CN101273134A

CN101273134A - 用于预防和治疗ⅰ型和ⅱ型糖尿病的组合物和方法

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Publication number: CN101273134A
Application number: CNA2006800355464A
Authority: CN
Inventors: 王庆华; 杰拉尔德·J·普鲁德霍姆; 莫汗·库马尔
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Yinnuo Pharmaceutical Group Co.,Ltd.; Shanghai Silver Connaught Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2005-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2026-07-27
Also published as: EP1920061A1; CN101273134B; WO2007012188A1; EP1920061A4; CA2658673A1; US20090181912A1; US8658174B2

Abstract

本发明涉及一种用于在受试者体内预防和治疗I型和II型糖尿病的方法和组合物。所述组合物含有IgG－Fc融合蛋白，其中，该融合蛋白含有GLP－1、GLP－1突变体或者exendin－4。

Description

用于预防和治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的组合物和方法

技术领域

本发明涉及糖尿病的预防和治疗。具体地，本发明提供一种用于治疗哺乳动物I型和II型糖尿病的组合物及其制备方法。所述组合物含有GLP-1或Ex4融合蛋白。

背景技术

糖尿病是造成人类死亡的主要病因，仅在北美就有超过2000万的患者而全球大约有2亿患者(美国糖尿病协会：www.diabetes.org；加拿大糖尿病协会：www.diabetes.ca；世界卫生组织： www.who.int.biabetes)。I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的两种主要形式。这两种糖尿病都以β-细胞的质量减少及其功能的降低为特点。

I型糖尿病(又称青少年糖尿病)是一种通常在低龄时形成的复杂的T-细胞依赖自身免疫性疾病(Juneja and Palmer，Autoimmunity.1999；29(1)：65-83)。I型糖尿病是由胰岛β-细胞的免疫性破坏造成伴随相应的胰岛素缺乏和对外源性胰岛素的依赖。单核细胞对胰腺内分泌细胞及组织的病灶性侵润以及功能性β-细胞质量的显著减少是诊断该疾病的组织病理学的特点，但是就这些损伤的程度而言个体间差异显著。自身免疫性破坏使得T-细胞侵润到胰岛(islets of Langerhans)，结果出现β-细胞的凋亡(Lee等人，Mol Genet Metab.2004；83(1-2)：82-92；Mandrup-Poulsen，Biochem Pharmacol.2003；66(8)：1433-1440；Sesti，Ann Med.2002；34(6)444-450；Mathis等人，Nature.2001；414(6865)792-798)。为研究糖尿病潜在的分子机制，已经建立了动物模型。例如，用链脲霉素(streptozotocin)(STZ)诱导的胰岛素缺乏性的大鼠或小鼠模拟在糖尿病患者体内可见的T-细胞介导的炎症和胰岛β-细胞的破坏。此外，非肥胖糖尿病(NOD)的小鼠是另一个研究自身免疫性疾病的模型，其中胰岛-抗原活性T-细胞浸润胰岛并杀死胰岛β-细胞，并且/或者引发炎症过程导致胰岛β-细胞的死亡(Anderson and Bluestone，AnnuRev Immunol.2005；23：447-485)。

胰岛素疗法是干预I型糖尿病的主要手段。虽然胰腺的胰岛移植是一个有效的治疗方法(Shapiro等人，N Engl J Med.2000；343(4)：230-238)，但由于人类胰岛来源有限而大大受限。另外，胰岛移植患者要终生使用免疫抑制剂。尽管胰岛素疗法运用于多数I型糖尿病患者，但胰岛素不能根治糖尿病，这是由于胰岛素很难将血糖水平维持在一个狭窄的生理范围内并且其既无法中止糖尿病的发展也不能阻止严重的糖尿病并发症的出现。

II型糖尿病是一种通常在成人期诊断的多基因功能失常，其以引起高血糖症的三个主要异常为特点：1)外周胰岛素抵抗、2)肝糖原的过量生成、3)胰腺β-细胞功能障碍。胰岛素抵抗是指外周组织主要是骨骼肌细胞对胰岛素的反应降低，导致葡萄糖运输到这些组织的障碍(Kahn and Goldfine，J Diabetes Complications.1993；7(2)：92-105；Weyer等人.，J Clin Invest.1999；104(6)：787-794)。胰岛素抵抗同样可以发生在肝脏，致使在肝脏中胰岛素不能有效地抑制肝脏葡萄糖的生成(Kahn和Goldfine，J Diabetes Complications.1993；7(2)：92-105；Lam等人，AmJ Physiol Endocrinol Metab.2002；283(4)：E682-E691)。此外，胰脏的胰高血糖素的过量分泌也是造成肝糖原不成比例地过量生成的一个主要原因(Unger and Orci，Arch Intern Med.1977；137(4)：482-491)。胰岛素抵抗的结果是机体对胰岛素的需求增加。在胰岛素抵抗的早期阶段，通过增加胰岛素分泌引起胰腺内β-细胞质量增加的代偿机制这些患者的血糖水平仍然可维持在正常范围内(Bonner-Weir，Trends EndocrinolMetab.2000；11(9)：375-378；Bonner-Weir，Endocrinology.2000；141(6)：1926-1929)。许多研究表明，如果能维持胰腺β-细胞的代偿功能，胰岛素抵抗本身还不足以激发糖尿病的发作(Weyer等人，Diabetes.1999；48(11)：2197-2203)。但胰岛素抵抗长时间不予纠正并变得严重，对胰岛素的过度需求导致β-细胞衰竭，胰岛素分泌减少，并出现空腹高血糖症状和明显的糖尿病(DeFronzo，Diabetes.1988；37(6)：667-687；Kahn等人，J Nutr.2001；131(2)：354S-360S；Weyer等人，J Clin Invest.1999；104(6)：787-794)。肥胖型胰岛素抵抗db/db小鼠是重症II型糖尿病的动物模型。这些小鼠瘦素信号途径(leptin signaling)缺陷(Herberg和Coleman，Metabolism.1977；26(1)：59-99；Chen等人，Cell.1996；84(3)：491-495)。

II型糖尿病的常规治疗包括节食和锻炼以及使用磺基脲(sulphonylureas)、甲福明二甲双胍和胰岛素进行药物性干预。但在大多数患者中这些治疗通常都无法阻止血糖控制的长期下降和β-细胞的功能紊乱(Matthews等人，Diabet Med.1998；15(4)：297-303；Turner等人，JAMA.1999；281(21)：2005-2012)临床上针对II型糖尿病所采用的阶梯式的治疗方法最终也无法维持血糖平衡，对于大多数患者，从节食和锻炼到单因素药物治疗、从联合治疗最终到胰岛素治疗成为不可避免的过程(Turner等人，JAMA.1999；281(21)：2005-2012；Gerich，Eur JClin Invest.2002；32 Suppl 3：46-53)。上述治疗既不能阻止II型糖尿病的进展又无法预防与该疾病相关的长期并发症，这可能是上述途径针对的是症状(即，高血糖症)而不是II型糖尿病的病因的结果(Gerich，Eur JClin Invest.2002；32 Suppl 3：46-53)。

胰高血糖素类肽-1(GLP-1，7-36氨基化合物)是一种促胰岛素分泌激素(insulinotropic hormone)(Brubaker and Drucker，Endocrinology.2004；145(6)：2653-2659；Perfetti和Merkel，Eur J Endocrinol.2000；143(6)：717-725；Holst，Gastroenterology.1994；107(6)：1848-1855；Holst和Gromada，Am J Physiol Endocrinol Metab.2004；287(2)：E199-E206)，该激素是由小肠L-细胞分泌通过调节胰岛激素的分泌对营养摄取起作用并促进营养吸收(Drucker，Diabetes.1998；47(2)：159-169)。GLP-1与GLP-1受体(GLP-1R)、G-蛋白偶联受体(GPCR)结合。GLP-1R主要在胰脏β-细胞表达，在其他组织细胞有一定程度的表达(肺脏、心脏、肾脏、胃肠消化道和脑)，并且与环AMP(cAMP)第二信使途径偶联引发其生物学作用(Drucker，Endocrinology.2001；142(2)：521-527；Brubaker和Drucker，Endocrinology.2004；145(6)：2653-2659)、(Brubakcr和Drucker，Receptors Channels.2002；8(3-4)：179-188；Brubaker和Drucker，Endocrinology.2004；145(6)：2653-2659；Thorens，Proc Natl Acad Sci U SA.1992；89(18)：8641-8645)并且和蛋白激酶A(PKA)和cAMP调节的鸟嘌呤置换因子(cAMPGEFs)的Epac家族偶联发挥作用(Miura和Matsui，Toxicol Appl Pharmacol.2006；Holz，Horm Metab Res.2004；36(11-12)：787-794)。其他蛋白激酶的活化包括蛋白激酶B(AKT)并且还发现MAPK(有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK))(Brubaker和Drucker，Endocrinology.2004；145(6)：2653-2659；Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273；Wang等人，Diabetologia.2004；47(3)：478-487)在介导GLP-1促进β-细胞生长和抑制其凋亡的作用中的重要性。

GLP-1以葡萄糖依赖的方式促进β-细胞增殖并抑制其凋亡(Nauck等人，Horm Metab Res.1997；29(9)：411-416；Nauck，Horm Metab Res.2004；36(11-12)：852-858；Drucker，Diabetes.1998；47(2)：159-169)。GLP-1也可以增加I型(Gutniak等人，Diabetes Care.1994；17(9)：1039-1044)和II型(Nauck等人，Diabetes.1997；105(4)：187-195；Todd等人，Eur J Clin Invest.1997；27(6)：533-536；Nathan等人，Diabetes Care.1992；15(2)：270-276)糖尿病的啮齿动物和人类的胰岛素分泌及降低血糖。在II型糖尿病动物模型中，GLP-1或其长效蛋白类似物exendin-4(Ex-4)治疗通过促进β-细胞生长并抑制其凋亡(Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273；Wang，EndocrinologyRounds.2004；3(7)；Wang等人，Diabetologia.2004；47(3)：478-487；Tourrel等人，Diabetes.2002；51(5)：1443-1452)而预防糖尿病的发生(Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273；Tourrel等人，Diabetes.2002；51(5)：1443-1452)。已经证实GLP-1对II型糖尿病有临床疗效(Meier和Nauck，Diabetes Metab Res Rev.2005；21(2)：91-117)。研究证明在分泌胰岛素的β-细胞中，淋巴因子诱导的凋亡和坏死可以明显地被GLP-1或exendin-4(Ex4)所阻滞(Saldeen，Endocrinology.2000；141(6)：2003-2010；Li等人，Diabetologia.2005)。对STZ处理诱导的β-细胞死亡的新生大鼠给以GLP-1/Ex4治疗导致大鼠在成年期持久地维持改善的葡萄糖稳态(Tourrel等人，Diabetes.2001；50(7)：1562-1570)。此外，结合多克隆抗T-细胞抗体免疫抑制处理施用GLP-1/Ex4c治疗，使88％的糖尿病NOD小鼠获得完全治愈(Ogawa等人，Diabetes.2004；53(7)：1700-1705)。

美国专利6,899,883和美国专利6,989,148公开了用胰岛素和胰高血糖素类肽1(7-37)或胰高血糖素类肽1(7-36)氨基化合物治疗I型糖尿病的方法。主要由于包括二肽酰二肽酶IV(DPP-IV)的快速酶促失活(Drucker，Diabetes.1998；47(2)：159-169)，和/或肾脏的清除(Montrose-Rafizadeh等人，Endocrinology.1999；140(3)：1132-1140)，使得天然的GLP-1具有短暂的循环半衰期(t_1/2＜2分钟)。因此需要通过泵采用持续性的皮下灌流以维持体内GLP-1的功效(Toft-Nielsen等人，Diabetes Care.1999；22(7)：1137-1143)。DPP-IV抑制剂能够延长GLP-1的半衰期，DPP-IV抑制剂也能使其他几种多肽激素和一些趋化因子失活(Meier和Nauck，Diabetes Metab Res Rev.2005；21(2)：91-117)，并且其抑制作用可能导致不良反应。出于这个原因，科研人员进行大量努力来开发长效的抗降解的GLP-1类似肽。这些具有氨基酸取代基的(Ahren和Schmitz，Horm Metab Res.2004；36(11-12)：867-876；Green等人，Curr Pharm Des.2004；10(29)：3651-3662)和/或包括脂酰化的N-封端改性的(Chang等人，Diabetes.2003；52(7)：1786-1791)和N-乙酰化(Liu等人，Cell Biol Int.2004；28(1)：69-73)改性的人类GLP-1类似物显现出延长的半衰期t_1/2，并有效地减少了糖尿病受试者的血糖漂移(glycemic excursion)(Chang等人，Diabetes.2003；52(7)：1786-1791)。Ex-4，具有与哺乳动物GLP-1高度的序列同源性的爬行动物肽是GLP-1R的有效激动剂(Fineman等人，Diabetes Care.2003；26(8)：2370-2377)。此外，白蛋白结合的GLP-1(Albugon)具有延长的GLP-1的半衰期，在抗糖尿病中起着有益作用(Kim等人Diabetes.2003；52(3)：751-759)。

