CN109394681B - 一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种含有Exendin‑4 Fc融合蛋白的注射制剂，所述注射制剂包括Exendin‑4 Fc融合蛋白和注射混合液，所述注射混合液的pH值为6.0－6.7，每mL所述注射制剂中含1.5‑2.5mg所述Exendin‑4 Fc融合蛋白，所述注射混合液包括以下重量份数的成分：表面活性剂0.1‑2.0份、溶液缓冲剂0.1‑0.8份、渗透压调节剂5‑10份、稳定剂50‑90份。本发明能够在各项检测指标均比较稳定、符合相应理化质量标准的情况下稳定储藏至少36个月以上，有效延长了Exendin‑4 Fc融合蛋白的保存期。

Description

一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂。
背景技术
糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病，当人体胰腺无法产生足够的胰岛素或者无法有效地利用所产生的胰岛素时即会引起该病的发生，目前，糖尿病作为人类四大非传染性疾病之一，对全球公共健康已经构成了严重威胁。
糖尿病主要包括I型和II型两种，其中，I型糖尿病又叫胰岛素依赖型糖尿病，是机体免疫系统损伤胰腺β细胞而引起的胰岛素缺乏症。II型糖尿病是由相对胰岛素分泌不足、或肝脏、肌肉和脂肪细胞产生胰岛素抗性、或胰高血糖素分泌过多等因素引起的复杂疾病。
GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种31个氨基酸组成的肽类激素，刺激胰岛β细胞以糖依赖的方式分泌胰岛素，抑制胰高血糖素分泌从而降低血糖水平。持续活化GLP-1受体可以提高胰岛素分泌、β细胞增殖和再生。天然的GLP-1不但分子量小，而且在体内快速被DPP4酶降解而失去生物学活性，因此，GLP-1在体内的生物学半衰期只有1-2分钟。GLP-1受体激动剂可模拟内源性肠激素GLP-1作用，GLP-1受体激动剂的重要优点是可降低患者体重，因为肥胖是II型糖尿病的主要并发症，GLP-1激动剂可以延缓肠道排空，从而提高饱腹感而抑制食欲。GLP-1受体激动剂的降体重作用不仅可以提高患者的生活质量，而且可以改善肥胖型II型糖尿病人的代谢异常。
Exendin-4(肠促胰岛素类似物)是中美洲毒蜥(Gila monster)唾液中分泌的一种39个氨基酸组成的多肽，与天然GLP-1有50％的同源性。研究表明，Exendin-4与GLP-1有相同的生物学效应，在体内能抵抗DPP4酶降解，其半衰期约为2.4小时，因此是GLP-1R信号通道第一个批准用于治疗II型糖尿病的药物。为了更快的将Exendin-4做成制剂供患者使用，这将对制剂生产要求更高，用于稳定抗体融合蛋白的常用方法是把含有蛋白和辅料的溶液冻干，但是，冻干法非常消耗时间和能源，因此很昂贵，此外，冻干粉每次给药前必须首先重构，使用麻烦，而且冻干后蛋白活性无法保证。
国内上市的GLP-1类似物药物制剂共有四款，分别是艾塞那肽注射剂(百泌达)、艾塞那肽微球注射剂(百达扬)、利拉鲁肽注射剂(诺和力)和贝那鲁肽。这四款药物全部为小分子化学药物，其中艾塞那肽微球注射剂(百达扬)为长效缓释药物，其余三款药物均为短效GLP-1类似物，不仅半衰期短，给药频率高，增加了患者用药负担和痛苦，而且每次给药后患者都有明显的胃肠道反应，如果长期给药会给患者带来很大的不便和痛苦；艾塞那肽微球注射剂(百达扬)，其制剂采用聚乙丙交酯和蔗糖作为辅料，虽然具有缓释效果，能够降低用药频率，但该微球制剂存在突释作用、易造成患者体内血药浓度不稳定，由于微球无法除菌过滤，需全程无菌工艺，生产成本高，工艺和质量可控性差，有微生物污染风险，此外，近年研究证实，艾塞那肽微球与艾塞那肽的普通注射剂相比能够显著增加甲状腺C细胞癌的风险，且存在显著的不良作用，该药目前已被美国食品药品管理局在说明书中标识黑框警告。此外，目前现有的注射剂或微球注射液的保存期较短，保存过程中无法保证注射液内药物分子的稳定性，因此，目前迫切需要一种保存期长，能够保证长期保存过程中药物质量，且长效、副作用小、制剂工艺安全可靠、不良反应低的GLP-1类似物制剂产品。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种半衰期长、质量稳定、安全可靠、不易降解，且保存期可达到至少36个月以上的含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂。其中，我公司已经申请了本发明中含有的Exendin-4 Fc融合蛋白的国内发明专利(专利号为201010205166.9)和全球多国发明专利保护，该融合蛋白在体内具有葡萄糖依赖性的降糖效果，能显著控制糖化血红蛋白、改善胰岛细胞功能、提高餐后胰岛素分泌、增强机体对胰岛素的敏感性，生物学活性高，国内尚无上市产品。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，所述注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，所述注射混合液的pH值为6.0－6.7，每mL所述注射制剂中含1.5-2.5mg所述Exendin-4 Fc融合蛋白，所述注射混合液包括以下重量份数的成分：
Figure BDA0001854927540000021
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的注射制剂通过注射混合液中表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂相互作用，协同配合，为Exendin-4 Fc融合蛋白提供了良好的存储环境，能够有效稳定保存Exendin-4 Fc融合蛋白至少36个月以上，且保存过程中，Exendin-4 Fc融合蛋白质量稳定，纯度较高，有效保证了药效，能够保证Exendin-4 Fc融合蛋白的可溶性、体液平衡及血液等渗性。
进一步的，所述表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆、没食子酸丙酯中的一种或多种混合，其中，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80；
优选的，所述表面活性剂为重量份数比为0.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯的混合物。
