疾患であり、かなりの不快感を生じる場合がある。治療法がなく、あらゆる年齢層に罹患する疾患である。乾癬は、欧州及び北アメリカの人口の約２パーセントに影響を及ぼしている。軽度の乾癬であれば、多くの場合、局所薬剤で疾患を抑えることができるが、世界中で１,０００,０００人を超える患者が、紫外線又は全身的な免疫抑制治療を必要としている。残念なことに、紫外線照射の不快感及び危険性、並びに多くの治療の毒性は、これらの長期使用を限られたものとする。さらに、患者は、免疫抑制療法を止めた後しばらくすると、通常、乾癬が再発し、場合によってはリバウンドが起こる。
ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体ポリペプチド及びそれに対する抗体はまた、診断系において、ＩＬ-１７Ｃリガンドの循環レベルの検出のため、及び急性期炎症性応答に関連するＩＬ-１７Ｃの検出において、使用することもできる。関連の実施形態では、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体と特異的に結合する抗体又は他の薬剤を用いて、循環中の受容体ポリペプチドを検出することができ、また逆に、ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体自体を用いて、循環中の、又は局部的に作用しているＩＬ-１７Ｃポリペプチドを検出することもできる。リガンド又は受容体ポリペプチドの上昇レベル又は抑制レベルは、炎症又は癌を含む病態の指標となり得る。さらに、ＩＬ-１７Ｃなどの急性期タンパク質又は分子の検出は、特定の病態(例えば、喘息、乾癬、関節リウマチ、大腸炎、ＩＢＤ)における慢性炎症性症状の指標となり得る。このような症状の検出は疾病診断の助けとなるとともに、医師が適切な治療を選択する助けともなる。
本明細書に記載の他の疾患モデルの他、ヒト乾癬病巣由来の炎症組織に対する、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１及び／又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の活性は、いくつかの複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスモデルを用い、in vivoにおいて測定することができる。免疫不全マウスにヒト細胞が移植される(異種移植モデルと総称される)いくつかのマウスモデルが開発されている、例えば、Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994及びFlavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996参照のこと。乾癬のin vivo異種移植モデルとしては、ＳＣＩＤマウスモデルにヒト乾癬皮膚組織を移植し、適当なアンタゴニストで刺激されたものである。さらに、ＡＧＲ１２９マウスモデルに移植され、適当なアンタゴニストで刺激されたヒト乾癬皮膚移植片などのＩＬ-１７Ｃアンタゴニストを評価するために、当技術分野における他の乾癬動物モデルを用いてもよい(例えば、Boyman, O.ら, J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004を参照のこと、当該文献は本明細書に援用される)。ＩＬ-１７Ｃと結合し、ＩＬ-１７Ｃの活性を遮断、阻害、低下、拮抗、又は中和する可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体が好ましいアンタゴニストであるが、抗ＩＬ-１７Ｃ、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、並びに他のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストをもこのモデルで使用することができる。同様に、ＳＣＩＤモデルにおいてヒト大腸炎、ＩＢＤ、関節炎、又は他の炎症病巣に由来する組織又は細胞を用い、本明細書に記載のＩＬ-１７Ｃアンタゴニストの抗炎症性特性を評価することができる。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又はその誘導体、アゴニスト、コンジュゲート又は変異体を用いて炎症を無効にする、遅延させる、又は軽減するように設計した治療は、ヒト炎症性組織(例えば、乾癬病変など)を有するＳＣＩＤマウス、又は本明細書に記載の他のモデルに抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１化合物を投与することによって試験することができる。治療有効性は、当技術分野に周知の方法を用いて経時的に、治療集団で上昇する抗炎症性作用として測定され、統計学的に評価される。いくつかの方法例として、限定されるものではないが、例えば、乾癬モデルにおける、表皮の厚さ、皮膚上層における炎症細胞の数、及び錯角化の程度の測定が挙げられる。このような方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。例えば、Zeigler, M.ら, Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M.ら, J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N.ら, Microbio.l Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P.ら, Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. Hら, Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. Hら, J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J.ら, Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. Hら, J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M.ら, J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998;及びVilladsen L.S.ら, J. Clin. Invest. 112:1571, 2003参照のこと。炎症はまた、フローサイトメトリー(又はＰＣＲ)などの周知の方法を用いて経時的にモニタリングし、サンプル中に存在する炎症細胞又は病巣細胞の数、ＩＢＤのスコア(体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ)、ＣＩＡ ＲＡモデルのパウ(paw)疾病スコア及び炎症スコアを定量することができる。例えば、このようなモデルで試験するのに好適な治療戦略としては、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体、他のＩＬ１７-Ｃアンタゴニスト若しくは関連するコンジュゲート、又は可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１とそのリガンドＩＬ-１７Ｃとの相互作用を破壊することに基づくアンタゴニストを用いた直接的な治療、或いは可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体若しくはその誘導体、アゴニスト、コンジュゲート、又は変異体を利用する細胞に基づく治療が挙げられる。
さらに、乾癬は、過形成上皮ケラチノサイト及び炎症性単核細胞、例えば、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞、好中球及びマクロファージなどに関連する慢性炎症性皮膚疾患である(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。現在のところ、環境中の抗原は疾病病理の誘導及び寄与に重要な役割を果たすと考えられている。しかし、乾癬の病理に介在すると考えられることは、自己抗原に対する抵抗性の欠如である。樹状細胞及びＣＤ４+Ｔ細胞は、その病理に至る免疫応答を媒介する抗原提示と認識に重要な役割を果たすと考えられている。本発明者らは最近、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ導入モデルに基づく乾癬モデルを開発した(Davenportら, Internat. Immunopharmacol., 2:653-672)。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体をマウスに投与する。疾病スコア(皮膚病巣、炎症性サイトカイン)の阻害は、乾癬におけるＩＬ-１７Ｃアンタゴニスト、例えば、抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又はＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体の有効性を示す。
５.アトピー性皮膚炎(Atopic Dermatitis)
ＡＤは、ヘルパーＴ細胞サブセット２(Ｔｈ２)の過剰活性化サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症性疾患である。ＡＤの厳密な病因論は未知であるが、活性過剰のＴｈ２免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲン、及び遺伝的素因を含む複数の因子が関連づけられている。この疾患の重要な特徴としては、乾燥症(皮膚の乾燥)、そう痒(皮膚のかゆみ)、結膜炎、炎症性皮膚病巣、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染、血中好酸球の増加、血清ＩｇＥ及びＩｇＧ１の上昇、並びにＴ細胞、肥満細胞、マクロファージ及び好酸球の浸潤を伴う慢性皮膚炎が挙げられる。黄色ブドウ球菌の定着又は感染は、ＡＤを増悪させ、この皮膚疾患の慢性化を永続させると認識されている。
ＡＤは、喘息及びアレルギー性鼻炎の患者で見られることが多く、アレルギー性疾患の初期徴候である場合が多い。西洋諸国の人口の約２０％がこれらのアレルギー性疾患に罹患しており、理由は分かっていないが、先進国のＡＤ罹患率は上昇している。ＡＤは一般に小児期に発症し、青年期から成人期へと持続する場合も多い。ＡＤに対する現行の治療は、局所用コルチコステロイド、経口用シクロスポリンＡ、非コルチコステロイド免疫抑制剤、例えば、タクロリムス(軟膏型ＦＫ５０６)、及びインターフェロン-γが挙げられる。多様なＡＤ治療があるにもかからず、多くの患者の症状は改善しなかったり、投薬に有害な反応を示したりし、他のより有効な治療薬の探索が必要である。本発明の中和抗ヒトＺｃｙｔｏＲ２１抗体をはじめとする、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド及び抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、本明細書で開示されるアトピー性皮膚炎、炎症性皮膚症状、及び他の炎症性症状など、特定のヒト疾患においてＩＬ-１７Ｃを中和するために使用することができる。
Ｋ)ＺｃｙｔｏＲ２１の医薬使用
医薬使用のため、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体は、常法に従い、非経口送達、特に静脈送達又は皮下送達用に処方される。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプ又は他の適当な技術を用いた制御放出、又は一般に１〜数時間の点滴による。一般に、医薬製剤は、造血系タンパク質を、生理食塩水、緩衝生理食塩水、５％デキストロース水溶液などの医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて含む。製剤はさらに、１以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどを含んでもよい。このような併用療法を用いる場合、サイトカインは単一の製剤中に組み合わせてもよいし、あるいは別個の製剤で投与してもよい。処方方法は当技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990に開示されている。当該文献は本明細書に援用される。治療用量は一般に０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日、好ましくは、０.５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、正確な用量は、医師により、治療する症状の性質及び重篤度、患者の形質などを考慮し、受け入れられている標準法に従って決定される。用量の決定は当業者の水準の範囲内である。これらのタンパク質は一般に、化学療法又は骨髄移植後２８日まで、又は血小板総数が＞２０,０００／ｍｍ3、好ましくは、＞５０,０００／ｍｍ3に達するまでの期間投与される。より一般的には、これらのタンパク質は、１週間以下、多くの場合には１〜３日間投与される。一般に、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の治療上有効な量は、リンパ系細胞又は骨髄前駆体細胞の増殖、及び／又は成熟細胞(例えば、血小板又は好中球)の循環レベルの増加として現れる分化に臨床上有意な増加をもたらすに十分な量である。よって、血小板障害の処置は、血小板総数が少なくとも２０,０００／ｍｍ3、好ましくは、５０,０００／ｍｍ3に達するまで続ける。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体はまた、ＩＬ-３、-６及び-１１などの他のサイトカイン；幹細胞因子；エリスロポエチン；Ｇ-ＣＳＦ及びＧＭ-ＣＳＦと組み合わせて投与することもできる。併用療法の投与計画の範囲内で、他のサイトカインの一日用量は、一般に、ＥＰＯでは１５０Ｕ／ｋｇ、ＧＭ-ＣＳＦでは５〜１５１ｇ／ｋｇ、ＩＬ-３では１〜５１ｇ／ｋｇ、及びＧ-ＣＳＦでは１〜２５１ｇ／ｋｇである。例えば、ＥＰＯレベルの低い貧血患者においては、ＥＰＯとの併用療法が指示される。
一般に、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１(又はＺｃｙｔｏＲ２１類似体若しくは融合タンパク質)又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、健康状態及び過去の病歴などの因子によって異なる。一般には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ(薬剤量／患者の体重)の範囲の量の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、状況によってはより低い、又はより高い用量を投与してもよい。
被験者への可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸腔内、くも膜下腔内、留置カテーテルを介した灌流、又は直接的局部注射によるものであってよい。治療用タンパク質を注射によって投与する場合、投与は持続的注入又は単回若しくは多回ボーラスによるものであってもよい。
その他の投与経路としては、経口、粘膜、肺、及び経皮経路が挙げられる。経口送達はポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、タンパク質様マイクロスフェア、ポリシアノアクリレートマイクロスフェア、及び脂質に基づく系に好適である(例えば、DiBase and Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 255-288 (Plenum Press 1997)参照)。鼻腔内送達の実現可能性は、このようなインスリン投与様式によって例示される(例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999) 参照)。可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体を含む乾燥又は液体粒子は、乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置、又はネブライザーの助けを借りて調製及び吸入することができる(例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Pattonら, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺へ送達するハンドヘルド式電動吸入器であるＡＥＲＸ糖尿病管理システムによって例示される。研究では、４８,０００ｋＤａという大きなタンパク質が、経皮投与の実現可能性を例示する低周波超音波の補助で、皮膚から治療的濃度で送達されたことが示された(Mitragotriら, Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いた経皮送達は、ＺｃｙｔｏＲ２１結合活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する(Pottsら, Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997))。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方することができ、それにより、治療用タンパク質が混合物として医薬として許容される担体と配合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得るならば「医薬として許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬として許容される担体の一例である。他の好適な担体も当業者に周知である。例えば、Gennaro (編), Remington's Pharmaceutical Sciences, 第19版 (Mack Publishing Company 1995)参照のこと。
治療目的では、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体分子と医薬として許容される担体は、治療上有効な量で患者に投与される。本発明の治療分子と医薬として許容される担体の組合せは、その投与量が生理学的に有意であれば「治療上有効な量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理状態に検出可能な変化をもたらすならば、生理学的に有意である。例えば、炎症を処置するために用いられる薬剤は、その存在が炎症性応答を緩和させるならば、生理学的に有意である。
ＺｃｙｔｏＲ２１(又はＺｃｙｔｏＲ２１類似体若しくは融合タンパク質)又は中和抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体を含む医薬組成物は液体形態、エアロゾル、又は固体形態で提供することができる。液体形態は、注射溶液及び経口懸濁液により例示される。固体形態の例としては、カプセル剤、錠剤、及び徐放性形態が挙げられる。徐放性形態は、ミニ浸透圧ポンプ及びインプラントにより例示される(Bremerら, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremerら, “Protein Delivery with Infusion Pumps,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yeweyら, “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。
リポソームは、治療用ポリペプチドを被検者に静脈内投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、若しくは経口投与、吸入、又は鼻内投与を介して送達するための一手段を提供する。リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む１以上の脂質二重層からなる微細な小胞である(一般に、Bakker-Woudenbergら, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1)：S61 (1993)、Kim, Drugs 46：618 (1993)、及びRanade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,”in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 3-24 (CRC Press 1995)参照)。リポソームは細胞膜に組成が類似し、その結果、安全に投与することができ、なおかつ、生分解性である。製造方法に応じて、リポソームは単層とすることも多層とすることもでき、また、リポソームは０.０２μｍ〜１０μｍを超える直径範囲で大きさを変更することができる。種々の薬剤をリポソーム内、すなわち、二重層内の疎水性物質の区画及び内側の水性空間内の親水性物質の区画内に、封入することができる(例えば、Machyら, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987)、及びOstroら, American J. Hosp. Pharm. 46：1576 (1989)参照)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、並びにリポソームの電荷及び表面特性を変化させることによって、封入された薬剤の治療的アベラビリティーを制御することができる。
リポソームは、事実上どんな種類の細胞にも吸着し、次いで封入された薬剤をゆっくり放出することができる。あるいは、吸収されたリポソームは、細胞によるエンドサイトーシス、すなわち食作用を受ける。エンドサイトーシスに引き続いて、リポソームの脂質はリソソーム内で分解され、封入された薬剤が放出される(Scherphofら, Ann. N.Y. Acad. Sci. 446：368 (1985))。静脈内投与後、小さいリポソーム(０.１〜１.０μｍ)は、一般に、主として肝臓及び脾臓に存在する網内皮系の細胞により取り込まれるが、３.０μｍよりも大きなリポソームは肺に沈着する。細網内皮系の細胞による、より小さいリポソームのこの優先的な取り込みは、化学療法薬をマクロファージに、及び肝臓の腫瘍に送達するために使用されてきた。
細網内皮系は、大用量のリポソーム粒子での飽和、又は薬理学的手段による選択的なマクロファージの不活性化を含むいくつかの方法により迂回することができる(Claassenら, Biochim. Biophys. Acta 802：428 (1984))。さらに、リポソーム膜への糖脂質又はポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の組込みは、細網内皮系による取り込みを有意に減少させることが示された(Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1068：133 (1991)；Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1050：9 (1993))。
また、リポソームは、リン脂質組成を変化させるか、又はリポソームの中に受容体若しくはリガンドを挿入することによって、特定の細胞又は器官をターゲッティングするように調製することもできる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームを使用して、肝臓をターゲッティングすることができる(Hayakawaら, 日本国特許第０４-２４４,０１８号；Katoら, Biol. Pharm. Bull. 16：960 (1993))。これらの製剤は、ダイズのホスファチジルコリン、α-トコフェロール、及びエトキシル化硬化ヒマシ油(ＨＣＯ-６０)をメタノール中で混合し、この混合物を吸引下で濃縮し、次いでこの混合物を水で再構成することによって調製された。また、ダイズ由来ステリルグルコシド混合物(ＳＧ)及びコレステロール(Ｃｈ)を含むジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)のリポソーム製剤は、肝臓をターゲッティングすることが示された(Shimizuら, Biol. Pharm. Bull. 20：881 (1997))。
あるいは、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン、及び輸送タンパク質などの、種々のターゲッティングリガンドをリポソームの表面に結合させることもできる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面で発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体をターゲッティングすることができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14：287 (1997)；Murahasiら, Biol. Pharm. Bull. 20：259 (1997))。同様に、Wuら, Hepatology 27： 772 (1998)は、アシアロフェツインでリポソームをターゲッティングすると、リポソーム血漿半減期が短縮され、肝細胞によるアシアロフェツ標識リポソームの取り込みが著しく増強されることを示した。他方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインの前注射により阻害することができる(Murahasiら, Biol. Pharm. Bull. 20：259 (1997))。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞にターゲッティングするためのもう１つのアプローチを提供する(Kampsら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94：11681 (1997))。さらに、Gehoら, 米国特許第４,６０３,０４４号は、肝臓の特殊な代謝細胞に関連する肝胆管受容体に対して特異性を有する、肝細胞特異的リポソーム小胞送達系を記載している。
組織ターゲッティングに対するさらに一般的なアプローチでは、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的なビオチニル化抗体で標的細胞を予め標識する(Harasymら. Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 (1998))。遊離抗体を血漿排除した後、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、ターゲッティング抗体をリポソームに直接付着させる(Harasymら, Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 (1998))。
ポリペプチド及び抗体は、タンパク質のマイクロカプセル化の標準的な技術を用いて、リポソーム内に封入することができる(例えば、Andersonら, Infect. Immun. 31：1099 (1981)、Andersonら, Cancer Res. 50：1853 (1990)、及びCohenら, Biochim. Biophys. Acta 1063：95 (1991)、Alvingら, “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,”in Liposome Technology, 第2版, Vol. III, Gregoriadis (編), page 317 (CRC Press 1993)、Wassefら, Meth. Enzymol. 149：124 (1987)参照)。前述したように、治療上有用なリポソームは、種々の成分を含有していてもよい。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含んでももよい(Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1150：9 (1993))。
治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するために、分解性ポリマーのマイクロスフェアが設計された。ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーなどの分解性ポリマーからマイクロスフェアを調製し、このポリマーにタンパク質が捕捉される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6：332 (1995)；Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery：Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartusら, Science 281：1161 (1998)； Putney and Burke, Nature Biotechnology 16：153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2：548(1998))。また、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)でコーティングされたナノスフェアも、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体となり得る(例えば、Grefら, Pharm. Biotechnol. 10：167 (1997)参照)。
本発明はまた、ＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体若しくは多量体可溶性受容体、及びＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニスト、例えば抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体若しくは結合ポリペプチド、又は中和抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体などの、ＺｃｙｔｏＲ２１結合活性を有する化学的に修飾されたポリペプチドも意図し、上述のようにポリペプチドはポリマーと連結される。
例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第5版 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (編), Remington's Pharmaceutical Sciences, 第19版 (Mack Publishing Company 1995)によって、また、Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されているように、当業者ならば他の投与形態を考案することもできる。
一例として、医薬組成物は、ポリペプチドをＺｃｙｔｏＲ２１細胞外ドメイン、例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体若しくは多量体可溶性受容体、又はＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニスト(例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドと結合する抗体若しくは抗体フラグメント、又は中和抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体)とともに含有する容器を含むキットとして供給してもよい。治療用ポリペプチドは、単回若しくは複数回用の注射溶液の形態で、又は注射前に構成する無菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、治療用ポリペプチドの投与ための乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置、又はネブライザーを含むことができる。このようなキットはさらに、医薬組成物の適応と使用に関する説明書を含んでもよい。さらにまた、このような説明書には、ＺｃｙｔｏＲ２１組成物が、ＺｃｙｔｏＲ２１に対して過敏感反応を示すことが分かっている患者には禁忌であるという記載を含んでもよい。
抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体若しくは結合パートナー(又は抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体フラグメント、抗体融合、ヒト化抗体など)、又はＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾル、又は固体形態で提供することができる。液体形態は、注射溶液、エアロゾル、滴剤、位相溶液(topological solution)及び経口懸濁液により例示される。固体形態の例としては、カプセル剤、錠剤、及び徐放性形態が挙げられる。徐放性形態は、ミニ浸透圧ポンプ及びインプラントにより例示される(Bremerら, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremerら, “Protein Delivery with Infusion Pumps,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yeweyら, “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。他の固体形態としては、クリーム、ペースト、他の位相適用などが挙げられる。
リポソームは、治療用ポリペプチドを被検者に静脈内投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、若しくは経口投与、吸入、又は鼻内投与を介して送達するための一手段を提供する。リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む１以上の脂質二重層からなる微細な小胞である(一般に、Bakker-Woudenbergら, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1)：S61 (1993)、Kim, Drugs 46：618 (1993)、及びRanade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,”in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 3-24 (CRC Press 1995)参照)。リポソームは細胞膜に組成が類似し、その結果、安全に投与することができ、なおかつ、生分解性である。製造方法に応じて、リポソームは単層とすることも多層とすることもでき、また、リポソームは０.０２μｍ〜１０μｍを超える直径範囲で大きさを変更することができる。種々の薬剤をリポソーム内、すなわち、二重層中の疎水性物質の区画及び内側の水性空間内の親水性物質の区画内に、封入することができる(例えば、Machyら, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987)、及びOstroら, American J. Hosp. Pharm. 46：1576 (1989)参照)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、並びにリポソームの電荷及び表面特性を変化させることによって、封入された薬剤の治療的アベラビリティーを制御することができる。
リポソームは、事実上どんな種類の細胞にも吸着し、次いで封入された薬剤をゆっくり放出することができる。あるいは、吸収されたリポソームは、細胞によるエンドサイトーシス、すなわち食作用を受ける。エンドサイトーシスに引き続いて、リポソームの脂質はリソソーム内で分解され、封入された薬剤が放出される(Scherphofら, Ann. N.Y. Acad. Sci. 446：368 (1985))。静脈内投与後、小さいリポソーム(０.１〜１.０μｍ)は、一般に、主として肝臓及び脾臓に存在する網内皮系の細胞により取り込まれるが、３.０μｍよりも大きなリポソームは肺に沈着する。細網内皮系の細胞による、より小さいリポソームのこの優先的な取り込みは、化学療法薬をマクロファージに、及び肝臓の腫瘍に送達ために使用されてきた。
細網内皮系は、大用量のリポソーム粒子での飽和、又は薬理学的手段による選択的なマクロファージの不活性化を含むいくつかの方法により迂回することができる(Claassenら, Biochim. Biophys. Acta 802：428 (1984))。さらに、リポソーム膜への糖脂質又はポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の組込みは、細網内皮系による取り込みを有意に減少させることが示された(Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1068：133 (1991)；Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1050：9 (1993))。
また、リポソームは、リン脂質組成を変化させるか、又はリポソームの中に受容体若しくはリガンドを挿入することによって、特定の細胞又は器官をターゲッティングするように調製することもできる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームを使用して、肝臓をターゲッティングすることができる(Hayakawaら, 日本国特許第０４-２４４,０１８号；Katoら, Biol. Pharm. Bull. 16：960 (1993))。これらの製剤は、ダイズのホスファチジルコリン、α-トコフェロール、及びエトキシル化硬化ヒマシ油(ＨＣＯ-６０)をメタノール中で混合し、この混合物を吸引下で濃縮し、次いでこの混合物を水で再構成することによって調製された。また、ダイズ由来ステリルグルコシド混合物(ＳＧ)及びコレステロール(Ｃｈ)を含むジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)のリポソーム処方物は、肝臓をターゲッティングすることが示された(Shimizuら, Biol. Pharm. Bull. 20：881 (1997))。
あるいは、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン、及び輸送タンパク質などの、種々のターゲッティングリガンドをリポソームの表面に結合させることもできる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面で発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体をターゲッティングすることができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14：287 (1997)；Murahasiら, Biol. Pharm. Bull. 20：259 (1997))。同様に、Wuら, Hepatology 27： 772 (1998)は、アシアロフェツインでリポソームをターゲッティングすると、リポソーム血漿半減期が短縮され、肝細胞によるアシアロフェツ標識リポソームの取り込みが著しく増強されることを示した。他方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインの前注射により阻害することができる(Murahasiら, Biol. Pharm. Bull. 20：259 (1997))。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞にターゲッティングするためのもう１つのアプローチを提供する(Kampsら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94：11681 (1997))。さらに、Gehoら, 米国特許第４,６０３,０４４号は、肝臓の特殊な代謝細胞に関連する肝胆管受容体に対して特異性を有する、肝細胞特異的リポソーム小胞送達系を記載している。