尽管DPP-IV-抗性的GLP-1R激动剂和Ex-4显现出可以作为治疗糖尿病的治疗性药物，但这些肽需要每日注射1-2次和/或结合口服糖尿病药物的治疗。如WO 02/46227或WO 05/000892中描述的GLP-1白蛋白融合蛋白或GLP-1融合IgG4融合蛋白的半衰期充分延长可能是由于其分子较大而肾脏排出减少造成的。然而体外研究显示融合蛋白显示出较低的功效(Kim等人，Diabetes.2003；52(3)：751-759)。这使得人们进行更多努力以产生在体内功效稳定的更有效的长效因子。

因此，依然需要开发针对I型和II型糖尿病的潜在分子机制而非该机制后果的有效治疗策略。理想的发明是既针对β-细胞功能障碍又针对胰岛素抵抗的治疗。因此，需要一种既能促进β-细胞生长并能保护其免于β-细胞死亡的治疗以有效治疗该类疾病。

发明内容

本发明涉及预防和治疗I型和II型糖尿病的方法和组合物。本发明的组合物包含新的融合蛋白。该融合蛋白含有与IgG重链恒定(Fc)区融合的GLP-1分子或者其类似物或片段。一方面该IgG为任何鼠源IgG，例如IgG₁，但不局限于IgG₁。另一方面，该IgG为人源的，可以选自IgG₁、IgG₂或IgG₃。本发明的融合蛋白在本文中被称为“GLP-1/IgG-Fc”。在本发明的其他方面，该融合蛋白含有Ex4/IgG-Fc，其中IgG可以是如本文所述的鼠源也可以是人源。

本发明的组合物在受试者中对I型和II型糖尿病的治疗有效。同样地，本发明提供了用于治疗受试者的I型和II型糖尿病的方法，其中如果需要给受试者使用所述的融合蛋白。

本发明还提供了使用哺乳动物表达细菌培养系统制备本发明的融合蛋白GLP-1/IgG-Fc和Ex4/IgG-Fc的新方法。在这两种系统中，培养细胞克隆以制备包括GLP-1/IgG₁-Fc和GLP-1/IgG₂-Fc的融合蛋白以及有效抵抗DPP-IV降解的治疗有效性突变体型，例如但不限于GLP-1A8G/IgG-FC(在第8位的丙氨酸被甘氨酸取代)和Ex4/IgG-Fc。本发明的二价GLP-1/IgG-Fc融合蛋白具有独特的特点：1)增加了循环半衰期t_1/2；2)高亲和性和效能；3)最小化的免疫原性和4)用于大规模制备的简便的一步法提纯。可以将本发明的组合物按需要以多种形式提供给受试者。在一个实施方案中，进行1次或2次GLP-1/IgG-Fc和/或GLP-1A8G/IgG-FC和/或Ex4/IgG-Fc载体取得和在两周内每日腹膜内注射Ex4相似的效果。

本发明的一方面提供了一种用于受试者控制血糖平衡的GLP-1融合蛋白。

本发明的一方面提供了一种用于控制受试者血糖浓度的GLP-1融合蛋白。

本发明的一方面提供了一种GLP-1融合蛋白，其促进受试者β-细胞增殖和/或减少β-细胞凋亡从而增加β-细胞质量。

根据本发明的一个方面，本发明的融合蛋白增加了受试者的胰岛素释放和葡萄糖耐受性并降低空腹血糖水平。

本发明的一方面提供了一种融合蛋白，该融合蛋白含有GLP-1多肽或类似物、或者其突变体或其片段或者IgG多肽。

本发明的一方面提供了一种异源性融合蛋白，该融合蛋白含有与IgG多肽融合的GLP-1多肽或其变异体，其中所述的IgG不是IgG₄。

根据本发明的一方面，所述IgG是鼠源。

根据本发明的一方面，所述IgG是鼠IgG₁。

根据本发明的一方面，所述IgG是人源。

根据本发明的一方面，所述IgG是人IgG₁、IgG₂或IgG₃。

根据本发明的一方面，所述IgG是人IgG₂。

根据本发明的一方面，所述GLP-1多肽选自由GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)氨基化合物、DPP-IV抗性的GLP-1及其片段和衍生物组成的组。

根据本发明的一方面，所述DPP-IV抗性的GLP-1为GLP-1A8G。

根据本发明的一方面，所述衍生物含有大约70％至大约95％与GLP-1 ID NO.1序列相同的序列的多肽。

根据本发明的一方面，所述IgG片段含有至少5个氨基酸至多达250个氨基酸。

根据本发明的一方面，所述IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。

本发明一方面提供了一种编码所述异源性融合蛋白的cDNA。

本发明一方面提供了一种含有所述融合蛋白的cDNA的载体。

本发明一方面提供了一种经含有所述异源性融合蛋白的cDNA的载体转染的宿主细胞。

本发明的一方面提供了一种药用组合物，所述组合物含有上述异源性融合蛋白或者包含以可药用载体负载的异源性融合蛋白的cDNA的载体。

根据本发明的一方面，所述药用组合物用于治疗I型和II型糖尿病。

根据本发明的一方面，所述药用组合物可通过选自由局部施用、口服、气雾方式、腹膜内注射、静脉注射或肌肉注射组成的组的方式施用。

根据本发明的一方面，所述药用组合物用于受治疗者的I型和II型糖尿病的治疗，所述组合物含有包含与IgG多肽融合的GLP-1多肽或者其衍生物或活性片段的异源性融合蛋白。

本发明一方面提供了一种治疗受试者的I型和/或II型糖尿病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的融合蛋白或所述组合物或所述载体。

本发明一方面提供了所述异源性融合蛋白用于治疗或预防I型和/或II型糖尿病的药物中的用途。

本发明的一方面提供了一种含有与IgG多肽融合的exendin-4多肽或者其衍生物或片段的异源性融合蛋白。

根据本发明的一方面，所述IgG选自由人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。

本发明的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是，应该理解的是，仅以示例的方式给出详细描述和具体实施例以表明本发明的实施方案，这是因为对于本领域熟练技术人员从所述的详细描述中在本发明的实质和范围内多种改变和改良是显而易见的。

附图说明

参考附图从以下详细描述中将进一步理解本发明，其中：

图1：构建编码GLP-1/IgG-Fc的质粒。1A：将编码GLP-1/mIgG 1-Fc融合蛋白的cDNA连接到载体的Mam H I和Eco RV位点之间。1B中显示：由活性GLP-1(7-37)分子和包含鼠IgG1恒定重链区(CH1、铰链、CH2和CH3部分)的IgG-Fc组成的分泌的GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的图示。1C：将化学合成的编码hGHRH/hGLP-1融合蛋白的cDNA链接到PCR扩增的编码人IgG2-Fc(铰链-ch2-ch3)的cDNA片段上，然后插入pAV0243载体的Nco I和Hind III位点之间产生GLP-1/hIgG-Fc/pAV0243。1D中显示：由活性GLP-1分子(7-37)和包含人IgG2恒定区重链(铰链、CH2和CH3)的IgG-Fc组成的可分泌的GLP-1/hIgG-Fc融合蛋白的图示。这些蛋白质表达时均以同型二聚体的形式分泌。利用位点导向突变产生的编码GLP-1A8G-IgG-Fc或Ex4/IgG-Fc融合蛋白的cDNA。使用相同的方法产生Ex4/IgG-Fc cDNA并克隆入pAV0243。

图2显示的是IgG-Fc融合蛋白在COS-7细胞中的表达和检测。用质粒载体编码IgG-Fc融合转染COS-7细胞，转染48h后分离总RNA。2A显示的是用溴化乙锭显色的在1％琼脂糖凝胶上的RT-PCR产物。2B显示的是用G蛋白琼脂糖凝胶纯化融合蛋白并用SDS-PAGE溶解然后转移到醋酸纤维素膜上。上述膜用抗小鼠抗体(1∶5000)探测并用ECL显影。

图3是显示转染后COS-7细胞的GLP-1融合蛋白的分泌的图。将COS-7细胞植入12孔培养板中并用仅含不同量的GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc的质粒转染。于转染48h后收集培养液并将150μL培养液用于RIA检测GLP-1。

图4A显示的是GLP-1融合蛋白在COS-7细胞中大量表达。将COS-7细胞植入150mm²培养皿中并于次日用80μg DNA转染。转染后48h收集培养液，用1mL G蛋白琼脂糖凝胶培养过夜纯化融合蛋白。洗涤细胞团(bead)，加入1mL 0.1M的氨基乙酸(pH2.7)洗脱纯化的蛋白。重复洗脱并收集组分。取30μL组分在所述的还原或非还原条件下通过SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝(Comasie Blue)染色。

图4B显示的是GLP-1在哺乳动物和细菌细胞中的表达。使用G蛋白凝胶纯化在COS-7细胞和细菌(Rosetta gami 2)表达的IgG-Fc融合蛋白。不同量的纯化蛋白用总GLP-1 RIA试剂盒检测GLP-1蛋白。

图5显示的是在稳定的转染COS-7细胞中GLP-1的表达。用GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc线性化质粒转染COS-7细胞并用500μg/mL的G418筛选。分拣可能的阳性克隆后，分拣的细胞在12孔培养板上生长，种植后48h收集培养液。用该培养液在总GLP-1 RIA分析中检测GLP-1蛋白。

图6显示的是GLP-1/IgG-Fc融合蛋白治疗对INS-1细胞中的胰岛素分泌的影响。将INS-1细胞种植在24孔板上生长过夜。将经葡萄糖和血清饥饿的细胞在含有0、5或20mM葡萄糖的KRB缓冲液中用纯化的GLP-1/IgG融合蛋白处理1h。用胰岛素放射性免疫测定分析培养液的胰岛素分泌量。

图7显示的是示例GLP-1/IgG-Fc具有与Ex-4相似的刺激INS-1细胞生成cAMP的功效。将INS-1细胞种植在24孔板上并培养过夜。经葡萄糖和血清饥饿的细胞在加有0或5mM葡萄糖的无血清RPMI中用纯化的GLP-1/IgG融合蛋白(IgG-Fc和Ex4作为阴性和阳性对照)处理10min。用放射性免疫测定测量冷冻干燥的细胞提取物中cAMP的水平。

图8A-D显示的是体内表达GLP-1/IgG-Fc对患有II型糖尿病的db/db模型鼠的作用。4周和/或6周龄的db/db小鼠通过电转移肌肉注射GLP-1/IgG-Fc和/或Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc载体。收集注射前的和注射后2、12、16周的血清。活性GLP-1水平通过GLP-1 Elisa试剂盒检测(8A)。首次注射后12周检测两组小鼠的空腹血糖水平(n＝5-6，p＜0.001)(图8B)。在第12周经过夜饥饿，用RIA检测试验鼠血液胰岛素水平(8C)和胰高血糖素水平(8D)。

图9A和图9B显示的是体内表达GLP-1/IgG-Fc对链脲霉素诱导的胰岛素缺陷的I型糖尿病模型中的作用。(9A)对CD1模型鼠肌肉注射编码GLP-1/IgG-Fc、Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc(每只鼠50μg)并用电转移促进基因转移。DNA注射7d后，受试鼠受强化注射，并于当日起接受连续5日每日注射STZ(55mg/kg，腹膜内注射)。注射STZ数天后注射IgG-Fc的对照受试鼠血糖增加显著(≥17mM)，但GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)处理的受试鼠被保护并表现出低的明显糖尿病的发生频率(9B)。胰腺的组织学研究以先前报道的胰腺切片方法进行(Wang等人，Mol Biol Cell.1998；9(11)：3057-3069)。β-细胞在4℃经豚鼠抗胰岛素IgG(1∶1,000，Dako)过夜处理后，用生物素偶联的鼠抗豚鼠IgG(1∶1,100)室温处理60min。加入Cy3偶联的抗生物素蛋白(1∶1,1000，Jackson Labs)另外处理45min。用Ziess激光共聚焦显微镜(510型)摄影。胰腺胰岛总的细胞质量的确定是由总的胰岛素阳性切片的细胞面积/总的胰腺组织面积乘以胰腺组织固定前的重量。图中显示在所有组中用STZ处理的鼠出现胰岛β-细胞受破坏，而GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)处理的小鼠中受损程度较轻。在这些小鼠中观察到单核细胞(淋巴和/或巨嗜细胞)对胰岛的侵润(没有显示)。有趣的是，尽管Ex4/IgG-Fc预期对DPP-IV降解表现抗性，但该处理与GLP-1/IgG-Fc处理的结果类似。上述结果表明，尽管胰岛有炎症存在(胰岛炎)，但是GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)的表达保护试验动物免受STZ-诱发的β-细胞损害()。