本发明提供的注射制剂中加入的表面活性剂能够增加Exendin-4 Fc融合蛋白的溶解性，更优选的，通过质量比为1.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯混合制成的表面活性剂可以使注射制剂的稳定性提高，能够通过减少蛋白与蛋白之间、蛋白与西林瓶之间表面相互反应来减少表面张力和系统自由能，有效保证了蛋白的质量和活性，延长了Exendin-4 Fc融合蛋白的保存期。
进一步的，所述溶液缓冲剂包括醋酸、柠檬酸、磷酸、琥铂酸、酒石酸钾钠中的一种或几种混合；
优选的，所述溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠的混合物。
本发明提供的注射剂中加入的溶液缓冲剂能够为Exendin-4 Fc融合蛋白的存储提供良好的酸性环境，此外，溶液缓冲剂包括的醋酸、柠檬酸、磷酸、琥铂酸、酒石酸钾钠均为食用酸，不仅不会与药效成分本身作用，而且长时间保存酸性不会变化，能够使溶液的pH始终维持在6.3－6.7，保证了Exendin-4 Fc融合蛋白存放的稳定性，当然，最优选的，溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠，三种成分按照特定比例混合，形成稳定的缓冲液，混合的缓冲液的生理学相容性是依据于它的pKa和血液很相似，可以在低离子强度下给出一个相当高的缓冲容量，有效保证了溶液在该混合溶液下的稳定性。
进一步的，所述渗透压调节剂包括果糖、氯化镁、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸、维生素B6中的一种或几种混合。
本发明提供的注射剂中加入的渗透压调节剂包括果糖、氯化镁、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸中的一种或几种混合，能够有效保证注射混合液的渗透压稳定，不会引起患者头疼或呕吐等不良反应。
优选的，所述渗透压调节剂为重量份数比为0.8:5:3:0.2:1的果糖、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸和维生素B6的混合物。
通过大量实验验证得到，渗透压调节剂为重量份数比为0.8:5:3:0.2:1的果糖、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸和和维生素B6的混合物具有与血浆相同或者略偏高的渗透压，同时苯丙氨酸与维生素B6相互作用，参与代谢反应，保护胃黏膜，有效缓解患者用药后引起肠胃道反应。
进一步的，所述稳定剂包括重量份数为10-50份的海藻糖、10-50份的甘露醇和1-30份的壳聚糖。
本发明提供的稳定剂中包括不同质量份数的海藻糖、甘露醇和壳聚糖，三种成分相互混合作为稳定剂可以保持Exendin-4 Fc融合蛋白的空间结构的稳定，可以延长Exendin-4 Fc融合蛋白的保存期，同时长期保存后的Exendin-4 Fc融合蛋白与GLP-IR仍然具有高特异性结合能力，保持了药效。
优选的，所述稳定剂还包括重量份数为1-10份的麦芽糖、1-10份的蔗糖、1-6份维生素C和1-6份谷胱甘肽。
本发明提供的稳定剂中还包括不同质量份数的麦芽糖、蔗糖、维生素和谷胱甘肽，这四种成分可以相互作用，能够保持药效成分Exendin-4 Fc融合蛋白的活性，从而保证了长期保存后的融合蛋白具有的药效。
进一步的，所述注射混合液还包括重量份数为1-5份的缓释剂，所述缓释剂包括重量份数为1-5份的大豆磷脂和1-5份胆固醇。
本发明提供的注射混合液中添加的缓释剂能够有效保持药物的药理活性，提高药物的生物利用度，对于糖尿病这种需要长期使用的药物，可以辅助延长药物的半衰期，减少药物的给药次数，提高患者用药依从性，此外，本发明限定的缓释剂中包括大豆磷脂和胆固醇可以形成载药基质，同时对药物分子本身不产生作用，并不影响药效，注射制剂注射后，随着载药基质的逐步降解，缓慢释放药物分子，有效延长了药物半衰期。
优选的，所述缓释剂还包括重量份数比为1-3份的卵磷脂和2-4份的海藻酸钠。
本发明提供的缓释剂中进一步加入卵磷脂和海藻酸钠能够使大豆磷脂和胆固醇形成的载药基质的粒径增大，延长了载药基质在注射部位的滞留时间，缓控释效果显著，有效延长了药物半衰期。
本发明还提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供的含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂能够在各项检测指标均比较稳定、符合相应理化质量标准的情况下稳定储藏至少36个月以上，有效延长了Exendin-4 Fc融合蛋白的保存期，此外，该制剂对于患者的肠胃道反应小，半衰期长，用药频率低，增强了患者服药的顺应性，同时制剂的缓释效果，能够使药物分子Exendin-4 Fc融合蛋白缓慢发挥药效，长期修复胰岛受损细胞，不断恢复胰岛素分泌功能，为药物分子的降糖作用提供了辅助效果，该注射制剂的形成减轻了糖尿病患者高频率、依赖性注射胰岛素等降糖针剂的痛苦，有效用于治疗糖尿病。
附图说明
图1为本发明实验4体内活性实验：小鼠食源性肥胖胰岛素抵抗线条图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
Figure BDA0001854927540000041
Figure BDA0001854927540000051
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.0，每mL注射制剂中含1.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
选择的具体成分
表面活性剂0.1mg 吐温40为0.04mg、泊洛沙姆0.06mg
溶液缓冲剂0.1mg 磷酸为0.05mg、琥珀酸0.05mg
渗透压调节剂5mg 果糖2.5mg、氯化钠为2.5mg
稳定剂50mg 海藻糖为10mg、甘露醇为10mg、壳聚糖为30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.7，每mL注射制剂中含2.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
具体成分
表面活性剂2mg 甘油脂肪酸酯1.5mg、泊洛沙姆0.5mg
溶液缓冲剂0.8mg 柠檬酸0.4mg、磷酸0.4mg
渗透压调节剂10mg 氯化钠5mg、葡萄糖5mg