組織ターゲッティングに対するさらに一般的なアプローチでは、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的なビオチニル化抗体で標的細胞を予め標識する(Harasymら. Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 (1998))。遊離抗体を血漿排除した後、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、ターゲッティング抗体をリポソームに直接付着させる(Harasymら, Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 (1998))。
抗ＺｃｙｔｏＲ２１中和抗体、及びＩＬ-１７Ｃ結合活性を有する結合パートナー、又はＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体は、タンパク質のマイクロカプセル化の標準的な技術を用いて、リポソーム内に封入することができる(例えば、Andersonら, Infect. Immun. 31：1099 (1981)、Andersonら, Cancer Res. 50：1853 (1990)、及びCohenら, Biochim. Biophys. Acta 1063：95 (1991)、Alvingら, “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,”in Liposome Technology, 第2版, Vol. III, Gregoriadis (編), page 317 (CRC Press 1993)、Wassefら, Meth. Enzymol. 149：124 (1987)参照)。前述したように、治療上有用なリポソームは、種々の成分を含有していてもよい。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含んでももよい(Allenら, Biochim. Biophys. Acta 1150：9 (1993))。
治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するために、分解性ポリマーのマイクロスフェアが設計された。ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーなどの分解性ポリマーからマイクロスフェアを調製し、このポリマーにタンパク質が捕捉される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6：332 (1995)；Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (編), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery：Physical Systems, Sanders and Hendren (編), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartusら, Science 281：1161 (1998)； Putney and Burke, Nature Biotechnology 16：153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2：548(1998))。また、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)でコーティングされたナノスフェアも、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体となり得る(例えば、Grefら, Pharm. Biotechnol. 10：167 (1997)参照)。
本発明はまた、化学的に修飾された抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又は結合パートナー、例えば、上述のようにポリマーと連結された抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体又はＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体も意図する。
例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第5版 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (編), Remington's Pharmaceutical Sciences, 第19版 (Mack Publishing Company 1995)によって、また、Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されているように、当業者ならば他の投与形を送達することもできる。
本発明は、抗ＬＬ-１７Ｃ抗体の組成物、並びに本明細書に記載の抗体、ペプチド又はポリペプチドを含む方法及び治療的使用を意図する。このような組成物はさらに、担体を含んでいてもよい。担体は、通常の有機担体又は無機担体であってよい。担体の例としては、水、バッファー溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、コーン油などが挙げられる。
Ｊ)トランスジェニックマウスの作出
トランスジェニックマウスを、全組織中で、又は組織特異的若しくは組織向性調節エレメントの制御下で、ＩＬ-１７Ｃ又はＺｃｙｔｏＲ２１のいずれかの遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作することができる。これらの過剰生産体を用いて、過剰発現から生じた表現型を同定することができ、これらのトランスジェニック動物を、過剰なＩＬ-１７Ｃ又はＺｃｙｔｏＲ２１によって引き起こされるヒト疾患のモデルとして用いることができる。これらのいずれかを過剰発現するトランスジェニックマウスはまた、大型動物の乳汁又は血液中の、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１などのＺｃｙｔｏＲ２１の産生のためのモデルバイリアクターも提供する。トランスジェニックマウスを作出する方法は当業者に周知である(例えば、Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (編), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、Monastersky and Robl (編), Strategies in Transgeni Animal Science (ASM Press 1995)、及びAbbud and Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice,” in Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (編), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)参照)。
例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作出する方法は、成体の繁殖可能な雄(種雄)(Ｂ６Ｃ３ｆ１、２〜８か月齢(Taconic Farms, Germantown, NY))、精管切除した雄(生殖不能雄)(Ｂ６Ｄ２ｆ１、２〜８か月齢、(Taconic Farms))、未成熟で繁殖可能な雌(ドナー)(Ｂ６Ｃ３ｆ１、４〜５週齢(Taconic Farms))及び成体の繁殖可能な雌(レシピエント)(Ｂ６Ｄ２ｆ１、２〜４か月齢(Taconic Farms))を用いて開始した。ドナーを１週間順化させた後、およそ８ＩＵ／マウスの妊娠ウマ血清ゴナドトロピン(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)を腹腔内注射し、４６〜４７時間後に８ＩＵ／マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ(Sigma))を腹腔内注射し、過排卵を誘導する。ホルモン注射の後、ドナーを種雄と交配させた。排卵は一般にｈＣＧ注射してから１３時間以内に起こる。交尾の成立は交配の翌朝、膣栓の存在により確認する。
受精卵は手術用スコープ下で採取する。卵管を採取し、卵をヒアルロニダーゼ(Sigma)を含有するユリンアナリシス(urinanalysis)スライドに放出させる。卵をヒアルロニダーゼ中で１回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2、５％Ｏ2、及び９０％Ｎ2でインキュベートしたWhittenのＷ６４０培地(例えば、Menino and O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986)、及びDienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996)により記載)で２回洗浄する。その後、卵を、マイクロインジェクションまで３７℃／５％ＣＯ2インキュベーター内に保存する。
ＺｃｙｔｏＲ２１コード配列を含むプラスミドＤＮＡ １０〜２０μｇを線状化し、ゲル精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、０.２５ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)中に、マイクロインジェクション用マイクロプレート当たり５〜１０ｎｇの終濃度で再懸濁させる。例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１コード配列は、配列番号３、６、９、１２、１５、２１、２３、１０９、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２２のいずれかを含むポリペプチドをコードし得る。
プラスミドＤＮＡを、温かい、ＣＯ2平衡化鉱油で覆ったＷ６４０培地の液滴中に入った採取卵中にマイクロインジェクションする。ＤＮＡをインジェクションニードル内に吸い取り(内径０.７５ｍｍ、外径１ｍｍのホウケイ酸ガラスキャピラリーから抜き取る)、個々の卵に注入する。各卵の半数性前核の一方又は両方にインジェクションニードルを穿通させる。
数ピコリットルのＤＮＡを前核に注入し、インジェクションニードルをその前核と接触しないように抜き取る。この手順を、全ての卵に注入されるまで繰り返す。マイクロインジェクションに成功した卵を、３７℃／５％ＣＯ2インキュベーター内で一晩保存するため、予めガスで処理したＷ６４０培地の入った器官組織培養皿に移す。
翌日、２細胞胚を偽妊娠レシピエント中に移す。これらのレシピエントは、精管切除した生殖不能雄と交尾させた後、膣栓の存在により確認する。レシピエントを麻酔し、背部の左側面を剃毛し、外科用顕微鏡に移す。皮膚を、膝と脾臓の間の中央、胸郭と鞍部と後脚を輪郭とする腹部領域の正中の筋肉壁に沿って小さく切開する。生殖器官を小さな外科用ドレープ上に出す。脂肪体をその外科用ドレープ上に拡げ、その脂肪体を小さな止血小鉗子(Roboz, Rockville, MD)で留め、マウスの背の上に、この器官がすべって戻らないように懸垂させておく。
鉱油の後にＷ６４０と気泡が交互に入った微細なトランスファーピペットで、前日のインジェクションから得た１２〜１７個の健康な２細胞胚をレシピエントに移植する。卵管膨大部の場所を特定し、その膨大部と交尾嚢の卵管を保持しつつ、２８ゲージの針で交尾嚢付近の卵管に、膨大部と交尾嚢が裂けないように切れ目を入れる。
この卵管の切れ目にピペットを入れ、最初の気泡をピペットから解放させつつ胚を送り込む。脂肪体を腹膜内へ静かに戻し入れ、生殖器管を滑り込ませる。腹腔壁をひと針で閉じ、皮膚を創傷クリップで閉じる。マウスを３７℃のスライドウォーマー上で最低４時間回復させる。
レシピエントをつがいごとにケージに戻し、妊娠１９〜２１日を経過させる。誕生後、離乳まで、産後１９〜２１日を経過させる。離乳個体の性別を決定し、性別毎にケージに入れ、清浄なハサミで、尾から生検０.５ｃｍを切り取る(遺伝子型分析に用いる)。
この尾の切片から、例えば、ＱＩＡＧＥＮ ＤＮＥＡＳＹキットを製造業者の使用説明書に従って用い、ゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡは、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子又は同じプラスミドに導入されている選択マーカー遺伝子を増幅するよう設計されたプライマーを用い、ＰＣＲにより分析する。動物がトランスジェニック体であることを確認した後、トランスジェニック雌を野生型雄とともに置くか、又はトランスジェニック雄を１又は２個体の野生型雌と置くことで、近交系に戻し交配する。子が生まれ、離乳したとことで性別に分け、遺伝子型分析のためにそれらの尾を切り取る。
生きている個体において導入遺伝子の発現を確認するため、部分肝切除を行う。ｚｙｐｈｏｉｄプロセス直下の腹部上部の外科標本を作製する。無菌技術を用い、胸骨の下を１.５〜２ｃｍで小さく切開し、肝左葉を体外に出す。４-０シルクを用い、下方葉が体腔外に保持されるようその周囲を接合する。吸収性のＤｅｘｏｎ(American Cyanamid; Wayne, N.J.)の第二のループが最初の接合部の近くに来るようにしつつ、非外傷性鉗子を用いて、その接合部を保持する。Ｄｅｘｏｎ接合部から離れた部分を切り取り、およそ１００ｍｇの肝組織切片を無菌のペトリ皿にのせる。この肝切片を１４ｍｌ容のポリプロピレン製丸底試験管に移し、液体窒素中で急速凍結させた後、ドライアイス上で保存する。外科術部位は縫合糸と創傷クリップで閉じ、その動物のケージを、術後２４時間、３７℃の加熱パッド上に置く。術後、動物を毎日確認し、術後７〜１０日で創傷クリップを外す。各トランスジェニックマウスについて、ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡ液相ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ連鎖反応を用いて調べる。
ＩＬ-１７Ｃ又はＺｃｙｔｏＲ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスの作出の他、これら遺伝子のいずれかの発現が異常に低いか、又は全く発現しないトランスジェニックマウスを遺伝子操作することも有用である。このようなトランスジェニックマウスは、ＩＬ-１７Ｃ又はＺｃｙｔｏＲ２１の欠損に関連する疾病の有用なモデルとなる。上述のように、ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部ガイド配列遺伝子を用いて阻害することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子の発現が十分でないトランスジェニックマウスを作出するためには、このような阻害配列をＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡにターゲッティングする。特定の遺伝子の発現が異常に低いトランスジェニックマウスを作出する方法は当業者に公知である(例えば、Wuら, “Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 205-224 (CRC Press 1997)参照)。
ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子がほとんど発現しないか、又は全く発現しないトランスジェニックマウスを作出するもう１つのアプローチは、少なくとも１つの正常なＺｃｙｔｏＲ２１対立遺伝子が非機能的ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子に置換されたマウスを作出することである。非機能的ＺｃｙｔｏＲ２１遺伝子をデザインする１つの方法は、ＺｃｙｔｏＲ２１をコードする核酸分子内に、選択マーカー遺伝子などの別の遺伝子を挿入することである。これらのいわゆる「ノックアウトマウス」を作出する標準的な方法は当業者に公知である(例えば、Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transjenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transjenic Mice, Jacob (編), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、及びWuら, “New Strategies for Gene Knockout,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 339-365 (CRC Press 1997)参照)。
以下、本発明を、非限定的な実施例によりさらに説明する。
実施例１
ＰＣＲを用いた組織パネルでのヒトＺｃｙｔｏＲ２１組織分布
ヒトＲａｐｉｄ-Ｓｃａｎ ｃＤＮＡパネルは、２４種類の成体組織で構成されており、１×、１０×、１００×、及び１０００×とする４つの異なる濃度で配列されている(Origen, Rockville, MD.)。「１０００×及び１００×」レベルのものを、ＰＣＲを用いてＺｃｙｔｏＲ２１転写についてスクリーニングした。センスプライマーは、５'非翻訳領域に対応するｃＤＮＡ領域に位置するｚｃ３９３３４(５' ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ ３')(配列番号２６)であった。アンチセンスプライマーは、３'非翻訳領域に対応するｃＤＮＡ領域に位置するｚｃ３９３３３(５'-ＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧ-Ｓ')(配列番号２７)であった。ｐｆｕ ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用い、製造業者の推奨(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて(ｒｅｄｉｌｏａｄ色素(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)、ワックスホットスタート(Molecular Bioproducts Inc. San Diego, CA)、及び１０％(終濃度)ＤＭＳＯを用いたことを除く)、ＰＣＲを適用した。増幅は次のように実施した：９４℃４分を１サイクル；９４℃３０秒、５１℃３０秒およぶ７２℃３分を４０サイクル；その後、７２℃７分を１サイクル。ＰＣＲ反応産物約１０μｌに対して、１％アガロースゲルを用いる標準的アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをサザンブロットし、それらの膜を標準的な方法により32Ｐ同位体標識したオリゴヌクレオチド、開始コドンのすぐ下流の、翻訳領域におけるｃＤＮＡ領域に位置するｚｃ４０４５８(５'-ＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＧＧ-３')(配列番号２８)を用いてハイブリダイズさせた。Ｘ線フィルムオートラジオグラフィーでは、結腸、肺、胃、胎盤、及び骨髄においてのみＺｃｙｔｏＲ２１特異的アンプリコンが示された。
実施例２
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１のクローニング
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)を、ヒトｈａｃａｔ細胞系統(皮膚由来)増幅プラスミドｃＤＮＡライブラリー鋳型１０ｎｇと、プライマー５' ＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧ ３'(配列番号１７９)及び５' ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ ３'(配列番号１８０)と、製造業者の推奨に従って、ｐｆｕ ｕｌｔｒａ ポリメラーゼとを用い、ＰＣＲによりクローニングした。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡの５'及び３'ｕｔｒ領域に位置する。得られた産物に対して分取低融点アガロースＴＡＥゲル電気泳動を行い、およそ１.３〜２.５ＫＢ領域をサイズ選択的に精製した後、ｇｅｌａｓｅ法(Epicenter)を用いて液化した。次に、この鋳型を滅菌水で１：５０希釈し、１μＬを、ＦｓｅＩ制限部位を含む５' ＣＧＴＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡ ３'(配列番号１８１)とＡｓｃＩ制限部位を含む５' ＴＧＡＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴ ３'(配列番号１８２)を用い、ネスティドＰＣＲによりｐｆｕ ｕｌｔｒａポリメラーゼを用いて増幅した。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１の翻訳領域だけを増幅する。得られた産物を脱塩し、それらのプライマーをｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ １００カラム(Clontech)を用いて排除した後、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で切断し、低融点アガロースゲルでおよそ１.３〜２.５ＫＢフラグメントについてサイズ選択した。フラグメントをｐＺＭＰ１１発現ベクターのＦｓｅＩ／ＡｓｃＩ制限部位に連結した。クローン化ＤＮＡインサートに対して配列解析を行い、クローンｄ２を明らかにした。このクローンを、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)と呼んだ。
実施例３
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４のクローニング
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号７)、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４(配列番号１０)を、ヒト成体皮膚ｃＤＮＡ(clontech)鋳型１μｌと、次のプライマー：
５'ＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧ３'(配列番号１６２)及び
５'ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ３'(配列番号１６３)と、ｐｆｕ ｕｌｔｒａ ポリメラーゼを製造業者の推奨に従って用いたＰＣＲによりクローニングした。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡの５'及び３'ｕｔｒ領域に位置する。得られた産物に対して分取低融点アガロースＴＡＥゲル電気泳動を行い、およそ１.３〜２.５ＫＢ領域をサイズ選択的に精製した後、ｇｅｌａｓｅ法(Epicenter)を用いて液化した。次に、この鋳型を滅菌水で１：５０希釈し、１μＬを、ＦｓｅＩ制限部位を含む５'ＣＧＴＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡ３'(配列番号１６４)及びＡｓｃＩ制限部位を含む５' ＴＧＡＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴ ３'(配列番号１６５)を用い、ネスティドＰＣＲによりｐｆｕ ｕｌｔｒａ ポリメラーゼを用いて増幅した。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１の翻訳領域だけを増幅する。得られた産物を脱塩し、それらのプライマーをｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ １００カラム(Clontech)を用いて排除した後、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で切断し、低融点アガロースゲルでおよそ１.３〜２.５ＫＢフラグメントについてサイズ選択した。フラグメントをｐＺＭＰ１１発現ベクターのＦｓｅＩ／ＡｓｃＩ制限部位に連結した。クローン化ＤＮＡインサートに対して配列解析を行い、クローンＦ１、Ｆ５、及びＦ６を明らかにした。これらのクローンを、それぞれ、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号７)、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４(配列番号１０)と呼んだ。
実施例４
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６及びｘ１３のクローニング
簡単に述べると、クローン病の活動期にある患者のヒト結腸から得られたｃＤＮＡを鋳型として使用した。上記鋳型１μｌを、プライマー３９３３３ ５' ＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧ ３'(配列番号５３)及び３９３３４、５' ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ ３'(配列番号５４)と、ｐｆｕ ｕｌｔｒａ ポリメラーゼを製造業者の推奨に従って用い、ＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡの５'及び３'ｕｔｒ領域に位置する。得られた産物に対して分取低融点アガロースＴＡＥゲル電気泳動を行い、約１.３〜２.５ＫＢ領域をサイズ選択的に精製した後、ｇｅｌａｓｅ法(Epicenter)を用いて液化した。精製したフラグメント２マイクロリットルを、ＺＣ ３９４２９、ＦｓｅＩ制限部位を含む５'ＣＧＴＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡ３'(配列番号６５)及びｚｃ ３９４３３、ＡｓｃＩ制限部位を含む５'ＴＧＡＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴ３'(配列番号６６)と、ｐｆｕ ｕｌｔｒａポリメラーゼを用い、ネスティドＰＣＲにより用いて増幅した。これらのプライマーは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１の翻訳領域だけを増幅する。次に、得られた産物をＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で切断し、低融点アガロースゲルで約１.３〜２.５ＫＢフラグメントについてサイズ選択し、それらのフラグメントを発現ベクター、ｐＺＭＰ１１にクローニングした。生じたコロニーのコロニーリフトを用いてＺｃｙｔｏＲ２１陽性クローンを同定し、放射性標識オリゴマー、ｚｃ ３９９４８、５'ＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣ３'(配列番号６７)とハイブリダイズさせた。１００個のヒトＺｃｙｔｏＲ２１陽性コロニーをＤＮＡ配列決定にまわし、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号２０及び２１)及びヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３(配列番号１０６及び１０７)をはじめとする、様々な異なるＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡを明らかにした。
実施例５
マウスＺｃｙｔｏＲ２１のクローニング
ＺｃｙｔｏＲ２１の推定全長マウスｃＤＮＡ配列を、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１の配列(配列番号６)との相同性を用いて、コンピューターによる方法及び生物情報学的方法によって同定した。この配列をＢｌａｓｔクエリに使用し、可能性のある全長マウスクローンを同定して、IMAGE consortiumクローンの製造供給元を通じて購入した。このようにして、ＩＭＡＧＥ ＩＤ番号５３１９４８９、４４５７１５９、６３１１５６８、及び４４８２３６７に対応するクローンを購入し(American Type Culture Collection, Manassas, VA)、それら全てを配列決定した。これらの配列を解析することにより、マウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ５(配列番号６８及び６９)及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号１３及び１４)と呼ばれる、この遺伝子の２つのイソ型が同定された。
実施例６
マウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１５のクローニング
マウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１５(配列番号１１０及び１１１)をクローニングするために、人為的に誘導された大腸炎を有するマウス(下記実施例４２に記載)の結腸から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを標準的な方法を用いて逆転写し、第一鎖ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡおよそ５０ｎｇを、プライマー５１３８８ ５' ＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＴ ３'(配列番号７０)及び５１３８７ ５' ＧＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＡ ３'(配列番号７１)並びにｐｆｕ ｕｌｔｒａポリメラーゼを製造業者の推奨に従って用い、ＰＣＲにより増幅した。得られた産物に対して分取低融点アガロースＴＡＥゲル電気泳動を行い、約１.３〜２.５ＫＢ領域をサイズ選択的に精製した後、ｇｅｌａｓｅ法(Epicenter)を用いて液化した。精製したフラグメントおよそ５μｌを、上記と同じプライマーを用い、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによりｐｆｕ ｕｌｔｒａ ポリメラーゼ及び５'Ｔオーバーハングを付加するＡｄｖａｎｔａｇｅ２ ２ポリメラーゼ(Clontech)を用いて増幅し、これによりそれらのｐＣＲ４ＴＯＰＯ(Invitrogen)へのサブクローニングを可能にした。サブクローニングの前に、アンプリコンを上記のようにもう一度サイズ選択した。コロニーリフトを用いて陽性のものを同定し、放射性標識オリゴマー５１６０２ ５' ＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＡＴＡＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣ ３'(配列番号７２)とハイブリダイズさせた。１００個のマウスＺｃｙｔｏＲ２１陽性コロニーをＤＮＡ配列決定にまわし、マウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１５(配列番号１１０及び１１１)をはじめとする、様々な異なるＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡを明らかにした。
実施例７
ヒトＩＬ-１７Ｃのクローニング
推定ＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡのフラグメントをコンピューターによる手段によって同定し、ＰＣＲプライマーｚｃ１８６３４(５' ａｔｇａｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃｃａｃａｇａａｇｃ ３')(配列番号２９)及びｚｃ１８６３５(５' ｇｇａｃｇｔｇｇａｔｇａａｃｔｃｇｇｔｇｔｇｇ ３')(配列番号３０)を合成し、それらを用いて、ＰＣＲにより、ＩＬ-１７Ｃについての多数の可能性あるクローニング起源を調べた。ＰＣＲ条件は次の通りである：製造業者の使用説明書に従って、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット(Clontech, Palo Alto, CA)を用い、Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑポリメラーゼ及びバッファー(Takara, Otsu, Shiga, Japan)を、唾液腺、脊髄、ＭＣＦ-７細胞系統、ＣａＣｏ２細胞系統、Ｔ４７Ｄ細胞系統、Ｍｏｌｔ-４細胞系統、及び前立腺由来のＲＮＡから作製されたｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ鋳型５μｌを含むＰＣＲ反応物５０μｌに使用した。また、各反応液は、１０×ＰＣＲバッファー２.５μｌ、Ｒｅｄｉ-Ｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)２.５μｌ、２.５ｍＭ ＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰｓ(Applied Biosystems, Foster City, CA)２μｌ、ＥｘＴａｑ ０.５μｌ、２０ｐｍ／μｌ ｚｃ１８６３４及びｚｃ１８６３５ ０.５μｌを含み、水を加えて５０μｌにした。サイクル条件は：９４℃１分；９４℃２０秒、６８℃１分を３０サイクル；その後、７２℃７分を１サイクルとした。
ＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、そのゲルから約２００ｂｐフラグメントを切り出し、製造業者の説明書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出スピンカラム(Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製した。次に、このフラグメントを配列決定し、それがＩＬ-１７Ｃであることを確認した。次に、自所で増幅した胎児肺ライブラリー由来のＤＮＡにおいて、標準的な５'及び３'ｎｅｓｔｅｄ ＲＡＣＥ反応を行い、重複ＰＣＲフラグメントを作製し、これらの配列により、ＩＬ-１７Ｃの完全オープンリーディングフレーム、並びにいくつかの５'及び３'非翻訳配列の解明が可能となった。
最後に、ｚｃ２１６０７(５'ｇｃａｃａｃｃｔｇｇｃｇｇｃａｃｃａｔｇａｃ３')(配列番号３１)及びｚｃ２１５９７(５'ｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａｃｇｇｇｇａａｔｇ３')(配列番号３２)を用いて、自所で増幅した胎児肺ライブラリーのＤＮＡから、ＰＣＲにより、ＩＬ-１７Ｃの完全オープンリーディングフレーム、並びにいくつかの３'非翻訳領域を含むｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は次の通りである：Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ試薬(Clontech, Palo Alto, CA)を、鋳型５μｌ、１０×ＰＣＲバッファー５μｌ、Ｒｅｄｉ-Ｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)５μｌ、２.５ｍＭ ＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰｓ(Applied Biosystems, Foster City, CA)４μｌ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス １μｌ、ＧＣ-ｍｅｌｔ(Clontech, Palo Alto, CA)５μｌ、ＤＭＳＯ ２.５μｌ、２０ｐｍ／μｌ ｚｃ２１６０７及びｚｃ２１５９７ １μｌを含み、水を加えて５０μｌにしたＰＣＲ反応物５０μｌに使用した。サイクル条件は：９４℃１分；９４℃２０秒、６８℃１分３０秒を２５サイクル；その後、７２℃５分を１サイクルとした。ＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、そのゲルから〜７７０ｂｐフラグメントを切り出し、製造業者の説明書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出スピンカラム(Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製した。
このフラグメントを、製造業者の使用説明書に従って、ＴＡクローニングベクター、ＰＣＲ２.１(Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブクローニングし、配列決定し、重複ＲＡＣＥ産物の配列及び現存するヒト公開ゲノム配列と比較して、潜在的ＰＣＲエラーを確認した。正確なクローンを保管し、さらなる研究用に使用した。
実施例８
マウスＩＬ-１７Ｃの同定及びクローニング
ＮＣＢＩムス・ムスクルス(Mus musculus)ｍＲＮＡ受託番号ＸＭ １４６５５８及び自所のコンピューターによる遺伝子予測モデルに基づき、マウスＩＬ１７ＣのｃＤＮＡを、マウスゲノムＤＮＡ(Clonetechカタログ番号６６５０-１、ロット番号００５０３１０)由来の推定エキソンのＰＣＲにより作製した。エキソン２ＰＣＲ産物は、プライマー４９９１０：５'ＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧ３'(配列番号７３)及び４４９９１：５'ＧＴＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡ３'(配列番号７４)を用いて作製した。エキソン３ＰＣＲ産物は、プライマー４９９１２：５'ＧＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣ３'(配列番号７５)及び４９９１３：５'ＴＣＡＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡ３'(配列番号７６)を用いて作製した。次に、エキソン１及び全ｃＤＮＡを、エキソン２及び３のＰＣＲ産物をプライマー４９９５９：５'ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴ３'(配列番号７７)とともに用いて、クロスオーバーＰＣＲ反応により増幅した。配列確認のため、得られた、マウスＩＬ-１７Ｃ(配列番号１９)をコードするＰＣＲ産物をＰＣＲ ＩＩ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯベクターにクローニングした。
実施例９
アデノウイルス構築物を用いたＩＬ-１７Ｃの発現
非タグ付組換えアデノウイルスの作製