图10显示的是体内表达GLP-1/IgG-Fc及其对猪血糖的影响。雄性受试约克夏猪(23kg)每只注射4mg GLP-1/IgG-Fc或注射IgG-Fc载体作为对照。注射3日后为诱导高血糖，在麻醉条件下将四氧嘧啶一水化合物(Sigma/80mg/kg)混合25ml生理盐水静脉注射。开始阶段，酸性的麻醉剂于注射前经中和但未引起高血糖症，后续试验免去中和步骤。结果显示，在IgG-Fc处理组引起中等程度高血糖，GLP-1/IgG-Fc处理组没有引起高血糖。在镇静剂可他命处理下每周2次测试受试猪空腹血糖值。血液样品用血糖计抽取(A)，Fc蛋白表达测试用ELISA(B)。

具体实施方式

本发明提供了预防和治疗糖尿病的组合物和方法。该组合物含有帮助调节血糖水平的融合蛋白。当对个体施用有效量的组合物时，本发明的组合物通过促进β-细胞的增殖和新生预防糖尿病的发生。增殖是指一个β-细胞分裂为2个。再生是指由原始细胞或干细胞产生新全的β-细胞。本发明组合物还降低了受试者的β-细胞的凋亡。增加增殖、再生和减少凋亡使得β-细胞质量增加。此外，本发明的融合蛋白的组合物还增加了β-细胞胰岛素的分泌量。本发明的含有新型融合蛋白的组合物能活化cAMP及其偶联的第二信使通路，增加了β-细胞中蛋白激酶(Akt1和/或MAPK)的表达，还减少了caspase-3的活性。有效量的含有融合蛋白的组合物在个体体内增加了胰岛素的分泌和葡萄糖耐受性。

在一个实施方案中，本发明的组合物和方法延长了GLP-1的循环半衰期增强了其功效。这是通过提供含有活性GLP-1和IgG重链恒定区的融合蛋白(GLP-1/IgG-Fc)而实现的。所述GLP-1肽是天然自身具有的，也可以是具有DPP-IV(二肽酰肽酶)抗性的。IgG可以是鼠源或人源。鼠源IgG可以为IgG₁。人源IgG可以选自IgG₁、IgG₂和IgG₃。GLP-1多肽可以是鼠源或人源序列，因为它们的序列相同。GLP-1多肽可以是天然序列或衍生物的片段。GLP-1多肽可以是GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)氨基化合物。

在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白含有Ex4多肽、Ex4片段或衍生物、或其衍生物的片段和IgG片段(IgG-Fc)。

本发明还提供了编码本发明的可分泌的融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括但不局限于：活性GLP-1和鼠IgG₁-Fc cDNA或GLP-1人IgG₂-Fc cDNA用于哺乳动物表达二价的GLP-1多肽；以及活性的Ex4-IgG cDNA。本领域技术人员可以在如同在本文实施例中描述的载体中或是以相同的方法容易地制备任何所需的GLP-1或Ex4序列。体外细胞系研究结合I型和II型糖尿病模型鼠体内肌肉注射基因转染表达的基因治疗术，证明重组的人类GLP-1融合蛋白GLP-1/IgG-Fc的生物学特性以及有效性。这种基因治疗方法在严重的I型和II型糖尿病模型中证明有效。运用了电转移因为其增加基因转染并可以证明在人类和大型动物中有效，而通过肌肉注射转染基因在啮齿类动物中证明效率较低。总之，本发明为用蛋白质治疗和基因治疗在哺乳类中预防和治疗I型和II型糖尿病提供了一种新的方法。

本发明的融合蛋白可以是GLP-1或Ex4片段，其与GLP-1多肽有至少60％或更多的相同序列；或与Ex4多肽有至少60％或更多的相同序列。所述序列可以与已知形式的GLP-1多肽有至少70％、80％、90％或95％或更多的相同序列；这些已知形式包括类似物、其衍生物和其片段。例如这些形式的序列已经在美国专利NO.6,268,343(该公开在此完整引入作为参考)中公开。本发明还包括将上述的组合物用于预防和治疗糖尿病的药物中的用途，例如I型和II型糖尿病。本发明还包括用于上述所有用途的一种药用组合物，例如预防性的组合物。

融合蛋白的构建是融合GLP-1和IgG-Fc分子组成一种新的分子，该分子能促进GLP-1的功效并结合有IgG-Fc的优点，即增加配体的亲和力和增加免疫耐受性。本发明提供了结合了GLP-1分子衍生物的融合蛋白，所述衍生物包括DPP-IV抗性的形式，例如GLP-1A8G与IgG-Fc分子形成的新分子，其具有所述的促进GLP-1功效和IgG-Fc分子的优点。同样，融合蛋白结合GLP-1受体激动剂(即，Ex4)和IgG-Fc分子形成新分子，该新分子具有GLP-1类似的功效并具备IgG-Fc分子的优点。

本发明的范围包括产生其化学等价物或化学上相似的氨基酸序列而作的变化。与GLP-1或Ex4序列具有相同序列的IgG-Fc融合多肽在本发明的范围内，并经试验确定适用于本发明的方法中。美国专利No.6,268,343(完整引入作为参考)描述了许多GLP-1衍生物和变异体。本发明中的多种多肽可自然出现变异体，也可以经过突变，或可以经过合成，例如通过如位点导向突变的蛋白质工程技术，该技术是本领域公知的氨基酸替换技术。比如一个疏水残基像甘氨酸可以被另一个疏水残基像丙氨酸替换，而丙氨酸残基又可以被疏水性更强的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸替换。带负电荷的氨基酸如天冬氨酸可被谷氨酸替换，带正电荷的氨基酸如赖氨酸可被另一带正电荷的氨基酸精氨酸替换。

所以，本发明包括在氨基酸序列上有保留的变动或替换的IgG-Fc融合多肽。有保留的替换插入一个或多个氨基酸，其保留被替换氨基酸相同的化学特性。本发明包括有保守型的替代的序列，经过保守性替换后不破坏原有序列的活性。本发明预期IgG-Fc融合多肽含有1或多个D-氨基酸。预期N-末端有一个或多个氨基酸乙酰化的多肽。本领域技术人员可以理解能用多种技术来构建多肽拟似物，该类似物具有所需的与本发明的相应多肽化合物相同或类似的性质，但在溶解度、稳定性和/或对水解和酶解的敏感性方面具有更好的活性。例如，Morgan和Gainor(Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252，1989)中所述。多肽拟似物的实施例在美国专利No.5,643,873中描述。其他描述如何制备和应用多肽拟似物的专利包括，例如，5,786,322、5,767,075、5,763,571、5,753,226、5,683,983、5,677,280、5,672,584、5,668,110、5,654,276、5,643,873，所有上述文献在此完整引入作为参考。也可以根据其他本领域已知的技术制备本发明的多肽拟似物。例如，通过用化学上转换氢基团为如羟基或氨基的另一种基团来改变侧基的因子来处理本发明的IgG-Fc融合多肽。拟似物优选包括完全是氨基酸的组成的序列或是包括氨基酸和改性的氨基酸或其他有机分子的杂交物。本发明同样包括杂交物和IgG-Fc融合多肽，例如，其中一个核苷酸序列与另一个序列结合。

本发明也包括本发明的IgG-Fc融合多肽的具有相同活性的片断，还包括IgG-Fc融合多肽的可以作为检验多肽性质和活性的研究工具的片断。这种多肽优选由至少5个氨基酸组成。在优选的实施方案中，它们可以由6～10、11～15、16～25、26～50、51～75、76～100或101～250个氨基酸组成。片断可以包含有一个或多个氨基酸缺失的序列，例如，化合物序列中的C-末端氨基酸。

通过选择性位点导向突变提高或降低复合的融合多肽的活性。通常倾向于用DNA质粒或是含有核酸分子的表达载体或是含有相同的序列的核酸分子来进行这方面的研究。通常这些工作可以用如从Pharmacia生物技术公司购得的去除特殊位点的U.S.E突变试剂盒或是其他公司的突变试剂盒，或可以用PCR的方法来进行获得。一旦建立起突变并通过DNA序列分析加以证实，就可以通过表达系统来表达这个突变融合蛋白并且它的活性就可以被检测。

本发明还包括具有与本发明的序列(或其部分序列)至少约：＞20％、＞25％、＞28％、＞30％、＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞70％、＞80％或＞90％更优选约＞95％、＞99％或＞99.5％相同的序列的融合蛋白。改性的融合蛋白分子在下面讨论。优选大约1、2、3、4、5、6～10、10～25、26～50或51～100或101～250个核苷酸或氨基酸被改性。根据本领域公知的方法计算一致性。最优选使用BLAST 2.1程序的高级搜索评估序列的一致性(参数同上)。BLAST是一套复合程序，可以通过互联网来获得和使用这些程序。网址是<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST>。高级BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi？Jform＝1)被设成默认参数(ie Matrix BLOSUM62；Gap existence cost 11；Per residuegap cost 1；Lambda ratio 0.85 default)。BLAST搜索的参考文献：Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)″Basic localalignment search tool.″J.Mol.Biol.215：403_410.Gish，W. & States，D.J.(1993)″Identification of protein coding regions by database similaritysearch.″Nature Genet.3：266_272.Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)″Applications of network BLAST server″Meth.Enzymol.266：131_141.Altschul，S.F.，Madden，T.L.，

A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST andPSI_BLAST：a new generation of protein database search programs.″Nucleic Acids Res.25：3389_3402.Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)″PowerBLAST：A new network BLAST application for interactive orautomated sequence analysis and annotation.″Genome Res.7：649_656。

本发明包括带突变的融合蛋白，这些氨基酸突变可以发生在融合蛋白无活性区部分，这些氨基酸突变也可以发生在活性区部分从而增加或减少了融合蛋白的活性。在本发明中，如美国专利WO.05/000892(在此完整引入作为参考)中所述，可以通过本领域技术人员公知的技术修饰融合蛋白的IgG-Fc部分以改变(增加或减少)免疫原性(immunogenicity)或者效应器功能(effector function)。

本发明的融合蛋白可以单独有效使用，但也可以在药物组合物中与其他如药用载体的成分一起使用。可以结合本发明的融合蛋白，即可将超过一种类型的可溶形式用于如人类或是动物的受治疗对象，以预防或治疗糖尿病。

本发明的融合蛋白作为药物应用于人类或动物可以通过多种途径，并不局限于局部施用，如口服、喷雾、气管内灌输、腹膜内注射、静脉注射、肌肉注射和基因疗法。施用剂量取决于患者需要、期望取得的效果和施用途径。例如人类的施用量可以为2nmol/kg体重或是0.02～100nmol/kg体重。当使用基因治疗时，人的DNA注射浓度可以为1μg/kg体重或是0.1～100μg/kg体重。用体内脂质体或是病毒转运载体可以将融合蛋白导入细胞。适用于本发明的多种转运载体对本领域技术人员是公知的。本发明的组合物可以每日、每周或是遵医嘱施用持续需要的时间。

本发明的药用组合物可用公知的制备能施用给患者的可药用载体的方法制备，从而使有效量的核苷酸或多肽分子与可药用的载体结合形成混合物。这些适合的载体，在例如雷明顿制药学(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA)中已有阐述。在此基础上，所述药用组合物可以包括与一种或多种可药用的载体或稀释液相结合、并存在于具适当pH值并与生理液体等渗的缓冲液中的活性化合物或物质，例如复合核酸分子、多肽分子或融合蛋。结合活性分子和载体或将两者与稀释剂结合的方法对本领域技术人员是公知的。所述组合物可包括用于运送活性化合物到组织内特定部位的靶向制剂(targeting agent)。

可以对与GLP-1或Ex4受体有相同序列的蛋白进行试验以证明它们适用于本发明的方法。有机小分子同样也试验过。本发明包括那些已经用本发明的筛选方法确认的化合物，以及那些适合于本发明的方法和用途的化合物，以及本发明的药用组合物中的化合物。在优选的实施方案中，本发明包括一个评价候选化合物是否能增加cAMP的产生、增加Akt-1或MAPK的表达或活性、或是减少caspase-3的表达或活性的鉴定方法。通过培养细胞(优选β-细胞)并在至少存在一种能调节(抑制或激活)表达活性化合物的情况下，测定和监测细胞是增加还是减少Akt-1或MAPK表达或活性，或者是否减少caspase-3的表达或活性。

受体结合试验(receptor binding assay)是评价化合物对细胞膜受体的特异性的优选方法，因为所有的信号传导事件都起始于这种配体-受体的结合。如果候选化合物与受体结合(例如，通过交联技术的凝胶-移动迁移率试验或竞争受体结合试验来鉴定)，这种结合表明该化合物适合在本发明随后的步骤中使用。受体激活试验可用于进一步测定候选化合物是否适合本发明的方法。例如，cAMP测定可用于评价受体的激活(GLP-1受体为GPCR)。此外，Akt激酶试验可进一步说明Akt的激活。在最初的筛选中，当有大量候选化合物时，可使用受体结合试验。对结合到受体上的化合物优选进行cAMP测定和最终的的Akt激酶试验。有机小分子同样可以作为候选化合物来测定其对本发明的方法的适用性。最后，可选择使用cAMP测定以筛选对GPCR的结合与激活。正如以上提到的每一项测定原理所描述的，Akt激酶试验，或MAPK试验非必须地用于评价化合物的细胞效率。