稳定剂90mg 海藻糖10mg、甘露醇50mg、壳聚糖30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例4
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 甘油脂肪酸酯0.075mg、吐温80为0.15mg、没食子酸丙酯0.005mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例5
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.0，每mL注射制剂中含1.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
选择的具体成分
表面活性剂0.1mg 甘油脂肪酸酯0.0696mg、吐温80为0.03mg、没食子酸丙酯0.0004mg
溶液缓冲剂0.1mg 磷酸为0.05mg、琥珀酸0.05mg
渗透压调节剂5mg 果糖2.5mg、氯化钠为2.5mg
稳定剂50mg 海藻糖为10mg、甘露醇为10mg、壳聚糖为30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例6
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.7，每mL注射制剂中含2.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
具体成分
表面活性剂2mg 甘油脂肪酸酯1.398mg、吐温80为0.6mg、没食子酸丙酯0.002mg
溶液缓冲剂0.8mg 柠檬酸0.4mg、磷酸0.4mg
渗透压调节剂10mg 氯化钠5mg、葡萄糖5mg
稳定剂90mg 海藻糖10mg、甘露醇50mg、壳聚糖30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例7
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 甘油脂肪酸酯0.075mg、吐温80为0.15mg、没食子酸丙酯0.005mg
溶液缓冲剂0.1345mg 磷酸0.06187mg、柠檬酸0.06725mg、酒石酸钾钠0.00538mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例8
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.0，每mL注射制剂中含1.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
选择的具体成分
表面活性剂0.1mg 甘油脂肪酸酯0.0696mg、吐温80为0.03mg、没食子酸丙酯0.0004mg
溶液缓冲剂0.1mg 磷酸0.049mg、柠檬酸0.05mg、酒石酸钾钠0.001mg
渗透压调节剂5mg 果糖2.5mg、氯化钠为2.5mg
稳定剂50mg 海藻糖为10mg、甘露醇为10mg、壳聚糖为30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例9
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.7，每mL注射制剂中含2.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
具体成分
表面活性剂2mg 甘油脂肪酸酯1.398mg、吐温80为0.6mg、没食子酸丙酯0.002mg
溶液缓冲剂0.8mg 磷酸0.376mg、柠檬酸0.4mg、酒石酸钾钠0.24mg
渗透压调节剂10mg 氯化钠5mg、葡萄糖5mg
稳定剂90mg 海藻糖10mg、甘露醇50mg、壳聚糖30mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例10
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
Figure BDA0001854927540000081
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例11
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
Figure BDA0001854927540000082
Figure BDA0001854927540000091
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例12
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
Figure BDA0001854927540000092
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例13
一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液由以下重量克数的成分组成：
Figure BDA0001854927540000093
Figure BDA0001854927540000101
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例14
本发明实施例14在实施例1的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 吐温80为0.2mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
缓释剂5mg 大豆磷脂3mg、胆固醇2mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例15
本发明实施例15在实施例2的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.0，每mL注射制剂中含1.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.1mg 吐温40为0.04mg、泊洛沙姆0.06mg
溶液缓冲剂0.1mg 磷酸为0.05mg、琥珀酸0.05mg
渗透压调节剂5mg 果糖2.5mg、氯化钠为2.5mg
稳定剂50mg 海藻糖为10mg、甘露醇为10mg、壳聚糖为30mg
缓释剂1mg 大豆磷脂0.2mg、胆固醇0.8mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例16