ヒトＩＬ-１７Ｃのタンパク質コード領域(配列番号１６)を、５'及び３'末端に、それぞれ、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位(AscI restriction sties)を付加したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーＺＣ２１９２５(５'ｃａｃａｃａｇｇｃｃｇｇｃｃａｃｃａｔｇａｃｇｃｔｃｃｔｃｃｃｃｇｇｃｃｔｃｃ３')(配列番号３７)及びＺＣ２１９２２(５'ｃａｃａｃａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔｃａｃａｃｔｇａａｃｇｇｇｇｃａｇｃａｃｇｃ３')(配列番号３８)を、全長マウスＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡを含むｐＣＲ２.１ ｔａプラスミドとともに、次のようなＰＣＲ反応で使用した：９５℃５分を１サイクル；９５℃０.５分、５８℃０.５分、及び７２℃０.５分を１８サイクル；その後、７２℃７分；その後、４℃で浸漬。このＰＣＲ反応産物をＴＡＥバッファー中１.２％(低融点)ＳＥＡＰＬＡＱＵＥ ＧＴＧ(FMC BioProducts; Rockland, ME)ゲルに流した。そのゲルからＩＬ-１７Ｃ ＰＣＲ産物を切り出し、６５℃で融解し、フェノールで２回抽出した後、エタノールで沈殿させた。次に、このＰＣＲ産物をＦｓｅＩ-ＡｓｃＩで切断し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、再水和させた(Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ、ｐＨ８)。
次に、このＩＬ-１７Ｃフラグメントを、修飾ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶのＦｓｅＩ-ＡｓｃＩ部位にライゲーションした(Heら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:2509 (1998))。この構築物は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)マーカー遺伝子も含む。ＧＦＰ発現を駆動するＣＭＶプロモーターはＳＶ４０プロモーターと置き換えられ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルと置き換えられた。さらに、天然ポリリンカーはＦｓｅＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、及びＡｓｃＩ部位と置き換えられた。この修飾型ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶをｐＺｙＴｒａｃｋと呼んだ。ライゲーションは、ＦＡＳＴ-ＬＩＮＫ ＤＮＡライゲーション及びスクリーニングキット(EPICENTRE TECHNOLOGIES; Madison, WI)を用いて行った。ＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡを含むクローンを標準的なミニプレップ法により同定した。プラスミドを線状化するために、ｐＺｙＴｒａｃｋ ＩＬ-１７Ｃプラスミドおよそ５μｇをＰｍｅＩで切断した。線状化したプラスミドおよそ１μｇを、スーパーコイルドｐＡｄＥａｓｙ(Heら., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:2509 (1998))２００ｎｇとともにＢＪ５１８３細胞に同時形質転換した。同時形質転換は、ＢＩＯ-ＲＡＤジーンパルサー(BIO-RAD laboratories, Inc.; Hercules, CA)を用いて２.５ｋＶ、２００オーム及び２５ｍＦａにて行った。全ての同時形質転換体を２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート４つにプレーティングした。最も小さいコロニーを採取し、ＬＢ／カナマイシンで増殖させ、標準的なＤＮＡミニプレップ法により組換えアデノウイルスＤＮＡを同定した。その組換えアデノウイルスＤＮＡをＦｓｅＩ-ＡｓｃＩで切断することによりＩＬ-１７Ｃが存在することを確認した。組換えアデノウイルスミニプレップＤＮＡをＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換し、ＱＩＡＧＥＮ マキシプレップキットをキットの使用説明書の通りに用いてＤＮＡを調製した。
２９３Ａ細胞の組換えＤＮＡでのトランスフェクション
組換えアデノウイルスＤＮＡおよそ５μｇを、２０〜３０ＵのＰａｃＩを含有する反応容量１００μｌにおいて、ＰａｃＩ酵素で３７℃にて３時間切断した。切断したＤＮＡを等量のフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈殿させた。そのＤＮＡペレットを蒸留水５μｌに再懸濁させた。前日に接種し、集密度６０〜７０％まで増殖させたＱＢＩ-２９３Ａ細胞(Quantum Biotechnologies, Inc.; Montreal, Quebec, Canada)のＴ２５フラスコを、ＰａｃＩで切断したＤＮＡでトランスフェクトした。ＰａｃＩで切断したＤＮＡは、滅菌ＨＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ)で全量５０μｌまで希釈した。別のチューブにおいて、２５μｌ ＤＯＴＡＰ(１ｍｇ／ｍｌ；Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN)をＨＢＳで全量１００μｌに希釈した。そのＤＯＴＡＰにＤＮＡを加え、ピペットで上下することにより穏やかに混合し、室温で１５分間放置した。２９３Ａ細胞から培地を除去し、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(LIFE TECHNOLOGIES, Inc)、０.１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸(LIFE TECHNOLOGIES, Inc)及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー(LIFE TECHNOLOGIES, Inc)を含有する血清フリーＭＥＭａｌｐｈａ(LIFE TECHNOLOGIES, Inc; Rockville, MD)５ｍｌで洗浄した。その２９３Ａ細胞に血清フリーＭＥＭ ５ｍｌを加え、３７℃にて維持した。２９３Ａ細胞のＴ２５フラスコにＤＮＡ／脂質混合物を滴下し、穏やかに混合し、３７℃にて４時間インキュベートした。４時間後、ＤＮＡ／脂質混合物を含む培地を吸引除去し、５％ウシ胎児血清を含有する完全ＭＥＭ ５ｍｌに交換した。トランスフェクションされた細胞を緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)発現及び点状局在(foci)形成についてモニタリングした。
２９３Ａ細胞を組換えアデノウイルスＤＮＡでトランスフェクションして７日後、それらの細胞はＧＦＰタンパク質を発現し、点状局在を形成し始めた。これらの点状局在はウイルス「プラーク」であり、細胞粉砕用スクレーパーを用いることにより粗ウイルス溶解物を採取し、２９３Ａ細胞の全てを回収した。この溶解物を５０ｍｌコニカルチューブに移した。これらの細胞からウイルス粒子の大部分を放出させるために、ドライアイス／エタノール浴及び３７℃の水浴において凍結／融解サイクルを３回行った。
組換えアデノウイルス(ｒＡｄＶ)の増幅
粗溶解物を増幅して(「一次増幅」)、ＩＬ-１７Ｃ ｒＡｄＶ溶解物のワーキングストックを得た。予め２０時間調製しておいた集密に近い(８０〜９０％)２９３Ａ細胞の１０ｃｍプレート１０個各々に、粗ｒＡｄＶ溶解物２００ｍｌを加えた。これらのプレートを、白色光顕微鏡下での細胞変性作用及び蛍光顕微鏡下でのＧＦＰ発現について４８〜７２時間モニタリングした。２９３Ａ細胞の全てが細胞変性作用を示した場合には、この一次増幅ストック溶解物を集め、上記のように凍結／融解サイクルを行った。
ＩＬ-１７Ｃ ｒＡｄＶの二次増幅は次のようにして得た。２９３Ａ細胞の１５ｃｍ組織培養皿２０個を、それらの細胞が集密度８０〜９０％となるように調製した。５％ＭＥＭ培地は２０ｍｌを残して除去し、各皿に一次増幅ｒＡｄｖ溶解物３００〜５００ｍｌを接種した。４８時間後、ウイルス産物から２９３Ａ細胞を溶解し、この溶解物を２５０ｍｌポリプロピレン製遠心用ボトルに集め、ｒＡｄＶを精製した。
ＡｄＶ／ｃＤＮＡ精製
粗溶解物のボトルにＮＰ-４０界面活性剤を終濃度０.５％まで加えて、全ての細胞を溶解した。ボトルを回転台の上に、ボトルを転置することなくできるだけ早く攪拌しながら１０分間置いた。残渣を２０,０００×ｇにて１５分間遠心分離することによりペレットとした。その上清を２５０ｍｌポリカーボネート製遠心用ボトルに移し、０.５容量の２０％ＰＥＧ８０００／２.５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えた。これらのボトルを一晩氷上で振盪した。これらのボトルを２０,０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清を漂白溶液中に廃棄した。沈殿したウイルス／ＰＥＧは、スピンマーク(spin mark)の各側面のボトル壁に沿った２本の縦線状に存在する白色沈殿物を呈していた。滅菌済細胞粉砕用スクレーパーを用い、２本のボトルからの沈殿物を２.５ｍｌ ＰＢＳに再懸濁させた。このウイルス溶液を２ｍｌ容の微量遠心チューブに入れ、微量遠心機で１４,０００×ｇにて１０分間遠心分離して、さらに細胞残渣を除去した。２ｍｌ容の微量遠心チューブの上清を１５ｍｌ容ポリプロピレン製スナップキャップチューブに移し、塩化セシウム(ＣｓＣｌ)で密度１.３４ｇ／ｍｌに調整した。ウイルス溶液の容量を測定し、０.５５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌを加えた。ＣｓＣｌを溶かし、この溶液１ｍｌを秤量したところ１.３４ｇであった。この溶液をポリカーボネート製厚肉遠心チューブ３.２ｍｌに移し、ＴＬＡ-１００.４ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ微量超遠心機で２５℃にて８０,０００ｒｐｍ(３４８,０００×ｇ)で３〜４時間回転させた。ウイルスは白色バンドを形成した。広口径のピペットチップを用いて、ウイルスバンドを回収した。
勾配から得たウイルスは多量のＣｓＣｌを含んでいるため、細胞とともに使用する前にこのＣｓＣｌを除去する必要がある。ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ-２５Ｍ(Amersham Pharmacia Biotech, Inc; Piscataway, NJ)がプレパックされたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ-１０カラムを使用して、ウイルス調製物を脱塩した。カラムをＰＢＳ２０ｍｌで平衡化した。ウイルスを載せ、カラムに流した。そのカラムにＰＢＳ５ｍｌを加え、８〜１０滴の画分を採取した。各画分の１：５０希釈液の光学密度を、分光光度計で２６０ｎｍにて測定した。明瞭な吸光度ピークが画分７〜１２の間に存在した。これらの画分をプールし、１：１０希釈液の光学密度(ＯＤ)を測定した。次の式を用いて、ＯＤをウイルス濃度に換算した：(２６０ｎｍでのＯＤ)(１０)(１.１×１０12)＝ビリオン／ｍｌ。ＩＬ-１７Ｃ ｒＡｄＶの１：１０希釈液のＯＤは０.２７であり、ウイルス濃度は２.８×１０12ビリオン／ｍｌであった。
ウイルスを保存するため、精製したウイルスに終濃度１５％までグリセロールを加え、穏やかにではあるが効果的に混合し、アリコートとして-８０℃にて保存した。
５０％ＣＰＥでの組織培養感染価(ＴＣＩＤ ５０)ウイルス力価アッセイ
Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Quebec, Canada)によって開発されたプロトコールに従って、組換えウイルスの感染性を測定した。簡潔に記載すると、アッセイする各組換えウイルスに関して、２つの９６ウェル組織培養プレートに、２％ウシ胎児血清含有ＭＥＭの入った各ウェルに１×１０4の２９３Ａ細胞を播種した。２４時間後、各ウイルスの１０倍希釈液１×１０-2〜１×１０-14を２％ウシ胎児血清含有ＭＥＭで作製した。各希釈液１００μｌを２０ウェルそれぞれに入れた。３７℃にて５日後、ウェルが細胞変性作用に対して陽性であるか陰性であるかを読み取り、「プラーク形成単位／ｍｌ」(ＰＦＵ)の値を算出する。
上記のQuantum Biotechnologies, Inc.の通りにＴＣＩＤ50式を作成した。使用ウイルスを１０-2〜１０-14希釈したプレートから力価を測定し、感染５日後に読み取る。各希釈液において、ウェル総数当たりの細胞変性作用に対して陽性を示すウェルの割合(Ｒ)を求める。
未希釈ウイルスサンプルの力価を算出するために、因子「Ｆ」を、まず、１＋ｄ(Ｓ-０.５)(ここで、「Ｓ」は割合(Ｒ)の合計であり、「ｄ」は希釈系列のｌｏｇ１０である(例えば、１０倍希釈系列では「ｄ」は１に等しい))として算出した。未希釈サンプルの力価は１０(1+F)＝ＴＣＩＤ50／ｍｌとして算出する。ＴＣＩＤ50／ｍｌをｐｆｕ／ｍｌに換算するため、力価(Ｔ)の計算結果の指数から０.７を差し引く。
この方法を用いると、ＩＬ-１７Ｃアデノウイルスの力価は１.３×１０10ｐｆｕ／ｍｌであった。
実施例１０
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１を発現する哺乳類発現ベクターの構築
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインの発現のために、発現ベクターＺｃｙｔｏＲ２１ＣＨＩＳを作製した。なお、この構築物は、予測される開始メチオニンからなり、予測される膜貫通ドメインの隣で末端切断されているＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドを発現するよう設計されており、Ｃ末端ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号７８)も有する。
１１６０ｂｐのＰＣＲ生成ＺｃｙｔｏＲ２１ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ５０２８２：５'ＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣ３'(配列番号７９)及びＺＣ５０２８３：５'ＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣ３'(配列番号８０)を用いて作出し、Ｅｓｐ３Ｉ制限部位及びＴｇｏ試薬(Roche, Applied Sciences, Indianapolis, IN)を付加した。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｃＤＮＡ(Clonetrack ＩＤ番号１００９８９)を含むプラスミドを鋳型として用いた。ＺｃｙｔｏＲ２１フラグメントのＰＣＲ増幅は次のようにして実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分を１５サイクル；７２℃５分を１サイクル；その後、４℃で維持。この反応物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いて精製し、製造業者のプロトコールに従って、Ｅｓｐ３Ｉ(Fermentas, Hanover, MD)で切断した。この反応物を、製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いて精製した。
切り出したＤＮＡを、Ｅｃｏ３１Ｉ(Fermentas, Hanover, MD)で切断しておいたプラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７にサブクローニングした。ｐＥｘｐｒｅｓｓ４７ベクターは天然ＺｃｙｔｏＲ２１シグナルペプチドを用い、ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号１２５)を、ＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の細胞外部分のＣ末端に付ける。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７は、クローニング部位間で３'ＨＩＳタグ及びカセットＡ(Invitrogen)と継ぎ目のない連結をするための、ｐＤＯＮＲ２２１主鎖、Ｋｏｚａｋ、ＯＲＦクローニング用Ｅｃｏ３１Ｉ部位を含むエントリーベクターである。このプラスミドはｐＵＣ複製起点、哺乳類選択マーカー発現ユニットも有する。
制限処理したＺｃｙｔｏＲ２１インサート約１０μｌと切断ベクター約７５ｎｇをＦａｓｔ ｌｉｎｋライゲーションキット(EPICENTRE technologies (Madison, WI)を用いて連結した。ライゲーション反応物２μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換し、２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。コロニーに対して、各コロニー５ｍｌの液体培養物にて配列決定を行った。クローンの挿入配列を配列解析により確認した。
ＬＲ反応は、ＬＲ反応キット(Invitrogen, Carlsbad, California)、ｐＥｘｐｒｅｓｓ ４発現ベクター約３００ｎｇ及びＺｃｙｔｏＲ２１／ｐｅｘｐｒｅｓｓ４７エントリークローン約１００〜３００ｎｇを用いて計画した。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４は、Ｇａｔｅｗａｙ変換カセットＡをｐＥＸＰＲＥＳＳ-０１のＮｒｕ Ｉ部位にクローニングすることにより作製された発現ベクターである；標準的なベクター；モジュール設計；プロモーター(Ｋｐｎ Ｉ／Ｍｆｅ)；ポリＡ(Ｘｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ)；Ｚｅｏ選択マーカー(Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｇｌ ＩＩ)；E. coli Ori(Ｂｇｌ ＩＩ／ Ｋｐｎ Ｉ)；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ カセット(Ｓｆｉ Ｉ／Ｓａｐ Ｉ)。この反応物は、５×ＬＲ反応バッファー４μｌ、トポイソメラーゼ１μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス４μｌを含み、ＴＥバッファーで最終量２０とした。２５℃にて１時間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ ２μｌを加え、３７℃にて１０分間インキュベートした。このＬＲ反応物１μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。ＰＣＲによりコロニーを選別し、そして同時にＬＢ培養液１００μｌに植菌した。
ＰＣＲは、以下を用いて計画した：Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２試薬(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)と、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ５０２０：５'ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧ３'(配列番号１２６)及びＺＣ１４０６３：５'ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴ３'(配列番号１２７)。ＺｃｙｔｏＲ２１のＰＣＲ増幅は次のように実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル；７２℃５分を１サイクル；その後、４℃で維持。４％アガロースゲル電気泳動により、予測サイズ１４６８ｂｐのバンドが見られた。液体培養物５ｍｌにＬＢクローンミックス１００μｌを接種し、振盪しながら３７℃に置いた。
製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用い、ミニプレップを行った。
実施例１１
ヒトＩＬ-１７Ｃを発現する哺乳類発現ベクターの構築
ヒトＩＬ-１７Ｃポリペプチドの発現のために、発現ベクターＩＬ-１７ＣＣＨＩＳを作製した。なお、この構築物は、予測される開始メチオニン〜停止コドンを除く最終アミノ酸からなるＩＬ-１７Ｃポリペプチドを発現するよう設計されており、Ｃ末端ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号１２８)も有する。
５９４ｂｐのＰＣＲ生成ＩＬ-１７Ｃ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ８０２０４” ５'ＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣ３'(配列番号１２９)及びＺＣ８０３００：５'ＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＧ３'(配列番号１３０)を用いて作出し、Ｅｓｐ３Ｉ制限部位及びＴｇｏ試薬(Roche, Applied Sciences, Indianapolis, IN)を、ＤＭＳＯ(Sigma, ST. Louis, MO)有り、又は無しで加えた。ＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡ(Clonetrack ＩＤ番号１００５２７)を含むプラスミドを鋳型として用いた。ＩＬ-１７ＣフラグメントのＰＣＲ増幅は次のよう実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃１５秒、４５℃３０秒、７２℃２.５分を３サイクル；さらに９４℃１５秒、６３℃３０秒、７２℃２.５分を９サイクル；７２℃５分を１サイクル；その後、４℃で維持。この反応物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いて精製し、製造業者のプロトコールに従って、Ｅｓｐ３Ｉ(Fermentas, Hanover, MD)で切断した。この反応物を、製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いて精製した。
切り出したＤＮＡを、Ｅｃｏ３１Ｉ(Fermentas, Hanover, MD)で切断しておいたプラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７にサブクローニングした。ｐＥｘｐｒｅｓｓ４７ベクターは天然ＩＬ-１７Ｃシグナルペプチドを用い、ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号１３１)をＩＬ-１７Ｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に付ける。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７は、クローニング部位間で３'ＨＩＳタグ及びカセットＡ(Invitrogen)と継ぎ目のない連結をするための、ｐＤＯＮＲ２２１主鎖、Ｋｏｚａｋ、ＯＲＦクローニング用Ｅｃｏ３１Ｉ部位を含むエントリーベクターである。このプラスミドはｐＵＣ複製起点、哺乳類選択マーカー発現ユニットも有する。
制限切断したＩＬ-１７Ｃインサート約１０μｌと切断ベクター約７５ｎｇをＦａｓｔ ｌｉｎｋライゲーションキット(EPICENTRE technologies (Madison, WI)を用いて連結した。連結反応物２μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換し、２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。コロニーに対し、各コロニーの液体培養物５ｍｌで配列決定を行った。クローンの挿入配列を配列解析により確認した。
ＬＲ反応は、ＬＲ反応キット(Invitrogen, Carlsbad, California)、ｐＥｘｐｒｅｓｓ ４発現ベクター約３００ｎｇ及びＩＬ-１７Ｃ／ｐｅｘｐｒｅｓｓ４７エントリークローン約１００〜３００ｎｇを用いて計画した。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４は、Ｇａｔｅｗａｙ変換カセットＡをｐＥＸＰＲＥＳＳ-０１のＮｒｕ Ｉ部位にクローニングすることにより作製された発現ベクターである；標準的なベクター；モジュール設計；プロモーター(Ｋｐｎ Ｉ／Ｍｆｅ)；ポリＡ(Ｘｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ)；Ｚｅｏ選択マーカー(Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｇｌ ＩＩ)；E. coli Ori(Ｂｇｌ ＩＩ／ Ｋｐｎ Ｉ)；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ カセット(Ｓｆｉ Ｉ／Ｓａｐ Ｉ)。この反応物は、５×ＬＲ反応バッファー４μｌ、トポイソメラーゼ１μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス４μｌを含み、ＴＥバッファーで最終量２０とした。２５℃にて１時間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ ２μｌを加え、３７℃にて１０分間インキュベートした。ＬＲ反応物１μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。ＰＣＲ、同時にＬＢ培養液１００μｌの接種によりコロニーをスクリーニングした。
ＰＣＲは、以下を用いて計画した：Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２試薬(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)と、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ５０２０：５'ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧ３'(配列番号１３２)及びＺＣ１４０６３：５'ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴ３'(配列番号１３３)。ＩＬ-１７ＣのＰＣＲ増幅は次のように実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル；７２℃５分を１サイクル；その後、４℃で維持。アガロースゲル電気泳動により、予測サイズ９４２ｂｐのバンドが見られた。液体培養物５ｍｌにＬＢクローンミックス１００μｌを接種し、振盪しながら３７℃で置いた。グリセロールストックは-８０℃にて保管した。プレートにグリセロールストックを植菌し、３７℃に置いた。液体培養物５ｍｌにクローンを接種し、振盪しながら３７℃に置いた。培養中の５ｍｌを使用して、液体培養物５００ｍｌを接種し、振盪しながら３７℃に置いた。
製造業者の使用説明書に基づいた最適化プロトコールに従って、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ プラスミドメガキット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用い、メガプレップを行った。
実施例１２
マウスＩＬ-１７Ｃの哺乳類発現ベクターの構築
マウスＩＬ-１７Ｃポリペプチドの発現のために、発現ベクターＩＬ-１７ＣＣＨＩＳを作製した。なお、この構築物は、予測される開始メチオニン〜停止コドンを除く最終アミノ酸からなるＩＬ-１７Ｃポリペプチドを発現するよう設計されており、Ｃ末端ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号１３４)も有する。
６２０ｂｐのＰＣＲ生成ＩＬ-１７Ｃ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ５０７４５：５'ＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＴ３'(配列番号１３５)及びＺＣ５０７４３：５'ＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡ３'(配列番号１３６)を用いて作出し、ＢｂｓＩ制限部位及びＴｇｏ試薬(Roche, Applied Sciences, Indianapolis, IN)、加えて１０％ＤＭＳＯ(Sigma, ST. Louis, MO)を加えた。ＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡ(Clonetrack ＩＤ番号１０１６１９)を含むプラスミドを鋳型として用いた。ＩＬ-１７ＣフラグメントのＰＣＲ増幅は次のように実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃１５秒、４５℃３０秒、７２℃２.５分を３サイクル；さらに９４℃１５秒、６３℃３０秒、７２℃２.５分を９サイクル；７２℃５分を１サイクル、その後、４℃で維持。この反応物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いて精製し、製造業者のプロトコールに従って、ＢｂｓＩ(Fermentas, Hanover, MD)で切断した。この反応物を、製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用いてゲル抽出した。
切り出したＤＮＡを、Ｅｃｏ３１Ｉ(Fermentas, Hanover, MD)で切断しておいたプラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７にサブクローニングした。ｐＥｘｐｒｅｓｓ４７ベクターは天然ＩＬ-１７Ｃシグナルペプチドを用い、ＨＩＳタグ：５'ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡ３'(配列番号１３７)をＩＬ-１７Ｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のＣ末端に付ける。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４７は、クローニング部位間で３'ＨＩＳタグ及びカセットＡ(Invitrogen)と継ぎ目のない連結をするための、ｐＤＯＮＲ２２１主鎖、Ｋｏｚａｋ、ＯＲＦクローニング用Ｅｃｏ３１Ｉ部位を含むエントリーベクターである。このプラスミドはｐＵＣ複製起点、哺乳類選択マーカー発現ユニットも有する。
制限処理されたＩＬ-１７Ｃインサート約１０μｌと切断ベクター約７５ｎｇをＦａｓｔ ｌｉｎｋライゲーションキット(EPICENTRE technologies (Madison, WI)を用いてライゲーションした。ライゲーション反応物２μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換させ、２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。コロニーに対し、各コロニーの液体培養物５ｍｌで配列決定を行った。クローンの挿入配列を配列解析により確認した。
ＬＲ反応は、ＬＲ反応キット(Invitrogen, Carlsbad, California)、ｐＥｘｐｒｅｓｓ ４発現ベクター約３００ｎｇ及びＩＬ-１７Ｃ／ｐｅｘｐｒｅｓｓ４７エントリークローン約１００〜３００ｎｇを用いて入念に計画した。プラスミドｐＥｘｐｒｅｓｓ４は、Ｇａｔｅｗａｙ変換カセットＡをｐＥＸＰＲＥＳＳ-０１のＮｒｕ Ｉ部位にクローニングすることにより作製された発現ベクターである；標準的なベクター；モジュール設計；プロモーター(Ｋｐｎ Ｉ／Ｍｆｅ)；ポリＡ(Ｘｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ)；Ｚｅｏ選択マーカー(Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｇｌ ＩＩ)；E. coli Ori(Ｂｇｌ ＩＩ／ Ｋｐｎ Ｉ)；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ カセット(Ｓｆｉ Ｉ／Ｓａｐ Ｉ)。この反応物は、５×ＬＲ反応バッファー４μｌ、トポイソメラーゼ１μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス４μｌを含み、ＴＥバッファーで最終量２０とした。２５℃にて１時間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ ２μｌを加え、３７℃にて１０分間インキュベートした。ＬＲ反応物１μｌを、製造業者の説明書に従って、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ-Ｔ１コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。ＰＣＲ及び同時にＬＢ培養液１００μｌを接種することによりコロニーをスクリーニングした。
ＰＣＲは、以下を用いて計画した：Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２試薬(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)と、ＰＣＲプライマーとしてＺＣ５０２０：５'ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧ３'(配列番号１３８)及びＺＣ１４０６３：５'ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴ３'(配列番号１３９)。ＩＬ-１７ＣのＰＣＲ増幅は次のように実施した：９４℃２分を１サイクル；９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル；７２℃５分を１サイクル；その後、４℃で維持。アガロースゲル電気泳動により、予測サイズ９３４ｂｐのバンドが見られた。液体培養物５ｍｌにＬＢクローンミックス１００μｌを接種し、振盪しながら３７℃に置いた。
製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ スピンミニプレップキット(Qiagen, Santa Clarita, Ca.)を用い、ミニプレップを行った。
実施例１３
可溶性ヒトＩＬ-１７Ｃのトランスフェクション及び発現
１日目に、振盪フラスコ培養した２９３ｆ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号Ｒ７９０-０７)、解凍後５代継代、２.４ｅ６ｃ／ｍｌ、５ＬをＷａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈリアクター(Wave Biotech, カタログ番号 cell bag 20L/O)内の、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１２３３８-０２６)４.５Ｌ中に播種した。この時点で、ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１５０７-０６３)混合物２５ｍｌも加えた。これらの細胞を、６％ＣＯ2を補給した周囲気流０.２ＬＰＭを伴い、３７℃にて培養した。このリアクターは、角度設定９.５で１分間に２５回揺動した。全培養期間でこれらの設定を用いた。
４日目に、このリアクターに、さらに、新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地４.７Ｌ ｗ／ ５ｍｌ／Ｌのペニシリン-ストレプトマイシン混合物を加え、最終量９.７Ｌとした。その後、これらの細胞を次のようにトランスフェクトした：０.８ｍｇ／ｍｌメガプレッププラスミドＤＮＡ(ＭＰＥＴ構築物 ＃８８９,ＩＬ-１７ＣｃＨ６)を、上記実施例に記載のようにして得た。１２０ｍｌアリコートのＯｐｔｉｍｅｍ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号３１９８５-０７０)２つを３７℃に予温した。１つのＯｐｔｉｍｅｍアリコートに、ＤＮＡプレップ１０ｍｌを加え、混合した。もう１つのＯｐｔｉｍｅｍアリコートに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ ２０００(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１１６６８-０１９)１０.５ｍｌを加え、混合した。２種類のアリコート混合物を合わせ、混合し、時々混合しながら室温で３０分インキュベートした。その後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ ２０００／ＤＮＡ混合物をリアクターに加えた。
トランスフェクション後９６時間で培養物を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ-ＨＣ遠心機により４０００Ｇで１０分回転させることにより細胞から培地を除いた。次に、この馴化培地を、１.２及び０.２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｏｐｔｉｃａｐフィルターセット(Millipore Bedford MA. カタログ番号ＫＷ１９０４ＨＢ３,ＫＷＳＳＬ４ＨＢ３)に連続して通した。さらに、濾過した培地を公知の方法により精製した。
実施例１４
可溶性マウスＩＬ-１７Ｃのトランスフェクション及び発現
１日目に、振盪フラスコ培養した２９３ｆ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号Ｒ７９０-０７)、解凍後２２代継代、２ｅ６ｃ／ｍｌ、１.２５ＬをＷａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈリアクター(Wave Biotech, カタログ番号 cell bag 20L/O)内のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１２３３８-０２６)８.１５Ｌに播種した。これらの細胞を、６％ＣＯ2を補給した周囲気流０.２ＬＰＭを伴い、３７℃にて培養した。このリアクターは、角度設定９.５で１分間に２５回揺動した。全培養期間でこれらの設定を用いた。４日目に、培養物７００ｍｌを抽出し、排出した。さらに、新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地１.４Ｌを加え、最終量１０Ｌとした。５日目に、培地２.６Ｌを抽出し、排出した。新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地１.４Ｌを加え、最終量８.８Ｌ ２ｅ６ｃ／ｍｌとし、これらの細胞を次のようにトランスフェクトした：メガプレッププラスミドＤＮＡ(ＭＰＥＴ構築物 ＃１２８０,ＩＬ-１７ＣｍｃＨ６)１.８８ｍｇ／ｍｌを、本明細書に記載のようにして得た。１５０ｍｌアリコートのＤＭＥＭ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１１９０９２)２つを３７℃に予温した。１つのＤＭＥＭアリコートに、ＤＮＡプレップ９.４ｍｌを加え、混合した。もう１つのＤＭＥＭアリコートに、１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩ溶液(ポリエチレンイミン,線状２５ｋＤａ.カタログ番号２３９６６. Polysciences, Inc. Warrington PA.)混合物１７.６ｍｌを加え、混合した。２種類の混合物を、別々に、室温で５分間インキュベートした後、それらを合わせ、混合し、時々混合しながら室温で２０分間インキュベートした。その後、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をリアクターに加えた。この時点で、ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA カタログ番号１５０７-０６３)混合物５０ｍｌも加えた。