为验证所筛选的多肽和有机分子化合物，可以在前期糖尿病动物模型长期(如2-12周)给予本发明的化合物后进行β-细胞质量分析。为此，也可使用胰岛素放射免疫测定试剂盒(Linco Research，St.Louis，MO)进行另外的胰岛素释放的检测。这些试验手段可用来证明所筛选的化合物对β-细胞生长的影响。为了验证筛选的载体，可以通过基因转移(gene transfer)对前糖尿病动物模型施用DNA质粒。如果需要，可以每2个月、6个月或1年进行重复施用。

本发明的组合物可以与已知的I型和/或II型糖尿病的治疗措施如使用降糖药物或结合胰岛素共同进行治疗。例如，治疗糖尿病的药物可以包括：Actos、Amaryl、avandia、DiaBeta、Diabinese、Dymelor、Glucophage、Glucophage XR、Glucotrol、Glucotrol XL、Glucovancc、Glynase、PresTab、Glyset、Micronase、Orinase、Pandin、Precose、Starlix和Tolinase。例如，适合的胰岛素包括：Aspart、Insulin Glargine(Lantus)、Lente、Lispro(Humalog)、NPH和Ultralente。

本发明适用于任何需要此类治疗的个体。这些个体有可能发展成糖尿病、或新近诊断为糖尿病的患者或是已经诊断为糖尿病的患者。本发明与预防和治疗如本文所述的I型和II型糖尿病相关。例如，这样的个体可以为肥胖的人或有糖尿病遗传史但尚未发病的人、或新近诊断为或已经诊断为糖尿病的人。世界卫生组织(WHO)根据身体质量指数(BMI)定义肥胖。BMI是用Kg体重除以身高米数的平方得来。BMI为18.5～25则体重正常。个体的BMI为25～30则为超重，等于或超过30则为肥胖。这些个体也可以是血糖高于相同年龄与体重的正常值(正常血糖可以是根据医学参考资料常规测定的)的人，尽管还不至于诊断为糖尿病。这些个体也可以是有糖尿病遗传史但是还没有发展成为糖尿病的人。当血糖值高于普遍认可的正常范围时即可诊断为糖尿病。根据ADA(美国糖尿病协会)和CDA(加拿大糖尿病协会)的标准，当个体的空腹血糖值超过7.0nmol/L，或是随机血糖值(任意时段的血糖值)超过11.1nmol/L可认定为始患糖尿病。一旦诊断为糖尿病，任何对患者进行的对抗高血糖症的努力/方法都是治疗措施而不是用于预防措施。有些人尽管还没有诊断为糖尿病，(例如，肥胖人群，其过量的体重通常与胰岛素抵抗相关)健康状况不佳，有发展为II型糖尿病的高风险。为降低或减少其发展为II型糖尿病的高风险，施用本发明的化合物用于预防和/或治疗II型糖尿病。此外，施用本发明的化合物以预防或治疗I型糖尿病。I型糖尿病是指通常有遗传性易患病体质、或具有胰岛β-细胞损伤、或具有缺乏胰岛素反应第一期的“前”糖尿病、或是刚刚诊断为糖尿病的个体。在新近诊断为I型糖尿病的患者中，免疫系统攻击并破坏产生胰岛素的胰岛β-细胞的结果是他们的胰腺不产生或是产生很少的胰岛素。

本发明还提供了新的编码融合蛋白的质粒，该融合蛋白编码含有通过应用交迭PCR(聚合酶链反应)得到的人GLP-1(7-37)和人或鼠IgG-Fc(图1)。图例显示IgG-Fc区域含有鼠IgG1恒定重链(包括CII1、铰链、CH2和CH3)。本发明还提供了可产生先导序列并导入载体使融合蛋白可以表达后分泌到细胞外培养液环境中去的方法。如图显示，一段IgK分泌先导肽序列与GLP-1序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。在本发明的实施例中，一段人类生长激素释放激素(GHRH)先导肽序列(gtg ctc tgg gtg ttc ttc ttt gtg atc ctc acc ctc agc aac agc tcc cactgc tcc)与GLP-1及IgG-Fc序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。每一个实施例中，这一战略保证了在分泌过程中在切除分泌先导肽之后将使产生的GLP-1与IgG-Fc融合蛋白N端的活性组氨酸残基融合。有代表性的GLP-1/IgG-Fc见图1。这种方法能达到：1)由于Fc融合蛋白以均一的二聚体的形式分泌，GLP-1-Fc融合蛋白半衰期长并且，其较高的配体亲和性从而使融合蛋白具有更高的效价。2)由于大量的GPCR在细胞表面以二聚体的前体形式存在，因而增强了多肽的药效。3)简化了纯化过程。利用G蛋白葡聚糖凝胶可以一步完成提纯，利于融合蛋白的分离纯化。

本专利还公开了使用哺乳动物表达系统证明了上述融合蛋白的新载体的表达。为评估载体表达和分泌GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的能力，将质粒载体转染至COS-7细胞中。转染后48h，从表达的转染细胞中提取总RNA，用RT-PCR评估融合蛋白的表达情况。用基因特异性引物(图2a)检测GLP-1-Fc融合蛋白和IgG-Fc对照蛋白在转录水平上的表达。而非转染样品没有检测到上述蛋白在基因转录水平上的表达。

用Western免疫印迹法和抗鼠抗体还分析了转染的COS-7细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图2b中所示，在培养液和细胞裂解物检测Fc融合蛋白。可以通过RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)、Western免疫印迹法或GLP-1放射免疫法(RIA)来检测融合蛋白。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细胞中合成并分泌。

由于GLP-1放射免疫法可以检测鉴别所有形式的GLP-1，因此利用RIA进一步确认了GLP-1融合蛋白的特征。COS-7细胞系分别瞬时转染了递增量的GLP-1/IgG-Fc质粒和IgG-Fc-only质粒，转染后48h收集细胞培养液。将该培养液用于GLP-1 RIAs以检测总的GLP-1。而在未转染或转染IgG-Fc-only的COS-7细胞中没有检测到GLP-1的存在，从转染GLP-1/IgG-Fc的细胞收集的培养液中检测到与DNA转染量依赖的GLP-1(图3)。从50mL培养液(接种浓度约1.25×10⁵个细胞/ml，2天静止培养)利用G蛋白葡聚糖凝胶一步纯化融合蛋白(Jungbauer等人，J Chromatogr.1989；476：257-268)得到约300μg融合蛋白。样品再分别经还原和非还原的2种凝胶电泳分离并经考马斯亮兰染色分别检测到了一个约35kDa或约70kDa的条带(图4)，表明二聚体GLP-1/IgG-Fc融合蛋白以天然状态存在。融合蛋白显现出在INS-1细胞中以葡萄糖水平依赖的形式刺激分泌胰岛素(图6)和cAMP产生(图7)能力。

用各种检测方法对融合蛋白GLP-1/IgG-Fc(其DPP-IV抗性突变体型和Ex4-IgG-Fc)进行了试验和证实。试验方法包括受体结合试验，cAMP(腺苷3’，5’-环一磷酸)试验和用在适当的刺激条件下可以分泌胰岛素的β-细胞进行胰岛素刺激试验。其他检测技术用还可来研究在融合蛋白作用下β-细胞的增殖和GLP-1/IgG-Fc及其衍生物作用下GLP-1受体的激活下信号的连锁传导。这些试验包括增殖试验(³H-胸苷结合试验)，AKt激酶活性试验，促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(MAPK)试验以及应用caspase-3或其他caspase家族成员进行的凋亡试验。

体内表达GLP-1/IgG-Fc分子的技术描述如下。例如在鼠或是猪体内，通过肌肉注射融合蛋白可以持续性地在体内表达。可以附加应用局部电转移技术因为其可以极大地提高基因转移这可能在人体和大型动物中的需要。在本研究中，每周都要测定动物的体重和空腹血糖。在注射前、第一次注射后2周和12周的时候收集隐静脉血以测定空腹胰岛素和血糖水平。用GLP-1 Elisa试剂盒(Linco)测定血浆中活性GLP-1的水平来评价GLP-1/IgG-Fc蛋白的表达。如图中所示，在第一次注射两周后，与注射IgG-Fc载体的小鼠相比，注射GLP-1/IgG-Fc的小鼠血浆中的GLP-1水平有显著提高。在注射16周后这些升高的GLP-1水平下降，但是仍然高于对照小鼠的水平(图表8A)。

在一个实施方案中，显示的是GLP-1/IgG-Fc、GLP-1A8G/IgG-Fc和Ex4/IgG-Fc在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效，用于实施例中，1)前期糖尿病db/db鼠作为II型糖尿病的模型；2)由链脲霉素(STZ)诱导的I型缺乏胰岛素的鼠作为I型糖尿病模型。Db/db小鼠缺乏功能性的瘦素受体，因此形成肥胖、高胰岛素症(hyperinsulinemia)并在4到6周龄时出现葡萄糖不耐受，在8周龄时出现明显的糖尿病。因此这些小鼠被广泛应用并被认为是II型糖尿病的模型。通过低剂量，多次用药，使用链脲霉素(STZ)诱导缺乏胰岛素的小鼠。链脲霉素可以特异性地破坏β-细胞，伴随T-细胞介导的浸润。因此这些小鼠被被广泛应用并被认为是模拟个体I型糖尿病的动物模式。目前可以获得并能应用于本发明的其他小鼠糖尿病模型还有：高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的小鼠模型；这种小鼠因过度摄入脂肪导致体内脂肪过量沉积，因而形成肥胖，具胰岛素抗性，和葡萄糖的不耐受性。另一种动物模型是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。这些小鼠是很好的自体免疫型糖尿病(I型糖尿病)模型，其中胰岛抗原活性T-细胞浸润胰岛并杀死胰岛细胞，和/或是引起炎症过程使胰岛细胞死亡(Anderson和Bluestone，2005)。

通过非病毒性基因治疗途径施用GLP-1/IgG-Fc(或者Ex4/IgG-Fc)的在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效。编码本发明的任意融合蛋白例如GLP-1/IgG-Fc分子(或者它的DPP-IV抗性融合蛋白或者Ex-4/IgG-Fc分子)的非病毒性载体用于治疗是有效的。通过基因转染和对4周龄db/db受试鼠施加电脉冲即电穿孔施用上述的融合蛋白。在所有的受试鼠中，在第一次注射后2周进行第二次注射，并监控受试鼠糖尿病的进展情况。遗传性缺乏瘦素受体的db/db鼠是啮齿类的II型糖尿病模型(Leiter，FASEB J.1989；3(11)：2231-2241)。如上所示，同时通过基因治疗途径用GLP-1/IgG-Fc处理的年龄匹配的db/db鼠在16周龄时(注射后12周)显示出血糖量正常，而对照组小鼠空腹血糖(FBG)水平则高出了正常范围(图8)。用GLP-1/IgG-Fc处理过的受试鼠显示出空腹胰岛素浓度提高和空腹胰高血糖素浓度降低(图8)。这些结果表明用GLP-1/IgG-Fc的治疗可以防止db/db鼠发生糖尿病。在表达GLP-1/IgG-Fc的db/db受试鼠中没有糖尿病的发生，这与我们先前的发现结果即每日注射Ex4(i.p.)持续两周可以阻止db/db受试鼠糖尿病的发展的结果(Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273)是非常吻合的。我们目前的治疗方案的意义在于肌肉注射GLP-1-Fc载体2次获得了与连续两周每天腹膜腔注射Ex4相似的效果。

通过基因转移并通过局部电转移法增强将GLP-1/IgG-Fc和Ex4/IgG-Fc分别被投送到CD1受试鼠中。DNA注射7天后，对小鼠进行了一次后续注射并开始连续5天每天注射STZ(55mg/kg，i.p.)。结果发现，IgG-Fc-对照小鼠的血糖浓度显著上升，几天后血糖浓度达到了糖尿病的水平(17mM)，但是GLP-1/IgG-Fc(或者Ex4/IgG-Fc)小鼠受到保护并显现出明显糖尿病的低发生率(图9)。胰腺的组织学研究表明这两组小鼠中都存在胰岛β-细胞被破坏的现象，但是GLP-1/IgG-Fc(或者Ex4/IgG-Fc)小鼠被破坏的程度较轻(图9)，这表明了GLP-1/IgG-Fc(或者Ex4/IgG-Fc)对β-细胞有保护作用。在两组小鼠中都观察到单核细胞(淋巴细胞和/或巨噬细胞)浸润胰岛(附图中未显示)。有趣的是，尽管预期Ex4/IgG-Fc能抗DPP-IV降解，但是Ex4/IgG-Fc的治疗效果却与GLP-1/IgG-Fc的相近。尽管出现胰岛发炎的情况(胰岛炎)，但这些发现还是表明了GLP-1/IgG-Fc(或者Ex4-IgG-Fc)可以抵抗链脲霉素诱导的β-细胞损伤。GLP-1/IgG-Fc(或者Ee-4/IgG-Fc)的治疗能保护β-细胞免受链脲霉素诱导的损伤，其可能原因是GLP-1/IgG-Fc或者Ex-4/IgG-Fc加速了β-细胞的增殖和新生，减少了β-细胞的凋亡。这些发现与先前在这些小鼠中使用GLP-1/Ex4的研究结果是一致的。