本发明实施例16在实施例3的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.7，每mL注射制剂中含2.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
具体成分
表面活性剂2mg 甘油脂肪酸酯1.5mg、泊洛沙姆0.5mg
溶液缓冲剂0.8mg 柠檬酸0.4mg、磷酸0.4mg
渗透压调节剂10mg 氯化钠5mg、葡萄糖5mg
稳定剂90mg 海藻糖10mg、甘露醇50mg、壳聚糖30mg
缓释剂3mg 大豆磷脂2.4mg、胆固醇0.6mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例17
本发明实施例17在实施例14的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 吐温80为0.2mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
缓释剂5mg 大豆磷脂1.875mg、胆固醇1.25mg、卵磷脂0.625mg、海藻酸钠1.25mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例18
本发明实施例18在实施例15的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.0，每mL注射制剂中含1.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.1mg 吐温40为0.04mg、泊洛沙姆0.06mg
溶液缓冲剂0.1mg 磷酸为0.05mg、琥珀酸0.05mg
渗透压调节剂5mg 果糖2.5mg、氯化钠为2.5mg
稳定剂50mg 海藻糖为10mg、甘露醇为10mg、壳聚糖为30mg
缓释剂1mg 大豆磷脂0.2mg、胆固醇0.1mg、卵磷脂0.3mg、海藻酸钠0.4mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例19
本发明实施例19在实施例16的基础上提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.7，每mL注射制剂中含2.5mg Exendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
具体成分
表面活性剂2mg 甘油脂肪酸酯1.5mg、泊洛沙姆0.5mg
溶液缓冲剂0.8mg 柠檬酸0.4mg、磷酸0.4mg
渗透压调节剂10mg 氯化钠5mg、葡萄糖5mg
稳定剂90mg 海藻糖10mg、甘露醇50mg、壳聚糖30mg
缓释剂3mg 大豆磷脂1.2mg、胆固醇0.3mg、卵磷脂0.6mg、海藻酸钠0.9mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例20
本发明还提供了含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。
对照例1
对照例1提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 吐温80为0.2mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例2
对照例2提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 甘油脂肪酸酯0.14mg、吐温80为0.06mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例3
对照例3提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 甘油脂肪酸酯0.075mg、吐温80为0.15mg、没食子酸丙酯0.005mg
溶液缓冲剂0.1345mg 磷酸0.06725mg、柠檬酸0.06725mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例4
对照例4提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 甘油脂肪酸酯0.075mg、吐温80为0.15mg、没食子酸丙酯0.005mg
溶液缓冲剂0.1345mg 磷酸0.06187mg、柠檬酸0.06725mg、酒石酸钾钠0.00538mg
渗透压调节剂8.775mg 果糖1.755mg、葡萄糖6.58125mg、苯丙氨酸0.43875mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例5
对照例5提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
Figure BDA0001854927540000141
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例6
对照例6提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
Figure BDA0001854927540000142
Figure BDA0001854927540000151
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对照例7
对照例7提供了一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂，注射制剂包括Exendin-4 Fc融合蛋白和注射混合液，注射混合液的pH值为6.5，每mL注射制剂中含2mgExendin-4 Fc融合蛋白，注射混合液包括以下重量克数的成分：
选择的具体成分
表面活性剂0.2mg 吐温80为0.2mg
溶液缓冲剂0.1345mg 柠檬酸0.1345mg
渗透压调节剂8.775mg 氯化钠8.775mg
稳定剂81mg 海藻糖50mg、甘露醇30mg、壳聚糖1mg
缓释剂5mg 大豆磷脂1.5mg、胆固醇2.0mg、卵磷脂1.5mg
余量为注射用水，加入至西林瓶中，制成1mL的注射制剂。
其中，所述Exendin-4 Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实验一、含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂稳定性实验