トランスフェクション９６時間後、培養物を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ-ＨＣ遠心機により４０００Ｇで１０分回転させることにより細胞から培地を除いた。次に、この馴化培地を１.２及び０.２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｏｐｔｉｃａｐフィルターセット(Millipore Bedford MA. カタログ番号ＫＷ１９０４ＨＢ３,ＫＷＳＳＬ４ＨＢ３)に連続して通した。さらに、濾過した培地を公知の方法により精製した。
実施例１５
ＺｃｙｔｏＲ２１ Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
ＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体に特有のイントロン／エキソンジャンクションに特異的なオリゴヌクレオチドを、スプライス変異体特異的ｍＲＮＡのレベルを測定するＬｕｍｉｎｅｘ マイクロスフェアに基づくアッセイ用に設計することができる。しかしながら、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１は他のスプライス変異体にはない特有のイントロン／エキソンジャンクションを含んでいないために、それに特異的なオリゴは設計することができない。例えば、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)、ｚｃ４９７８９(５'ｇｃｃｔｃｃｃａｃａｃｇａｇｇａａｇｃｔｇｃｔｇｃ３')(配列番号３９)は、５'アミンＵｎｉ-Ｌｉｎｋ基を用いて合成され、その相補的アンチセンスオリゴヌクレオチドｚｃ４９８９０(５'ｇｃａｇｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｃ３')(配列番号４０)は、プロトコールの後半にカップリング効率をモニタリングするために５'ビオチン基を用いて合成された。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号７)は、他のＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体と比べて３つの特有のイントロン／エキソンジャンクションを有しているため、それぞれ、５'アミンＵｎｉ-Ｌｉｎｋ基を有する３つのセンスオリゴヌクレオチド、ｚｃ４９７９０(５'ｔｇｇａｃｔｃａｃａａａｇｇａｃｃｃｇａｇｔｔｃｔ３')(配列番号４１)、ｚｃ４９８９１(５'ｇｃｃｔｃｔｇｔｔａｔｔｃｃａｇｔｃｔｇｇｔｇｇｇ３')(配列番号４２)、及びｚｃ４９８９２(５'ｃｃｃｃｇｔｔｇａａｇａｃｃｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｃ３')(配列番号４３)と、それらの相補的アンチセンス５'ビオチン標識対照オリゴヌクレオチド、ｚｃ４９７９１(５'ｃｃｃａｃｃａｇａｃｔｇｇａａｔａａｃａｇａｇｇｃ３')(配列番号４４)、ｚｃ４９７９２(５'ｇｃｃｔｃｃｃａｃａｃｇｇｔｃｔｔｃａａｃｇｇｇｇ３')(配列番号４５)、及びｚｃ４９７２４(５'ａｇａａｃｔｃｇｇｇｔｃｃｔｔｔｇｔｇａｇｔｃｃａ３')(配列番号４６)を設計する必要がある。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４(配列番号１０)特異的センスオリゴヌクレオチドｚｃ４９７９３(５'ｔｇｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃａｔｇｃｔｔｃａｃ３')(配列番号４７)は、５'アミンＵｎｉ-Ｌｉｎｋ基を用いて合成され、その５'ビオチン標識アンチセンス相補体ｚｃ４９７２９(５'ｇｔｇａａｇｃａｔｇｇａｇｃａｇｇａｃａｃａｇｃａ３')(配列番号４８)も合成される。長鎖ｍＲＮＡの増幅におけるＲＮＡ増幅ステップの効率を評価するために、確認されている全てのスプライス変異体に共通している、ＺｃｙｔｏＲ２１の最初エキソン及び最後のエキソンに対するオリゴを設計する。ＺｃｙｔｏＲ２１の最初のエキソンに対しては、５'アミンＵｎｉ-Ｌｉｎｋ基を用いて、ｚｃ４９７９４(５'ｔｃｔｇａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｇａｔｔｇｇｃｔｔｔｃ３')(配列番号４９)を合成し、５'ビオチン基を用いて、その相補的アンチセンスオリゴヌクレオチドｚｃ４９８９３(５'ｇａａａｇｃｃａａｔｃｃｃａｇｃａｇａｇｔｃａｇａ３')(配列番号５０)を合成する。ＺｃｙｔｏＲ２１の最後のエキソンに対しては、５'アミンＵｎｉ-Ｌｉｎｋ基を用いて、ｚｃ４９７９５(５'ｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｃｇｇｃｇｃｃｇａ３')(配列番号５１)を合成し、その相補体 ｚｃ４９８９４(５'ｔｃｇｇｃｇｃｃｇｃｔｃｃａｃａｇｃａｇｃａｇｃａ３')(配列番号５２)を合成する。最初のエキソンと最後のエキソンの測定値の比を利用して、ｍＲＮＡの３'末端から離れたところにある配列標的(ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２に特異的な特有のイントロン／エキソンジャンクションなど)のレベルの測定に及ぼす影響を定性的に評価することができる。
各センスオリゴヌクレオチドを、次のように特異的ｘＭＡＰ(商標)多重分析カルボキシル化マイクロスフェア(Luminex Corporation, Austin, TX)とカップリングさせる：ストックマイクロスフェアを、ボルテックスと音波処理をおよそ２０秒間行うことにより再懸濁し、２００μｌ(２.５×１０6マイクロスフェア)を微量遠心チューブに移し、８０００×ｇ超で１〜２分間微量遠心分離することによりペレットとする。上清を除去し、マイクロスフェアペレットを０.１Ｍ ＭＥＳ(２(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸,Sigma, St. Louis, MO)、ｐＨ４.５、５０μｌに、ボルテックスと音波処理を行うことにより再懸濁する。ｄＨ2Ｏで新たなＥＤＣカルボジイミドＨＣＬ(１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドＨＣｌ,Pierce, Rockford, IL)の溶液１０ｍｇ／ｍｌを調製し、この溶液２.５μｌをマイクロスフェアに加え、ボルテックスにかけ、室温にて３０分暗所でインキュベートする。第２の、新鮮な１０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣ溶液を調製し、２.５μｌをマイクロスフェアに加え、暗所で３０分間のインキュベートを繰り返す。任意で、３回目の、ＥＤＣの添加とインキュベートを繰り返す。０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０(モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン,Sigma, St. Louis, MO)１ｍｌを、カップリングしたマイクロスフェアに加え、ボルテックスにかけることにより混合し、微量遠心分離によりペレットとする。上清を除去し、マイクロスフェアペレットを０.１％ＳＤＳ(ラウリル硫酸塩,Sigma, St. Louis, MO)１ｍｌに、ボルテックスにかけることにより再懸濁し、遠心分離によりペレットとする。上清(supernatent)を除去し、ペレットをＴＥ、ｐｈ ８.０ １００μｌに、ボルテックスと音波処理を約２０秒間行うことにより再懸濁させる。マイクロスフェアを、血球計を使用することにより数え、使用するまで暗所で４℃にて保存する。
マイクロスフェアのカップリング及びハイブリダイゼーション効率を、次のように、カップリングしたマイクロスフェアをビオチン標識相補的オリゴヌクレオチドと混合することにより評価する：カップリングしたマイクロスフェアを、ボルテックスと音波処理を約２０秒間行うことにより再懸濁させ、使用する混合物を、カップリングしたマイクロスフェアのストックを、１.５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファー(４.５Ｍ ＴＭＡＣ(Sigma, St. Louis, MO) ０.１５％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０.７５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８(Sigma, St. Louis, MO)、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０(Gibco, Grand Island, NY)中１５０マイクロスフェア／μｌに希釈することにより調製する。ＭｉｃｒｏＡｍｐ ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート(Applied Biosystems, Foster City, CA)の各サンプル又はバックグラウンドのウェルに、カップリングしたマイクロスフェア３３.３μｌを加え、各バックグラウンドのウェルにはＴＥ、ｐＨ８.０ １６.６７μｌを加える。各サンプルのウェルには５〜２００フェムトモルの範囲にわたる適当なビオチン化相補的オリゴヌクレオチドを加え、最終量１６.７μｌに調整する。そのプレートを密閉し、プレートシェーカーを４００ｒｐｍにて用いて反応物を混合する。プレートを９４℃にて３分間、次いで、５５℃にて１５分間インキュベートする。真空マニホールド(Millipore Corporation, Billerica, MA)を用いて、結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、プレートを洗浄バッファー(１ｍＭ ＰＢＳ、０.０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０)１００μｌ／ウェルで３回洗浄する；毎回、真空濾過によりバッファーを除去する。新鮮なレポーターミックスを、ストレプトアビジン-Ｒ-フィコエリトリンコンジュゲート(Molecular Probes, Eugene, OR)を洗浄バッファーで４μｇ／ｍｌに希釈することにより調製し、７５μｌを各ウェルに加え、アッセイプレートをホイルで覆い、プレートシェーカーで１１００ｒｐｍにて３０秒間混合した後、室温で４００ｒｐｍにて１５分間インキュベートする。次に、そのプレートを３回洗浄して、結合していないストレプトアビジン-ＰＥを除去し、サンプルを最終量７５μｌの洗浄バッファーに再懸濁する。その後、５０μｌをＢｉｏ-Ｐｌｅｘアレイリーダー(BioRad Laboratories, Inc, Hercules, CA)で解析する。
およそ２×１０6個のＵ９３７細胞をプレーティングし、２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ＋０.５μｇ／ｍｌイオノマイシンで、６時間、１１時間及び２４時間刺激する。〜２×１０6個のＴＨＰ１細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで、１２時間、２４時間及び４８時間刺激する。細胞を回収し、全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ(Valencia, CA)ＲＮｅａｓｙキットを用いて精製する(任意で、プロトコールにＤＮアーゼステップを含める)。製造業者の使用説明書に従って、ＤＮＡフリー試薬(Ambion, Inc, Austin, TX)を用いて、ＲＮＡをＤＮアーゼ処理する。アリコートをＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーにかけることによりＲＮＡの質を評価する。もしＲＮＡが著しく劣化しているならば、ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡについてのその後のアッセイにはそれを使用しない。カテプシンＺ遺伝子座のイントロン内のゲノムＤＮＡの単一部位を増幅するプライマーｚｃ３７２６３(５' ｇａａｔｔａｃａｃｃｃｔｃｔｇｇａｇａｇｔｇｇ ３')及びｚｃ３７２６４(５' ｇａａｔｔｔｃｇｇａｃａａｔｃｃａｇｔａｃｔｃ ３')を用いた、アリコートのＲＮＡにおけるＰＣＲアッセイにより、混入しているゲノムＤＮＡの存在を評価する。混入ゲノムＤＮＡアッセイのＰＣＲ条件は次のとおりである：１０×バッファー２.５μｌ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)０.５μｌ、２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)２μｌ、１０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)２.５μｌ、及び２０μＭ ｚｃ３７２６３及びｚｃ３７２６４ ０.５μｌ、最終量２５μｌ。サイクルパラメーターは、９４℃２０秒；９４℃２０秒、６２℃２０秒、７２℃１分を４０サイクル；及び７２℃７分を１サイクルのである。各反応物１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、混入ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の存在に関してゲルを調べる。混入ゲノムＤＮＡを含んでいないと思われるＲＮＡだけをＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体 ｍＲＮＡについてのその後のアッセイに使用する。
カップリングさせるＬｕｍｉｎｅｘ マイクロスフェアを用いてＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体についてアッセイしようとする各ＲＮＡ５μｇを、まず、製造業者の使用説明書に従って(キットで提供されているｄＮＴＰの代わりに標識ｄＮＴＰｓ(ビオチン-１６-ＵＴＰ及びビオチン-１１-ＣＴＰ,Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA)を使用するように、アンチセンスＲＮＡを合成するＩｎ-Ｖｉｔｒｏ転写ステップを変更することを除く)、Ａｍｂｉｏｎ ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ(商標)ａＲＮＡキット(Ambion Incorporated, Austin, TX)を用いて増幅する。各増幅ＲＮＡサンプルにおけるＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体ｍＲＮＡのレベルは次のようにして測定する：適当なハウスキーピング遺伝子対照オリゴヌクレオチドとカップリングしたマイクロスフェア及びＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体特異的オリゴヌクレオチドとカップリングしたマイクロスフェアを用いて、使用するマイクロスフェア混合物を、カップリングしたマイクロスフェアのストックを、１.５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファーで３３.３μｌ当たり５０００に希釈することにより調製する；総量は、３３.３μｌに、試験するサンプル及びバックグラウンドのウェル数を乗じた量とする。この使用マイクロスフェア溶液を、ボルテックスと音波処理を約２０秒間行うことにより混合する。各バックグラウンドのウェルにはＴＥ、ｐＨ８.０ １６.７μｌを加え、各サンプルのウェルには増幅したビオチン化ＲＮＡ ５μｇを加え、それをまず、９４℃に３５分間加熱し、氷冷し、１６.７μｌ量のＴＥ、ｐＨ８.０を入れる。サンプル及びバックグラウンドのウェルに使用するマイクロスフェア混合物３３.３μｌを加え、ピペットで上下させ、プレート振盪機で短時間振盪することによりウェルを混合する。そのプレートを密閉し、９４℃にて１０分間インキュベートして、増幅ビオチン化ＲＮＡを変性させた後、緩やかに揺動しながら振盪インキュベーターで６０℃にて５時間インキュベートする。その反応物をマイクロタイタープレートに移し、真空マニホールドを使用して、結合していないヌクレオチドを分離し、プレートを洗浄し、レポーターミックスを、上記のようにサンプルとともにインキュベートする。その後、プレートを洗浄し、上記のようにＢｉｏ-Ｐｌｅｘ アレイリーダーで計数する。
結果より、ＺｃｙｔｏＲ２１転写物は、Ｕ９３７細胞において、ＰＭＡの有無には関係なく、ＴＨＰ１よりもずっと高いレベルで発現されるということが示される。さらに、各スプライス変異体 ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４の有意義な発現も認められる。変異体ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１及び／又はまだ記されていないような可能性あるスプライス変異体も、最後のエキソンの発現レベルが高いことから、Ｕ９３７においてＴＨＰ１よりも高度に発現されると推測される。
実施例１６
ＺｃｙｔｏＲ２１のノーザン分析及びドットブロット分析
ノーザン分析及びドットブロット分析は、ヒトマルチプルティッシュブロットＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ、並びにヒトＲＮＡマスターブロット(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を用いて行った。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)ｃＤＮＡをＥｃｏＲ１及びＮｏｔで切断した後、ゲル電気泳動を行い、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出試薬及びプロトコール(Qiagen, Valencia, CA)を用いてフラグメントを精製することにより、１.４ｋｂのＤＮＡフラグメントを作製した。このＤＮＡフラグメントは、配列番号２のアミノ酸２５７〜６９０番をコードする配列を含んでおり、ＺｃｙｔｏＲ２１の既知のスプライス変異体の全てとハイブリダイズすると予測される。このフラグメントを、製造業者のプロトコールに従ってＲｅｄｉ-Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用い、放射性標識した。このプローブを、製造業者の使用説明書に従いＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ-２００ ＨＲスピンカラム(Amersham, Arlington Heights, IL)を用いて精製した。サケ精子ＤＮＡ(Stratagene, La Jolla, CA)及びＣｏｔ-１ ＤＮＡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を５分間煮沸し、氷上で急速冷却し、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び６μｇ／ｍｌでＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ(CLONTECH)に加え、ブロットのためのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液として用いた。プレハイブリダイゼーションは５５℃で３時間行った。放射性標識されたＤＮＡフラグメントを５分間煮沸し、氷上で急速冷却し、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液でブロットに加えた。ハイブリダイゼーションは５５℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、これらのブロットを次のように洗浄した：室温にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２回、６５℃にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で１回、その後、６５℃にて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２０秒１回の洗浄。これらのブロットを一晩フィルムに露光した。結果を以下の図面に示すが、ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡが広範囲に発現し、胃、膵臓で最も強く発現し、程度は低いが、前立腺、甲状腺、気管、唾液腺、肝臓、腎臓、小腸、肺、胎児肺、胎児胸腺、胎盤、乳腺、心臓、小脳、尾状核、及び結腸でも発現した。これに対し、全脳、骨格筋、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、末梢血白血球、脊髄、リンパ節、副腎、子宮、膀胱、胎児全脳、胎児心臓、胎児肝臓、胎児脾臓、及び骨髄ではほんとんど発現しないか、全く発現しない。
実施例１７
ＩＬ-１７Ｃのノーザン分析、ドットブロット分析及び疾患アレイ分析
ノーザン分析、ドットブロット分析、及び疾患アレイ分析を、ヒトマルチプルティッシュブロットＩ及びＩＩ、ヒト胎児マルチプルティッシュブロットＩＩ、ヒトＲＮＡマスターブロット、癌プロファイリングアレイＩＩ、血液疾患プロファイリングアレイ、自己免疫疾患プロファイリングアレイ、及び癌細胞系統プロファイリングアレイ(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を用いて行った。ＩＬ-１７Ｃ ｃＤＮＡをＥｃｏＲ１で切断した後、ゲル電気泳動を行い、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出試薬及びプロトコール(Qiagen, Valencia, CA)を用いてフラグメントを精製することにより、〜７７０ｂｐ ＤＮＡフラグメントを作製した。このＤＮＡフラグメントは、ＩＬ-１７Ｃの完全オープンリーディングフレームをコードする配列を含んでいた。このフラグメントを、製造業者のプロトコールに従ってＲｅｄｉ-Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用い、放射性標識した。このプローブを、製造業者の使用説明書に従い、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ-２００ ＨＲスピンカラム(Amersham, Arlington Heights, IL)を用いて精製した。サケ精子ＤＮＡ(Stratagene, La Jolla, CA)及びＣｏｔ-１ ＤＮＡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を５分間煮沸し、氷上で急速冷却し、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び６μｇ／ｍｌでＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ(CLONTECH)に加え、ブロットのためのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液として用いた。プレハイブリダイゼーションは５５℃で一晩行った。放射性標識されたＤＮＡフラグメントを５分間煮沸し、氷上で急速冷却し、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液でブロットに加えた。ハイブリダイゼーションは５５℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、これらのブロットを次のように洗浄した：室温にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２回、６５℃にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で１回、その後、６５℃にて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２０秒１回の洗浄。これらのブロットを６日間増感紙を用いてフィルムに露光した。
これらの結果は、一般に、ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは広範囲に発現せず、また、発現も高くないことを示す。〜１.４ｋｂの転写物が胎児肺には見られるが、ＩＬ-１７Ｃ転写物は、胎児脳、胎児肝臓、又は胎児腎臓には存在しない。成体組織では、〜４.８ｋｂの転写物が心臓に見られ、〜５ｋｂと３ｋｂの２つの転写物が骨格筋に見られる。これに対し、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、脊髄リンパ節、気管、副腎又は骨髄ではＩＬ-１７Ｃ転写物は見られない。癌プロファイリングアレイでは、ＩＬ-１７Ｃは、乳癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、外陰癌、前立腺癌、気管癌、子宮癌、子宮頸癌、直腸癌、甲状腺癌、精巣癌、皮膚癌及び膵臓癌を有する複数の患者由来の正常及び腫瘍ｃＤＮＡには比較的存在しない。しかし、同じ組織の癌を有する数名の患者の正常な肝臓及び小腸においては、若干高いＩＬ-１７Ｃハイブリダイゼーションが見られる。自己免疫疾患及び血液疾患のプロファイリングアレイでは、ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、ＣＤ１４(主として単球)、ＣＤ３(主としてＴ細胞)、単核細胞及び多形核細胞におけるＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡのレベルよりも、通常の、罹患した患者ボードの血液のＣＤ１９(主としてＢ細胞)画分で若干の増加が見られる。興味深いことに、ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡのレベルは、ＩＬ-１７Ｃの正常な患者ＣＤ１９血液画分レベルよりも、多発性硬化症、フォン・ウィルブラント病、狼瘡性抗血液凝固症、高安関節炎、特発性血小板減少性紫斑病、ホジキン病、及び慢性骨髄性白血病患者のＣＤ１９血液画分においてさらに上昇すると思われる。癌細胞系統プロファイリングアレイでは、ＩＬ-１７Ｃはここでも発現は高くも広くもないが、特定の条件下で散逸した数種の細胞系統で発現が見られる。サイトカラシンＤで刺激されたＭＤＡ-ＭＢ-４３５Ｓ、並びにデメコルシン、ミオマイシン、アクチノマイシンＤ及びシクロヘキサミドで刺激されたＵ-８７ ＭＧは全て低レベルのＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡを発現すると思われるが、他の２４の細胞系統では、刺激条件を組み合わせても、ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡをほとんど発現しないか、全く発現しない。
実施例１８
ＺｃｙｔｏＲ２１の一時的発現
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)及びｘ２(配列番号４)ｃＤＮＡを二シストロン型発現ベクターであるｐｚｍｐ１１に配置した。これらのｃＤＮＡをｃｍｖプロモーターの下流であって、ＩＲＥＳ部位及び細胞表面マーカーであるヒトＣＤ８のｃＤＮＡの前に挿入した。ＣＤ８の発現は挿入されたｃＤＮＡの転写と相関し、これを用いてＣＤ８細胞をＦＡＣＳ選別し、非ＣＤ８集団に対してこの集団が結合結果と相関するかどうかを調べることができる。
２９３ＦＢ懸濁細胞を、１２５ｍｌ容の組織培養エルレンマイヤー発酵フラスコ中、１０ｍｌの新鮮Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地(Invitrogen)に１０6細胞／ｍｌの密度で播種した。これらの細胞にＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１-ｐｚｍｐ１１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２-ｐｚｍｐ１１及びエンプティーｐｚｍｐ１１ベクター１０μｇを、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、トランスフェクション２４〜７８時間後に、細胞を本明細書に示すような結合実験に用いた。
実施例１９
ａｐ／ｎｆｋｂ転写因子を発現する安定なｎｉｈ３ｔ３アッセイクローンの作出
マウスｎｉｈ３ｔ３細胞を、ネオマイシン選択マーカーを含むｋｚｌ４２ ａｐ１／ｎｆｋｂルシフェラーゼレポーター構築物で安定にトランスフェクトした。Ｎｅｏ耐性トランスフェクションプールをクローン密度でプレーティングした。クローニングリングを用いてクローンを単離し、ヒトＩＬ-１７Ｃリガンドをインデューサーとして用い、ルシフェラーゼアッセイによりスクリーニングした。最大の平均蛍光強度(ＭＦＩ)(ａｐ１／ＮｆｋＢルシフェラーゼを介する)と最小のバックグラウンドを有するクローンを選択した。安定なトランスフェクト細胞系統を選択し、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８と呼んだ。
実施例２０
マウスｎｉｈ３ｔ３細胞はＺｃｙｔｏＲ２１を発現する
ｎｉｈ３ｔ３ ＲＮＡの二段階ＰＣＲ分析は、これらの細胞がＺｃｙｔｏＲ２１転写陽性であり、この受容体により媒介されるＩＬ-１７Ｃに対するそれらのシグナル応答と一致していることを示した。標準的な方法を用い、ｎｉｈ３ｔ３細胞から単離した全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを作製した。ｈｏｔ ｓｔａｒポリメラーゼと、ＤＭＳＯ終濃度１０％を用いること以外は製造業者の推奨(Qiagen, Valencia, CA)を用い、ＰＣＲを適用した。用いたプライマーとしては、センスプライマーｚｃ４０４１３(５' ｔｇｃｇｃｃｃｇｇａｔｃｃｔａｃａｇａａｇｃ ３')(配列番号５５)及びアンチセンスプライマーｚｃ４０４１２(５'ｇｃａｃｃｔｃｇｇｇｃａｇｃａａａｔｃａａａｇ ３')(配列番号５６)を含んだ。アガロースゲル電気泳動により、予測されたサイズの、単一の多量のアンプリコンが明らかになった。
実施例２１
ＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体の組換え過剰発現を伴う細胞系統の作出
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１の安定な組換え過剰発現は、標的細胞の、そのリガンドによる活性化及び結合に対する増感性を高めることによって、そのリガンドの同定を容易にする。この現象は、ＺｃｙｔｏＲ２１のホモログで認められている。リガンドの活性化は、組換え受容体の過剰発現のない同じ細胞で見られるものよりもはるかに低い濃度で生じた。この活性化現象は、マウスｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８細胞系統で見られ、これらの細胞はこれらの受容体を内因的に発現することが示された。リガンド結合研究は、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ５７０)を過剰発現する組換えＺｃｙｔｏＲ２１で行われた。
マウスアッセイ細胞系統ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８におけるヒト及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１の安定過剰発現
マウスｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８(実施例１７)は内因性のＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡを産生することがＰＣＲにより示された(実施例１８)。これらの細胞を、挿入されたｃＤＮＡの転写を駆動するＣＭＶプロモーター、その後にＩＲＥＳ、その後にヒトＣＤ８のｃＤＮＡを含む二シストロン型発現ベクターｐＺＭＰ１１中の、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号７)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号２０)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３(配列番号１０６)及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号１３)のｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＣＤ８発現細胞は挿入されたｃＤＮＡの発現に関して選択可能であり、その発現と相関がある。Ｐｚｍｐ１１はメトトレキサート耐性遺伝子(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を含む。トランスフェクションは、市販のキットと製造業者の推奨(Mirus, Madison, WI. カタログ番号ＭＩＲ２１８)を用いて行った。細胞を１μＭ ｍｔｘを加えた増殖培地に置き、ヒト及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１導入遺伝子を含む発現構築物を選択した。選択後、トランスフェクションプールを作製し、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ１、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ２、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ３、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ６、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ１３及びｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２.８／ｍｃｙｔｏｒ２１ｘ６と呼んだ。
ベビーハムスター腎臓細胞系統(ＢＨＫ５７０)におけるヒト及びマウスＺｃｖｔｏＲ２１の安定過剰発現
ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ５７０)を、結合研究のためのＺｃｙｔｏＲ２１の組換え過剰発現用に選択した。これらの細胞を、挿入されたｃＤＮＡの転写を駆動するＣＭＶプロモーター、その後にＩＲＥＳ、その後にヒトＣＤ８のｃＤＮＡを含む二シストロン型発現ベクターｐＺＭＰ１１中の、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号７)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号２０)、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３(配列番号１０６)及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号１３)のｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＣＤ８発現細胞は挿入されたｃＤＮＡの発現に関して選択可能であり、その発現と相関がある。Ｐｚｍｐ１１はメトトレキサート耐性遺伝子(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を含む。トランスフェクションは、市販のキットと製造業者の推奨(Mirus, Madison, WI. カタログ番号ＭＩＲ２１８)を用いて行った。細胞を１μＭ ｍｔｘで修飾した増殖培地に置き、ヒト及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１導入遺伝子を含む発現構築物を選択した。選択後、トランスフェクションプールを作製し、ＢＨＫ／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ１、ＢＨＫ／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ２、ＢＨＫ／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ３、ＢＨＫ／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ６、ＢＨＫ／ｈｃｙｔｏｒ２１ｘ１３、及びＢＨＫ／ｍｃｙｔｏｒ２１ｘ６と呼んだ。
実施例２２
ＰＣＲを用いた細胞系統パネルにおけるＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの分布
自所で増殖させた、休止中の、また、刺激した細胞系統から全ＲＮＡを精製し、製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ(Valencia, CA)ＲＮｅａｓｙキット、又は酸-フェノール精製プロトコール(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)を用いて精製した。このＲＮＡの品質を、アリコートをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに流すことによって評価した。ＲＮＡの分解が著しければ、その後の第一鎖ｃＤＮＡの作出には用いなかった。ゲノムＤＮＡの混入は、遺伝子間ゲノムＤＮＡの単一部位を増幅するプライマーであるｚｃ４１０１１(５'ｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｔａｔｃｔｔｔｃａｔｃａａｃ３')(配列番号５７)及びｚｃ４１０１２(５'ｃｔｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃｔａａａｃａａａａｃａｃ３')(配列番号５８)を用い、ＲＮＡアリコートに対するＰＣＲアッセイによって評価した。混入ゲノムＤＮＡアッセイのためのＰＣＲ条件は次の通りであった：最終量２５μｌ中、２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)、並びに０.５μｌ ２０μＭ ｚｃ４１０１１及びｚｃ４１０１２。サイクリングパラメーターは、９４℃２０秒；９４℃２０秒及び６０℃１分２０秒を４０サイクル；その後、７２℃７分を１サイクル。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、混入ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の存在に関してゲルを調べた。混入ゲノムＤＮＡが見られた場合には、その全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、ＤＮＡフリー試薬(Ambion, Inc, Austin, TX)を用いてＤＮアーゼ処理し、その後、上記のように再試験を行った。混入ゲノムＤＮＡが存在しないことが明らかになったＲＮＡだけを、その後の第一鎖ｃＤＮＡの作出に用いた。