本专利中所述的GLP-1衍生分子是由融合GLP-1与IgG-Fc cDNA序列的结果(图1)。在本专利的实施方案中，IgG的进一步分类可以是鼠IgG₁或是人IgG₂。在本发明的融合蛋白中用人IgG₂较使用其他类型的IgG，如IgG₄有着很大优越性。不像IgG₄，IgG₂并不结合Fc-γRI。Fc-γR I是激活型的Fc受体可以高亲和性地结合单价的IgG。因此IgG₂不会传递任何活性信号以激活免疫细胞上Fc受体更不会传递任何由Fc受体激活而引起的激活其他效应因子的效应。继而，由于种群在Fc受体的遗传差异尤其是在Fc-γRIIa活性受体上的差异，只有在50％的人群中IgG₂可能能充当调理素(opsonin)的角色。相比之下，由于IgG₄能与Fc-γRI结合，因此IgG₄在所有人群中充当调理素角色。显而易见，在IgG₂不充当调理素的人群中，表面结合有IgG₂-Fc分子的细胞被巨噬细胞或吞噬细胞攻击和吞噬的可能性会降低。另外，由于Fc-γRIIa受体的多态性，在缺乏调理素性(opsonization)的50％的人群中，正由于IgG₂-Fc对效应免疫细胞缺乏激活效应，IgG₂-Fc不能激活效应免疫细胞。相反，与IgG₄相比较，因为IgG2能激活抑制型的Fc-γRIIb受体因此其对一些免疫细胞调控的抑制效应得到加强。这意味着，Fc受体的遗传差异会使大约50％的人群受益，即，IgG₂-Fc的安全性要好于IgG₄-Fc。另一项优点是，怀孕的妇女经胎盘转移的IgG₂会少，从而降低任何对胎儿的风险。对于育龄妇女而言，这是一个很重要的优点(Kolar，GR and Capra，JD.Immunoglobulins：Structure and Function.In Fundamental Immuhnology(Ed.William E.Paul)，Lippincott Willimansand Wilkins publishers，Philadelphia，2003，pp.47-68；Janeway Jr，CA，Travers，P，Walport M，Schlomchik MJ(Editors).Immunobiology，GarlandScience publishers，New York，2005，pp.387-391；and Roitt，R，Brostoff，J，Male，D(Editors).Immunology，6th Edition，Mosby publishers，Edinburgh，2001，pp/73-78)。

基于IgG-Fc的药物有多项优点。因为IgG融合分子以70Kda均一二聚体的形式制备，并不会被肾脏在短时间内清除，故它们具有实质上更长的半衰期(Larrick and Fry，Hum Antibodies Hybridomas.1991；2(4)：172-189；Weir等人，Biochem Soc Trans.2002；30(4)：512-516)。因此，大的GLP-1/IgG-Fc同型二聚体融合分子较天然GLP-1半衰期增长。由于一些酶更容易降解较小的多肽(Hupe-Sodmann等人，RegulPept.1995；58(3)：149-156)，而分子量较大的GLP-1/IgG-Fc不容易被降解。而且GLP-1二聚体可以增加配体的亲和性，通过预先形成的GPCR二聚体/多聚体(George等人，Nat Rev Drug Discov.2002；1(10)：808-820；Dupuis等人，Brain Res Mol Brain Res.1999；67(1)：107-123)增强细胞内信号传导，因此以同型二聚体形式存在的GLP-融合分子有更多潜力结合更多的GLP-1受体。本专利所进行的cAMP和胰岛素分泌试验表明，本发明的融合蛋白在克隆INS-1细胞中能活化GLP-1Rs。融合蛋白以葡萄糖依赖性的方式促进胰岛素分泌，进一步表明GLP-1融合蛋白保留着天然GLP-1的生物学功能。

GLP-1/IgG-Fc融合蛋白在体内有降血糖的作用已在由肌肉注射进行转基因的db/db小鼠中得到了证明。这种方法具有在持续数周的时间里连续释放融合蛋白进入血液循环中的优点。肌肉注射GLP-1/IgG-Fc载体db/db小鼠中，两周以后已经可以检测到在血液循环中的GLP-1融合蛋白，但是作为对照的只注射IgG质粒载体的小鼠中却检测不到GLP-1融合蛋白。有趣的是，仅在第一次注射后12周观察到空腹血糖有明显的下降。在表达GLP-1/IgG-Fc的小鼠中空腹血糖水平的下降伴随着空腹胰岛素水平的增加和空腹胰高血糖素水平的下降，这说明由于胰岛素的分泌增强了，同时抑制了胰高血糖的释放，使得空腹血糖达到了正常的水平。

db/db受试鼠作为重症II型糖尿病模型是因为它在瘦素信号传导途径方面存在缺陷(Herberg and Coleman，Metabolism.1977；26(1)：59-99；Chen等人，Cell.1996；84(3)：491-495)。起初，可能由于db/db受试鼠糖尿病进行性的不减弱的发展，受试组与对照组血糖水平都持续升高，注射融合蛋白基因的受试鼠血糖在注射后3月才观察到趋于正常。对比一般肌肉DNA注射试验质粒的表达都在注射后1-2周出现峰值。我们的试验显示，注射2周后血清中GLP-1的水平开始增加(图8A)。这一增加导致的血糖水平实现正常，空腹胰岛素增加和胰高血糖素减少却是较晚的时候才观察到。有可能血糖的正常化更多地是受到融合蛋白对胰腺β-细胞再生(包括β-细胞增殖和新生)的影响。而较少地受到天然GLP-1通常有的即时胰岛素敏感性效应的影响。

另外，尽管我们没有看到一些例子中对啮齿动物模型用天然GLP-1治疗观察到的降低体重的作用(Turton等人，Nature.1996；379(6560)：69-72)。我们也没有观察到GLP-1/IgG-Fc对动物有厌食的情况发生(Kim等人，Diabetes.2003；52(3)：751-759)。尽管长时间而有效的GLP-1受体激动剂Ex4的处理改变了肥胖症小鼠的空腹血糖并伴随着β-细胞质量和功能的增强(Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273)。但是，体重和外围胰岛素敏感性依然没有改变(Wang和Brubaker，Diabetologia.2002；45(9)：1263-1273)。这个发现更进一步支持了仅有胰岛素抵抗不足以导致II型糖尿病的发生，只有当B细胞功能失常时才会发生II型糖尿病(Weyer等人，J Clin Invest.1999；104(6)：787-794；Weyer等人，Diabetes.1999；48(11)：2197-2203)。GLP-1的厌食效果取决于对中枢神经系统脑部多个区域的作用(Schick等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2003；284(6)：R1427-R1435)，GLP-1/IgG-Fc融合蛋白穿透血脑屏障的能力还需要进一步的探究。

经由对肌肉组织注射裸露的DNA质粒不仅比其他大多数组织更为便捷(Wolff等人，Biotechniques.1991；11(4)：474-485；Wolff等人，Science.1990；247(4949 Pt 1)：1465-1468)。而且转基因肌肉组织的表达通常比其他组织中更为长久，条纹状的肌细胞是非分裂的寿命较长的细胞可能与此有关。通常注射裸露的DNA效率并不高，而活体施加电转移能极大地改善转移效率(50～1000倍)(Wells，Gene Ther.2004；11(18)：1363-1369；Mir等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1999；96(8)：4262-4267)。认为电脉冲能在细胞膜上造成暂时性的孔从而促进DNA转运进细胞。我们施加了低的电场强度(100～200V/cm)和相对较长的(20～50mS)方波电脉冲，快速连续6～8次。虽然这种低电压电脉冲在某种程度上有可能使肌肉受损，但是它一般较温和而且是暂时的。电转移后2周，肌肉基本上可以恢复正常(Mathiesen，Gene Ther.(1999；6(4)：508-514)。

肌肉注射质粒载体并结合体内电转移已被证明是基因转移有效而安全的方法。这种方法已被广泛使用，并已经用于转染细胞因子、肽类激素、可溶性受体以及许多膜结合蛋白或细胞质蛋白。确实如此，这种方法在系统性地转染诸如GLP-1/IgG-Fc融合蛋白这类蛋白质类调节因子方面特别有用。IgG融合技术的优点是在试验室可以通过简单的一步程序得到试验室规模量的GLP-1/IgG-Fc融合蛋白。GLP-1 RIAs表明细菌表达系统的表达效率要低于哺乳动物细胞表达系统的表达效率，这可能归结于在大肠杆菌中表达较COS-7细胞表达的错误折叠(misfold)的蛋白质。虽然Rosetta gami 2细菌细胞表达的正确折叠和功能化蛋白比起其他细菌系已大大提高(Prinz等人，J Biol Chem.1997；272(25)：15661-15667)这种提高是通过增加细菌细胞质体中蛋白二硫健的形成并提供大肠杆菌系统中缺乏的特异密码子的tRNAs实现(Kurland和Gallant，Curr Opin Biotechnol.1996；7(5))489-493)。

总之，本发明是GLP-1(鼠源或人源，因为GLP-1在一些物种中是相同的(Perfetti and Merkel，Eur J Endocrinol.2000；143(6)717-725；Holst，Gastroenterology.1994；107(6)1848-1855)与IgG-Fc衍生物融合(形成GLP-1/IgG-Fc)以增加半衰期、增强在体内活性并减少免疫原性。GLP-1/IgG-Fc融合蛋白以天然二价的形式存在。融合蛋白表现出在INS-1细胞中以葡萄糖依赖性的方式刺激胰岛素分泌和产生cAMP的功效。在本发明的一个实施方案中，GLP-1/IgG-Fc融合蛋白可以直接通过注射施用。用鼠糖尿病模型体内试验表明，可以通过非病毒性的基因疗法施用，这种方法可以在体内长久表达融合蛋白。在β-细胞受损的I型糖尿病模型上证明可以保护免于发生STZ诱导的糖尿病；在II型糖尿病db/db鼠模型证明可以治疗糖尿病。最后，还证明该组合物能对抗四氧嘧啶一水化物诱导的猪的高血糖症。

上述公开的内容对本发明进行了大体的描述。通过参考下列具体实施例对本发明做更全面的理解。这些实施例仅仅是为了进一步的说明，而不是为了限定本发明的范围。换言之，一些形式上的变异或替换是用作达意的考量。因此，在下文例引用的一些特殊的术语旨在达意，而非限止其意的目的。

实施例

实施例1：载体的构建

使用交迭PCR(overlap PCR)构建了含有人GLP-1(7-37)和鼠IgG₁-Fc的编码融合蛋白的载体。IgG₁-Fc区含有IgG₁恒定重链(CH1、铰链、CH2和CH3部分)。将IgK分泌先导肽序列与GLP-1序列融合以便引导合成的融合蛋白分泌到培养液中。编码hGHRH/hGLP-1融合蛋白的cDNA是化学合成的，并将其连接到编码人IgG2-FC(铰链-CH2-CH3)的PCR扩增的cDNA上，然后插入pAVO243载体的Nco I和Hind III位点间构建GLP-1/hIgG-Fc/pAV0243载体。可分泌的GLP-1/hIgG-Fc融合蛋白含有IgG2恒定重链(铰链、CH2和CH3)。GHRH分泌引导肽序列与GLP-1序列融合引导合成的蛋白分泌到细胞培养液中。该方法确保在分泌过程中，分泌引导肽被切除之后，融合蛋白的GLP-1的氨基端可以和一个活性组氨酸残基融合。图1显示了分泌的GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的图示。其特点是1)解决了GLP-1半衰期短的问题，因为融合蛋白是以同型二聚体的形式分泌的，在体内具有长的半衰期并由于配体的高度亲和性而达到了高效价(Ozmen等人，J Immunol.1993；150(7)：2698-2705；Kurschner等人，J Immunol.1992；149(12)：4096-4100；Kurschner等人，J Biol Chem.1992；267(13)：9354-9360)；2)由于大多数GPCR是在细胞表面预先形成二聚体(George等人，Nat Rev DrugDiscov.2002；1(10)：808-820；Dupuis等人，Brain Res Mol Brain Res.1999；67(1)：107-123)，因而多肽与其受体的结合将更为有效；3)有利于生产中的提纯过程，可以通过G蛋白葡聚糖凝胶一步纯化(Jungbauer等人，Chromatogr.1989；476：257-268)。

使用基因特异性引物和交迭PCR从GLP-1/PCR2.1(黄(X Huang)博士惠赠)和IgG质粒扩增全长GLP-1和鼠IgG-Fc cDNA。对于第一轮交迭PCR，使用