1、高温加速实验
分别取本发明实施例1、4、7、10、11和对照例1、2、3、4、5提供的含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂各10支，同时在37℃高温条件下放置21天(504小时)，同时在第7(168小时)、14(336小时)和21天分别取样进行纯度、电荷异构体及活性分析，测试结果取平均值，具体测试结果如下：
表1本发明实施例提供的注射制剂的纯度分析
Figure BDA0001854927540000152
Figure BDA0001854927540000161
通过表1结果表明，在37℃高温条件下加速存放504h后，本发明实施例1与对照例1提供的注射制剂相比，实施例1提供的注射制剂在504h时，单体百分比为80.78％远高于对照例1中注射制剂内单体百分比，为此说明本发明提供的注射制剂中表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂及稳定剂缺一不可，缺少或增加任意一种添加成分将有可能导致注射制剂内聚合体、二聚体和降解物增加，从而降低了单体百分比。
同理，本发明实施例4提供的注射制剂经过高温存放504h后其单体百分比高于与实施例1提供的注射制剂，说明本发明实施例4中在改变表面活性剂的成分后，其单体百分比升高，聚合体、二聚体和降解物等明显降低，可以说明表面活性剂为重量份数比为0.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯的混合物，可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例4与对照例2相比，实施例4的单体百分比明显高于对照例2，由此说明，甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯组成的表面活性剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致注射制剂内聚合体、二聚体和降解物增加，从而降低了单体百分比。
同理，本发明实施例7提供的注射制剂经过高温存放504h后其单体百分比高于与实施例4提供的注射制剂，说明本发明实施例7中在改变溶液缓冲剂的成分后，其单体百分比升高，聚合体、二聚体和降解物等明显降低，可以说明溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠的混合物可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例7与对照例3相比，实施例7的单体百分比明显高于对照例3，由此说明，磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠组成的溶液缓冲剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致注射制剂内聚合体、二聚体和降解物增加，从而降低了单体百分比。
同理，本发明实施例10提供的注射制剂经过高温存放504h后其单体百分比高于实施例7提供的注射制剂，说明本发明实施例10中在改变渗透压调节剂的成分后，其单体百分比升高，聚合体、二聚体和降解物等明显降低，可以说明渗透压调节剂为重量份数比为0.8:6:3:0.2的果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸的混合物可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例10与对照例4相比，实施例10的单体百分比明显高于对照例4，由此说明，果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸组成的渗透压调节剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致注射制剂内聚合体、二聚体和降解物增加，从而降低了单体百分比。
同理，本发明实施例11提供的注射制剂经过高温存放504h后其单体百分比高于实施例10提供的注射制剂，说明本发明实施例11中在改变稳定剂的成分后，其单体百分比升高，聚合体、二聚体和降解物等明显降低，可以说明稳定剂包括重量份数为10-50份的海藻糖、10-50份的甘露醇、1-30份的壳聚糖、1-10份的麦芽糖、1-10份的蔗糖、1-6份维生素C和1-6份谷胱甘肽可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例11与对照例5相比，实施例11的单体百分比明显高于对照例5，由此说明，海藻糖、甘露醇、壳聚糖、麦芽糖、蔗糖、维生素C和谷胱甘肽组成的稳定剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致注射制剂内聚合体、二聚体和降解物增加，从而降低了单体百分比。
表2本发明不同实施例提供的注射制剂的电荷异构体分析
Figure BDA0001854927540000181
Figure BDA0001854927540000191
通过表2结果表明，在37℃高温条件下加速存放504h后，本发明实施例1与对照例1相比，实施例1提供的注射制剂在高温加速504h的主峰值远远大于对照例1，说明本发明提供的注射制剂中加入的表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂及稳定剂能够提高注射制剂的稳定性，而且四种成分缺一不可，缺少任意一种将有可能导致稳定性下降。
同理，本发明实施例4与实施例1相比，实施例4提供的注射制剂在高温加速504h的主峰值大于实施例1，说明在改变表面活性剂的成分后，稳定性提高，由此说明，表面活性剂为重量份数比为0.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯的混合物，可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例4与对照例2相比，实施例4在高温加速504h的主峰值大于对照例2，所以甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯组成的表面活性剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的稳定性降低。