８２のヒト細胞系統からの全ＲＮＡ２０μｇをそれぞれＨ2Ｏで９８μｌとした後、各全ＲＮＡ１０μｇを含む２つの４９μｌアリコートに分割し、２枚の９６ウェルＰＣＲプレートに入れた。各アリコートに第一鎖ｃＤＮＡ合成のための試薬(Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA)：２０μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μｌ １０×ＲＴバッファー、１０μｌ ０.１Ｍ ＤＴＴ、２μｌオリゴｄＴ、２μｌ ＲＮＡｓｅＯｕｔを加えた。次に、各細胞系統由来の１つのアリコートに、２μｌスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を加え、もう一方の細胞系統アリコートには、２μｌ Ｈ2Ｏを加えて、逆転写酵素を含まない陰性対照とした。全てのサンプルを次のようにインキュベートした：２５℃１０分、４２℃５０分、７０℃１５分。サンプルを深孔プレートに配置し、Ｈ2Ｏで１.７ｍｌまで希釈した。Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅ(Saigan)ロボットを用い、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに１６.５μｌの分注を多数回行い、細胞系統の１回使用用ＰＣＲパネルを多数作製し、これを密封し、-２０℃で保存した。これらのパネルの各ウェルは、およそ１００ｎｇの全ＲＮＡに由来する第一鎖ｃＤＮＡに相当する。８２の細胞系統は２枚のパネル、アレイ番号１１８Ａと１１８Ｂに分布している。
これらのパネル上の第一鎖ｃＤＮＡの品質を、発現は広範囲であるが、存在量は多くない２つの遺伝子ＣＬＴＣ(クラスリン)とＴＦＲＣ(トランスフェリン受容体Ｃ)に対するプライマーを用い、１組のパネルで多重ＰＣＲアッセイによって評価した。クラスリンプライマーｚｃ４２９０１(５'ｃｔｃａｔａｔｔｇｃｔｃａａｃｔｇｔｇｔｇａａａａｇ ３')(配列番号５９)、ｚｃ４２９０２(５'ｔａｇａａｇｃｃａｃｃｔｇａａｃａｃａａａｔｃｔｇ ３')(配列番号６０)、及びＴＦＲＣプライマーｚｃ４２５９９(５'ａｔｃｔｔｇｃｇｔｔｇｔａｔｇｔｔｇａａａａｔｃａａｔｔ ３')(配列番号６１)、ｚｃ４２６００(５'ｔｔｃｔｃｃａｃｃａｇｇｔａａａｃａａｇｔｃｔａｃ ３')(配列番号６２)各０.５μｌを、２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合し、アレイ番号１１８Ａとアレイ番号１１８Ｂのパネルの各ウェルに加えた。サイクリングパラメーターは次の通りとした：９４℃２０秒；９４℃２０秒及び６７℃８０秒を３５サイクル；その後、７２℃７分を１サイクル。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、各細胞系統について＋ＲＴウェルに特異的な各遺伝子のＰＣＲ産物が多量に存在しているかどうかに関してゲルをスコアリングした。
ＺｃｙｔｏＲ２１に関するヒト第一鎖ｃＤＮＡパネルにおけるｍＲＮＡの発現は、センスオリゴｚｃ４０４５０(５'ｔｃｃｔｇｃｃｔｃｔｃｃｔｃｃｔｃａｔａｇｔｃａ ３')(配列番号６３)及びアンチセンスオリゴｚｃ４０４５４(５'ｃｃａｇｇａｔｃａａｇａｇｃｃｃｃａｇｇｔｇｔｃ ３')(配列番号６４)を用いたＰＣＲによって、１サンプルあたり：２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)、及び各０.５μｌの２０μＭセンス及びアンチセンスプライマーにつきこれらのＰＣＲ条件下でアッセイした。プライマーはＺｃｙｔｏＲ２１の既知の全てのスプライス変異体をピックアップするものと予測されるが、それらは必ずしも各変異体間を識別するものではなかった。サイクル条件は、９４℃２０秒；９４℃２０秒、６９℃２分３０秒を３５サイクル；その後、７２℃７分を１サイクルとした。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、ＺｃｙｔｏＲ２１発現が陽性であるか陰性であるか、ゲルをスコアリングした。結果は、このアッセイにより細胞系統においてＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの発現が広範囲にわたることを示した。ＺｃｙｔｏＲ２１は、Ｕ-９３７(刺激無し、及びＰＭＡ又はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激)、Ｂリンパ腫(ＤＯＨＨ-２ Ｒａｍｏｓ、Ｇｒａｎｔａ-５１９及びＲＬ)、及び切断系に由来する数種の細胞系統(ＣａＣＯ２、ＣａＣＯ２分化型、ＨＣＴ-１５、及びＨＣＴ-１１６)では、一貫して、通常、強い陽性反応がある。全体として、ＺｃｙｔｏＲ２１陽性であったサンプルは、Ｌ３６３、Ａ３７５、ＣＴＢ-１＋ＰＭＡ／イオノマイシン、ＴＦ１、ＡＲＨ７７、Ｇ-３６１、ＭａｃＬＬＣ＋ＰＭＡ／イオノマイシン、ＤＯＨＨ-２、ＲＥＨ、ＨａＣａｔ、 Ｒａｍｏｓ、Ｇｒａｎｔａ-５１９、ＲＬ、Ｈｓ２９４Ｔ、ＨＬ６０＋酪酸、ＡｓＰＣ-１、Ａ-１７２、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｕ９３７＋ＰＭＡ／イオノマイシン、ＴｒＢＭＥＣ、ＨｅｐＧ２＋ＩＬ６、Ｕ９３７＋ＰＭＡ、ＭＥ１８０、ＡＲＰＥ、Ａ-５４９、Ｕ９３７、ＣａＣＯ２、ＭＲＣ-５、ＰＣ-３、ＣａＣＯ２分化型、ＤＬＤ-１、ＳＫＬＵ-１、Ｉｎｔ４０７、ＨＣＴ１１６、及びＨＣＴ１５であった。
実施例２３
ＰＣＲを用いたマウス細胞系統パネルにおけるマウスＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの分布
自所で増殖させた、休止中の、また、刺激された６０の細胞系統から全ＲＮＡを精製し、製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ(Valencia, CA)ＲＮｅａｓｙキット、酸-フェノール精製プロトコール(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)、又はトリゾール試薬プロトコール(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて精製した。各細胞系統からの全ＲＮＡ５μｇを深孔９６ウェルプレートに配置し、各ウェルに１２５μｌ ３Ｍ ＮａＯＡｃ及び１００μｌペレットペイント(Novagen, Madison, WI)を加えた後、最終量をＨ2Ｏで１.２５ｍｌに調整した。Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅ(Saigan)ロボットを用い、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルにＲＮＡ混合物２５μｌと、その後、ＥｔＯＨ ７５μｌの分注を多数回行い、各ウェルにＥｔＯＨ中１００ｎｇの全ＲＮＡが入った、細胞系統の１回使用用ＲＴ ＰＣＲパネルを多数作製した。その後、パネルを密封し、-２０℃で保存した。このアレイ上のサンプルの配置と含量は下表１で詳細に示す。ＲＴ ＰＣＲスクリーニングは、まず、Qiagen (Valencia, CA)９６ウェル遠心機にて６０００ＲＰＭで１０分パネルを遠心分離することにより行う。このプレートを吸収紙上で逆さにすることにより上清を除去する。ＲＮＡペレットを ７０％ＥｔＯＨ １００μｌで洗浄した後、５分間６０００ＲＰＭで遠心分離した。上清を再び除去し、残留しているＥｔＯＨが蒸発するまでプレートを風乾させた。
マウス細胞系統ＲＮＡパネルにおけるＺｃｙｔｏＲ２１ｍ ｍＲＮＡの発現は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｏｔ Ｏｎｅ-Ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、センスオリゴＺＣ４０４０３(５'ｃｔｇｔｇａｇｇｃｇｃａａａａａｇｔｇｔｃ３')(配列番号８１)及びアンチセンスオリゴＺＣ４８５１６(５'ｇｃａａｇｔｃｃａｃａｔｔｃｔｃｃａｇｇａｔ ３')(配列番号８２)を用いたＲＴ ＰＣＲによりアッセイした。ＲＮＡペレットを、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)、１２.５μｌ ２×反応ミックス、０.５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌセンスオリゴ、０.５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌアンチセンスオリゴ、０.５μｌ ＲＴ／白金Ｔａｑ及び８.５μｌ滅菌水を含んだ全量２５μｌ／ウェルの反応ミックスに再懸濁させた。サイクル条件は、５２℃３０分を１サイクル；９４℃２分を１サイクル；９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃１分を３５サイクル；その後、７２℃７分の最終サイクルとした。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、ＺｃｙｔｏＲ２１ｍ発現が陽性であるか陰性であるか、ゲルをスコアリングした。これらのプライマーは既知の全てのスプライス変異体をピックアップするが、混入ゲノムＤＮＡに対する産物は生成しないとものと予測された。結果は、１４の細胞系統でＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡが存在することを示し、最も典型的な膵臓起源の系統は、ｐｉｋ１０、ｐｉｋ１５、ｐｉｋ１８、ｐｉｋ３４、ｐｉｄ１４、ｐｉｄ２０、５ＦＨ-１７及び５ＦＵ-１９である。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡはまた、骨格筋筋芽細胞系統Ｃ２Ｃ１２、単球細胞系統ＲＡＷ ２６４.７、唾液腺細胞系統ＳＡＧ-５／２２-６、及び肝臓細胞系統ＡＭＬでも存在した。これに対し、ＺｃｙｔｏＲ２１ｍ ＲＮＡは、Ｔ又はＢリンパ球細胞系統、胚細胞系統、脂肪細胞系統、骨芽細胞及び破骨細胞系統、並びに視床下部細胞系統では発現していなかった。また、ＺｃｙｔｏＲ２１を発現しなかったものとして、１０種の膵臓細胞系統と４種の唾液腺細胞系統があった。
実施例２４
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＨＩＳ、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＦＬＡＧタグ付きタンパク質を発現する哺乳類可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１発現構築物の構築
Ｇｌｕ-Ｇｌｕ(ＣＥＥ)、６Ｈｉｓ(ＣＨＩＳ)、又はＦＬＡＧ(ＣＦＬＡＧ)のいずれかのＣ末端タグを有するヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１の細胞外ドメインを含む発現構築物を、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号８３)をコードするＤＮＡフラグメントと発現ベクターｐＺＭＰ２０を用い、ＰＣＲと相同組換えによって構築する。
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＥＥをコードするＰＣＲフラグメントは、至適化された組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ分泌リーダー配列コード領域におけるｐＺＭＰ２０ベクター配列との５'重複、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１細胞外ドメインコード領域(配列番号８４)、Ｇｌｕ-Ｇｌｕタグ(Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｕ)コード配列、及びポリオウイルス内部リボソームエントリー部位領域におけるｐＺＭＰ２０ベクターとの３'重複を含む。このＰＣＲ増幅反応では、次の５'オリゴヌクレオチド(ＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＡＧＣＴ ＧＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣ)(配列番号８５)、次の３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴ ＡＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号８６)、及び予め作製された鋳型としてのＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１のＤＮＡクローン(配列番号８３)を用いる。
ＰＣＲ増幅反応条件は次の通りである：９４℃５分を１サイクル；９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分を３５サイクル；７２℃１０分を１サイクル。このＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ(商標)ゲル抽出キット(Qiagen, カタログ番号２８７０４)を用い、このゲルから、予測されたサイズに相当するＤＮＡフラグメントを抽出する。
プラスミドｐＺＭＰ２０は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母組換えの前に線状化するためのＢｇｌＩＩ部位、ｏｔＰＡシグナルペプチド配列、ポリオウイルス由来の内部リボソームエントリーエレメント、膜貫通ドメインのＣ末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメインを含む発現カセット；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；並びにＳ.セルビシエ中での選択及び複製に必要なＵＲＡ３及びＣＥＮ-ＡＲＳ配列を含む哺乳類発現ベクターである。
ゲル抽出したＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＥＥ ＰＣＲフラグメントを用い酵母で組換えを行う前に、プラスミドｐＺＭＰ２０をＢｇｌＩＩで切断した。コンピテント酵母(Ｓ.セレビシエ)細胞１００μｌを、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＥＥインサートＤＮＡ １０μｌ及びＢｇＩＩ切断したｐＺＭＰ２０ベクター１００ｎｇと合わせ、この混合物を０.２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。この酵母／ＤＮＡ混合物に、０.７５ｋＶ(５ｋＶ／ｃｍ)、∞オーム、及び２５μＦに設定した電源装置(BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いて電気パルスをかける。このキュベットに１.２Ｍソルビトール６００μｌを加え、酵母１００μｌ及び３００μｌアリコートを２枚のＵＲＡ-Ｄプレートにプレーティングし、３０℃でインキュベートする。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ+酵母形質転換体をＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁させ、軽く回転させて酵母細胞をペレットとする。この細胞ペレットを０.５ｍｌの溶解バッファー(２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁させる。この溶解混合物５００μｌを、酸で洗浄したガラスビーズ２５０μｌとフェノール-クロロホルム３００μｌの入ったエッペンドルフチューブに加え、３分ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心機にて最大速度で５分回転させる。水相３００μｌを新しいチューブに移し、エタノール６００μｌでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で３０分遠心分離する。このチューブをデカントし、ペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄する。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットを３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させる。
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(ＤＨ１２Ｓ)の形質転換を、酵母ＤＮＡ調製物５μｌと大腸菌細胞５０μｌを用いて行う。これらの細胞に、２.０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、１ｍｌ ＳＯＣ(２％Ｂａｃｔｏ(商標)トリプトン(Difco, Detroit, MI)、０.５％酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース)を加えた後、細胞５０μｌ及び２００μｌアリコートを２枚のＬＢ ＡＭＰプレート(ＬＢブロス(Lennox)、１.８％Ｂａｃｔｏ(商標)寒天(Difco)、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン)にプレーティングする。
この構築物の３つのＤＮＡクローンのインサートに対して配列決定を行い、適正な配列を含む１クローンを選択する。製造業者の使用説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を用い、大規模なプラスミドＤＮＡ単離を行う。
同じプロセスを用いて、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ(配列番号８７)(ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＨＩＳ)からなるＣ末端ｈｉｓタグか、又はＧｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ(配列番号８８)(ＺｃｙｔｏＲ２１×１ＣＦＬＡＧ)からなるＣ末端ＦＬＡＧタグを有するＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１も作製する。これらの構築物の作製においては、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＨＩＳを作製するためには、次の３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＴＡ ＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号８９)を用い、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＦＬＡＧを作製するためには、３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴ ＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号９０)を用いる。
実施例２５
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＨＩＳ、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＦＬＡＧ Ｃ末端タグ付きタンパク質を発現する可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１受容体発現構築物のトランスフェクション及び発現
実施例２２に記載のように、各２００μｇの可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１タグ付き発現構築物３組をそれぞれ、２００単位のＰｖｕＩで３７℃にて３時間切断し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、１.５ｍＬ容の微量遠心チューブで遠心分離する。上清をデカントしてペレットを得、このペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄し、室温で５分インキュベートする。このチューブを微量遠心機で１４,０００ＲＰＭにて１０分回転させ、上清をデカントしてペレットを得る。次に、このペレットを無菌環境中、ＣＨＯ細胞組織培養培地７５０μｌに再懸濁させ、６０℃で３０分インキュベートし、室温まで冷却する。３本の各チューブにつき、およそ５×１０6個のＣＨＯ細胞がペレットとなり、これをＤＮＡ媒体溶液に再懸濁させる。これらのＤＮＡ／細胞混合物を０.４ｃｍギャップキュベットに入れ、次のパラメーター：９５０μＦ、高電気容量、３００Ｖを用いてエレクトロポレーションを行う。次に、これらキュベットの内容物を取り出してプールし、ＣＨＯ細胞組織培養培地で２５ｍＬまで希釈し、１２５ｍＬ容の振盪フラスコに入れる。このフラスコを、３７℃、６％ＣＯ2のインキュベーター内の振盪機上に置き、１２０ＲＰＭで振盪する。
これらのＣＨＯ細胞に対して栄養選択を行った後、２００ｎＭメトトレキサート(ＭＴＸ)、次いで１μＭ ＭＴＸへと段階的に増加させる。タグ付きタンパク質の発現はウエスタンブロットにより確認し、タンパク質精製用に採取するため、ＣＨＯ細胞プールをスケールアップする。
実施例２６
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＨＩＳ、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＦＬＡＧタグ付きタンパク質を発現する哺乳類可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２発現構築物の構築
Ｇｌｕ-Ｇｌｕ(ＣＥＥ)、６Ｈｉｓ(ＣＨＩＳ)、又はＦＬＡＧ(ＣＦＬＡＧ)のいずれかのＣ末端タグを有するヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２の細胞外ドメインを含む発現構築物を、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号９１)をコードするＤＮＡフラグメントと発現ベクターｐＺＭＰ２０を用い、ＰＣＲと相同組換えによって構築する。
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＥＥをコードするＰＣＲフラグメントは、至適化された組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ分泌リーダー配列コード領域におけるｐＺＭＰ２０ベクター配列との５'重複、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２細胞外ドメインコード領域(配列番号９２)、Ｇｌｕ-Ｇｌｕタグ(Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｕ)コード配列、及びポリオウイルス内部リボソームエントリー部位領域におけるｐＺＭＰ２０ベクターとの３'重複を含む。このＰＣＲ増幅反応では、５'オリゴヌクレオチド(ＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＡＧＣＴ ＧＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣ)(配列番号９３)、３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴ ＡＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号９４)、及び予め作製された鋳型としてのＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２のＤＮＡクローン(配列番号９１)を用いる。
ＰＣＲ増幅反応条件は次の通りである：９４℃５分を１サイクル；９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分を３５サイクル；７２℃１０分を１サイクル。このＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ(商標)ゲル抽出キット(Qiagen, カタログ番号２８７０４)を用い、このゲルから、予測されたサイズに相当するＤＮＡフラグメントを抽出する。
プラスミドｐＺＭＰ２０は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母組換えの前に線状化するためのＢｇｌＩＩ部位、ｏｔＰＡシグナルペプチド配列、ポリオウイルス由来の内部リボソームエントリーエレメント、膜貫通ドメインのＣ末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメインを含む発現カセット；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；並びにＳ.セレビシエ中での選択及び複製に必要なＵＲＡ３及びＣＥＮ-ＡＲＳ配列を含む哺乳類発現ベクターである。
ゲル抽出したＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＥＥ ＰＣＲフラグメントを用い酵母で組換えを行う前に、プラスミドｐＺＭＰ２０をＢｇｌＩＩで切断した。コンピテント酵母(Ｓ.セレビシエ)細胞１００μｌを、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＥＥ挿入ＤＮＡ １０μｌ及びＢｇＩＩ切断したｐＺＭＰ２０ベクター１００ｎｇと合わせ、この混合物を０.２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。この酵母／ＤＮＡ混合物に、０.７５ｋＶ(５ｋＶ／ｃｍ)、∞オーム、及び２５μＦに設定した電源装置(BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いて電気パルスをかけた。このキュベットに１.２Ｍソルビトール６００μｌを加え、酵母１００μｌ及び３００μｌアリコートを２枚のＵＲＡ-Ｄプレートにプレーティングし、３０℃でインキュベートする。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ+酵母形質転換体をＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁させ、軽く回転させて酵母細胞をペレットとする。この細胞ペレットを０.５ｍｌの溶解バッファー(２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁させる。この溶解混合物５００μｌを、酸で洗浄したガラスビーズ２５０μｌとフェノール-クロロホルム３００μｌの入ったエッペンドルフチューブに加え、３分ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心機にて最大速度で５分回転させる。水相３００μｌを新しいチューブに移し、エタノール６００μｌでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で３０分遠心分離する。このチューブをデカントし、ペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄する。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットを３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させる。
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(ＤＨ１２Ｓ)の形質転換を、酵母ＤＮＡ調製物５μｌと大腸菌細胞５０μｌを用いて行う。これらの細胞に、２.０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、１ｍｌ ＳＯＣ(２％Ｂａｃｔｏ(商標)トリプトン(Difco, Detroit, MI)、０.５％酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース)を加えた後、細胞５０μｌ及び２００μｌアリコートを２枚のＬＢ ＡＭＰプレート(ＬＢブロス(Lennox)、１.８％Ｂａｃｔｏ(商標)寒天(Difco)、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン)にプレーティングする。
この構築物の３つのＤＮＡクローンのインサートに対して配列決定を行い、適正な配列を含む１クローンを選択する。製造業者の使用説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を用い、大規模なプラスミドＤＮＡ単離を行う。
同じプロセスを用いて、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ(配列番号９５)(ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＨＩＳ)からなるＣ末端ｈｉｓタグか、又はＧｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ(配列番号９６)(ＺｃｙｔｏＲ２１×２ＣＦＬＡＧ)からなるＣ末端ＦＬＡＧタグを有するＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１も作製する。これらの構築物の作製においては、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＨＩＳを作製するためには、次の３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号９７)を用い、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１ＣＦＬＡＧを作製するためには、３'オリゴヌクレオチド(ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴ ＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡ)(配列番号９８)を用いる。
実施例２７
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＨＩＳ、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ＣＦＬＡＧ Ｃ末端タグ付きタンパク質を発現する可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２受容体発現構築物のトランスフェクション及び発現
実施例２４に記載のように、各２００μｇの可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２タグ付き発現構築物３組をそれぞれ、２００単位のＰｖｕＩで３７℃にて３時間切断し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、１.５ｍＬ容の微量遠心チューブで遠心分離する。上清をデカントしてペレットを得、このペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄し、室温で５分インキュベートする。このチューブを微量遠心機で１４,０００ＲＰＭにて１０分回転させ、上清をデカントしてペレットを得る。次に、このペレットを無菌環境中、ＣＨＯ細胞組織培養培地７５０μｌに再懸濁させ、６０℃で３０分インキュベートし、室温まで冷却する。３本の各チューブにつき、およそ５×１０6個のＣＨＯ細胞がペレットとなり、これをＤＮＡ媒体溶液に再懸濁させる。これらのＤＮＡ／細胞混合物を０.４ｃｍギャップキュベットに入れ、次のパラメーター：９５０μＦ、高電気容量、３００Ｖを用いてエレクトロポレーションを行う。次に、これらキュベットの内容物を取り出してプールし、ＣＨＯ細胞組織培養培地で２５ｍＬまで希釈し、１２５ｍＬ容の振盪フラスコに入れる。このフラスコを、３７℃、６％ＣＯ2のインキュベーター内の振盪機上に置き、１２０ＲＰＭで振盪する。
これらのＣＨＯ細胞に対して栄養選択を行った後、２００ｎＭメトトレキサート(ＭＴＸ)、次いで１μＭ ＭＴＸへと段階的に増加させる。タグ付きタンパク質の発現はウエスタンブロットにより確認し、タンパク質精製用に採取するため、ＣＨＯ細胞プールをスケールアップする。
実施例２８
ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥ、ＩＬ-１７Ｃ-ＣＨＩＳ、及びＩＬ-１７Ｃ-ＣＦＬＡＧ Ｃ末端タグ付きタンパク質を発現するＩＬ-１７Ｃ発現構築物のトランスフェクション及び発現
ＩＬ-１７Ｃ融合の発現構築物又はタグ付き構築物を用い、リポフェクタミン法により、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)をトランスフェクトした。具体的には、１００ｍｍ皿の１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.２を含有するダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に１×１０6個のＢＨＫ細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。付着した細胞を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１μｇ／ｍｌインスリン、４ｎｇ／ｍｌ二酸化セレン、２５μＭクエン酸鉄(ＩＩＩ)も含んだ血清フリー培地(ＳＦＭ)：ＤＭＥＭ／Ｆ１２(Ｈａｍ)培地(ｌ：ｌ)１０ｍｌですすいだ。ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥのｃＤＮＡを含む発現構築物１６μｇアリコートを、ＳＦＭ１.２ｍｌ中で２０分、リポフェクタミン(Gibco)３５μｌと複合体形成させ、その後、ＳＦＭで希釈した後、プレーティングされたＢＨＫ細胞に適用した。３７℃で５時間のインキュベート後、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ６.５ｍｌを加えた。これらの細胞を加湿した組織培養インキュベーター内で３７℃にて一晩培養した。トランスフェクションしてからおよそ２４時間後、細胞培地を、１０％ウシ胎児血清と１μＭメトトレキサート(ＭＴＸ)を含む新鮮なＤＭＥＭと交換する。１μＭ ＭＴＸ中で７日後、ＭＴＸ濃度を１０μＭに高め、さらに７〜１０日間細胞を増殖させた。これらの細胞を培養維持してＭＴＸ耐性クローンを採取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)、及び抗ＥＥペプチド抗体(ＥＥペプチド＝Ｇｌｕ-Ｇｌｕタグ(Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｕ)を用いたウエスタンブロット法により、ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥの発現に関して培地を評価した。次に、組換えタンパク質の生産のために、ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥ産生細胞をスケールアップした。この方法に関して、本明細書に配列が記載されているＥＥペプチドの代わりに、Ｆｃ配列又は他のタグ配列(Ｈｉｓ、Ｆｌａｇなど)の別の融合タンパク質を含む発現構築物を用いてもよいことは当技術分野で周知のことである。
実施例２９
ＢＨＫ細胞からのＩＬ-１７Ｃ ＣＥＥの精製
ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥ(実施例２６)を発現するＢＨＫ細胞由来の馴化培地を０.２μｍで濾過除菌した後、抗ＥＥペプチド(ＥＥペプチド＝Ｇｌｕ-Ｇｌｕタグ(Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｕ)抗体アフィニティーカラムに載せ、４℃で流した。流す前に、馴化培地と抗ＥＥ抗体カラムのｐＨを７.４に調整した。
カラムに培地を流した後、カラムの１０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４でカラムを洗浄した。次に、結合したタンパク質をカラムの３倍量の、ＥＥペプチド(Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｕ)０.５ｍｇ／ｍｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水で溶出させた。画分を採取し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥクマシーブルー染色により分析した。ＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥ含有画分をプールし、製造業者の使用説明書に従って１０ｋＤ分子量カットオフのウルトラフリー-１５メンブランコンセントレーター(Millipore, Bedford, MA)を用い、およそ１０倍に濃縮した。
次に、この濃縮サンプルに対して、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２で平衡化したセファクリル-Ｓ１００カラム(１６／６０)(Pharmacia, Piscataway, NJ)でサイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶出したタンパク質を３ｍｌずつの画分で回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥクーマシブルー染色により分析した。純粋なＩＬ-１７Ｃ-ＣＥＥを含む画分をプールし、０.２２μｍで濾過除菌した後、タンパク質をアリコートに分け、使用まで-８０℃で保存した。純粋なタンパク質のＮ末端配列決定により、これはＩＬ-１７Ｃであることが同定された。この組換えタンパク質の分析は、この成熟タンパク質のＮ末端配列がシグナル配列を欠き、ヒスチジン-１９で始まり、分子量は、Ｃ末端ＥＥ-タグを含めて２０６６３であることを示す。
実施例３０
２９３Ｆトランジェント細胞からのＨｉｓタグ付きＩＬ-１７Ｃの精製
次の手順を用い、ポリヒスチジンがカルボキシ末端に融合しているヒト型及びマウス型双方のＩＬ１７Ｃを精製した。精製は４℃で行った。Ｈｉｓタグ付きＩＬ１７Ｃでトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞から得られた馴化培地約１０Ｌを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２５ｋフィルター(Millipore, Bedford, MA)を用い、１.６Ｌまで濃縮した。この１.６Ｌ培地にイミダゾール及びＮａＣｌを、それぞれ終濃度１５ｍＭ及び０.５Ｍとなるように加えた。ベッド容量５ｍＬのＴａｌｏｎ(BD Biosciences)カラムを充填し、２０ｍＭ ＮａＰｉ、１５ｍＭイミダゾール、０.５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５で平衡化した。培地を流速１.７ｍＬ／分でカラムに流した後、カラムの１０倍量の平衡バッファーで洗浄した。Ｈｉｓタグ付きＩＬ１７Ｃは、２０ｍＭ ＮａＰｉ、０.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍイミダゾール、ｐＨ７.４、流速１ｍＬ／分でカラムから溶出させた。２ｍＬずつの画分を回収し、クーマシー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、Ｈｉｓタグ付きＩＬ１７Ｃの存在を分析した。