5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3’和5’-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’。在第二轮交迭PCR中使用PCR产物制备备用(contingent)GLP-1/IgG-Fc cDNA。将扩增的产物亚克隆到载体d Bam HI和Eco RV位点。为构建编码IgG-Fc的对照载体，使用

5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’和

5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’通过PCR单独扩增IgG cDNA，并克隆到载体Bam HI和Eco RV位点。

用于编码人IgG₂Fc(铰链-ch2-ch3)的cDNA片段的PCR-扩增的引物为：5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’和

5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGG AGAG-3’。

载体含有CMV直接-早期(immediate-early)增强子和启动子、单一真核生物转录单元，兔最小β球蛋白多聚腺嘌呤尾和转录终止序列(Hartikka等人，Hum Gene Ther.1996；7(10)：1205-1217)。载体是VR1255载体(Hartikka等人，Hum Gene Ther.1996；7(10)：1205-1217)通过删除荧光素酶报告基因改性并添加了限制性内切酶位点的衍生物。为使GLP-1或Exendin-4序列分泌，通过PCR于其5’端引入Igκ-链信号肽序列。为在细菌中表达GLP-1/IgG-Fc融合蛋白，融合cDNA序列通过PCR扩增并亚克隆至pET-28a载体(Novagen，EMD Bioscience，SanDiego，CA)。

实施例2：哺乳动物的GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的表达

为了估价载体在表达与分泌GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的能力，构建的融合蛋白载体转染至COS-7细胞中瞬时表达。转染后48h，自转染细胞中提取总RNA并用RT-PCR评估表达效果。应用基因特异性引物，检测到GLP-1/IgG-Fc融合蛋白基因在转录水平上的表达和IgG-Fc对照基因的表达(图2a)。在未转染对照样品中没有检测到转录水平的表达。

用Western免疫印记法和抗鼠抗体检测了转染的COS-7细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图2b中所示，同时在培养液和细胞裂解物中检测到Fc融合蛋白。融合蛋白在电泳迁移位置大约在35kDa，是在还原的SDS-PAGE条件下融合蛋白单体的分子量。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测到融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细胞中合成并分泌。

GLP-1融合蛋白还进一步用放射性免疫测定(RIA)加以鉴定，该方法可以检测以所有形式存在的GLP-1。用渐增量的GLP-1/IgG-Fc/VRnew/Fc-only质粒瞬间转染COS-7细胞并在转染后48h收集细胞培养液。并将该培养液用于GLP-1 RIA以检测总的GLP-1。而在未转染和Fc-only/VRnew转染的COS-7细胞中没有检测到GLP-1的存在。从GLP-1-Fc/VRnew转染的细胞中还检测到GLP-1的含量与DNA转染量呈正相关(图3)。使用了0.8μg的DNA对1.25×10⁵个细胞/mL进行转染。而后从50mLCOS-7培养液纯化出总量为100μmol的GLP-1。

在哺乳动物细胞中的表达，是将GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通过脂质体(Lipofectamine)2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染到COS-7细胞中。其过程是先将密度为每孔2.5×10⁵个的COS-7细胞生长在6孔细胞培养板。添加含有4μg GLP-1/IgG-Fc cDNA和10μL转染脂质体的无血清无抗菌素的DMEM(Invitrogen)进行培养。转染6h后，转换为全培养液。转染后48h分别收集培养液和细胞。为了大规模地表达GLP-1/IgG-Fc融合蛋白，将生长在150mm培养皿内的COS-7细胞用阳离子转染试剂、聚(乙撑亚胺)(Poly(ethyleneimine)(PEI，25kDa)和80μg相关cDNA转染。用150mM Nacl分别稀释DNA和PEI，混合后培养20分钟。然后将DNA/PEI复合物加到细胞中，并在无血清无抗菌素的DMEM培养液中培养6h。以加有10％FBS和1％P/S的DMEM替换培养液。该方法的转染率可高达85％。

为建立稳定表达GLP-1/IgG-Fc的COS-7细胞，将在6孔细胞培养板(2.5×10⁵个细胞/孔)上生长的细胞用4μg线性化的GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc转染。转染24h后，细胞在含有G418(500μg/mL)的DMEM培养液分裂和培养，以筛选那些已经将重组质粒稳定整合到其基因组内的细胞。培养过程中，每3天换培养液一次直至细胞克隆形成。分离单克隆细胞并扩展成稳定的细胞系并将这些细胞系在24-孔板上生长的组织培养的上清液用鼠GLP-1 RIA试剂盒(见下文)检测融合蛋白。选择能分泌融合蛋白的细胞用作以后的特性分析。

实施例3：从哺乳动物细胞培养液中纯化GLP-1/IgG-Fc融合蛋白

为进行小规模的纯化，将从转染细胞收集的培养液(通常为6孔培养板中每孔取2.5mL)加入用含100mM Tris pH值8.0和150mM NaCl的缓冲液预冲洗的70μL(满体积(packed volume))G蛋白的葡聚糖凝胶4快速洗脱树脂(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)中。在4℃下培养过夜后，以Tris缓冲液冲洗，然后以30μL含SDS的样品缓冲液直接将蛋白从树脂上洗脱。

为获得大量的融合蛋白，应用G蛋白葡聚糖凝胶柱可以进行中规模的蛋白纯化。50ml的柱体积可以纯化15cm培养皿中生长的转染GLP-1/IgG-Fc-融合载体的COS-7细胞的条件培养液。收集细胞转染后48h的50mL DMEM培养液，或是收集稳定表达融合蛋白的细胞，将其加入G蛋白葡聚糖凝胶(1mL满体积，Amersham-Pharmacia)。加入1％Triton×-100在4℃下培养过夜。然后用含1％Triton×-100的PBS缓冲液洗涤，然后用150mM NaCl洗涤，最后用1mL 0.1M氨基乙酸(pH2.7)将蛋白从树脂上洗脱。洗脱液立即用Tris缓冲液(pH9.0)中和并且纯化的蛋白用PD-10凝胶柱除盐(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脱。如图中所见(图4A)，两步洗脱方法可以将大部分融合蛋白由葡聚糖凝胶柱上洗脱下来。样品的组分经SDS PAGE溶解并经考马斯亮兰染色显影以评估产率和纯化率(结果显示每ml培养液接种1.25×10⁵细胞培养2d后，融合蛋白得率约为6μg/mL)。

实施例4：GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的细菌表达

在大肠杆菌细胞中表达GLP-1/IgG-Fc融合蛋白。为了补偿大肠杆菌BL21细胞的密码子偏倚(codon bias)，使用了可以促进二硫键形成并可额外搭载质粒以表达7个罕见的tRNAs的Rosetta gami 2细胞(Novagen，EMD，biosciences，San Diego，CA)。用GLP-1/IgG-Fc/pET28a或IgG-Fc/pET28a载体(Novagen)转化细菌后，选择并筛选出其中几个克隆以最佳表达融合蛋白。蛋白质的表达是将单一克隆培养在有卡那霉素的50mL的2X YT培养液中于37℃过夜培养。而后将培养液稀释成(1∶50)新培养液，直至细胞密度达到O.D₆₀₀读数值0.6后，再在培养液中添加1mM的IPTG(EMD)3小时以诱导表达。收集细菌并将菌球(pallet)在-80℃保存以进行其他步骤。蛋白质的提取简言之是将离心后的细菌重新悬浮在冰浴的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma，St.Louis，MO)的PBS缓冲液后用超声波裂解细胞。添加1％Triton×-100以溶解蛋白，30min后离心(12,000g，10min)收集含有融合蛋白的上清液。表达的融合蛋白通过G蛋白葡聚糖凝胶纯化并通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色分析验证(未显示数据)。从4L的细菌培养液中可以提纯约120μg的GLP-1/IgG-Fc和Fc-only融合蛋白。

由哺乳动物细胞和细菌中纯化的融合蛋白进一步通过总GLP-1放射性免疫测定(RIA)以确定GLP-1的表达。在表达GLP-1融合蛋白的哺乳动物和细菌细胞中均能观察到GLP-1水平呈肽剂量依赖性增加。但发现总GLP-1在细菌中的表达水平低于在哺乳动物细胞中的水平(图4B)。

实施例5：分泌GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的稳定COS-7细胞

经过G148筛选和用RIA验证细胞系分泌GLP-1之后，建立起表达GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的稳定的COS-7细胞系。以生长稳定细胞系的培养液中总GLP-1水平作为评估细胞分泌GLP-1/IgG-Fc融合蛋白水平的基线。如图中所示(图5)，所有表达Fc-only蛋白的稳定细胞的分泌GLP-1的水平都低于培养液的基准线。我们分离了分泌GLP-1/IgG-Fc融合蛋白量高于基线的几株稳定表达细胞并建立了稳定表达细胞系(图5)。但是，分泌水平低，增加少于基线的2倍。

实施例6：GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的体外特征

天然的GLP-1能依赖葡萄糖水平刺激β-细胞分泌胰岛素(100)。为评估由哺乳动物细胞系分泌纯化的GLP-1/IgG-Fc融合蛋白是否具有生物学功能，将其对克隆培养的具胰岛素分泌功能的INS-1细胞系的分泌功能的影响进行了评估。经无血清培养和葡萄糖饥饿的INS-1细胞用不同剂量的纯化后GLP-1/IgG-Fc融合蛋白处理，同时添加0、5或20mM的葡萄糖进行培养。如图所示(图6)，没有葡萄糖存在的情况下，GLP-1/IgG-Fc融合蛋白并不能刺激β-细胞的胰岛素分泌。然而，在5mM或20mM葡萄糖存在的情况下，GLP-1/IgG-Fc以剂量依赖的形式刺激β-细胞胰岛素的分泌。这些数据表明，GLP-1/IgG-Fc融合蛋白具有生物学活性并可以以葡萄糖依赖的形式刺激β-细胞胰岛素的分泌。

实施例7：GLP-1/IgG-Fc融合蛋白诱导cAMP

图7显示，当葡萄糖含量为零时，以120nM GLP-1/IgG-Fc融合蛋白处理的INS-1细胞内cAMP水平为基础水平(图7)。但是，在5mM葡萄糖存在的条件下，经GLP-1/IgG-Fc处理的细胞的cAMP水平显著增加，与经Ex-4处理的细胞cAMP水平几乎相同(图7)。这一结果表明，GLP-1/IgG-Fc融合蛋白以葡萄糖浓度依赖的方式刺激INS-1细胞内cAMP的产生。

实施例8：GLP-1/IgG-Fc治疗预防db/db小鼠中(II型糖尿病模型)糖尿病的发生

4周龄的雌性db/db鼠(BKS.Cg-m+/+Leps^db，NO000642，购自Jackson试验室(Bar Harbor，ME，USA)。年龄背景匹配的对照鼠C57BLKS/J和CD1购自Charles River Canada(Motreal，QC，Canada)。受试鼠在有控光照(12光照/12小时黑暗)和恒温条件下饲养，提供充足的(适宜啮齿类的)食物和饮水。所有程序都依照加拿大保护动物协会的守则进行并经多伦多大学保护动物委员会批准。

通过如前所述的DNA注射/电转移法处理糖尿病db/db受试鼠(Prud′homme and Chang，Gene Ther.1999；6(5)：771-777)以促进基因转移。简言之，对麻醉处理的受试鼠胫腓骨肌肉注射了含有50μg的GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc质粒的PBS，注射使用有塑料套的27号针头以限制针头注射深度为5mm。注射后对肌肉实行100V方波电脉冲3次以强化转染效果，每次脉冲间隔1s。在第一次注射后2周，对所有受试鼠又进行了第二次注射。每周对其体重和空腹血糖水平进行监测。在注射前和第一次注射后2周和12周收集隐静脉血以测量空腹胰岛素和胰高血糖素水平。DNA注射后4、6、32周取空腹条件下的隐静脉血。用加拿大Lifecsan公司生产的基础血糖计(BC，Canada)测量空腹血糖水平，GLP-1、胰岛素和胰高血糖素水平的测量如下所述：

GLP-1/IgG-Fc融合蛋白体内的表达量是用Linco公司GLP-1 Elisa试剂盒检测血浆活性GLP-1含量来进行评估。如图所示，第一次注射后2周，注射GLP-1/IgG-Fc的受试鼠较注射IgG-Fc载体的受试鼠血清GLP-1水平显著提高。而第一次注射后16周，受试鼠血浆GLP-1水平回落至基线水平附近(图8A)。

在试验过程中，两组受试鼠的体重并没有发生显著的变化(未显示)。在注射后第一个月里，两组受试鼠空腹血糖水平也没有显著的差异(未显示)。然而，在注射后12周，注射过GLP-1/IgG-Fc的受试鼠空腹血糖水平显著低于对照组(P＜0.001)(图8B)。此外，GLP-1/IgG-Fc的受试鼠空腹胰岛素水平显著高于IgG-Fc对照鼠(P＜0.05)(图8C)，空腹胰高血糖素水平在GLP-1组受试鼠低于对照鼠(P＜0.05)(图8C)。这一结果表明，体内表达的GLP-1/IgG-Fc对db/de受试鼠有降低血糖的功效，其原因很可能是由于促进了胰岛素的分泌和减少了基础胰高血糖素分泌所致。