同理，本发明实施例7与实施例4相比，实施例7提供的注射制剂在高温加速504h的主峰值大于实施例4，说明在改变溶液缓冲剂的成分后，稳定性提高，由此说明，溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠的混合物可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例7与对照例3相比，实施例7在高温加速504h的主峰值大于对照例3，所以磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠组成的溶液缓冲剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的稳定性降低。
同理，本发明实施例10与实施例7相比，实施例10提供的注射制剂在高温加速504h的主峰值大于实施例7，说明在改变渗透压调节剂的成分后，稳定性提高，由此说明，渗透压调节剂为重量份数比为0.8:6:3:0.2的果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸的混合物可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例10与对照例4相比，实施例10在高温加速504h的主峰值大于对照例4，所以果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸组成的渗透压调节剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的稳定性降低。
同理，本发明实施例11与实施例10相比，实施例11提供的注射制剂在高温加速504h的主峰值大于实施例10，说明在改变稳定剂的成分后，稳定性提高，由此说明，稳定剂包括重量份数为10-50份的海藻糖、10-50份的甘露醇、1-30份的壳聚糖、1-10份的麦芽糖、1-10份的蔗糖、1-6份维生素C和1-6份谷胱甘肽可以提高注射制剂内融合蛋白的稳定性，相反的，实施例11与对照例5相比，实施例11在高温加速504h的主峰值大于对照例5，所以海藻糖、甘露醇、壳聚糖、麦芽糖、蔗糖、维生素C和谷胱甘肽组成的稳定剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的稳定性降低。
将上述样品在37℃高温条件不同时间内Exendin-4与GLP-1R特异性结合能力，检测在不同制剂注射混合液存放的融合蛋白结合活性效果的差异。
Exendin-4通过与靶细胞表面受体胰高血糖素1受体GLP-1R结合，激活与受体偶联的G蛋白，继而G蛋白亚基使腺苷酸环化酶活化，使靶细胞内CAMP浓度升高，CAMP随之激活蛋白激酶A(PKA)，最终促使胰岛素分泌，达到降糖的目的。在本发明使用ELISA手段，分析和比较融合蛋白注射制剂样品在37℃加速条件不同时间内Exendin-4与GLP-1R特异性结合能力，以评价结合活性效果。
采用Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白作为结合活性参考品，使用GraphPad Prism软件(版本5.00)的非线性回归(Nonlinear Regression(curve fit))中Sigmoidal dose-response(variable slope)进行数据回归分析，具体测试结果如下。
表3本发明不同实施例提供的注射制剂的结合活性测定
Figure BDA0001854927540000201
Figure BDA0001854927540000211
通过表3表明，结合活性检定相关质量标准为50％～150％，在37℃高温条件下高温加速存放504h后，本发明实施例1与对照例1提供的注射制剂相比，实施例1提供的注射制剂在高温加速504h的活性高于对照例1，说明本发明提供的注射制剂中加入的表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂及稳定剂能够使蛋白保持活性，而且四种成分缺一不可，缺少或添加任意一种将有可能导致活性下降。
同理，本发明实施例4与实施例1相比，实施例4提供的注射制剂在高温加速504h的活性高于实施例1，由此说明，表面活性剂为重量份数比为0.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯的混合物，可以使注射制剂内融合蛋白保持活性，相反的，实施例4与对照例2相比，实施例4在高温加速504h的蛋白活性高于对照例2，所以甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯组成的表面活性剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的活性降低。
同理，本发明实施例7与实施例4相比，实施例7提供的注射制剂在高温加速504h的蛋白活性高于实施例4，由此说明，溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠的混合物可以使注射制剂内融合蛋白保持活性，相反的，实施例7与对照例3相比，实施例7在高温加速504h的蛋白活性高于对照例3，所以磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠组成的溶液缓冲剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的活性降低。
同理，本发明实施例10与实施例7相比，实施例10提供的注射制剂在高温加速504h的蛋白活性高于实施例7，由此说明，渗透压调节剂为重量份数比为0.8:6:3:0.2的果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸的混合物可以使注射制剂内融合蛋白保持活性，相反的，实施例10与对照例4相比，实施例10在高温加速504h的蛋白活性高于对照例4，所以果糖、氯化钠、葡萄糖和苯丙氨酸组成的渗透压调节剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的活性降低。
同理，本发明实施例11与实施例10相比，实施例11提供的注射制剂在高温加速504h的蛋白活性高于实施例10，由此说明，稳定剂包括重量份数为10-50份的海藻糖、10-50份的甘露醇、1-30份的壳聚糖、1-10份的麦芽糖、1-10份的蔗糖、1-6份维生素C和1-6份谷胱甘肽可以使注射制剂内融合蛋白保持活性，相反的，实施例11与对照例5相比，实施例11在高温加速504h的蛋白活性高于对照例5，所以海藻糖、甘露醇、壳聚糖、麦芽糖、蔗糖、维生素C和谷胱甘肽组成的稳定剂缺一不可，缺少或增加任何一种成分将会导致蛋白的活性降低。