Ｔａｌｏｎカラム溶出プールを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５ｋ遠心分離フィルター(Millipore, Bedford, MA)を用い、１２ｍＬから１ｍＬに濃縮した。ベッド容量１２１ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを、５０ｍＭ ＮａＰｉ、１０９ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.３で平衡化し、サンプル１ｍＬを流速０.５ｍＬ／分でカラムに注入した。２ｍＬずつの画分を回収し、クーマシー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、Ｈｉｓタグ付きＩＬ１７Ｃの存在を分析した。純粋なＨｉｓタグ付きＩＬ１７Ｃを含む画分をプールし、２ｍＬまで濃縮し、２μｍ Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルター(Pall Corporation)で濾過除菌し、-８０℃で保存した。最終サンプルの濃度をＢＣＡ(Pierce, Rockford, IL)により測定した。
実施例３１
ＺｃｙｔｏＲ２１ Ｆｃ１０融合タンパク質発現構築物
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１-Ｃ(Ｆｃ１０)(配列番号９９；配列番号１００)か、又はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２-Ｃ(Ｆｃ１０)(配列番号１０１；配列番号１０２)のいずれかを含む２つの発現プラスミドを、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントと発現ベクターｐＺＭＰ４０を用い、相同組換えによって構築した。ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１)及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号４)のポリヌクレオチド配列のフラグメントは、プライマーｚｃ４８７０６(配列番号１０３)、ｚｃ４８７０７(配列番号１０４)及びｚｃ４８７０８(配列番号１０５)を用い、ＰＣＲ増幅により作製した。
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２のフラグメントは双方とも、それらの個々のコード領域の細胞外ドメインを含んでおり、これはＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１又はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２のいずれかの、予め作製されたクローンを鋳型として用いて作製されたものである。これらのフラグメントは双方とも、部分的ｐＺＭＰ４０ベクター配列を有する５'重複、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１セグメント又はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２セグメントのいずれか、リンカー配列、カスパーゼ-３切断部位、及びＦｃ１０の最初の５個のアミノ酸をコードするリンカー領域、その後に部分的ｐＺＭＰ４０ベクター配列を含む３'重複を含んでいた。ＰＣＲ条件：９４℃５分を１サイクル；９４℃１分、５５℃２分、その後、７２℃３分を３５サイクル；７２℃１０分を１サイクル。
このＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、挿入部のサイズに相当するバンドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ(商標)ゲル抽出キット(Qiagen, カタログ番号２８７０４)を用いてゲル抽出した。
これらのＰＣＲ挿入フラグメントの一方又は他方を用いる組換え反応において、ＢｇｌＩＩで切断したプラスミドｐＺＭＰ４０を用いた。プラスミドｐＺＭＰ４０は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列の挿入のための多重制限部位、及びＦｃ９コード領域を含む発現カセット；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；並びにＳ.セレビシエ中での選択及び複製に必要なＵＲＡ３及びＣＥＮ-ＡＲＳ配列を含む哺乳類発現ベクターである。このプラスミドは、ｐＺＰ９(the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、受託番号９８６６８)から、ｐＲＳ３１６(the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、受託番号７７１４５)から採取した酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の内部リボソームエントリー部位(ＩＲＥＳ)エレメント、及び膜貫通ドメインのＣ末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメインを用いて構築した。
コンピテント酵母(Ｓ.セレビシエ)細胞１００μｌをそれぞれ、インサートＤＮＡ １０μｌ及び切断したｐＺＭＰ４０ベクター１００ｎｇと合わせ、この混合物を０.２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。この酵母／ＤＮＡ混合物に、０.７５ｋＶ(５ｋＶ／ｃｍ)、∞オーム、及び２５μＦに設定した電源装置(BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いて電気パルスをかけた。このキュベットに１.２Ｍソルビトール６００μｌを加え、酵母１００μｌ及び３００μｌアリコートを２枚のＵＲＡ-Ｄプレートにプレーティングし、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ+酵母形質転換体をＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁させ、軽く回転させて酵母細胞をペレットとした。この細胞ペレットを０.５ｍｌの溶解バッファー(２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁させた。この溶解混合物５００μｌを、酸で洗浄したガラスビーズ２５０μｌとフェノール-クロロホルム３００μｌの入ったエッペンドルフチューブに加え、３分ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心機にて最大速度で５分回転させた。水相３００μｌを新しいチューブに移し、エタノール(ＥｔＯＨ)６００μｌと３Ｍ酢酸ナトリウム３０μｌでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で３０分遠心分離した。このチューブをデカントし、ペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄した。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットをＴＥ ３０μｌに再懸濁させた。
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(ＤＨ１２Ｓ)の形質転換は、酵母ＤＮＡ調製物５μｌと細胞５０μｌを用いて行った。これらの細胞に、２.０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、１ｍｌ ＳＯＣ(２％Ｂａｃｔｏ(商標)トリプトン(Difco, Detroit, MI)、０.５％酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース)を加えた後、細胞５０μｌ及び２００μｌアリコートを２枚のＬＢ ＡＭＰプレート(ＬＢブロス(Lennox)、１.８％Ｂａｃｔｏ(商標)寒天(Difco)、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン)にプレーティングした。
この構築物の３つのクローンのインサートに対して配列決定を行い、各クローンにつき、適正な配列を含む１クローンを選択した。製造業者の使用説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を用い、より大規模なプラスミドＤＮＡ単離を行った。
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１-Ｃ(Ｆｃ１０)構築物(配列番号９９)２００μｇ３組をそれぞれ２００単位のＰｖｕ Ｉで３７℃にて３時間切断した後、ＩＰＡで沈殿させ、１.５ｍＬ容の微量遠心チューブで回転沈降させた。上清をデカントしてペレットを得、ペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄し、室温で５分インキュベートした。このチューブを微量遠心機にて１０分、１４,０００ＲＰＭで回転させ、上清をデカントしてペレットを得た。次に、無菌環境中でこのペレットをＰＦ-ＣＨＯ培地７５０μｌに再懸濁させ、６０℃で３０分インキュベートした。５Ｅ６個のＡＰＦＤＸＢ１１細胞を３本の各チューブで回転沈降させ、ＤＮＡ媒体溶液に再懸濁させた。これらのＤＮＡ／細胞混合物を０.４ｃｍギャップキュベットに入れ、次のパラメーター：９５０μＦ、高電気容量、３００Ｖを用いてエレクトロポレーションを行った。次に、これらキュベットの内容物を取り出してプールし、ＰＦ-ＣＨＯ培地で２５ｍＬまで希釈し、１２５ｍＬ容の振盪フラスコに入れた。このフラスコを、３７℃、６％ＣＯ2のインキュベーター内の振盪機上に置き、１２０ＲＰＭで振盪した。タンパク質発現はウエスタンブロットによって確認した。
この細胞系統に対して栄養選択を行った後、１００ｎＭメトトレキサート(ＭＴＸ)、次いで５００ｎＭ ＭＴＸへと段階的に増加させた。段階的増加の後にＣＤ８細胞を選別した。このＣＤ８細胞の選別は、５００ｎＭ ＭＴＸに増加させた安定なプールを得、製造業者の推奨濃度を用い、モノクローナルＦＩＴＣ抗ＣＤ８抗体(BD PharMingen, カタログ番号３０３２４Ｘ)でおよそ５Ｅ６個の細胞を染色することによって行った。染色した細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ(ＢＤ)フローサイトメーターで処理し、選別した。細胞の上層５％を採取し、増殖させた。
実施例３２
受容体-リガンド相互作用の検出のためのリンタンパク質アッセイ
特異的な受容体-リガンド結合は、いくつかの異なる方法で検出可能な細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。特異的受容体-リガンド結合の数分内に、増殖、アポトーシス、細胞接着、炎症性応答増殖などをはじめとする下流細胞応答の活性化又は不活性化をもたらすシグナル伝達経路内のキナーゼ及び転写因子のリン酸化状態に変化を生じる。これらのシグナル伝達経路の活性化は、キナーゼ又は転写因子のリン酸化形態を特異的に認識する抗体の使用によって検出することができる。リンタンパク質レベルの変化は、ウエスタンブロット法、標準的ＥＬＩＳＡ法、又はＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘ懸濁アレイ系などのＬｕｍｉｎｅｘ検出技術に基づく市販のキットを用いた多重イムノアッセイにより検出及び定量することができる。
ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘアッセイ系は、捕捉サンドイッチイムノアッセイと類似のアッセイ系に基づくビーズである。目的の標的タンパク質(全転写因子又はキナーゼ)に対する抗体を、内部に色素を有する蛍光ビーズに共有結合させる。結合ビーズを標的タンパク質を含む溶解液と反応させる。一連の線状で結合していないタンパク質を除去した後、標的タンパク質のリン酸化形態(リン酸化された転写因子又はキナーゼ)に対して向けられた、種々のエピトープに特異的なビオチニル化検出抗体を加える。この結果、標的タンパク質を挟んだサンドイッチが形成される。ストレプトアビジン-フィコエリトリンを加えてビオチニル化検出抗体と結合させる。異なる蛍光色素を有するビーズと結合した抗体は別々に実施することもできるし、あるいは、ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ(商標)３.０ソフトウエアと組み合わせたＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘ懸濁アレイ系で複数の標的タンパク質が同時に測定できるように組み合わせて実施することもできる。この様式では、最大１００の異なる標的タンパク質が同時にアッセイできる。多重アッセイ形式の一例として、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ｐ３８ Ｍａｐキナーゼ、Ａｋｔ、ＡＴＦ-２、ＳＴＡＴ-３、及びＩκβαのリン酸化形態の同時測定がある。
ＩＬ-１７Ｃ又は他の特異的リガンドによるＺｃｙｔｏＲ２１の結合及び活性化は、その受容体を内因的に発現する細胞系統を用いることで検出することができる(ＲＴ-ＰＣＲによって測定される)。あるいは、トランスフェクトされたＺｃｙｔｏＲ２１受容体を過剰発現する細胞も使用することができる(実施例１７の場合のように、トランスフェクトされたＺｃｙｔｏＲ２１受容体を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８細胞)。
細胞の処理
内因性の、又はトランスフェクトされたＺｃｙｔｏＲ２１を発現する細胞系統を９６ウェル組織培養プレートに５０００細胞／ウェルで入れ、完全増殖培地中で一晩増殖させる。血清フリー増殖培地でさらに２４時間細胞を培養した後、３００ｎｇ／ｍＬまでの様々な濃度のＩＬ-１７Ｃで７分及び１５分処理する。さらに細胞を、ＺｃｙｔｏＲ２１リガンド(ＩＬ-１７Ｃ)と組み合わせた既知のサイトカイン又は増殖因子の存在下でインキュベートし、既知の因子のシグナル伝達を増強又は阻害するＺｃｙｔｏＲ２１リガンドの能力を調べることができる。
溶解液の調製
インキュベート後、細胞を１００μｌ／ウェルの氷冷洗浄バッファーで洗浄し、氷上に置き、５０μｌ／ウェルの溶解バッファー(ＢｉｏＰｌｅｘ細胞溶解キット,カタログ番号１７１-３０４０１２)を加える。氷上で溶解液をピペットで５回上下させた後、マイクロプレートプラットフォーム振盪機にて３００ｒｐｍ、４℃で２０分、振盪させる。プレートを４５００ｒｐｍにて４℃で２０分遠心分離する。上清を回収し、新しいマイクロタイタープレートに移し、リンタンパク質アッセイまで-２０℃で保存する。溶解液中のタンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄのＤＣタンパク質アッセイ又は総タンパク質濃度を測定するいずれかの標準的な方法を用いて測定する。サンプルは、必要に応じて溶解バッファーを加えて総タンパク質２００〜９００μｇ／ｍＬとなるように調整する。
Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘ(Ｌｕｍｉｎｅｘ)リンタンパク質アッセイ
捕捉ビーズ(５０μｌ／ウェル)(目的の転写因子に対する一次抗体と結合されたビーズ)を、マイクロタイタープレート中の溶解液５０μｌに加える。アルミホイルで覆ったプレートを、３００ｒｐｍで振盪させながら室温で一晩インキュベートする。このプレートをマイクロタイター真空装置に移し、アッセイバッファーで３回洗浄する。２５μｌ／ウェルの検出抗体を加えた後、アルミホイルで覆ったプレートを室温で３０分、３００ｒｐｍでインキュベートする。このプレートを濾過し、アッセイバッファーで３回洗浄する。ストレプトアビジン-ＰＥ(５０μｌ／ウェル)を加え、アルミホイルで覆ったプレートを室温で１５分、３００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートする。このプレートを濾過し、ビーズ再懸濁バッファーで２回洗浄する。最後の洗浄の後、ビーズを１２５μｌ／ウェルのビーズ懸濁バッファーに再懸濁させ、３０秒振盪させ、製造業者の使用説明書に従ってＢｉｏ-Ｐｌｅｘ懸濁アレイ系で読み取る。データはＢｉｏ-Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウエアを用いて解析する。溶解液中に存在するリン酸化転写因子のレベルに変化があれば、特異的受容体-リガンド相互作用を示す。
リンタンパク質のウエスタン分析
また、上記のように調製した溶解液を、標準的なウエスタンブロットプロトコールを用いて分析し、リン酸化状態に特異的な抗体を用いてプローブすることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１とＩＬ-１７Ｃ(又は他のリガンド)の間の受容体-リガンド相互作用は、ゲル上に存在するリン酸化された転写因子のバンド強度の変化によって示すことができる。
実施例３３
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、並びにヒトＩＬ-１７Ｒに対するヒトＩＬ-１７Ｃの結合
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた２９３ｆｂ細胞を、ビオチニル化ヒトＩＬ-１７Ｃと結合する能力に関して評価した。対照トランスフェクションとして、１)ＤＮＡを含まないトランスフェクション、２)ベクター単独(ｐｚｍｐ１１)、及び３)ヒトＩＬ１７Ｒを含んだ。１日目、２日目、３日目、及び５日目のトランスフェクト懸濁培養物から１０6個の細胞を取り出した。細胞をペレットとし、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び０.１％アジ化ナトリウム(ｗ／ｖ)を含むＨＢＳＳである染色培地(ＳＭ)１００μｌに再懸濁させた。１μｇ／ｍｌ濃度のビオチニル化ヒトＩＬ-１７Ｃを氷上で細胞とともに４５分インキュベートした。また、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ８抗体(BD Pharmingen；カタログ番号５５５３６９)も１：２５希釈で加えた。３０分後、過剰なサイトカイン及び抗体をＳＭで洗い流し、細胞を氷上で３０分、１：１００希釈のストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン(SA-PE; BD Pharmingen; カタログ番号５５４０６１)とともにインキュベートした。過剰なＳＡ-ＰＥを洗い流し、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
サイトカイン結合の量は、陰性対照、すなわち、１)ＤＮＡを含まないトランスフェクション及び２)ベクター単独と比較した、サイトカイン染色の平均蛍光強度の変化から検出した。この分析から、発明者らは、ヒトＩＬ-１７ＣがヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１とＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２の双方に結合するが、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２との結合が有意に多いことを見出した。また、ヒトＩＬ-１７Ｒへの結合も見られた。
次に、ベビーハムスター腎臓細胞を、次にそれらの細胞に対してメトトレキサート薬剤選択を行い、トランスフェクトされた細胞だけを選択的に増殖させたこと以外は上記と同様に、発現ベクターでトランスフェクトした。安定な細胞系統を確立し、ＣＤ８発現及び上記のようにビオチニル化ＩＬ-１７Ｃの結合に関してアッセイした。一時的トランスフェクションの分析で得られた結果と一致して、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２及びｘ１型を発現したＢＨＫ細胞系統だけがＩＬ-１７Ｃと結合した。ここで、ｘ２型とＩＬ-１７Ｃの結合の方がｘ１型よりも良好であった。
実施例３４
ＺｃｙｔｏＲ２１変異体に対するＩＬ-１７Ｃの結合
ヒト及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体で安定トランスフェクトされたＢＨＫ細胞をＴ-７５フラスコにプレーティングし、集密となるまで増殖させた。Ｖｅｒｓｅｎｅ(Invitrogen 15040-066)などの非プロテアーゼ試薬を用いて細胞を剥がし、ペレットとし、染色試薬(ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ＋０.１％ＮａＡｚｉｄｅ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ)に、２×１０ｅ７細胞／ｍｌで再懸濁させ、９６ウェルＣｏｓｔａｒプレートに分注した。ビオチンで標識したＩＬ-１７Ｃを１μｇ／ｍｌの濃度で細胞に独立に加えた。この細胞／リガンド混合物は４℃で１時間インキュベートすることができる。これらのウェルを試薬で１回洗浄し、染色試薬とストレプトアビジン-ＰＥ(BD Pharmingen 554061)を１：１００の比率で含有する第二の試薬中でインキュベートした。これらのウェルを４℃の暗所で１時間インキュベートした後、染色培地で２回洗浄した。次に、これらの細胞を染色培地とＣｙｔｏｆｉｘ(BD Bioscience 554655)の１：１混合物中に再懸濁させ、室温で１０分インキュベートした。フローサイトメトリーにより、そしてＩＬ-１７Ｃと結合した細胞に対してＰＥ陽性とするゲート設定により、細胞を分析した。
結果は次の通りであった。ヒトＩＬ-１７Ｃと結合したＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３、及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６である。マウスＩＬ-１７Ｃと結合したＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体は、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３、及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６である。マウスＩＬ-１７Ｃはまた、マウスＩＬ１７-ＲＡとも結合した。さらに、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、及びＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３は、ＩＬ-１７Ａ、ＩＬ-１７Ｂ、ＩＬ-１７Ｄ、及びＩＬ-１７Ｆ(全てビオチニル化ヒト型)のいずれとも結合しなかった。
リポフェクタミン２０００(Invitrogen 11668-027)を用い、ＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体で一時的にトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞を上記のように染色した。これらのＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体は、実施例２２及び２４に記載のように、Ｃ末端でＦｌａｇ Ｔａｇ及びＧＰＩ結合ドメインと結合された細胞外ドメインを有するように操作されていた。このＦｌａｇ Ｔａｇを、上記のような染色の指針に従い、１：１００の抗Ｆｌａｇ-ＦＩＴＣ抗体(Sigma F-4049)を用いて検出した。
結果は次の通りであった。ヒトＩＬ-１７Ｃと結合したＺｃｙｔｏＲ２１スプライス変異体はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ４、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３、及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６である。程度は低いが、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３もヒトＩＬ-１７Ｃと結合した。
実施例３５
ＰＣＲを用いた細胞系統パネルにおけるｍＲＮＡの分布
ヒト細胞系統を自所で増殖させ、そのいくつかを次のように種々の薬剤で処理した：ＰＭＡ(ホルボール-１２-ミリステート-１３-アセテート)１０ｎｇ／ｍｌ及びイオノマイシン０.５μｇ／ｍｌで４時間(これらの細胞系統は「活性化型」と表示される)、ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍｌで４８時間、ＬＰＳ(リポ多糖)１００ｎｇ／ｍｌで２４時間、ＳＥＢ(ブドウ球菌(Staphlyococcus)内毒素Ｂ)１μｇ／ｍｌで２４時間、及びＣＴＸ(コレラ毒)５０ｎＭで２４時間。製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ(Valencia, CA)ＲＮｅａｓｙキット、又は酸-フェノール精製プロトコール(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)を用いてＲＮＡを精製した。このＲＮＡの品質を、アリコートをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに流すことによって評価した。ＲＮＡの分解が著しければ、その後の第一鎖ｃＤＮＡの作出には用いなかった。ゲノムＤＮＡの混入は、遺伝子間ゲノムＤＮＡの単一部位を増幅するプライマーであるｚｃ４１０１１ ５'ＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡＣ ３ '(配列番号１４０)及びｚｃ４１０１２ ５'ＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣ ３'(配列番号１４１)を用い、ＲＮＡアリコートに対するＰＣＲアッセイによって評価した。混入ゲノムＤＮＡアッセイのためのＰＣＲ条件は次の通りであった：最終量２５μｌ中、２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)、並びに０.５μｌ ２０μＭ ｚｃ４１０１１及びｚｃ４１０１２。サイクリングパラメーターは、９４℃２０秒；９４℃２０秒及び６０℃１分２０秒を４０サイクル；その後、７２℃７分を１サイクル。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、混入ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の存在に関してゲルを調べた。混入ゲノムＤＮＡが見られた場合には、その全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、ＤＮＡフリー試薬(Ambion, Inc, Austin, TX)を用いてＤＮアーゼ処理し、その後、上記のように再試験を行った。混入ゲノムＤＮＡが存在しないことが明らかになったＲＮＡだけを、その後の第一鎖ｃＤＮＡの作出に用いた。
９０の細胞系統からの全ＲＮＡ２０μｇをそれぞれＨ2Ｏで９８μｌとした後、各全ＲＮＡ１０μｇを含む２つの４９μｌアリコートに分割し、２枚の９６ウェルＰＣＲプレートに入れた。各アリコートに第一鎖ｃＤＮＡ合成のための試薬(Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA)：２０μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μｌ １０×ＲＴバッファー、１０μｌ ０.１Ｍ ＤＴＴ、２μｌオリゴｄＴ、２μｌ ＲＮＡｓｅＯｕｔを加えた。次に、各細胞系統由来の１つのアリコートに、２μｌスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を加え、もう一方の細胞系統アリコートには、２μｌ Ｈ2Ｏを加えて、逆転写酵素を含まない陰性対照とした。全てのサンプルを次のようにインキュベートした：２５℃１０分、４２℃５０分、７０℃１５秒。サンプルを深孔プレートに配置し、Ｈ2Ｏで１.７ｍｌまで希釈した。Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅ(Saigan)ロボットを用い、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに１６.５μｌの分注を多数回行い、細胞系統の１回使用用ＰＣＲパネルを多数作製し、これを密封し、-２０℃で保存した。これらのパネルの各ウェルは、およそ１００ｎｇの全ＲＮＡに由来する第一鎖ｃＤＮＡに相当する。１８０のサンプルは２枚の９６ウェルパネル、アレイ番号１１９.０１と１１９.０２に分布している。これらのパネル上の第一鎖ｃＤＮＡの品質を、発現は広範囲であるが、存在量は多くない２つの遺伝子ＣＬＴＣ(クラスリン)とＴＦＲＣ(トランスフェリン受容体Ｃ)に対するプライマーを用い、１組のパネルで多重ＰＣＲアッセイによって評価した。クラスリンプライマーｚｃ４２９０１：５'ＣＴＣＡＴＡＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＡＧ ３'(配列番号１４２)、ｚｃ４２９０２：５'ＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧ ３'(配列番号１４３)、及びＴＦＲＣプライマーｚｃ４２５９９：５'ＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴ ３'(配列番号１４４)、ｚｃ４２６００：５'ＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＴＣＴＡＣ ３'(配列番号１４５)各０.５μｌを、２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合し、アレイ番号１１９.０１とアレイ番号１１９.０２のパネルの各ウェルに加えた。サイクリングパラメーターは次の通りとした：９４℃２０秒；９４℃２０秒及び６７℃８０秒を３５サイクル；その後、７２℃７分を１サイクル。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、各細胞系統について＋ＲＴウェルに特異的な各遺伝子のＰＣＲ産物が多量に存在しているかどうかに関してゲルをスコアリングした。
ＩＬ-１７Ｃに関する第一鎖ｃＤＮＡパネルにおけるｍＲＮＡの発現は、センスオリゴｚｃ２６００４： ５'ｃａｃｔｇｃｔａｃｔｃｇｇｃｔｇａｇｇａａｃｔｇｃ ３'(配列番号１４６)及びアンチセンスオリゴｚｃ２０９９６： ５'ｔｔｃｔｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｃｃｔｃａｔｃ ３'(配列番号１４７)を用いたＰＣＲによって、サンプル：２.５μｌ １０×バッファー及び０.５μｌ ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、２μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰミックス(Applied Biosystems)、２.５μｌ １０×Ｒｅｄｉｌｏａｄ(Invitrogen, Carlsbad, CA)、及び各０.５μｌの２０μＭセンス及びアンチセンスプライマーにつきこれらのＰＣＲ条件下でアッセイした。サイクル条件は、９４℃２分；９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル；その後、７２℃７分を１サイクルとした。各反応液１０μｌに対してアガロースゲル電気泳動を行い、ＩＬ-１７Ｃ発現が陽性であるか陰性であるか、ゲルをスコアリングした。
結果は、いくつかの細胞系統で、それらが薬剤で処理されているかどうかによってＩＬ-１７Ｃの発現が異なることを示した。休止状態でＩＬ-１７Ｃ陰性であり、かつ、活性化又は処理状態でＩＬ-１７Ｃ陽性であった細胞系統は、骨髄ＡＭＬ細胞系統ＫＧ-１、ＴＮＦα、ＬＰＳ、又はＳＥＢで処理されたＮＨＢＥ(正常ヒト気管支上皮一次細胞)細胞系統、及びＵ-９３７単球細胞系統であった。これに対し、Ｔａｎｏｕｅ ＡＬＬ Ｂ細胞系統及びホジキンリンパ腫細胞系統ＫＭ-Ｈ２は、休止状態ではＩＬ-１７Ｃ陽性であり、活性化細胞系統のＲＮＡはＩＬ-１７Ｃ陰性であることが分かった。
刺激状態及び休止状態ともにＩＬ-１７Ｃ陽性であった細胞系統は、ＤＵ-４４７５、Ｕ６９８、ＭＮ６０、ＡＭＬ-１９３、ＤＢ、ＮＫ-９２、Ｍｏｌｔ-４、ＵＴ-７、ＷｅＲＩ-Ｒｂ.１、ＣＣＲＦ-ＨＳＢ２、及びＮＣＩ-Ｈ９２９であった。最後に、休止状態でのみ処理した細胞系統がＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡ陽性であったものは、ＮＣＩ-Ｈ７１６、ＮＣＩ-Ｈ２９５Ｒ、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８、ＪＡＲ、ＮＩＨ： ＯＶＣＡＲ-３、Ｓｕｐ-Ｂ１５、ＮＣＩ-Ｈ６９、ＨＥＬ-２９９、ＩＭＲ-９０、ＮＩＣ- Ｈ２９２、ＢＥＡＳ２Ｂ、Ｕ２ＯＳ、ＨＦＬＳ-ＯＡ、ＭＧ-６３、５６３７、ＨＫ-２、Ｄａｕｄｉ、及びＨｕｔ ７８であった。
結果を全体的に見ると、ＩＬ-１７Ｃは、数種の免疫系関連細胞系統を含む多くの細胞系統で構成的に発現されるが、種々の薬剤による活性化に応答してＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡを発現し始める細胞系統もいくつかあることを示す。特に注目されるのは、ＴＮＦα、ＬＰＳ及びＳＥＢ(これらは全て炎症性化合物であると考えられる)で処理した際にＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡを産生する気管支一次上皮細胞系統ＮＨＢＥの応答である。このことは、ＩＬ-１７Ｃが炎症誘導に役割を果たすことを示唆している。
実施例３６
マウスＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは非罹患組織に比べマウスモデルの選択された組織において調節される
試験プロトコール
次のマウス疾患モデル：大腸炎、喘息、実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、乾癬及びコラーゲン誘導関節炎(ＣＩＡ)から組織を得た。動物モデルは標準的な手順従って取扱い、適当な非罹患対照を含めた。大腸炎は、飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)により誘導し、このモデルから単離した組織としては、遠位結腸、近位結腸及び腸間膜リンパ節を含んだ。喘息は、抗原オボアルブミンの感作及び鼻腔内刺激によって誘導した。単離組織としては、肺、脾臓及びリンパ節を含んだ。ＥＡＥは、ＲＩＢＩアジュバント中のＭＯＧ３５-５５ペプチドの感作により誘導した。単離組織としては、脳、頸部、リンパ節、及び脊髄を含んだ。乾癬は、副組織適合性が合致しないマウス又は同系免疫不全マウスにナイーブＴ細胞を移注(adoptive transfer)することによって誘導した。単離組織としては、病変皮膚及び隣接する皮膚を含んだ。ＣＩＡはコラーゲン注射により誘導し、単離組織としては、脚及び膝窩リンパ節を含んだ。標準的な手順を用い、全ての組織からＲＮＡを単離した。要するに、組織を採取し、すぐに液体窒素中で凍結させ、その後、処理まで-８０℃下に移した。
処理については、組織をＱｉａｚｏｌ試薬(Qiagen, Valencia, CA)中に入れ、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットを製造業者の推奨に従って用い、ＲＮＡを単離した。マウスＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの発現は、多重リアルタイム定量的ＲＴ-ＰＣＲ法(TaqMan)及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００配列検出系(PE Applied Biosystems)を用いて測定した。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡレベルは、マウス・ヒポキサンチングアニンフィスホリボシル(physphoribosyl)トランスフェラーゼｍＲＮＡの発現に対してノーマライズし、閾値サイクルの比較法(comparative threshold cycle method)(User Bulletin 2; PE Applied Biosystems)により判定した。マウスＺｃｙｔｏＲ２１のプライマー及びプローブとしては、フォワードプライマー５' ＣＣＡＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＧＡＡＡ(配列番号１４８)、リバースプライマー５' ＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＴ(配列番号１４９)、及びプローブＡＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧ(配列番号１５０)を含んだ。
マウスＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡ発現は、全ての供試組織で検出された。最も高いレベルの発現は、結腸、皮膚、肺、及び脚組織で見られた。それより低い発現が、脳、脊髄、リンパ節、及び脾臓組織で見られた。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、非罹患対照に比べ、ＥＡＥモデルの動物由来の脊髄組織で高かった。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、軽度疾病スコアの動物ではおよそ３.７５倍高く、重度疾病スコアの動物ではおよそ２.８倍高かった。急性ＤＳＳ大腸炎モデル由来の組織のマウスＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、非罹患対照由来の組織に比べて低かった。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは非罹患対照に比べ、遠位結腸ではおよそ２.２倍低く、近位結腸ではおよそ２.８倍低かった。
よって、当業者ならば、このような疾患でＺｃｙｔｏＲ２１の発現が上昇していることから、本発明の可溶性受容体及びＭＡｂなどのＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニストがこれらの疾患の処置に有用であることが分かるであろう。
実施例３７
ＺｃｙｔｏＲ２１は潰瘍性大腸炎及びクローン病患者の炎症大腸部分において調節される
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、正常対照患者の大腸部分に比べ潰瘍性大腸炎及びクローン病患者の炎症大腸部分において調節される。
試験プロトコール