实施例9：GLP-1/IgG-Fc预防STZ诱导的胰岛素缺乏性小鼠(I型糖尿病模型)中糖尿病的发生

最近的研究结果表明，肠泌素的功能(如GLP-1)可能在调节血糖缓解I型糖尿病中起重要作用(Dupre等人，J Clin Endocrinol Metab.2004；89(7)：3469-3473)。为了确定GLP-1/IgG-Fc基因治疗对胰岛β-细胞损伤模型的有效性，我们研究了其对链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病CD1小鼠的作用。分别将编码GLP-1/IgG-Fc、Ex4/IgG-Fc或IgG-Fc的载体(50μg/小鼠)肌肉注射到CD1受试鼠，用局部电转移加强基因转移。DNA注射7天后，连续5d注射STZ(55mg/kg，i.p.)。结果显示，IgG-Fc对照组血糖显著增加，几天内达到糖尿病的水平(血糖≥17mM)，但是注射GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)的受试鼠受到保护显现出明显糖尿病的低发生率(图9)。胰腺组织学研究表明两组小鼠中均出现了胰岛β-细胞的损害，但是发现在GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)小鼠体内损害程度较轻(图9)。在两组受试鼠体内均观察到了胰岛单核细胞(淋巴细胞和/或巨噬细胞)的侵润(未显示)。有趣的是，尽管期望Ex4/IgG-Fc对DPP-IV降解有抵抗作用，但是Ex4/IgG-Fc处理的结果和GLP-/IgG-Fc处理效果几乎一样。这些发现表明，尽管胰岛发生炎症(胰岛炎)，但是GLP-1/IgG-Fc(或Ex4/IgG-Fc)的表达对抗了STZ诱导的β-细胞损害。

实施例10：GLP-/IgG-Fc的体内表达及其对猪血糖的影响

雄性受试约克夏猪(23kg)肌肉注射(muscularly)GLP-1/IgG1-Fc或作为对照的IgG₁-Fc载体(4mg/只猪)，注射后用ADVISYS电转移仪进行电转移。注射3日后为诱导高血糖，用Flurotan进行麻醉将四氧嘧啶一水合物(Sigma 80mg/kg)混合25ml生理盐水静脉注射。开始阶段，于注射前将酸性的四氧嘧啶中和，但中和后的溶液未能引起高血糖症于是后续试验免去中和步骤，并在IgG-Fc处理组引起中等程度高血糖，而GLP-1/IgG-Fc处理组没有发生高血糖。在克他命-镇静的(ketamine-sedated)的受试猪中每两周检测空腹血糖值。血液样品用血糖计抽取(A)，用ELISA测定Fc蛋白的表达(B)。

实施例11：RT-PCR法检测GLP-1/IgG-Fc融合蛋白的表达

使用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)和基因特异性引物检测IgG融合蛋白在转录水平上的表达。为检测GLP-1融合蛋白基因表达，100ng的总RNA作为模板和添加0.6μM的特异性引物(SEQ ID No：15)

5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’和(SEQ ID No：16)

5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。同时为检测IgG-Fc的表达，使用特异性引物(SEQID No：17)

(5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’和(SEQID No：18)

5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’)。一步RT-PCR的条件是50℃30分钟，95℃15分钟，40个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃60秒，随后在72℃下进行10min的延伸。RT-PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色检测。

实施例12：SDS PAGE和/或免疫印迹法检测GLP-1/IgG-Fc融合蛋白

对表达的融合蛋白进行翻译水平上的检测。取小规模提取的溶于SDS上样缓冲液的融合蛋白30μL经10％SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜，并用抗鼠抗体(1∶5000，Amersham-Pharmacia)探测，用ECL显影(Amersham-Pharmacia)。30μL中等规模提取的融合蛋白则经10％SDS-PAGE凝胶电泳分离后用考马斯亮兰染色检测。

实施例13：GLP-1分泌试验

GLP-1分泌试验是采用总(所有类型)GLP-1放射免疫试剂盒(Linco)，对从瞬时或永久表达GLP-1/IgG-Fc或IgG-Fc融合蛋白的COS-7细胞或表达融合蛋白的细菌裂解液收集的培养液(150μL)检测其GLP-1水平。为进行体内检测，使用活性GLP-1 ELISA试剂盒(Linco)对取自db/db受试鼠的血清进行GLP-1水平检测。

实施例14：胰岛素和胰高血糖素分泌试验

将INS-1细胞以每孔2.5×10⁵的密度在24孔细胞培养板培养。使用含10％FBS的RPMI 1640细胞培养液。次日，以无葡萄糖的新鲜KRB缓冲液培养2次每次30分钟。然后细胞分别接受加有0、5或20mM的葡萄糖及不同浓度的纯化的GLP-1/IgG融合蛋白的KRB缓冲液处理1小时。用鼠胰岛素RIA试剂盒(Linco，St.Charles，MO)测量25μLKRB缓冲液中的胰岛素水平。按照厂家的指导手册，用大鼠胰岛素RIA试剂盒或大鼠胰高血糖素RIA试剂盒(Linco)测量从空腹16小时的db/db受试鼠获得的血清样品

测量cAMP：将INS-1细胞以62,500个/孔种植在24-孔板上。在试验前一天对该细胞在含有100μM IBMX的SF-RPMI中血清饥饿5小时。接着将该细胞在450μL SF-RPMI培养液中与纯化的GLP-1/IgG-Fc-融合多肽(120nM)或Ex4(100nM)培养10分钟。通过加入1mL冰冷的乙醇终止试验。将提取物在20℃下培养3小时至过夜，接着将200μL提取物制样(aliquoted)并冰冻。将冰冻的提取物再悬浮与50μL的醋酸钠试验缓冲液中并用于cAMP RIAs(Biomedical Technologies，Stoughton，MA)。

统计学分析：所有数据都以平均值±标准差(mean±SEM)的形式表示。用SAS软件(Statistical Analysis Systems，Cary，NC)进行学生T检验或是方差分析(ANOVA)，用“n-1”假设检验(post hoc customhypotheses test)，以p＜0.05表示显著性差异。

实施例15：检测融合蛋白的例举方法

β-细胞质量测定：胰腺切片(4mm)按如前描述的处理(Finegood等人，Diabetes.2001；50(5)：1021-1029)。简言之，通过脱蜡，脱水和在柠檬酸盐缓冲液中煮沸进行抗原修复后，切片与豚鼠抗胰岛素抗体(Dako Diagnostics，Mississauga，ON，Canada)在4℃孵育过夜，然后样品用生物素标记的抗豚鼠抗体(Vector Laboratories，Burlington，ON，Canada)孵育1小时，随后用抗生物素蛋白/生物素复合物(Vectastain Elite ABCKit；Vector Laboratories，Burlingame，CA.).处理1小时。切片然后用3，3′-二氨基联苯胺盐酸盐(3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAB；Sigma-Aldrich)染色10分钟。DAB染色后，切片用自来水冲洗，并用苏木精复染。通过连接带有彩色监视器和图像采集软件的视频照像设备的Nikon(ECLIPSE-E1000)显微镜，从切片上胰岛素抗体着色程度测定β-细胞质量。由β-细胞占据的样品切面区和所有胰腺组织的样品切面区进行定量。计算每一个动物总的β-细胞面积和总的胰腺质量是通过测定每个胰腺的8-10个胰腺切片，每个胰腺数1000-1500个β-细胞，将切面总的β-细胞面积除以总的胰腺组织切面面积乘以固定前的胰腺重量，得到每个胰腺的总的β-细胞质量。

受体结合试验：本发明的组合物用传统的氯胺-T法处理(HUNTER和GREENWOOD，Nature.1962；194：495-496)。受体结合试验如前述的方法进行(Wang等人，Cell Physiol Biochem.1998；8(6)：304-313)。将分离的胰岛细胞和胰岛素分泌细胞悬浮于PBS中，用600G离心10分钟，将沉淀的细胞重悬浮于分装的PBS中。细胞与同位素碘标记的化合物的结合是在装有300mL分析缓冲液(PBS含0.2％BSA)的聚苯乙烯管(7×35mm)中于4℃进行。标记的本发明化合物(20,000cpm)分别在未标记的本发明化合物存在或不存在的情况下孵育4.5小时，当分析体系达到一平衡状态后加入冷的PBS缓冲液。样品于4℃ 600g下离心10min，弃上清，用冷PBS洗涤细胞沉淀后其放射活性用伽马计数器测定。

cAMP测定试验：测定cAMP可以评价G蛋白偶联的受体(GPCR)活性(Lee等人，Biochim Biophys Acta.2000；1490(3)：311-323)。细胞内cAMP水平的测定是以分离的胰岛细胞或培养在35mm器皿中的胰岛素分泌细胞进行的。先将细胞预先孵育在缓冲液(130mM NaCl，5mMKCl，1mM磷酸钠，1mM MgSO₄，2mM CaCl₂，20mM HEPES(pH7.4)，6mM glucose，和0.1％BSA(RIA grade，Sigma)(pH7.4)，1小时后加入PKA抑制剂孵育20分钟，再加入100μM异丁基甲基黄嘌呤孵育10min后加入化合物孵育20分钟。再用冰浴的PBS洗涤细胞3次，用0.1M，300μl盐酸提取cAMP，用放免试剂盒(Biomedical Technologies，Stoughton，MA)按操作说明检测。

PI 3-激酶活性试验：PI 3是Akt的上游激酶(Wang等人，Mol CellBiol.1999；19(6)：4008-4018)。从分离的胰岛细胞和胰岛素分泌细胞系(INS-1细胞和β-TC细胞)获得的全部细胞裂解物用本发明的组合物预处理20分钟，PI 3激酶与抗PI 3激酶p85调节亚基的抗体(Santa CruzBiotechnology)形成免疫共沉淀。通过测定形成的[³²P]PI 3-磷酸盐以检测PI 3-激酶和定量其活性(Wang等人，Biochem J.1998；331(Pt3)：917-928)。简言之，经过与抗体包被的球珠孵育过夜，抗体结合的蛋白用缓冲液I(PBS添加1％Nonidet P-40和100μM Na₃VO₄)洗涤3次后用缓冲液II(100mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM LiCl，和100μMNa₃VO₄)洗3次，最后用缓冲液III(Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，1mM EDTA和100μM Na₃VO₄)洗3次。洗涤后的免疫共沉淀产物重悬于添加了10μl 100mM MgCl₂和10μl PI(2μg/ml)的50μl缓冲液II。样品于室温放置5分钟后加入10μl ATP(440μM ATP和30μCi/10μl[³²P]ATP)振荡10分钟，加入20μl 8 N盐酸和160μl氯仿-甲醇(1∶1)终止反应。用标准方法提取脂类，干燥，重悬于20μl氯仿-甲醇(1∶1)，用硅胶薄层板采用氯仿-甲醇-水-氢氧化铵(60∶47∶11∶2.2，vol/vol/vol/vol)溶剂系统里分离，通过放射自显影测定结合到PI 3-磷酸中的³²P，用分子动力学磷显影系统(Molecular Dynamics PhosphorImager System)(Sunnyvale，CA)定量其活性。

细胞凋亡试验：分离的胰岛细胞和胰岛素分泌细胞系(INS-1细胞和β-TC细胞)经本发明的组合物处理0.5～24小时后，细胞的凋亡率用APO比率试验试剂盒(Biocolor Ltd.Ireland)按操作说明进行测定。在体内试验的动物模型中，分别将用组合物处理组和对照组胰腺切片进行胰岛素双重免疫组化染色。DNA片段用Tunel染色检测凋亡细胞的核酸片段特性。Tunel染色使用ApopTag试剂盒(Intergen，Purchas，NY)，按操作说明进行。胰岛组织因胰岛素着色成红色区(chromagen：New Fuchsin Substrate，DAKO)，而凋亡细胞核着色成暗棕色(chromagen：3，3’-二氨基联苯胺，Sigma)。试验结果用Tunel阳性的β-细胞的百分率表示。