2、长期稳定性实验
取本发明实施例1、4、7、10、11和对照例1、2、3、4、5提供的Exendin-4Fc(IgG2)融合蛋白注射制剂，进一步考察本发明Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白在不同配方的注射混合液中，2℃～8℃温度存贮条件下至少36个月的长期稳定性，在不同时间点取样进行蛋白含量、相对活性、纯度等检查。
表4本发明的长期稳定性实验结果
Figure BDA0001854927540000221
Figure BDA0001854927540000231
由表4可知，通过2℃～8℃存放36个月的长期稳定性试验，在不同时间点分别对实施例1、4、7、10、11和对照例1、2、3、4、5取样进行外观、蛋白含量、相对活性、纯度等检查。通过长期试验验证，实施例1、4、7、10、11提供的注射制剂存放至36个月时，其外观仍为无色澄清，无颗粒，符合质量要求，而对照例1在存放至18个月时开始出现浑浊情况，直至36个月后明显存在浑浊，有少量蛋白析出，所以本发明实施例提供的注射制剂各项指标均比较稳定，符合相应理化质量标准。此外，通过蛋白含量、纯度、结合活性等检测，发现实施例11的稳定性最高，其外观、蛋白含量、纯度、结合活性全部保持稳定，未呈现下降趋势。
综上所述，通过加速试验和长期稳定性实验可知，本发明实施例提供的含有Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白的注射制剂较稳定，注射制剂中加入的表面活性剂、溶液缓冲剂、渗透压调节剂及稳定剂能够提高注射制剂的稳定性，而且四种成分缺一不可，缺少任意一种将有可能导致稳定性下降，能够稳定储藏至少36个月以上，在改变的气候条件下，特别是在升高的温度下也能够保持贮存稳定，此外，实施例11提供的注射剂的稳定性最高。
实验二、pH对Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白的降解的效应
将本发明实施例1、4、7、10、11提供的Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白注射制剂均配置多组pH值5.6－6.9制剂，在37℃高温下，进行21天(504小时)稳定性分析。
表5本发明不同实施例在不同pH值下Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白的降解效应
Figure BDA0001854927540000241
Figure BDA0001854927540000251
由表5可知，本发明1、4、7、10、11提供的Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白注射制剂在37℃高温下加速存放21天后，本发明1、4、7、10、11提供的Exendin-4Fc(IgG2)融合蛋白注射制剂的注射混合液在pH值6.0－6.7范围存储的Exendin-4Fc(IgG2)融合蛋白的单体百分比较高，该范围以外的其他pH值均造成融合蛋白的单体百分比降低，杂质较多，所以，pH值6.0－6.7范围的注射混合液能够使Exendin-4 Fc(IgG2)融合蛋白保持稳定。
实验三、本发明提供的注射制剂的胃肠道反应验证
取本发明实施例1、实施例10、对照例4和艾塞那肽(百泌达)提供的注射制剂进行动物实验，购买来自南京鹏晟生物科技发展有限公司的C57/B6雄性小鼠。选择14-16周龄的C57/B6雄性小鼠，随机分成四组，每组10只，分别注射本发明实施例1、实施例10、对照例4和艾塞那肽，提供的注射剂及生理盐水，注射生理盐水作为空白对照，连续21天。试验期间，每日观察，记录各组小鼠的食欲、粪便情况。小鼠胃肠道不良反应的诊断标准为根据人胃肠道不良反应的标准并结合小鼠的生物学特性，确定食欲不振(食量下降)、消瘦(体重下降)、便溏(拉尾排便次数增多，便形溏稀，肛周污秽)或便秘等症状和体征为主要诊断标准。观察注射后小鼠是否出现胃肠道反应，实验结果如下：
表6本发明不同实施例提供的注射制剂的胃肠道反应实验
Figure BDA0001854927540000252
Figure BDA0001854927540000261
通过表6可知，本发明实施例10中提供的注射制剂中添加的渗透压调节剂由果糖、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸和维生素B6组成，能够有效缓解胃肠道反应，通过对照例4相比，4种成分缺一不可，缺少或增加任何一种或两种均对胃肠道反应的缓解效果变差。
实验四、本发明提供的注射制剂的缓释效果验证
购买来自南京鹏晟生物科技发展有限公司的C57/B6雄性小鼠，将小鼠在高脂肪食品喂养六周以上的条件下形成肥胖症，并出现胰岛素抵抗和血糖升高的症状，这种症状类似于常见的人类II型糖尿病。
选择14-16周龄的C57/B6雄性小鼠，随机分成两组，每组4只，分别注射本发明实施例1、实施例14、实施例17和对照例6、对照例7提供的注射剂及生理盐水，注射生理盐水作为空白对照，检测其30天内血糖浓度的变化。
通过检测，如图1所示，注射生理盐水组的血糖浓度无明显变化，说明生理盐水对食源性肥胖胰岛素抵抗不起作用；单次注射本发明实施例1提供的注射剂把血糖从约200mg/dL持续降低到100mg/dL，而且周期持续至少一周，单次注射本发明实施例14提供的注射剂把血糖从约200mg/dL持续降低到100mg/dL，而且周期持续至少2周，单次注射本发明对照例6提供的注射剂把血糖从约200mg/dL能够持续降低到100mg/dL，但周期持续1周左右，与实施例1提供的注射剂无太大变化，所以可以说明，本发明实施例14中添加的缓释剂能够有效提高注射剂中药物成分Exendin-4 Fc融合蛋白的缓释效果，延长药物半衰期。
此外，单次注射本发明实施例17提供的注射剂把血糖从约200mg/dL持续降低到100mg/dL，而且周期持续至少3周，同时单次注射本发明对照例7提供的注射剂把血糖从约200mg/dL能够持续降低到100mg/dL，但周期持续2周左右，与实施例14提供的注射剂无太大变化，所以可以说明，本发明实施例17中添加的缓释剂包括的大豆磷脂、胆固醇、卵磷脂、海藻酸钠的混合物能够有效延长药物成分的半衰期，通过对照例7相比，说明这几种成分缺一不可，缺少或增加任何一种，将有可能造成半衰期缩短。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种含有Exendin-4 Fc融合蛋白的注射制剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
His Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ser Ala Leu Ser Leu Gly Met Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ala Val Ala Leu Pro Ile Gly Thr Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Val Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
50 55 60
Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu Met Ile Ser Ala Thr
65 70 75 80
Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Gly Ala Pro Gly
85 90 95
Val Gly Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly Val Gly Val His Ala Ala Leu
100 105 110
Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro Ala Ser Thr Pro Ala Val Val Ser
115 120 125
Val Leu Thr Val Val His Gly Ala Thr Leu Ala Gly Leu Gly Thr Leu
130 135 140
Cys Leu Val Ser Ala Leu Gly Leu Pro Ala Pro Ile Gly Leu Thr Ile
145 150 155 160
Ser Leu Thr Leu Gly Gly Pro Ala Gly Pro Gly Val Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Pro Ser Ala Gly Gly Met Thr Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Cys Leu
180 185 190
Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile Ala Val Gly Thr Gly Ser Ala
195 200 205
Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr Thr Pro Pro Met Leu Ala Ser
210 215 220
Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Leu Leu Thr Val Ala Leu Ser Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu
245 250 255
His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu
260 265 270

Claims (8)

1.一种含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述注射制剂包括Exendin-4Fc融合蛋白和注射混合液，所述注射混合液的pH值为6.0－6.7，每mL所述注射制剂中含1.5-2.5mg所述Exendin-4Fc融合蛋白，所述注射混合液包括以下重量份数的成分：
Figure FDA0002267636530000011
其中，所述Exendin-4Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆、没食子酸丙酯中的一种或多种混合，其中，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80；
所述溶液缓冲剂包括醋酸、柠檬酸、磷酸、琥铂酸、酒石酸钾钠中的一种或几种混合；
所述渗透调节剂包括果糖、氯化镁、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸、维生素B6中的一种或几种混合；
所述稳定剂包括重量份数为10-50份的海藻糖、10-50份的甘露醇和1-30份的壳聚糖。
2.如权利要求1所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂为重量份数比为0.5-8:3:0.01-0.1的甘油脂肪酸酯、吐温80和没食子酸丙酯的混合物。
3.如权利要求1所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述溶液缓冲剂为重量份数比为0.1-7:5:0.1-0.4的磷酸、柠檬酸和酒石酸钾钠的混合物。
4.如权利要求1所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述渗透调节剂为重量份数比为0.8:5:3:0.2:1的果糖、氯化钠、葡萄糖、苯丙氨酸和维生素B6的混合物。
5.如权利要求1所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述稳定剂还包括重量份数为1-10份的麦芽糖、1-10份的蔗糖、1-6份维生素C和1-6份谷胱甘肽。
6.如权利要求1所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述注射混合液还包括重量份数为1-5份的缓释剂，所述缓释剂包括重量份数为1-5份的大豆磷脂和1-5份胆固醇。
7.如权利要求6所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述缓释剂还包括重量份数比为1-3份的卵磷脂和2-4份的海藻酸钠。
8.一种权利要求1-7任一项所述的含有Exendin-4Fc融合蛋白的注射制剂在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。
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