クローン病患者、潰瘍性大腸炎患者又は正常対照患者の炎症大腸部分及び非炎症大腸部分から組織を得た。標準的な手順を用いてＲＮＡを単離した。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの発現は、多重リアルタイム定量的ＲＴ-ＰＣＲ法(TaqMan)及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００配列検出系(PE Applied Biosystems)を用いて測定した。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡレベルは、ヒト・ヒポキサンチングアニンフィスホリボシル(physphoribosyl)トランスフェラーゼｍＲＮＡの発現に対してノーマライズし、閾値サイクル比較法(User Bulletin 2; PE Applied Biosystems)により判定した。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１のプライマー及びプローブとしては、フォワードプライマー５'ＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡ(配列番号１５１)、リバースプライマー５'ＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＴ(配列番号１５２)、及びプローブＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ(配列番号１５３)を含んだ。
結果
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡの発現は、全ての供試大腸サンプルで検出された。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、正常患者由来の大腸に比べ、潰瘍性大腸炎患者の大腸では２.１倍低かった。ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＲＮＡは、クローン病患者由来の大腸サンプルでは低かった。ＺｃｙｔｏＲ２１の発現は、無病な正常患者に比べて１.５倍低かった。
ＺｃｙｔｏＲ２１発現の低下は、上皮粘膜のＺｃｙｔｏＲ２１発現細胞の減少によって説明することができる。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)の投与を含むラット大腸炎モデル(Scand J Gastroenterol. 2000 Oct;35(10):1053-9参照)は、ＤＳＳ投与後６０分では低い上皮細胞生存率を示し、投与後２日では上皮が剥離するとして、この仮説を支持する。
実施例３８
マウスＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは非罹患組織に比べマウス疾患モデルの選択された組織において調節される
マウスＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、非罹患対照に比べ、マウス疾患モデルの選択された組織において調節される。
試験プロトコール
次のマウス疾患モデル：大腸炎、喘息、実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、乾癬及びコラーゲン誘導関節炎(ＣＩＡ)から組織を得た。動物モデルは標準的な手順従って取扱い、適当な非罹患対照を含めた。大腸炎は、飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)により誘導し、このモデルから単離した組織としては、遠位結腸、近位結腸及び腸間膜リンパ節を含んだ。喘息は、抗原オボアルブミンの感作及び鼻腔内刺激によって誘導した。単離組織としては、肺、脾臓及びリンパ節を含んだ。ＥＡＥは、ＲＩＢＩアジュバント中のＭＯＧ３５-５５ペプチドの感作により誘導した。単離組織としては、脳、頸部、リンパ節、及び脊髄を含んだ。乾癬は、副組織適合性の適合しないマウス又は同系免疫不全マウスにナイーブＴ細胞を移注することによって誘導した。単離組織としては、病変皮膚及び隣接する皮膚を含んだ。ＣＩＡはコラーゲン注射により誘導し、単離組織としては、脚及び膝窩リンパ節を含んだ。標準的な手順を用い、全ての組織からＲＮＡを単離した。要するに、組織を採取し、すぐに液体窒素中で凍結させ、その後、処理まで-８０℃下に移した。処理については、組織をＱｉａｚｏｌ試薬(Qiagen, Valencia, CA)中に入れ、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットを製造業者の推奨に従って用い、ＲＮＡを単離した。マウスＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡの発現は、多重リアルタイム定量的ＲＴ-ＰＣＲ法(TaqMan)及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００配列検出系(PE Applied Biosystems)を用いて測定した。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡレベルは、マウス・ヒポキサンチングアニンフィスホリボシル(physphoribosyl)トランスフェラーゼｍＲＮＡの発現に対してノーマライズし、閾値サイクル比較法(User Bulletin 2; PE Applied Biosystems)により判定した。マウスＩＬ-１７Ｃのプライマー及びプローブとしては、フォワードプライマー５'ＴＧＧＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＡ(配列番号１５４)、リバースプライマー５'ＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴ(配列番号１５５)、及びプローブＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧ(配列番号１５６)を含んだ。
結果
マウスＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡの発現は、全ての供試組織で検出された。最も高いレベルの発現は、リンパ節、結腸、皮膚、肺、脚及び脾臓組織で見られた。それより低い発現が、脳及び脊髄組織で見られた。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、非罹患対照の脚組織に比べ、ＣＩＡ関節炎モデルのマウス由来の全脚組織で高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、軽度疾病スコアの動物ではおよそ６.６倍高く、中度疾病スコアの動物ではおよそ９.１倍高く、重度疾病スコアの動物ではおよそ５倍高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、非罹患対照に比べ、ＥＡＥモデルの動物由来の脊髄組織では高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、軽度疾病スコアの動物ではおよそ２.０５倍高く、重度疾病スコアの動物ではおよそ２.９倍高かった。マウスＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、非罹患対照由来の組織に比べ、急性ＤＳＳ大腸炎モデル由来の組織で高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、非罹患対照に比べ、遠位結腸ではおよそ２.８倍高く、近位結腸ではおよそ１.９倍高かった。
実施例３９
ＩＬ-１７Ｃは潰瘍性大腸炎及びクローン病患者の炎症大腸部分において調節される
ヒトＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、クローン病患者の炎症大腸部分において調節される。
試験プロトコール
クローン病患者、潰瘍性大腸炎患者又は正常対照患者の炎症大腸部分及び非炎症大腸部分から組織を得た。標準的な手順を用いてＲＮＡを単離した。ヒトＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡの発現は、多重リアルタイム定量的ＲＴ-ＰＣＲ法(TaqMan)及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００配列検出系(PE Applied Biosystems)を用いて測定した。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡレベルは、ヒト・ヒポキサンチングアニンフィスホリボシル(physphoribosyl)トランスフェラーゼｍＲＮＡの発現に対してノーマライズし、閾値サイクル比較法(User Bulletin 2; PE Applied Biosystems)により判定した。ヒトＩＬ-１７Ｃのプライマー及びプローブとしては、フォワードプライマー５'ａｔｇ ａｇｇ ａｃｃ ｇｃｔ ａｔｅ ｃａｃ ａｇａ ３'(配列番号１５７)、リバースプライマー：５'ｃｃｃ ｇｔｃ ｃｇｔ ｇｃａ ｔｃｇ ａ３'(配列番号１５８)、及びプローブ：ｔｇｇ ｃｃｔ ｔｃｇ ｃｃｇ ａｇｔ ｇｃｃ ｔｇ(配列番号１５９)を含んだ。
結果
ヒトＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡの発現は、全ての供試大腸サンプルで検出された。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、クローン病患者由来のサンプルで高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、無病の正常患者に比べ、およそ７.７倍高かった。ＩＬ-１７Ｃ ｍＲＮＡは、正常患者由来の大腸に比べ、潰瘍性大腸炎患者の大腸の全てではないが幾人かの大腸で高かった。
実施例４０
ＺｃｙｔｏＲ２１形質転換体に対するＩＬ-１７Ｃの機能的応答
実施例１９に記載のように、ＮＩＨ-３Ｔ３／ＫＺ１４２細胞を、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、及びヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６受容体スプライス変異体で安定にトランスフェクトした。実施例３２に記載のように、各細胞系統を応答用量のヒトＩＬ-１７Ｃ(配列番号１７)、マウスＩＬ-１７Ｃ(配列番号１９)、及び適当な対照で７分間及び１５分間処理した。ヒトＩＬ-１７Ｃのみを用いて、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１形質転換体を分析した。ヒト及びマウスＩＬ-１７Ｃは、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(ｎ＝３)、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(ｎ＝３)、及びヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(ｎ＝２)スプライス変異体を過剰発現する系統において、リン酸化ＩκＢ-αに用量依存的応答を誘導し、非トランスフェクトＮＩＨ-３Ｔ３／ＫＺ１４２細胞(ｎ＝３)には応答をもたらさなかった。７分の時点で、ヒトＩＬ-１７Ｃは、ＮＴＨ-３Ｔ３／ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２系統に対し、３００ｎｇ／ｍＬで４.６８倍の最大応答をもたらし、一方、マウスＩＬ-１７Ｃは、３００ｎｇ／ｍＬで５.２２倍の最大応答をもたらした。同様に、ヒトＩＬ-１７Ｃは、ＮＴＨ-３Ｔ３／ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６に対し、３.０４倍の最大応答をもたらし、一方、マウスＩＬ-１７Ｃは、２.９２倍の最大応答をもたらした。１５分の時点では、ヒトＩＬ-１７Ｃ(Ａ９０３Ｇ)は、ＮＴＨ-３Ｔ３／ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１系統に対し、１００ｎｇ／ｍＬで２.５４倍の最大応答をもたらした。よって、当業者ならば、ＺｃｙｔｏＲ２１受容体スプライス変異体が過剰発現される細胞にのみ見られる、ＩＬ-１７Ｃによって誘導される結合及び細胞内シグナル伝達が、ＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１の間の特異的な受容体-リガンド相互作用の証拠であることが分かるであろう。
実施例４１
ヒトＺｃｙｔｏＲＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲＲ２１ｘ２スプライス変異体でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８細胞及びＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８に対するＩＬ-１７Ｃ活性を測定するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ
１日目： ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８(誘導型ＮＦｋＢ／ＡＰ１ルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞)、並びにＺｃｙｔｏＲ２１受容体スプライス変異体であるヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、又はＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６でさらに安定にトランスフェクトされた同じ細胞を、白色ソリッド９６ウェル組織培養プレート(カタログ番号３９１７. Costar)にて、ＤＭＥＭ高グルコース、５％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×Ｇ４１８、及び１μＭ ＭＴＸ(ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８親細胞系統の増殖培地ではＭＴＸを除いた)中、５０００細胞／ウェルでプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ2下で一晩培養した。
２日目： 増殖培地をＤＭＥＭ高グルコース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０.１％ＢＳＡ、及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(アッセイ培地)に交換し、プレートを３７℃、５％ＣＯ2下で一晩インキュベートした。
３日目： ヒトＩＬ-１７Ｃ、マウスＩＬ-１７Ｃ、及び適当な対照タンパク質をアッセイ培地で連続希釈した。ヒトＩＬ-１７Ｃのみを用いて、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１形質転換体を分析した。消耗培地を細胞から除去し、各濃度の試験リガンド又は対照タンパク質を３反復でウェルに加え、最終アッセイ濃度０、０.１、１、１０及び１００ｎｇ／ｍｌとした。３７℃、５％ＣＯ2下で４時間インキュベート後、アッセイ培地を除去し、２５μｌ／ウェルの１×溶解バッファー(Promegaカタログ番号Ｅ１５３１)を加えた。プレートを室温で１０分インキュベートした後、Ｂｅｒｔｈｏｌｄマイクロプレート照度計にて、３秒間組み込み及び４０μｌのルシフェラーゼ基質(Promegaカタログ番号Ｅ４５５０)を用いて読み取った。
ヒト及びマウスＩＬ-１７Ｃはいずれも、ＺｃｙｔｏＲ２１Ｘ２及びＺｃｙｔｏＲ２１Ｘ６スプライス変異体を過剰発現する細胞において、２倍を超えるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を誘導した。親ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＺ１４２.８細胞では誘導は見られなかった。よって、当業者ならば、ＺｃｙｔｏＲ２１受容体スプライス変異体が過剰発現される細胞にのみ見られる、ＩＬ-１７Ｃによって生じる結合及び細胞内シグナル伝達が、ＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１の間の特異的な受容体-リガンド相互作用の証拠であることが分かるであろう。
実施例４２
疾患モデルにおける可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性
ＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１の発現パターンに基づき、当業者ならば、これら２つの分子間の相互作用の調節が、次の疾患モデルで生物活性を持ち得ることが分かるであろう。このような調節は、本明細書で開示されるＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド(例えば、配列番号１００、１０２又は１２４のいずれか)とのＦｃ融合タンパク質を用いて促進することができる。
マウス喘息モデルにおける可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性
マウス喘息モデルは、ＤｅｒＰ１抗原又はオボアルブミンによる感作及び抗原刺激によって誘導される。マウスはミョウバン中の抗原を腹腔内注射することにより感作させ、その後、抗原の鼻腔内投与によって抗原刺激することができる。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性を証明するためには、マウスを組換えＺｃｙｔｏＲ２１で抗原刺激すればよい。肺の炎症は、洗浄液中の炎症細胞の定量、気道の過敏感反応の測定及び病理分析により、抗原刺激後の様々な時点で評価することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１のin vivo有効性は、炎症細胞の肺への移動の減少、並びに肺の病理及び気道の過敏感反応の変化によって示される。
マウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性
このモデルは、関節リウマチの疾病機序及び可能性のある治療法を検討するために使用することができる。マウスの尾の基部に、-２１日目にフロイントの完全アジュバント中のヒヨコＩＩ型コラーゲンを感作させ、０日目にでフロイントの不完全アジュバント中のヒヨコＩＩ型コラーゲンを感作させることができる。２回目の感作後、毎日疾病の進行をスコアリングし、質的臨床スコア(スケール０〜３)と足厚のカリパス測定値を採取することによって評価することができる。臨床スコアは次のように評価することができる：
０ -正常な足先
０.５-１本の足先に炎症
１ -２本以上の足先に炎症があるか、又は足の甲に炎症がある
２ -足の甲及び足弓(かかとの手前まで)に炎症(かかとは含まない)
３ -かかとを含む足全体に炎症
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性を証明するためには、感作前又は疾病の進行中に、マウスを組換えＺｃｙｔｏＲ２１の腹腔内、筋肉内、皮下、又は静脈内注射により処置することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１のin vivo有効性は、臨床徴候の軽減、足の腫脹の軽減、組織病理学により評価される炎症性浸潤物の減少、及び／又は組織病理学により評価される骨／軟骨の分解の減少によって判断される疾病進行の低減により示すことができる。
マウスＥＡＥモデルにおける可溶性ＺｃｖｔｏＲ２１の有効性
ＥＡＥは、動物モデルにおける多発性硬化症の疾病機構及び可能性のある治療法を検討するために用いられる。ＥＡＥは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではｒＭＯＧタンパク質又はＭＯＧ３５-５５ペプチドを用いて、あるいはＳＪＬマウスではプロテオリピドタンパク質ペプチドを用いて誘導することができる。ＥＡＥを誘導するため、マウスに、０日目に、ｒＭＯＧ／フロイントの完全アジュバント(ＣＦＡ)、ＭＯＧ３５-５５ペプチド／ＲＩＢＩ、又はＰＬＰ／ＣＦＡエマルションを皮下感作させ、その後、０日目及び／又は２日目に、百日咳毒素の静注処置を行うことができる。疾病の進行は、百日咳毒素注射後の臨床スコア及び体重減少によってモニタリングすることができる。臨床スコアは次のように動物の尾の状態、姿勢及び歩行に基づくものである：０-健康、１-尾が弱い(尾の先端が曲がっていない)、２-尾の麻痺(尾をまっすぐ保つことができない)、３-尾の麻痺と軽度の歩行難、４-尾の麻痺と重度の歩行難、５-尾の麻痺と１本の足の麻痺、６-尾の麻痺といずれか２本の足の麻痺、７-四肢麻痺(４本の足全てが麻痺)、８-瀕死又は致死。
可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性を証明するためには、感作前又は疾病の進行中に、マウスを組換えＺｃｙｔｏＲ２１で処置することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１のin vivo有効性は、臨床徴候の軽減、体重減少の緩和、及び組織病理学により評価される脳における炎症性浸潤物の減少によって判断される疾病進行の低減により示すことができる。
実験的大腸炎のマウスモデルにおける可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１の有効性
マウスにおいて大腸炎モデルを誘導し、これを用い、ヒト疾患の治療法有効性の機構を評価することができる。
マウスに、飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)溶液を自由摂取により投与することができる。ＤＳＳは急性又は慢性疾患のいずれを誘導する場合でもこのようにして投与することができる。疾病の進行は、体重減少により、また、体重減少率％、便の堅さ(０＝正常、２＝軟便、４＝下痢)及び潜血反応(０＝正常、２＝肛門上又は糞便中に潜血は見られないが、潜血反応スライドに青色が見られる、４＝肛門上又は糞便中に潜血が見られる)からなる疾病活動指数(ＤＡＩ)によってモニタリングすることができる。このモデルの慢性型では、疾病の進行及び退縮はこれらの基準を用いて測定することができる。ＺｃｙｔｏＲ２１のin vivo有効性は、上記の基準を用いた疾病進行の低下、及び病理学により評価される切断管の炎症性浸潤物の減少によって示すことができる。
ハプテン誘導大腸炎モデルを用い、Ｔｈ２を媒介とする大腸炎を研究することができる。このモデルでは、第１日にオキサゾロン又はＴＮＢＳの局所塗布によりマウスを感作させ、第６日にオキサゾロン又はＴＮＢＳの直腸投与によって抗原刺激を行う。疾病の進行は、体重減少により、また、体重減少率％、便の堅さ(０＝正常、２＝軟便、４＝下痢)及び潜血反応(０＝正常、２＝肛門上又は糞便中に潜血は見られないが、潜血反応スライドに青色が見られる、４＝肛門上又は糞便中に潜血が見られる)からなる疾病活動指数(ＤＡＩ)によってモニタリングすることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１のin vivo有効性は、上記の基準を用いた疾病進行の低下、及び病理学により評価される切断管の炎症性浸潤物の減少によって示すことができる。
実施例４３
カルボキシ末端エピトープタグの発現及びＧＰＩを介した原形質膜固定を可能とするベクターにおけるＺｃｙｔｏＲ２１変異体細胞外ドメインの構築
カルボキシ末端ＦＬＡＧエピトープタグと融合され、かつ、ＧＰＩリンカーを介して細胞の原形質膜に固定されたＺｃｙｔｏＲ２１細胞外(ＥＣＤ)ドメインを発現させることにより、リガンド結合研究をタンパク質発現レベルに対してノーマライズすることができる。市販の哺乳類発現ベクターｐＶＡＣ２(Invivogen, SanDiego, CA)によれば、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ(ＰＬＡＰ)の３２アミノ酸のカルボキシ末端ドメインにＥＣＤを融合させることができる。このプロペプチドのプロセシングの際、ゴルジを通過する時に、トランスアミナーゼがこのＰＬＡＰドメインを切断すると同時にＧＰＩテールを付加することから、細胞膜中にＥＣＤに対する疎水性アンカーが提供される。次の各ＺｃｙｔｏＲ２１ ＥＣＤスプライス変異体を、ＰＬＡＰフラグメントがフレーム内に保持されるように、ベクターのＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１部位を用いて市販の哺乳類発現ベクターｐＶＡＣ２にクローニングした。このＦＬＡＧエピトープ配列は汎用されおり、モノクローナル抗体も市販されている。このエピトープ配列は、ＥＣＤを作製したＰＣＲ反応で用いた各アンチセンスオリゴヌクレオチドにコードされていたものである。事前に作製したクローンを鋳型として用い、ＰＣＲにより、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３及びマウスＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６のフラグメントを作製した。これらのクローン間で異なる領域はオリゴの内部にあるので、全てのＰＣＲ反応で、配列番号１６６及び配列番号１６７で示されるような同じオリゴヌクレオチド対を用いた。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２クローンは、鋳型としてのヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２と、配列番号１６８で示される異なるセンスオリゴヌクレオチド及び同じアンチセンスプライマーを用いて作製した。マウス型のＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６は、事前にクローニングした鋳型と、配列番号１６９及び配列番号１７０で示されるようなプライマーを用いて作製した。内部ＥｃｏＲ１部位が存在するために、ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲ１とＢａｍＨ１を適合させる付着末端を残す制限酵素Ｅｓｐ３Ｉで切断した。切断及び精製した産物は上手くｐＶＡＣ２とライゲーションし、配列決定したろころ、ｐＶＡＣ２-ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１(配列番号１７１)、ｐＶＡＣ２-ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号１７２)、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３(配列番号１７３)、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号１７４)、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３(配列番号１７５)、ｐＶＡＣ２-ｍＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６(配列番号１７６)、ｐＶＡＣ２-ｈｃｙｔｏｒ２１-Ｓ２(配列番号１７７)が得られた。
実施例４４
ＺｃｙｔｏＲ２１ Ｆｃ１０融合タンパク質発現構築物
ＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２-Ｃ(Ｆｃ１０)を天然リーダーとともに含む発現プラスミドを、これまでに記載の至適化ＴＰＡリーダー型(実施例２９；配列番号１０１及び配列番号１０２)から構築した。これを、実施例１６に記載の全長ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２ ｐｚｍｐ１１である２シストロン型発現構築物由来のおよそ４８０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを、ＴＰＡリーダー型のおよそ５３０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに置き換えることにより行った。着目するこの２つの発現構築物は共通に、一方では挿入部のすぐ上流にベクター由来のＥｃｏＲ１部位を有し、他方ではＺｃｙｔｏＲ２１挿入部由来のＥｃｏＲＩ部位を有する。この遺伝子操作から得られた数種のクローンを配列決定し、適切な向きのＥｃｏＲＩフラグメントを含むクローンを発現用に選択した。この天然リーダー型のＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２-Ｃ(Ｆｃ１０)をｍｐｅｔ １３３０(配列番号１７８)と呼んだ。
実施例４５
哺乳類細胞におけるＧＰＩアンカー型ＺｃｙｔｏＲ２１変異体細胞外ドメインの発現
サイトカイン受容体のリガンド結合特性の評価を、ＧＰＩリンカーによって細胞表面につながれたそれらの細胞外ドメインの発現により容易にすることができる。実施例４１で既述の次の構築物を、２９３ｆ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)において４８〜９６時間一時的に発現させ、遠心分離により回収し、ＦＡＣＳによるリガンド結合解析に用いた：ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ３、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１ｘ１３、ｐＶＡＣ２-ｈＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２及びｐＶＡＣ２-ｍＺｃｙｔｏＲ２１ｘ６。
１日目に、振盪フラスコ培養された継代数の少ない２９３ｆ細胞２５ｍｌを、５００ｍｌエルレンマイヤー、ポリカーボネート製ＴＣフラスコ(Corning, Corning NY)中のＦｒｅｅｓｔｙｅ発現培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)１００ｍｌに、密度およそ０.７ｅ６細胞／ｍｌで播種した。これらの細胞を、６％ＣＯ2を補給した周囲気流０.２ＬＰＭで３７℃にて、回転数９０ｒｐｍのオービタルシェーカーに取り付けて培養した。全培養期間でこれらの設定を用いた。２日目に、血球計を使用してそれらの細胞を計数し、８００ｇで遠心分離し、新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地にｌ.０ｅ６細胞／ｍｌとなるように再懸濁させ、１２５ｍｌ容のエルレンマイヤー、ポリカーボネート製ＴＣフラスコ(Corning, Corning NY)２０本に１０ｍｌ／フラスコで分注し、次のようにトランスフェクトした。製造業者提案の方法に従って、ミニプレップ又はマキシプレップＱｉａｇｅｎキット(Valencia, CA)のいずれかを用いて調製したプラスミドＤＮＡ１０μｇをＯｐｔｉｍｅｍ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)２００μｌで希釈した。同時に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)１２.５μｌをＯｐｔｉｍｅｍ ２００μｌと混合した。両方の混合物を室温で５分間インキュベートした後、それらをピペットで混合し、室温でさらに３０分インキュベートした。次に、細胞の１２５ｍｌフラスコに各ＤＮＡ-脂質混合物を加えた。このようにしてトランスフェクトした細胞を４８〜９６インキュベートし、回収し、ＰＢＳ＋アジド／ＢＳＡに入れて遠心分離により洗浄し、ＦＡＣＳに基づく結合研究に用いた。非修飾ｐＶＡＣ２「空」ベクターでトランスフェクトされた細胞において見られる非特異的結合に対し、ＦＬＡＧエピトープ特異的抗体及びビオチン化ＩＬ１７Ｃ結合を測定することにより受容体発現レベルを評価した。
実施例４６
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１ポリクローナル抗体
２匹の雌ニュージーランドシロウサギを、精製を容易にするためにＣ末端タグ融合物(例えば、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＥＥ、Ｆｃ)を含む、２９３細胞から産生された精製成熟組換えヒトＺｃｙｔｏＲ２１ポリペプチド(ＺｙｔｏＲｌ-２９３)、精製組換えヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｓ２、又はそれらのサブドメイン(配列番号１１３、１１５、１１７又は１１９を含む)のいずれかで免疫することにより、抗ＺｃｙｔｏＲ２１ポリクローナル抗体を作製する。
あるいは、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)と融合されたＺｃｙｔｏＲ２１の細胞外ドメイン配列を利用し、大腸菌で産生されるＺｃｙｔｏＲ２１-ＭＢＰ融合タンパク質、又はヒトＺｃｙｔｏＲ２１の細胞外ドメインで見られるペプチド配列の一部を含み、コンジュゲーションを容易にするためにそれらのペプチドのＮ末端又はＣ末端に追加のＣｙｓが付加されている合成ペプチド。それらのペプチドと融合タンパク質は、ペプチド又は融合タンパク質の抗原性を高めるために、当技術分野で公知の方法(例えば、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｕｐｅｒｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｏ７７６５６、又はＰｈａｒｍａｌｉｎｋキットＮｏ７７１５８,Pierce Biotechnology, Rockland IL)により担体タンパク質(ＢＳＡ及びＫＬＨなど)とコンジュゲートさせる。ウサギそれぞれに、フロイントの完全アジュバント中の精製タンパク質２００μｇの初回腹腔内(ｉｐ)注射を行い、続いて、３週間おきにフロイントの不完全アジュバント中のペプチド１００μｇの追加免疫ＩＰ注射を行った。２回目の追加免疫注射(全３回注射)実施の７〜１０日後、動物から血液を採取し、血清を回収した。さらに、それらの動物に３週間おきに追加免疫し、血液を採取した。
免疫ウサギ血清から、ＣＮＢｒ-セファロース１グラム当たり特異的抗原精製した組換えタンパク質ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-２９３又はペプチド１０ｍｇを用いて調製したＣＮＢｒ-セファロース４Ｂタンパク質カラム(Pharmacia LKB)を用いて、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１特異的ポリクローナル抗体をアフィニティー精製し、続いて、ＰＢＳ中で一晩２０×透析を行う。ヒトＺｃｙｔｏＲ２１特異的抗体は、抗体標的として５００ｎｇ／ｍｌの精製組換えタンパク質ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-２９３用いたＥＬＩＳＡにより同定する。ウサギ抗ヒトＺｃｙｔｏＲ２１アフィニティー精製抗体の検出下限(ＬＬＤ)は、その特異的精製組換え抗原ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-２９３において通常１０〜５００ｐｇ／ｍｌである。あるいは、Ａタンパク質-アフィニティークロマトグラフィー又は当技術分野で公知の他の方法によりＩｇＧ画分を単離するために血清を処理することができる。
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１特異的ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ形式でＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃタンパク質に結合する能力、又はＺｃｙｔｏＲ２１をトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３、２９３、又はＢＨＫ細胞に特異的に結合する能力、又はＩＬ-１７Ｃで処理されたＮＩＨ３Ｔ３細胞であって、ＮＦκＢ感受性ルシフェラーゼ受容体構築物を含み、そしてＺｃｙｔｏＲ２１でトランスフェクションされた細胞においてルシフェラーゼの誘導を阻害する能力により同定される。精製組換えヒトＩＬ-１７Ｃの、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃタンパク質若しくはＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト２９３細胞若しくはＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＢＨＫ細胞との結合を阻害するＺｃｙｔｏＲ２１に対するポリクローナル抗体の能力、又はＮＩＨ３Ｔ３／ＺｃｙｔｏＲ２１／ＮＦｋＢ-ルシフェラーゼ生物検定法によるＩＬ-１７Ｃの生物活性を阻害するＺｃｙｔｏＲ２１特異的ポリクローナル抗体の能力は、ヒトＩＬ-１７Ｃの生物活性を拮抗作用するＺｃｙｔｏＲ２１特異的抗体の能力を示す証拠となる。
実施例４７
マウス抗ヒトＺｃｙｔｏＲ２１モノクローナル抗体の作製
Ａ.抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体の作製のための免疫化
１.可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ
６〜１２週齢の未処理のマウス又はＺｃｙｔｏＲ２１ノックアウトマウスを、週２回(biweekly)の計画で、Ｒｉｂｉアジュバント(Sigma)と１：１(ｖ：ｖ)で混合した可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-ｍＦｃタンパク質５０〜１００μｇの腹腔内注射により免疫する。３回目の免疫から７〜１０日後、後眼窩採血によって血液サンプルを採取し、その血清を回収し、中和アッセイによりＩＬ-１７ＣのＺｃｙｔｏＲ２１との結合を阻害するその能力、及びＦＡＣＳ染色アッセイにより又はＦＭＡＴシステムにおいてトランスフェクトＰ８１５細胞若しくはトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト細胞を染色するその能力について評価する。マウスへの免疫を続け、血液サンプルを採取し、中和力価がプラトーに達するまで上記のように評価する。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスにＰＢＳ中の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃタンパク質２５〜５０μｇを静注する。３日後、これらのマウスの脾臓及びリンパ節を回収し、例えば、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら, J Immunol. 123:1548-50, 1979; 及びLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8. 1985参照)を用いて、マウス骨髄腫(Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.６５３.３.１２.１１)細胞又は当技術分野の他の適当な細胞系統を使用する、ハイブリドーマ作製に使用する。
２.可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｈｉｓ、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＦＬＡＧ
６〜１２週齢の未処理のマウス又はＺｃｙｔｏＲ２１ノックアウトマウスを、週２回の計画で、Ｒｉｂｉアジュバント(Sigma)と１：１(ｖ：ｖ)で混合した可溶性ヒト可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｈｉｓ、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＦＬＡＧタンパク質５０〜１００μｇの腹腔内注射により免疫する。３回目の免疫から７〜１０日後、後眼窩採血によって血液サンプルを採取し、その血清を回収し、中和アッセイによりＩＬ-１７Ｃの、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ、ヒト可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｈｉｓ、若しくはＺｃｙｔｏＲ２１-ＦＬＡＧとの結合を阻害するその能力、及びＦＡＣＳ染色アッセイにより又はＦＭＡＴシステムにおいてトランスフェクトＰ８１５細胞若しくはトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト細胞を染色するその能力について評価した。マウスへの免疫を続け、血液サンプルを採取し、中和力価がプラトーに達するまで上記のように評価する。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスにＰＢＳ中の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃタンパク質２５〜５０μｇを静注した。３日後、これらのマウスの脾臓及びリンパ節を回収し、例えば、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら, J Immunol. 123:1548-50, 1979; 及びLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8. 1985参照)を用い、マウス骨髄腫(Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.６５３.３.１２.１１)細胞又は当技術分野の他の適当な細胞系統を用いて、ハイブリドーマ作製に使用する。
３.可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１ドメイン
６〜１２週齢の未処理のマウス又はＺｃｙｔｏＲ２１ノックアウトマウスは、可溶性精製組換えヒトＺｃｙｔｏＲ２１ドメイン ＨＵＺＣＹＴＯＲ２１ｓ２(配列番号１１３)、又はそのサブドメイン(例えば配列番号１１５、１１７又は１１９)５０〜１００μｇであって、精製を容易にするためのＣ末端タグ融合物(例えば、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＥＥ、Ｆｃ)を含み、抗原性を高めるために当技術分野で公知の方法(例えば、Ｐｈａｒｍａｌｉｎｋ ＩｍｍｕｎｏｇｅｎキットＮｏ７７１５８,Pierce Biotechnology, Rockland IL)により担体タンパク質(ＢＳＡ及びＫＬＨなど)とコンジュゲートされたものの腹腔内注射により免疫する。週２回の計画で、純粋なタンパク質をＲｉｂｉアジュバント(Sigma)と１：１(ｖ：ｖ)で混合する。３回目の免疫から７〜１０日後、後眼窩採血によって血液サンプルを採取し、その血清を回収し、中和アッセイによりＩＬ-１７Ｃの、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ、ヒト可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｈｉｓ、若しくはＺｃｙｔｏＲ２１-ＦＬＡＧとの結合を阻害するその能力、及びＦＡＣＳ染色アッセイにより又はＦＭＡＴシステムにおいてトランスフェクトＰ８１５細胞若しくはトランスフェクト２９３細胞に対してＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト細胞を染色するその能力について評価した。マウスへの免疫を続け、血液サンプルを採取し、中和力価がプラトーに達するまで上記のように評価する。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスにＰＢＳ中の可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１タンパク質抗原２５〜５０μｇを静注した。３日後、これらのマウスの脾臓及びリンパ節を回収し、例えば、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら, J Immunol. 123:1548-50, 1979; 及びLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8. 1985参照)を用い、マウス骨髄腫(Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.６５３.３.１２.１１)細胞又は当技術分野の他の適当な細胞系統を用いて、ハイブリドーマ作製に使用する。
４.ＺｃｙｔｏＲ２１を発現するＰ８１５形質転換体
６〜１０週齢の雌ＤＢＡ／２マウスを、２〜３週おきの１〜５×１０6照射トランスフェクト細胞の腹腔内注射により免疫する。このアプローチにおいて、腹水腫瘍を発現し、死亡した動物はいない。代わりに、上記のように、２回目の免疫後の採血から、それらの血清中のＺｃｙｔｏＲ２１に対する中和免疫応答について動物をモニタリングする。一度、中和力価が最大レベルに達したら、最も高い力価を有するマウスに５×１０6照射細胞のプレフージョン(pre-fusion)、腹腔内注射を行い、４日後、これらのマウスの脾臓及びリンパ節を回収し、例えば、当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら, J Immunol. 123:1548-50, 1979; 及びLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8. 1985参照)を用い、マウス骨髄腫(Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.６５３.３.１２.１１)細胞又は当技術分野の他の適当な細胞系統を用いて、ハイブリドーマ作製に使用する。
Ｂ.ＺｃｙｔｏＲ２１と結合し、ＩＬ-１７ＣのＺｃｙｔｏＲ２１との結合を阻害する抗体についてのハイブリドーマ融合物のスクリーニング
融合後８〜１０日目のハイブリドーマ上清に対して、４種類の異なる一次スクリーニングを行う。第１のアッセイでは、上清中の抗体を、結合したマウス抗体を同定するＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスκ及び抗λ軽鎖第２段階試薬を用いるＥＬＩＳＡにより可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ、ヒト可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１、ＺｃｙｔｏＲ２１-ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｈｉｓ、又はＺｃｙｔｏＲ２１-ＦＬＡＧタンパク質が結合されたプレートと結合する能力についての試験を行った。ＺｃｙｔｏＲ２１融合タンパク質のＺｃｙｔｏＲ２１部分に対する特異性を示すため、同じマウスＦｃ領域(ｍＧ２ａ)、ＥＥ配列、Ｈｉｓ配列、又はＦＬＡＧ配列と融合させた無関係のタンパク質において、最初のアッセイで陽性を示す上清を評価する。ＺｃｙｔｏＲ２１-融合タンパク質と結合するが、融合タンパク質配列を含む無関係のｍｕＦｃ又は他のタンパク質とは結合しない、それらの上清中の抗体は、ＺｃｙｔｏＲ２１に対して特異的であると思われた。第２のアッセイでは、全てのハイブリドーマ上清中の抗体に対して、ＥＬＩＳＡによりビオチン化ヒトＩＬ-１７ＣとＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃ又は他のＺｃｙｔｏＲ２１-融合タンパク質が結合されたプレートとの結合を阻害する能力についての評価を行った。
ＺｃｙｔｏＲ２１と特異的に結合する抗体を含む全ての上清に対して、それらの抗体がＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ-１７ＣのＺｃｙｔｏＲ２１との結合を阻害したかどうかにはかかわらず、ＩＬ-１７Ｃの、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト２９３細胞若しくはＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＢＨＫ細胞、又は正常ヒト上皮細胞との結合を阻害する能力についての試験を行う。続いて、ＩＬ-１７Ｃ中和アッセイにより中和陽性を示す全ての上清に対して、ＦＡＣＳ解析によりＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト２９３細胞又はＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＢＨＫ細胞を染色する能力についての評価を行う。この解析は、ＺｃｙｔｏＲ２１とのＩＬ-１７Ｃ結合の阻害は、実際にはＺｃｙｔｏＲ２１受容体と特異的に結合する抗体に起因したということが確認できるように設計されている。さらに、ＦＡＣＳ解析は抗ＩｇＧ第２段階試薬を用いて行われるため、明確なＦＡＣＳ陽性結果より、その中和抗体がＩｇＧクラスのものである可能性が高いということも示される。これらの手段により、プレート結合ＥＬＩＳＡによりＺｃｙｔｏＲ２１と結合し、ＥＬＩＳＡに基づく阻害アッセイによりＩＬ-１７ＣのＺｃｙｔｏＲ２１との結合を阻害し、ＩＬ-１７Ｃの、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト２９３細胞又はＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＢＨＫ細胞それぞれとの相互作用を遮断するマスターウェルを同定し、そのマスターウェルは抗マウスＩｇＧ第２段階試薬によるＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト２９３細胞又はＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＢＨＫ細胞の染色について陽性を示す。
第３のアッセイは、ＮＦｋＢ感受性ルシフェラーゼレポーター構築物を含み、ＺｃｙｔｏＲ２１でトランスフェクトもされていることから、ＩＬ-１７Ｃ処理に対して応答可能であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞からなる。これらの細胞は、ＩＬ-１７Ｃ処理に対してルシフェラーゼ発現を増強することにより応答し、このルシフェラーゼは当技術分野で公知の標準的な方法によりアッセイすることができる。ＺｃｙｔｏＲ２１に対して特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ１７Ｃによって刺激される、これらの細胞によるルシフェラーゼ産生を阻害する能力によりアッセイする。
第４のアッセイは、ＺｃｙｔｏＲ２１を発現し、ＩＬ-１７Ｃ処理に対して応答する一次ヒト上皮細胞又はヒト起源の細胞系統(Ｕ９３７細胞、ＨＣＴ１５細胞、ＤＬＤ-１細胞又はＣａｃｏ２細胞など)からなる。特異的モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ１７Ｃによって刺激される、これらの細胞によるケモカイン又はサイトカイン産生を阻害する能力によりアッセイする。ケモカイン又はサイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡアッセイキット(例えば、R&D Systems, Minneapolis, MN)を用い、ＩＬ-１７Ｃに応答してアッセイする。あるいは、この目的に利用できるリン酸化特異的抗体(BioRad, Richmond, CA)を用いてＩＬ-１７Ｃ応答性細胞におけるｐｈｏｓｐｈｏ-ＩｋＢレベルをモニタリングしてもよい。ＩＬ-１７Ｃにより媒介されるｐｈｏｓｐｈｏ-ＩｋＢ産生の阻害は、モノクローナル抗体のＺｃｙｔｏＲ２１アンタゴニスト活性の指標となる。
Ｃ.抗ＺｃｙｔｏＲ２１特異的抗体を産生するハイブリドーマのクローニング
適切にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞又はＢＨＫ細胞に対するＩＬ-１７Ｃの結合を中和する特異的抗ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞株を、標準的な低密度希釈(ウェル当たり１細胞未満)アプローチによりクローニングする。プレーティングからおよそ５〜７日後、クローンを、例えば、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃが結合されたプレートでのＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、続いて、上記のような無関係のＦｃを含む融合タンパク質でのＥＬＩＤＡにより陽性を示したウェルを再試験する。選択クローン(そのクローンの上清はＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃと結合するが、無関係のＦｃを含む融合タンパク質とは結合しない)の特異的抗体活性を両中和アッセイ並びにＦＡＣＳ解析を繰り返すことでさらに確認する。クローン性を確保する助けとして、また、抗体産生の安定性を評価するために、全ての選択ＺｃｙｔｏＲ２１抗体陽性クローンを最低２回クローニングする。クローニングをさらに繰り返し、得られたクローンの、好ましくは、少なくとも９５％が抗ＺｃｙｔｏＲ２１抗体産生の中和に対して陽性を示すまで記載のようなスクリーニングを行う。
Ｄ.抗ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＡｂによって認識される分子の生化学的同定
推定抗ＺｃｙｔｏＲ２１ ｍＡｂによって認識される標的分子ＺｃｙｔｏＲ２１が実際にＺｃｙｔｏＲ２１であるということの生化学的立証は、標準的な免疫沈降とその後のＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析又はウエスタンブロット法(両方法とも、非トランスフェクトＢａｆ３細胞又は非トランスフェクトＢＨＫ細胞に対してＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクト細胞由来の可溶性膜調製物を使用する)によって行う。さらに、ｍＡｂが天然受容体鎖を認識するだけでなく、トランスフェクトされているものも認識するということを示すために、ＺｃｙｔｏＲ２１を発現する非トランスフェクト細胞系統の可溶性膜調製物を使用する。あるいは、ｍＡｂを、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｆｃタンパク質を特異的に免疫沈降させる能力又はウエスタンブロットにより検出する能力について試験する。
実施例４８
ヒトＺｃｙｔｏＲ２１でトランスフェクトしたＰ８１５細胞を注射したマウスに由来する血清によるヒトＺｃｙｔｏＲ２１の中和
細胞に基づく中和アッセイを用い、ヒトＺｃｙｔｏＲ２１トランスフェクトＰ８１５細胞を注射したマウス由来の血清を、本明細書に記載のように、１％、０.５％、０.２５％、０.１３％、０.０６％、０.０３％、０.０２％及び０％の連続希釈液として加える。アッセイプレートを３７℃にて、５％ＣＯ2、４日間インキュベートし、その時点でＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ(Accumed, Chicago, IL)を２０μｌ／ウェルで加える。プレートを再び３７℃にて、５％ＣＯ2、４〜１６時間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ変換の違いにより、動物の血清はヒトＺｃｙｔｏＲ２１を介してＩＬ-１７Ｃのシグナル伝達を中和することができるということが示される。
このアッセイでの結果より、例えば、本発明のＺｃｙｔｏＲ２１に対する中和モノクローナル抗体を介しての、ＺｃｙｔｏＲ２１結合の効果的な遮断、ＩＬ-１７Ｃ活性の遮断、阻害、低下、拮抗又は中和は、in vivoでのＩＬ-１７Ｃの効果を低下させるのに有利である可能性があり、乾癬、ＩＢＤ、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性繊維症、関節炎、喘息、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎又は他の炎症性疾患に見られるようなＩＬ-１７Ｃに関連する炎症を軽減し得るというさらなる証拠を提示することができる。
ペプチド合成
ペプチドＺｃｙｔｏＲ２１-１.１［ＣＩＥＡＳＹＬＱＥＤＴＶＲＲＫＫ-アミド］及びペプチドＺｃｙｔｏＲ２１-２.１［ＩＳＨＫＧＬＲＳＫＲＴＱＰＳＤＰＥＴＷＥＳＣ］をＦｍｏｃ化学を用いてモデル４３３Ａペプチドシンセサイザー(Applied Biosystems)により合成した。Ｆｍｏｃ-アミド又はＦｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)-Ｗａｎｇ樹脂(AnaSpec)(０.２５ｍｍｏｌ)それぞれを、最初の支持樹脂として使用した。２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(ＨＢＴＵ)、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ-メチルピロリドン、ジクロロメタン(Applied Biosystems)及びピペリジン(Aldrich Chemical Co.)の混合物を合成試薬として使用した。ペプチドを９５％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で固相支持体から切断した。ペプチドの精製は、水／アセトニトリル／ＴＦＡ勾配でＶｙｄａｃ Ｃ１８、１０〜１５ミクロン、５０×２５０ｍｍ分取カラムを用いるＲＰ-ＨＢＬＣにより行った。カラムからの溶出画分を採取し、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析により純度を分析した。プールした画分を凍結乾固させ、１０％アセトニトリル、１％酢酸に再懸濁した後、既知重量のＦａｌｃｏｎチューブに入れて再び凍結乾固させた。最終的なドライダウンの前にＨＰＬＣ分析及び質量分析(ＭＳ)を行った。合成全体の収率は３０〜３３％であった。
実施例４９
哺乳類可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２発現構築物の構築
突然変異誘発、タンパク質工学及び結合研究から、配列番号５のアミノ酸２４〜９６を含まない、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２(配列番号１１３)と呼ばれるＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２細胞外ドメインが高いリガンド結合親和性を有することが示唆された。哺乳類発現ベクターｐＺＭＰ４０(配列番号１８３)に配置されているカルボキシ末端Ｆｃ型タグを伴いヒト又はマウスＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２の細胞外ドメインを含む発現構築物を、次のように酵母においてＰＣＲ及び相同組換えを用いて構築する。ヒトｐＺＭＰ４０-ｈＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２-ＦＣ１０、(配列番号１８４)を構築するために、ＰＣＲ産物を、鋳型として予め作製したヒトＺｃｙｔｏＲ２１ｘ２(配列番号９１)プラスミドを用いるＰＣＲ反応においてセンスオリゴヌクレオチド５'ＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴ３'(配列番号１８５)とアンチセンスオリゴヌクレオチド５'ｃｔｃｔｇａｔｃｃａｔｃａａｃｔｔｃａｔｃａｇａｔｃｃＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＡ３'(配列番号１８６)を混合することにより得る。要するに、このＰＣＲ反応を、製造業者提案の試薬濃度に従って、Ｅｘｐａｎｄ(商標)ＤＮＡポリメラーゼ(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を用い、以下サイクルパラメーターを用いて実施する：９４℃５分を１サイクル；９４℃３０秒、その後、およそ６２℃３０秒、その後、７２℃１分を３０サイクル；７２℃１０分を１サイクル。このＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ(商標)ゲル抽出キット(Qiagen,カタログ番号２８７０４)を用いてそのゲルから予測サイズに相当するＤＮＡフラグメントを抽出し、精製ＤＮＡフラグメントを得る。
このＰＣＲフラグメントは、至適化組織プラスミノーゲン活性化因子プレプロ分泌リーダー配列コード領域におけるＭＰＥＴ １１２２ベクター配列(配列番号１８７)との５'重複、ｐＺＭＰ４０-ｈＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２-Ｆｃ１０(配列番号１８４)内に含まれたＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２細胞外ドメインコード領域、及びＦｃ１０カルボキシ末端タグにおけるＭＰＥＴ １１２２ベクターとの３'重複を含む。
プラスミドｐＺＭＰ４０は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母組換え前に線状化するためのＢｇｌＩＩ部位、ｏｔＰＡシグナルペプチド配列、ポリオウイルス由来の内部リボソームエントリーエレメント、膜貫通ドメインのＣ末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメインを含む発現カセット；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；並びにＳ.セレビシエ中での選択及び複製に必要なＵＲＡ３配列及びＣＥＮ-ＡＲＳ配列を含む哺乳類発現ベクターであり、ＭＰＥＴ １１２２構築物のための足場である。
プラスミドＭＰＥＴ １１２２は、酵母における組換え前にゲル抽出ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２ ＰＣＲフラグメントと一緒にＳｒｆ１で切断する。コンピテント酵母(Ｓ.セレビシエ)細胞１００μｌを、ＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２挿入ＤＮＡ １０μｌ及びＢｇｌＩＩで切断したｐＺＭＰ２０ベクター１００ｎｇと合わせ、この混合物を０.２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。この酵母／ＤＮＡ混合物に、０.７５ｋＶ(５ｋＶ／ｃｍ)、∞オーム、及び２５μＦに設定した電源装置(BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いて電気パルスをかける。このキュベットに１.２Ｍソルビトール６００μｌを加え、酵母を１００μｌ及び３００μｌアリコートで２枚のＵＲＡ-Ｄプレートにプレーティングし、３０℃でインキュベートする。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ+酵母形質転換体をＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁させ、短時間回転さて酵母細胞をペレットにした。この細胞ペレットを０.５ｍｌの溶解バッファー(２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁させる。この溶解混合物５００μｌを、酸で洗浄したガラスビーズ２５０μｌとフェノール-クロロホルム３００μｌの入ったエッペンドルフチューブに加え、１分ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心機にて最高速度で５分回転させる。水相３００μｌを新しいチューブに移し、エタノール６００μｌでＤＮＡを沈殿させた後、最高速度で３０分遠心分離する。このチューブをデカントし、ペレットを７０％エタノール１ｍＬで洗浄する。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットを３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させる。
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(ＤＨ１０ｂ,Invitrogen, Carlsbad, CA)の形質転換を、酵母ＤＮＡ調製物５μｌと大腸菌細胞５０μｌを用いて行う。これらの細胞に、２.０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、１ｍｌ ＳＯＣ(２％Ｂａｃｔｏ(商標)トリプトン(Difco, Detroit, MI)、０.５％酵母抽出物(Difco)、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース)を加えた後、細胞５０μｌ及び２００μｌアリコートを２枚のＬＢ ＡＭＰプレート(ＬＢブロス(Lennox)、１.８％Ｂａｃｔｏ(商標)寒天(Difco)、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン)にプレーティングする。
この構築物の３つのＤＮＡクローンのインサートに対して配列決定を行い、適正な配列を含む１クローンを選択する。製造業者の使用説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を用い、大規模なプラスミドＤＮＡ単離を行う。可溶性タンパク質は、実施例２５及び２６で既述するような標準的なトランスフェクション法に従って、一般的な哺乳類産生細胞(ＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞など)により産生される。
このＺｃｙｔｏＲ２１-Ｓ２構築物の変形形態は、可溶性タンパク質に異なる有用な特性を与えるか、又はタンパク質発現の向上に有用な異なる発現ベクター内に配置された他の分泌リーダー、エピトープタグ又は融合パートナーを利用してを構築することができる。
以上、本発明の具体的な実施形態を例示として記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な改変が行えることは、上記の内容から明らかであろう。よって、本発明は添付の特許請求項の範囲によってのみ限定される。

Claims (52)

  1. 配列番号９を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  2. 配列番号１２を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  3. 配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  4. 配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  5. 配列番号２３を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  6. 配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  7. 配列番号１２２を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  8. 配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  9. 配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  10. 配列番号１１３を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  11. 配列番号１１５を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  12. 配列番号１１７を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  13. 配列番号１１９を含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  14. 配列番号１１５を含む第一ポリペプチドと配列番号１１７及び１１９からなる群からのポリペプチドを含む第二ポリペプチドとを含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  15. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１７を含む、請求項１４に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  16. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１９を含む、請求項１４に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  17. 配列番号１１７を含む第一ポリペプチドと配列番号１１５及び１１９からなる群からのポリペプチドを含む第二ポリペプチドとを含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  18. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１５を含む、請求項１７に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  19. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１９を含む、請求項１７に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  20. 配列番号１１９を含む第一ポリペプチドと配列番号１１５及び１１７からなる群からのポリペプチドを含む第二ポリペプチドとを含む、単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  21. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１５を含む、請求項２０に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  22. 前記第二ポリペプチドが配列番号１１７を含む、請求項１７に記載の単離されたＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体。
  23. ＺｃｙｔｏＲ２１を含む単離された可溶性受容体であって、該ＺｃｙｔｏＲ２１が、配列番号９、１２、２３、１２２、１１３、１１５、１１７、１１９、配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７、配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４、及び配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、そして該可溶性受容体残基がＩＬ-１７Ｃ(配列番号１７)の活性を低下させる、前記受容体。
  24. 配列番号９、１２、２３、１２２、１１３、１１５、１１７、１１９、配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７、配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４、及び配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドと結合する抗体又は抗体フラグメントであって、可溶性受容体がＩＬ-１７Ｃ(配列番号１７)の活性を低下させる、抗体又は抗体フラグメント。
  25. (ａ)ポリクローナル抗体、(ｂ)マウスモノクローナル抗体、(ｃ)(ｂ)に由来するヒト化抗体、(ｄ)抗体フラグメント、又は(ｅ)ヒトモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  26. 放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、薬剤、又は毒素をさらに含む、請求項２４に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  27. ペグ化をさらに含む、請求項２５に記載の抗体。
  28. 治療を必要とする患者における免疫介在疾患を治療する方法であって、可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
  29. 可溶性ＺｃｙｔｏＲ２１受容体が、配列番号９、１２、２３、１２２、１１３、１１５、１１７、１１９、配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７、配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４、及び配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
  30. 炎症の軽減に十分な量の、請求項２４に記載の抗体の組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含む、ＩＬ-１７Ｃ介在炎症の軽減方法。
  31. 炎症の軽減に十分な量の、ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体含有組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含む、ＩＬ-１７Ｃ介在炎症の軽減方法であって、当該ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体が、配列番号９、１２、２３、１２２、１１３、１１５、１１７、１１９、配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７、配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４、及び配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む、前記方法。
  32. ＩＬ-１７Ｃが役割を果たす炎症性疾患に罹患した哺乳類を治療する方法であって、
    ＺｃｙｔｏＲ２１のアンタゴニストを哺乳類に投与して炎症を軽減することを含み、ここで、該アンタゴニストが、(ｉ)ＺｃｙｔｏＲ２１のポリペプチド又はポリペプチドフラグメントと特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、若しくは結合ポリペプチド、又は(ｉｉ)ＺｃｙｔｏＲ２１のポリペプチド若しくはポリペプチドフラグメントを含み；かつ
    ＩＬ-１７Ｃの炎症活性が軽減される、前記方法。
  33. 前記疾患が喘息である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記疾患が慢性炎症性疾患である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、又は乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記疾患が急性炎症性疾患である、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記疾患が、内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群又は感染性疾患を含む急性炎症性疾患である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記抗体、抗体フラグメント、又は結合ポリペプチドが放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、薬剤、又は毒素をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  39. ＺｃｙｔｏＲ２１活性に関連する被験者の病態を治療する方法であって、有効量のＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体を投与することを含み、当該ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体が、配列番号９、１２、２３、１２２、１１３、１１５、１１７、１１９、配列番号２１のアミノ酸残基１３６〜４１４、配列番号２１のアミノ酸残基２４〜４１４、配列番号１０７のアミノ酸残基１５９〜４３７、配列番号１０９のアミノ酸残基１３６〜４１４、及び配列番号１０９のアミノ酸残基２４〜４１４からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含んでなり、それにより当該病態を治療する、前記方法。
  40. 前記病態が喘息である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記病態が慢性炎症性症状である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記慢性炎症性症状が炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、又は乾癬を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記病態が急性炎症性症状である、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記急性炎症性症状が内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群、又は感染性疾患を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. ＺｃｙｔｏＲ２１が役割を果たす炎症性疾患に罹患した哺乳類を治療する方法であって、
    ＺｃｙｔｏＲ２１のアンタゴニストを哺乳類に投与して炎症を軽減することを含み、ここで当該アンタゴニストが、ＺｃｙｔｏＲ２１のポリペプチド又はポリペプチドフラグメントと特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、ＺｃｙｔｏＲ２１可溶性受容体又は結合ポリペプチドを含み；かつ
    当該炎症活性が軽減される、前記方法。
  46. 前記疾患が喘息である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記疾患が慢性炎症性疾患である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、又は乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記疾患が急性炎症性疾患である、請求項４５に記載の方法。
  50. 前記疾患が、内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群又は感染性疾患を含む急性炎症性疾患である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記抗体、抗体フラグメント、又は結合ポリペプチドが放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、薬剤、又は毒素をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記抗体、抗体フラグメント、又は結合ポリペプチドがペグ化をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
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