Akt激酶试验：用本发明的组合物处理10分钟后，将分离的胰岛细胞和胰岛素分泌细胞系(INS-1细胞和β-TC细胞)置于细胞裂介缓冲液(组成为50mM HEPES(pH7.6)，150mM NaCl，10％(vol/vol)甘油，1％(vol/vol)Triton×-100，30mM焦磷酸钠，10mM NaF，1mM EDTA，1mM苯基甲磺酰氟，1mM苯甲脒，1mM Na₃VO₄，1mM二硫苏糖醇[DTT]，和100nM聚醚类毒素)得到全部细胞的裂解物(Wang等人，Mol Cell Biol.1999；19(6)：4008-4018)。预先将Akt抗体与混合有A蛋白和G蛋白的琼脂糖凝胶球珠耦联16小时，这些抗体球珠复合物用PBS洗涤2次后用裂解缓冲液洗1次(4℃)。200μg细胞总蛋白与带抗Akt抗体的球珠复合物于4℃旋转孵育2～3小时后Akt形成免疫沉淀。用1ml缓冲液(25mM HEPES[pH7.8]，10％[vol/vol]甘油，1％[vol/vol]Triton×-100，0.1％[wt/vol]BSA，1M NaCl，1mM DTT，1mM苯基甲磺酰氟，1mM小胱氨酸(microcystin)，和100nM聚醚类毒素)洗涤Akt免疫复合物4次，再用1mL激酶缓冲液(50mM Tris-HCl[pH7.5]，10mMMgCl₂和1mM DTT)洗涤2次。免疫复合物在30℃与30mL的反应混合物(激酶缓冲液含有5μM ATP，2μCi[γ-³²P]ATP，100μM Crosstide)振荡孵育30分钟。反应之后，将30μL上清液转移到Whatman p81滤纸上，用3ml 175mM磷酸洗涤，每次10分钟，再用蒸馏水洗1次，每次5分钟。重复4次。置于空气干燥后用于液体闪烁计数器计数。

MAP激酶试验：β-细胞经本发明的组合物处理20分钟后，在37℃下无磷酸盐无血清的RPMI细胞培养液中，用1.25微居里的³²Pi/组(NEN Life Science Products Boston MA)标记3小时。收获细胞并置于加有100ng/ml PS-结合蛋白(LBP)的RPMI细胞培养液，用本发明的组合物处理细胞30分钟。随后在37℃条件下用LPS刺激细胞15分钟。收集细胞并将其置于裂介缓冲液(1％Nonidet P-40 1％sodiumdeoxycholate 0.1％SDS 0.15M NaCl 0.01M Na₃PO₄(pH7.2，2mMNa3VO4，1μM聚醚类毒素，100μg/ml PMSF，50μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素，50μg/ml胃酶抑素。Boehringer Mannheim公司产品)进行超声处理。裂解产物中免疫沉淀MEK，用10％SDS-PAGE不连续凝胶电泳分离样品，用抗-磷-MEK抗体(Oncogene Research ProductsSan Diego CA)进行免疫印迹反应。

其他的一些检测方案包括诸如上述检测方法的变异在美国专利No.5,851,788、5,736,337和5,767,075所列举的参考文献中有描述。例如，本发明的组合物可以与β-细胞共孵育，并应用特异性的抗磷-caspase-3抗体进行免疫印迹试验以确定其是否抑制caspase-3。

表一：GLP-1、Ex4、鼠IgG ₁ -Fc、IgK、人IgG ₂ 、人GHRH引导序列、 PCR引物的序列以及一些在本申请中描述的试验中非必须使用的化合物的序列：

GLP-1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH₂(SEQID NO：1)

Ex4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWIKNGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO：2)

IgG₁-Fc PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK

PCICTVPEVS SVFIFPPKPK DVLTITLTPK VTCVVVDISK

DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS TFRSVSELPI

MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV

YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA

ENYKNTQPIM NTNGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTC SVL

HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID NO：3)

IgK METDTLLLWV LLLWVPGS TGD(SEQ ID NO：4)

人Akt/蛋白激酶B：

1 mkterprpnt fiirclqwtt viertfhvet peereewtta iqtvadglkk qeeeemdfrs

61 gspsdnsgae emevslakpk hrvtmnefey lkllgkgtfg kvilvkekat ayyamkilkk

121 evivakdeva htltenrvqq nsrhpfltrl kysfqthdrl cfvmeyangg elffhlsrer

181 vfaedrarfy gaeivsaldy lhseknvvyr dlklenlmld kdghikitdf glckegikdg

241 atmktfcgtp eylapevled ndygravdww glgvvmyemm cgrlpfynqdheklfelilm

301 eeirfprtlg peaksllsgl lkkdpkqrlg ggsedakeim qhrfftgivw qhvyekklsp

361 pfkpqvtset dtryfdeeft aqmititppd qddsmecvds errphfpqfs yspsata(SEQ ID NO：5)

人MAP激酶：

1 msdskcdsqf ysvqvadstf tvlkryqqlk pigsgaqgiv caafdtvlgi nvavkklsrp

61 fqnqthakra yrelvllkcv nhkniislln vftpqktlee fqdvylvmel mdanlcqvih

121 meldhermsy llyqmlcgik hlhsagiihr dlkpsnivvk sdctlkildf glartactnf

181 mmtpyvvtry yrapevilgm gykenvdiws vgcimgelvk gcvifqgtdhidqwnkvieq

241 lgtpsaefmk klqptvrnyv enrpkypgik feelfpdwif pseserdkik tsqardllsk

301 mlvidpdkri svdealrhpy itvwydpaea eapppqiyda qleerehaieewkeliykev

361 mdweerskng vvkdqpsdaa vssnatpsqs ssindissms teqtlasdtdssldastgpl

421 egcr (SEQ ID NO：6)

人caspase-3：

1 mentensvds ksiknlepki ihgsesmdsg mswdtgykmd ypcmglciiinnknfhkstg

61 mtsrsgtdvd aanlretfrn lkyevrnknd ltreeivelm rdvskedhsk rssfvcvlls

121 hgeegiifgt ngpvdlkkit nffrgdrcrs ltgkpklfii qacrgteldc gietdsgvdd

181 dmachkipvd adflyaysta pgyyswrnsk dgswfiqslc amlkqyadklefmhiltrvn

241 rkvatefesf sfdatfhakk qipcivsmlt kelyfyhl (SEQ ID NO：7)人IgG₂-Fc(788-1689)-cDNA：

788 gag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc

841 ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc

901 cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct gtggcaggac

961 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg

1021 aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt

1081 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca

1141 gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg

1201 agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca

1261 aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggccacatgg acagaggccggctcggccca

1321 ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa

1381 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg

1441 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg

1501 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc

1561 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc

1621 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg

1681 ggtaaatga (SEQ ID NO：8)

人IgF₂-Fc(788-1689)-氨基酸：

ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS

HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVIIQD

WLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：9)

人生长激素释放激素(GHRH)引导序列(leader sequence)：gtg ctc tgg gtg ttc ttc ttt gtg atc ctc acc ctc agc aac agc tcc cac tgc tcc(SEQ ID No：10)

PCR引物：

5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3’(SEQ ID No：11)

5’-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’(SEQ ID No：12)

5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’(SEQ ID No：13)

5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’(SEQID No：14)

5′CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3′(SEQ ID No：15)

5′-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3′(SEQID No：16)

5′-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3′(SEQ ID No：17)

5′-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3′(SEQID No：18)

5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’(SEQ ID No：19)

5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQ ID No：20)

Claims

1、一种含有与IgG多肽融合的GLP-1多肽或其衍生物的异源性融合蛋白，其中所述的IgG不是IgG4。

2、如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠源。

3、如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠IgG1。

4、如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人源。

5、如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述的IgG选自由人IgG1、IgG2和IgG3组成的组。

6、如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人IgG2。

7、如权利要求1～6中任一项所述的融合蛋白，其中所述的GLP-1多肽选自由GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)氨基化合物-1、DPP-IV抗性GLP-1及其片段和衍生物组成的组。

8、如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述的DPP-IV抗性GLP-1是GLP-1A8G。

9、如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述的衍生物含有与GLP-1ID NO.1序列大约70％至大约95％相同的序列的多肽。

10、如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述片段含有至少5个氨基酸至最多达大约250个氨基酸。

11、如权利要求1～10中任一项所述的融合蛋白，其中所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。

12、一种cDNA，所述cDNA编码如权利要求1所述的异源性融合蛋白。

13、一种载体，所述载体含有如权利要求12所述的cDNA。

14、一种宿主细胞，所述宿主细胞经如权利要求13所述的载体转染。

15、一种药用组合物，所述药用组合物含有如权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白，或由可药用载体搭载的如权利要求13所述的载体。

16、如权利要求5所述的组合物，所述组合物用于治疗I型和II型糖尿病。

17、如权利要求16所述的组合物，其中通过选自由局部、口服、气雾剂、腹膜内注射、静脉注射和肌肉注射组成的组的方式施用所述的组合物。

18、一种用于治疗受试者的I型和II型糖尿病的药用组合物，其中所述的组合物含有包含与IgG多肽融合的GLP-1多肽或者其衍生物或其活性片段的融合蛋白的异源融合蛋白。

19、如权利要求18所述的组合物，其中所述的IgG是鼠源。

20、如权利要求19所述的组合物，其中所述的IgG是鼠IgG1。

21、如权利要求18所述的组合物，其中所述的IgG是人源。

22、如权利要求21所述的组合物，其中所述的IgG选自由人IgG1、IgG2和IgG3组成的组。

23、如权利要求22所述的组合物，其中所述的IgG是人IgG2序列 ID No.9。

24、如权利要求17～23中任一项所述的组合物，其中所述的GLP-1多肽是选自由GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)氨基化合物-1、DPP-IV抗性GLP-1和其片段或衍生物组成的组。

25、如权利要求24所述的组合物，其中所述的DPP-IV抗性GLP-1是GLP-1A8G。

26、如权利要求24所述的组合物，其中所述的衍生物含有与GLP-1ID NO.1序列大约70％至大约95％相同的序列的多肽。

27、如权利要求24所述的组合物，其中所述的片段含有至少5个氨基酸至多达约250个氨基酸。

28、如权利要求18～27中任一项所述的组合物，其中所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。

29、如权利要求18～28中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过选自由局部、口服、气雾剂、腹膜内注射、静脉注射和肌肉注射组成的组的方式施用。

30、一种治疗受试者I型和II型糖尿病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求1～11中任一项所述的融合蛋白、或如权利要求18～29中任一项所述的组合物或如权利要求13所述的载体。

31、将如权利要求1～11中任一项所述的融合蛋白用作预防和治疗受试者I型和II型糖尿病的药物的用途。

32、一种制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在适宜条件下培养如权利要求14所述的宿主细胞以表达所述的蛋白质。

33、一种制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞内转录和翻译如权利要求12所述的载体及在一定条件下表达所述的蛋白质。

34、一种异源融合蛋白，所述融合蛋白含有与IgG多肽融合的exendin-4多肽或其衍生物。

35、如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠源。

36、如权利要求35所述的融合蛋白，其中所述的IgG是鼠IgG1。

37、如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述的的IgG是人源。

38、如权利要求37所述的融合蛋白，其中所述的IgG是选自由人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。

39、如权利要求38所述的融合蛋白，其中所述的IgG是人IgG2。

40、如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述的衍生物包含大约70％至大约95％与exendin-4 ID NO.2序列相同的序列的多肽。

41、如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述的片段含有至少5个氨基酸至多达约250个氨基酸。

42、如权利要求34～41中任一项所述的融合蛋白，其中所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。

43、一种编码如权利要求34所述的融合蛋白的cDNA。

44、一种包含如权利要求43所述的cDNA的载体。

45、一种经如权利要求44所述的载体转染的宿主细胞。

46、一种用于治疗受试者I型和II型糖尿病的药用组合物，所述的组合物包含含有与IgG多肽融合的exendin-4多肽或者其衍生物或活性片段的异源融合蛋白。

47、如权利要求46所述的组合物，其中所述的IgG是鼠源。

48、如权利要求47所述的组合物，其中所述的IgG是鼠IgG1。

49、如权利要求46所述的组合物，其中所述的IgG是人源。

50、如权利要求49所述的组合物，其中所述的IgG选自由人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。

51、如权利要求50所述的组合物，其中所述的IgG是人IgG2。

52、如权利要求46所述的组合物，其中所述的载体含有大约70％至大约95％序列与exendin-4多肽ID NO.2序列相同的多肽。

53、如权利要求46所述的组合物，其中所述的片段含有至少5个氨基酸至多达约250个氨基酸。

54、如权利要求46～53中任一项所述的组合物，其中所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或其衍生物。

55、如权利要求46所述的组合物，其中所述的片段含有至少5个氨基酸至多达约250个氨基酸。

56、如权利要求46～55中任一项所述的组合物，其中所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。

57、如权利要求46～55中任一项所述的组合物，其中所述的组合物通过选自由局部、口服、气雾剂、腹膜内注射、静脉注射或肌肉注射组成的组的方式施用。

58、一种用于治疗受试者I型和II型糖尿病的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的如权利34～42中任一项所述的融合蛋白，或者施用如权利要求46～47中任一项所述的组合物或如权利要求44所述的载体。

59、如权利要求34～42中任一项所述的融合蛋白用于在预防和治疗受试者I型和II型糖尿病患者的药物中的用途。

60、一种制备如权利要求34所述的融合蛋白的方法，所述方法包含在适宜条件下培养如权利要求45所述的宿主细胞以表达蛋白质。

61、一种制备如权利要求34所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞内转录和翻译如权利44要求中的载体在一定条件下表达所述蛋白质。